CN105154483A - 热带假丝酵母在利用不饱和油脂产十二碳二元酸的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及热带假丝酵母在利用不饱和油脂产十二碳二元酸的应用。所述热带假丝酵母(Candida？tropicalis)来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为CICC？1798。本发明首次发现热带假丝酵母(Candida？tropicalis)CICC？1798发酵时可以将油脂中长链不饱和脂肪酸成分(十八碳不饱和脂肪酸)中的不饱和双键进行断裂加成获得十二碳二元酸，从而突破了石化产品作为原料生产长链二元酸的限制，提供了一种合成十二碳二元酸的新途径。

Description

热带假丝酵母在利用不饱和油脂产十二碳二元酸的应用

技术领域

本发明涉及热带假丝酵母在利用不饱和油脂产十二碳二元酸的应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

长链二元酸是指碳链中含有7个以上碳原子的脂肪族二羧酸，它们是一类有着重要和广泛工业用途的精细化工产品，是化学工业中合成高级香料、高性能尼龙工程塑料、高档尼龙热熔胶、高温电介质、高级油漆和涂料、高级润滑油、耐寒性增塑剂、树脂、医药和农药等的重要原料。

长链二元酸在早期主要依赖于化学法进行生产，但由于制备过程中存在高污染、高耗能等缺点，并且对生产设备有较高的要求，因此目前主要依赖微生物发酵法获取长链二元酸。微生物发酵法主要依赖于微生物特有的氧化能力及其胞内酶的作用，通过α及ω氧化的方法，在常温常压下将烷烃或一元羧酸转化为二元羧酸的技术。该技术自20世纪60年代兴起，随后日本、美国和德国等国家开始由相关技术的基础理论研究转入应用开发研究，主要涉及十二碳二元酸(DC₁₂)、十三碳二元酸(DC₁₃)、十四碳二元酸(DC₁₄)和十六碳二元酸(DC₁₆)的生产。

我国对长链二元酸的研究开发和利用工作是从70年代后期开始的，由中国科学院微生物研究所、清华大学、中国石油化工股份有限公司及上海凯赛生物技术有限公司等研究机构和公司完成了利用单一或混合烷烃发酵获取C₁₀～C₁₈长链二元酸或长链混合二元酸产品的开发研究，涉及中国专利CN200410018255、CN200610038331、CN200710195842、CN200910256590、CN200910256589、CN200910256587、CN200910256586、CN201010160310和CN201210439799，其中十五碳二元酸(DC₁₅)、十二碳二元酸(DC₁₂)、十三碳二元酸(DC₁₃)和十四碳二元酸(DC₁₄)已进入中试和20～50t罐规模的工业生产试验及鉴定阶段。

上述方法生产长链二元酸特别是十二碳二元酸的原料均为烷烃，而原油储量的下降，长链二元酸生产所需石化原料资源的紧缺，导致了二元酸生产成本的增加，因此寻找新的可持续的替代物已刻不容缓，而目前尚未有利用微生物催化长链不饱和油脂生产十二碳二元酸的报道。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种热带假丝酵母在利用不饱和油脂产十二碳二元酸的应用。

本发明技术方案如下：

热带假丝酵母在利用不饱和油脂生产十二碳二元酸中的应用，所述热带假丝酵母(Candidatropicalis)来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为CICC1798。

根据本发明优选的，所述不饱和油脂中饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的质量百分含量合计为50％以上，所述饱和脂肪酸为硬脂酸(十八烷酸)、软脂酸(十六烷酸)和/或肉豆蔻酸(十四烷酸)，不饱和脂肪酸为油酸(顺式-9-十八碳烯酸)、亚油酸(顺，顺-9，12-十八碳二烯酸)和/或亚麻酸(全顺式9、12、15十八碳三烯酸)。

能满足上述不饱和油脂要求的原料可来源于花生油、大豆油、玉米油、橄榄油、菜籽油等油料作物榨取的植物油，以及包含地沟油、餐余油在内的回收油脂。

上述应用，步骤如下：

(1)将热带假丝酵母种子液接种于发酵培养基中，在温度25～35℃、通风比1:0.3～0.7vvm、罐压0.08～0.12Mpa的条件下，流加葡萄糖溶液，使葡萄糖质量浓度为5.5～6.5％，控制发酵液pH4.0～6.0，发酵20～28h；然后，流加不饱和油脂，使油脂质量浓度为8～12％，控制发酵液pH6.5～8.5，发酵100～150h，制得发酵液；

(2)将步骤(1)制得的发酵液经提纯，制得十二碳二元酸。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中的热带假丝酵母种子液，制备步骤如下：

