CN106947713A - 一种用于培养细黄链霉菌的培养基及其培养黄链霉菌的方法 - Google Patents
一种用于培养细黄链霉菌的培养基及其培养黄链霉菌的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物领域，涉及一种用于培养细黄链霉菌的培养基及其培养黄链霉菌的方法，用于培养细黄链霉菌的培养基按重量份计具体由以下组分组成：可溶性淀粉10‑25份，KCl1‑3份，酵母粉0.1‑1份，氯化钠0.1‑1.5份，CaCO30.1‑1.5份，Bi2MoO60.01‑0.05份，MgSO4.7H2O0.1‑0.5份；培养方法所采用的发酵工艺为：将细黄链霉菌种子液接种到装有所述培养基的发酵罐中进行发酵，发酵条件为：30‑37℃连续培养24‑72小时后，密闭发酵罐，不通气不搅拌，静置培养96‑120小时，得细黄链霉菌菌液。该方法工艺稳定，细黄链霉菌含量高，生产成本低，可用于规模化生产细黄链霉菌生物制剂菌液。
Description
技术领域
本发明属于生物领域，涉及细黄链霉菌的培养方法，具体来说涉及一种用于培养细黄链霉菌的培养基，还涉及利用该培养基培养黄链霉的方法。
背景技术
随着人们生活水平的不断提高、农产品质量安全体系逐步建立，化肥施用过量带来的问题越来越受到重视。农产品质量的需求与传统化肥的矛盾，亟需新型绿色肥料来解决，而微生物肥料的发展为解决这个矛盾提出了新的思路和途径。
微生物肥料，又称生物肥料、菌肥、接种剂，是一类以微生物生命活动及其产物作为农作物特定肥料的微生物活体制品，微生物种类是其中的核心，决定微生物肥料的应用效果。我国从20世纪50年代开始使用5406放线菌，经鉴定该菌株为细黄链霉菌乳糖变种，能够促进小麦、蔬菜、烟草、人参等多种大田和经济作物生长，提高产量并具有一定抗病、驱虫作用。微生物肥料与化肥、有机肥料的科学配合使用，能够提高化肥利用率，减少化肥的使用量，缓解并逐步解决单独使用化肥带来的环境污染等问题，对于我国农业的可持续发展具有特别重要的作用。
细黄链霉菌是链霉菌属放线菌，孢子丝直或柔曲。孢子卵圆形至杆状，表面光滑。有发育良好的分枝菌丝，菌丝无横隔，分化为营养菌丝、气生菌丝。孢子丝再形成分生孢子。孢子丝螺旋形，螺旋数目一般1-3圈。孢子柱形，一般为0.8×(1.3-1.7)微米。细黄链霉菌其代谢产物中含有生长素、抗菌素、苯乙酸、琥珀酸及细胞分裂素等作物生长所必须的生长调节剂成分，具有转化土壤中氮、磷、钾，提高土壤肥力，减少化肥用量，抑制病菌繁殖，防病保苗，刺激细胞分裂，促进作物生根、发芽、成熟，提高作物产量，促进有效物质合成，显著提高农产品的品质等作用，达到“增产增收、保水养田、抑制病害、提高品质”四效合一的功效。
对于细黄链霉菌微生物肥料，大规模发酵细黄链霉菌菌液是新型细黄链霉菌生物制剂生产的基础和关键之一，但目前未见有工厂化大规模发酵细黄链霉菌菌液的发酵工艺。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种用于培养细黄链霉菌的培养基；本发明的目的之二在于提供培养基培养黄链霉的方法，该方法所需要的培养基成本低，取材方便，适用于细黄链霉菌的高效培养，且操作简单，适用于大规模生产。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
1.一种用于培养细黄链霉菌的培养基，按重量份计具体由以下组分组成：可溶性淀粉10-25份，KCl 1-3份，酵母粉0.1-1份，氯化钠0.1-1.5份，CaCO3 0.1-1.5份，Bi2MoO60.01-0.05份，MgSO4·7H2O 0.1-0.5份。
该培养基为细黄链霉菌的专用培养基，在特定的发酵条件下，可得到较好的发酵效果。
进一步，按重量份计具体由以下组分组成：可溶性淀粉15-20份，KCl 1.5-2.5份，酵母粉0.3-0.8份，氯化钠0.3-1份，CaCO3 0.3-1.2份，Bi2MoO6 0.02-0.04份，MgSO4·7H2O0.2-0.4份。
进一步，按重量份计具体由以下组分组成：可溶性淀粉18份，KCl 2份，酵母粉0.5份，氯化钠1份，CaCO3 1份，Bi2MoO6 0.03份，MgSO4﹒7H2O 0.3份。
2.所述培养基的制备方法，取配方量的可溶性淀粉、KCl、酵母粉及氯化钠和碳酸钙，加水使可溶性淀粉的质量体积分数为10-25g/L，并使各组分充分溶解，得混合液体；将所述混合液体灭菌，加入配方量的Bi2MoO6和MgSO4·7H2O，混合均匀，得培养基。
本发明高效生产细黄链霉菌菌液的方法是基于本发明所述的用于培养细黄链霉菌的培养基来生产细黄链霉菌菌液，该方法操作简单，稳定性高，产率高。
具体方法如下：首先，将细黄链霉菌种子液接种到装有所述培养基的发酵罐中进行发酵，所述发酵条件为：通气量0.1-0.8(V/V·min)，30-37℃连续培养24-72小时，然后密闭发酵罐，不通气不搅拌，静置培养96-120小时，得细黄链霉菌菌液。
进一步，所述种子液的浓度为1-15×108cfu/mL，所述种子液和所述培养基的体积比为1-4：10。
进一步，所述发酵条件为：在2～30转/分钟条件下动态搅拌发酵。
进一步，所述细黄链霉菌种子液为二级种子液。
进一步，所述二级种子液的制备方法具体包括以下步骤：
A一级种子液的获得
将细黄链霉菌菌种接入TSBY培养基，37±2℃培养24±4小时；然后划线接种在TSBY培养基琼脂平板上，在生化培养箱中，在37±2℃条件下培养24-48小时，选典型菌落接种TSBY不含琼脂的液体培养基，置37±2℃生化培养箱中培养24±4小时，得一级种子液；
B二级种子液的获得
取步骤A所得的一级种子接种于TSBY不含琼脂的液体培养基，置37±2℃生化培养箱中培养24±4小时，得二级种子液。
在本发明的一个具体实施例中，所述二级种子液的制备方法具体包括以下步骤：
A一级种子液的获得
将细黄链霉菌菌种接入TSBY培养基，37±2℃培养24±4小时；然后划线接种在TSBY培养基琼脂平板上，在生化培养箱中，在37±2℃条件下培养24-48小时，选典型菌落接种TSBY不含琼脂的液体培养基，置37±2℃生化培养箱中培养24±4小时，得一级种子液；
B二级种子液的获得
取步骤A所得的一级种子接种于TSBY培养基，置37±2℃生化培养箱中培养24±4小时，得二级种子液。
优选的，所述步骤A中，细黄链霉菌菌种接入TSBY培养基时，接种量优选1ml/100mL。
优选的，所述步骤B中，一级种子接种于TSBY培养基时接种量优选2ml/100mL。
优选的，所述TSBY培养基的制备方法为：取胰胨豆汤粉(TSB)30g，蔗糖350g，酵母抽提物5g，加入蒸馏水溶解，然后加蒸馏水至1000mL，调节pH为7.4，高压灭菌，得TSBY培养基。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明的用于培养细黄链霉菌的培养基配方简单，培养基成本低，取材方便，适用于细黄链霉菌的高效培养。
(2)本发明的基于所述培养基的高效生产细黄链霉菌菌液的方法，其工艺稳定，益生菌含量高，生产成本低，可用于规模化生产细黄链霉菌生物制剂菌液。
具体实施方式
下面将对本发明的优选实施例进行详细的描述。
以下实施例中，以细黄链霉菌5406株作为菌种。
实施例1细黄链霉菌的培养基配方
配方一：可溶性淀粉10kg，KCl 1kg，酵母粉0.1kg，氯化钠0.1kg，碳酸钙0.1kg，Bi2MoO60.02kg，MgSO4.7H2O 0.1kg。
配方二：可溶性淀粉20kg，KCl 2kg，酵母粉0.5kg，氯化钠1.0kg，碳酸钙1.0kg，Bi2MoO60.01kg，MgSO4.7H2O 0.2kg。
配方三：可溶性淀粉25kg，KCl 3kg，酵母粉1kg，氯化钠1.5kg，碳酸钙1.5kg，Bi2MoO60.03kg，MgSO4.7H2O 0.5kg。
将上述三种配方按以下步骤制备：取配方量的可溶性淀粉、KCl、酵母粉及氯化钠和碳酸钙，加入适量的水使可溶性淀粉的质量体积分数为15g/L(10-25g/L均可)，并使各组分充分溶解，得混合液体；将所述混合液体灭菌，加入配方量的Bi2MoO6和MgSO4·7H2O混合均匀，得培养基一、培养基二和培养基三。
实施例2细黄链霉菌菌液的生产
首先，分别将实施例1制备的培养基一、培养基二和培养基三装入发酵罐中，培养基装入量与发酵罐的体积比为20mL/100mL。
其次，取浓度为1-15×108cfu/mL的细黄链霉菌种子液，分别接种到已装入培养基的发酵罐中进行发酵，所述种子液和培养基的体积比为1：10，发酵条件为：30℃连续培养24小时后静置培养(就是密闭发酵罐，不通气不搅拌，静静放置)96小时，得细黄链霉菌菌液。经计数，三种配方的培养基发酵所得的细黄链霉菌菌液中细黄链霉菌的含菌数均大于1.80×1010CFU/mL。