将热带假丝酵母接种于种子培养基中，在温度28～30℃、转速200～250转/分的条件下，摇床培养10～15小时，制得热带假丝酵母种子液；

所述种子培养基组分如下：

酵母浸粉5～10g/L、蛋白胨10～20g/L、葡糖糖20～30g/L，水配制，pH自然。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中的发酵培养基，组分如下：

葡萄糖40～60g/L、(NH₄)₂SO₄0.5～1g/L、玉米浆1～2g/L、酵母膏1～2g/L、VB₁0.1～0.2g/L、NaCl1～2g/L、KH₂PO₄4～8g/L、Na₂HPO₄·12H₂O5～10.08g/L、尿素2～3g/L、Mg₂SO₄·7H₂O5～6.15g/L、乳化剂0.02～0.5g/L、消泡剂3g/L，水配制，pH6.0～7.0。

进一步优选的，所述的乳化剂为吐温60，消泡剂为泡敌。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中的接种量为3～10％。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中的提纯，步骤如下：

调节发酵液pH至10～12，加热至85～95℃，高温处理10～60min，经离心除菌体，降温，调节pH至2.5～3.0，然后加热至85～95℃保持10～60min，然后降至室温，离心，取沉淀，制得十二碳二元酸。

有益效果

1、本发明首次发现热带假丝酵母(Candidatropicalis)CICC1798发酵时可以将油脂中长链不饱和脂肪酸成分(十八碳不饱和脂肪酸)中的不饱和双键进行断裂加成获得十二碳二元酸，从而突破了石化产品作为原料生产长链二元酸的限制，提供了一种合成十二碳二元酸的新途径；

2、本发明采用微生物法生产十二碳二元酸，后续提纯工艺简单易实现，且原材料成本低，为大幅度降低十二碳二元酸的生产成本奠定了基础。

附图说明

图1为HPLC分析玉米油发酵产物结果图；

图中：(a)癸二酸和十八碳二元酸标准品液相色谱图、(b)玉米油发酵产二元酸液相色谱图；

图2为气相色谱-质谱联用法分析玉米油发酵产物结果图。

具体实施方式

下面结合实施实例对本发明的技术方案进行详细说明，以使本发明的特性更清楚，但本发明的保护范围不局限于本文中列出的实施例。

生物材料来源

实施例中所述热带假丝酵母购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为CICC1798。

玉米油购自山东西王食品有限公司，经检测，成分为亚油酸、油酸、棕榈酸和硬脂酸。饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的质量百分含量分别为15％和84.9％，油酸购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司。

实施例1、催化油脂成分中不饱和脂肪酸不饱和键断裂菌种的筛选

对购自中国工业微生物菌种保藏管理中心的清酒假丝酵母CICC33015、解脂假丝酵母CICC1457、热带假丝酵母CICC1798及保藏于齐鲁工业大学酶工程研究所的二元酸高产酵母CandidatropicalisIEE001进行活化后，分别接种至筛选培养基中，其中培养基成分为酵母浸粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡糖糖20g/L、花生油50ml/L，自来水配置，自然pH，115℃灭菌30分钟。发酵结束后发酵液调节pH至12后加热至90℃，处理30min。趁热于7000转/分离心5min除菌体。调节上述步骤的上清pH值至2.95左右，再次加热至90℃保持30min；缓慢降温至室温。于7000转/分下离心5min获得二元酸样品并采用液相色谱法进行分析，高效液相色谱法条件：色谱柱WatersC18、流动相(甲醇：乙腈：水)＝80:5:15、流速1.0ml/min、柱温30℃、检测波长210nm。

结果发现只有热带假丝酵母菌(Candidatropicalis)CICC1798在发酵花生油时能够产生碳链长度在10碳左右的二元酸(图1)。

实施例2、在500mL摇瓶中发酵玉米油生产十二碳二元酸

热带假丝酵母在利用不饱和油脂生产十二碳二元酸中的应用，步骤如下：

(1)将5mL热带假丝酵母种子液接种于100mL发酵培养基中，在温度30℃、转速210r/min的条件下，每12h补加一次葡萄糖溶液，使葡萄糖浓度为6.2％，同时调节一次pH控制发酵液pH6.0，发酵24h；然后，每12h补加一次玉米油，使油脂质量浓度为10％，控制发酵液pH7.5，发酵120h，制得发酵液；

所述步骤(1)中的发酵培养基，组分如下：

葡萄糖50g/L、(NH₄)₂SO₄1g/L、玉米浆1g/L、酵母膏2g/L、VB₁0.1g/L、NaCl2g/L、KH₂PO₄6g/L、Na₂HPO₄·12H₂O10.08g/L、尿素3g/L、Mg₂SO₄·7H₂O6g/L、乳化剂0.02g/L、消泡剂3g/L，水配制，pH6.2。