实施例3细黄链霉菌菌液的生产
(1)配制TSBY培养基
取胰胨豆汤粉(TSB)30Kg，蔗糖350Kg，酵母抽提物5Kg，加入蒸馏水溶解，然后加蒸馏水至1000L，调节pH为7.4，(可分装若干瓶)121℃高压灭菌15min，得TSBY培养基。
(2)一级种子液的获得
将细黄链霉菌菌种接入TSBY培养基(接种量1ml/100mL)，37±1℃培养24小时；然后划线接种在TSBY琼脂平板上，在生化培养箱中，经37℃、48小时培养后选典型菌落接种TSBY琼脂斜面，置37℃、生化培养箱中培养24小时，作为一级种子液(浓度：1-15×108cfu/mL)。
(3)二级种子液的获得
取一级种子接种于TSBY培养基(接种量2ml/100mL)，置37±1℃生化培养箱中培养24小时，得二级种子液(浓度：1-15×108cfu/mL)。
(4)细黄链霉菌菌液的生产
将上述所得的细黄链霉菌的二级种子液接种到装有所述培养基(实施例1中的所述培养基三)的发酵罐中进行发酵，培养基装入量与发酵罐的体积比为15mL/100mL。发酵条件为：37℃连续培养(2-30转/分钟动态搅拌发酵，通气量：0.1-0.8(V/V·min))72小时后静置培养(就是密闭发酵罐，不通气不搅拌，静静放置)120小时，得细黄链霉菌菌液。所述种子液和培养基的体积比为2：10。经计数，细黄链霉菌菌液中细黄链霉菌的含菌数大于2.20×1010CFU/mL。
实施例4细黄链霉菌菌液的生产
(1)配制TSBY培养基
取胰胨豆汤粉(TSB)30Kg，蔗糖350Kg，酵母抽提物5Kg，加入蒸馏水溶解，然后加蒸馏水至1000L，调节pH为7.4，(可分装若干瓶)121℃高压灭菌15min，得TSBY培养基。
(2)一级种子液的获得
将细黄链霉菌菌种接入TSBY培养基(接种量1ml/100mL)，37±1℃培养24小时；然后划线接种在TSBY琼脂平板上，在生化培养箱中，经37℃、48小时培养后选典型菌落接种TSBY琼脂斜面，置37℃、生化培养箱中培养24小时，作为一级种子液(浓度：1-15×108cfu/mL)。
(3)二级种子液的获得
取一级种子接种于TSBY培养基(接种量2ml/100mL)，置37±1℃生化培养箱中培养24小时，得二级种子液(浓度：1-15×108cfu/mL)。
(4)细黄链霉菌菌液的生产
将上述所得的细黄链霉菌的二级种子液接种到装有TSBY培养基的发酵罐中进行发酵，培养基装入量与发酵罐的体积比为15mL/100mL。发酵条件为：37℃连续培养(2-30转/分钟动态搅拌发酵，通气量：0.1-0.8(V/V·min))72小时后静置培养(就是密闭发酵罐，不通气不搅拌，静静放置)120小时，得细黄链霉菌菌液。所述种子液和培养基的体积比为2：10。经计数，细黄链霉菌菌液中细黄链霉菌的含菌数大于2.10×109CFU/mL。
实施例5细黄链霉菌菌液的生产
(1)一级种子液的获得
将细黄链霉菌菌种接入实施例1所得的培养基一(接种量1ml/100mL)，37±1℃培养24小时；然后划线接种在培养基一琼脂平板上，在生化培养箱中，经37℃、48小时培养后选典型菌落接种培养基一琼脂斜面，置37℃、生化培养箱中培养24小时，作为一级种子液(浓度：2-20×108cfu/mL)。
(2)二级种子液的获得
取一级种子接种于实施例1所得的培养基一(接种量2ml/100mL)，置37±1℃生化培养箱中培养24小时，得二级种子液(浓度：2-20×108cfu/mL)。
(3)细黄链霉菌菌液的生产
将上述所得的细黄链霉菌的二级种子液接种到装有所述培养基(实施例1中的所述培养基一)的发酵罐中进行发酵，培养基装入量与发酵罐的体积比为15mL/100mL。发酵条件为：37℃连续培养(2-30转/分钟动态搅拌发酵，通气量：0.1-0.8(V/V·min))72小时后静置培养(就是密闭发酵罐，不通气不搅拌，静静放置)120小时，得细黄链霉菌菌液。所述种子液和培养基的体积比为4：10。经计数，细黄链霉菌菌液中细黄链霉菌的含菌数大于6.21×1010CFU/mL。
实施例6细黄链霉菌菌粉半成品与成品试验
用实施例3的方法制备生产细黄链霉菌菌液，经喷雾干燥(参数：干燥能力：0.1-2.0Kg水/小时；干燥时间：1.0-1.5秒；最大空气流量：35m3/h；压缩空气流量：1000-3000L/h；温度：90-220℃；加热控温精度：±2℃)等最后制成细黄链霉菌菌粉。
发明人试制生产了5批共100千克实验室制细黄链霉菌菌菌粉，批号分别为2016001、2016002、2016003、2016004、2016005。添加剂生产过程中，严格按半成品和成品检验规定进行检验，半成品生产和检验报告结果见表1，成品质量检验情况见表2。
表1细黄链霉菌菌粉半成品生产和检验结果
表2细黄链霉菌菌粉实验室成品检验结果
上述5批实验室制细黄链霉菌菌粉成品(20160011、20160021、20160031、20160041、20160051)在整个生过程中安全、顺畅。
细黄链霉菌菌粉半成品及成品各检验项目均达到《农用微生物菌剂国家标准》的各项指标之上。充分证明了本菌剂生产工艺稳定，按照《农用微生物菌剂生产技术规程》所制定的菌剂质量稳定、安全有效，可进行规模化生产。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (9)
1.一种用于培养细黄链霉菌的培养基，其特征在于，按重量份计具体由以下组分组成：可溶性淀粉10-25份，KCl 1-3份，酵母粉0.1-1份，氯化钠0.1-1.5份，CaCO3 0.1-1.5份，Bi2MoO6 0.01-0.05份，MgSO4·7H2O 0.1-0.5份。
2.根据权利要求1所述的用于培养细黄链霉菌的培养基，其特征在于，按重量份计具体由以下组分组成：可溶性淀粉15-20份，KCl 1.5-2.5份，酵母粉0.3-0.8份，氯化钠0.3-1份，CaCO3 0.3-1.2份，Bi2MoO6 0.02-0.04份，MgSO4·7H2O 0.2-0.4份。
3.根据权利要求2所述的用于培养细黄链霉菌的培养基，其特征在于，按重量份计具体由以下组分组成：可溶性淀粉18份，KCl 2份，酵母粉0.5份，氯化钠1份，CaCO3 1份，Bi2MoO60.03份，MgSO4﹒7H2O 0.3份。
4.权利要求1-3任一项所述培养基的制备方法，其特征在于，取配方量的可溶性淀粉、KCl、酵母粉及氯化钠和碳酸钙，加水使可溶性淀粉的质量体积分数为10-25g/L，并使各组分充分溶解，得混合液体；将所述混合液体灭菌，加入配方量的Bi2MoO6和MgSO4·7H2O，混合均匀，得培养基。
5.基于权利要求1-3任一项所述的用于培养细黄链霉菌的培养基生产细黄链霉菌菌液的方法，其特征在于，首先，将细黄链霉菌种子液接种到装有所述培养基的发酵罐中进行发酵，所述发酵条件为：通气量0.1-0.8(V/V·min)，30-37℃连续培养24-72小时，然后密闭发酵罐，不通气不搅拌，静置培养96-120小时，得细黄链霉菌菌液。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述种子液的浓度为1-15×108cfu/mL，所述种子液和所述培养基的体积比为1-4：10。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵条件为：在2～30转/分钟条件下动态搅拌发酵。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述细黄链霉菌种子液为二级种子液。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述二级种子液的制备方法具体包括以下步骤：
A一级种子液的获得
将细黄链霉菌菌种接入TSBY培养基，37±2℃培养24±4小时；然后划线接种在TSBY培养基琼脂平板上，在生化培养箱中，在37±2℃条件下培养24-48小时，选典型菌落接种TSBY不含琼脂的液体培养基，置37±2℃生化培养箱中培养24±4小时，得一级种子液；
B二级种子液的获得
取步骤A所得的一级种子接种于TSBY不含琼脂的液体培养基，置37±2℃生化培养箱中培养24±4小时，得二级种子液。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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