(2)调节步骤(1)制得的发酵液pH至12，加热至90℃，高温处理30min，经7000转/分离心5min除菌体，降温，调节pH至2.95，然后加热至90℃保持30min，然后降至室温，7000转/分下离心5min，取沉淀，制得十二碳二元酸。

所述步骤(1)中的热带假丝酵母种子液，制备步骤如下：

取一支甘油管保藏的热带假丝酵母CICC1798菌种2mL移入装有100mL种子培养基的500mL三角瓶中，将热带假丝酵母接种于种子培养基中，在温度28～30℃、转速210转/分的条件下，摇床培养12小时，制得热带假丝酵母种子液；

所述种子培养基组分如下：

酵母浸粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L，水配制，pH自然。

用标准NaOH溶液滴定，计算二元酸含量，结果产量为5.1g/L，对样品进行甲酯化处理，二元酸甲酯化处理方法：称取二元酸样品33-55mg于25ml比色管中，加入硫酸-甲醇(1+99)溶液2.0ml，加塞，聚四氟乙烯生料带封口，于70℃水浴加热60min。冷却至室温，加正己烷10ml，振荡萃取脂肪酸甲酯至有机相。再加水至25ml，振荡，洗涤硫酸至水相，静置2h，吸取上层二元酸甲酯，按仪器工作条件进行测定。采用气相色谱-质谱联用法对所获二元酸制品进行分析(图2)，气相色谱条件：J&WDB-WAX弹性石英毛细管色谱柱(30mm×0.25mm，0.25μm)；载气为氦气(纯度99.999％)；程序升温：柱初始温度180℃，保温2min；以3℃·min^－1速率升至240℃，保温5min；进样口温度250℃，柱流量1mL·min^－1，分流比100：1；进样量1μL，结果显示热带假丝酵母菌CICC1798发酵玉米油所产二元酸中出现十二碳二元酸，所占比例大于20％，表明该酵母能够有效催化玉米油转化成为十二碳二元酸。

实施例3、在5L发酵罐中发酵玉米油生产十二碳二元酸

热带假丝酵母在利用不饱和油脂生产十二碳二元酸中的应用，步骤如下：

(1)将热带假丝酵母种子液300mL接种于3L发酵培养基中，在温度30℃、通风比1:0.7vvm、罐压0.08Mpa的条件下，流加葡萄糖溶液，使葡萄糖浓度为6.2％，控制发酵液pH6.0，发酵24h；然后，流加不饱和油脂，使油脂质量浓度为10％，控制发酵液pH7.5，发酵120h，制得发酵液；

所述步骤(1)中的发酵培养基，组分如下：

葡萄糖40g/L、(NH₄)₂SO₄1g/L、玉米浆1g/L、酵母膏2g/L、VB₁0.1g/L、NaCl2g/L、KH₂PO₄4g/L、Na₂HPO₄·12H₂O10.08g/L、尿素2g/L、Mg₂SO₄·7H2O6.15g/L、乳化剂0.02g/L、消泡剂3g/L，水配制，pH7.0。

(2)调节步骤(1)制得的发酵液pH至10，加热至85℃，高温处理60min，经7000转/分下离心5min除菌体，降温，调节pH至2.5，然后加热至95℃保持10min，然后降至室温，7000转/分下离心5min，取沉淀，制得十二碳二元酸。

所述步骤(1)中的热带假丝酵母种子液，制备步骤如下：

取一支甘油管保藏的热带假丝酵母CICC1798菌种2mL移入装有100mL种子培养基的500mL三角瓶中，将热带假丝酵母接种于种子培养基中，在温度28～30℃、转速250转/分的条件下，摇床培养10小时，制得热带假丝酵母种子液；

所述种子培养基组分如下：

酵母浸粉5g/L、蛋白胨10g/L、葡萄糖30g/L，水配制，pH自然。

用标准NaOH溶液滴定，计算二元酸含量，结果产量为4.8g/L，转化率为5％，对样品进行甲酯化处理，并采用气相色谱-质谱联用法对所获二元酸制品进行分析(图2)，结果显示热带假丝酵母菌CICC1798发酵玉米油所产二元酸中出现十二碳二元酸，表明该酵母能够催化玉米油转化成为十二碳二元酸。

实施例4、在500mL摇瓶中发酵油酸生产十二碳二元酸

(1)将5mL热带假丝酵母种子液接种于100mL发酵培养基中，在温度30℃、转速210r/min的条件下，每12h补加一次葡萄糖溶液，使葡萄糖浓度为6.2％，同时调节一次pH控制发酵液pH6.0，发酵24h；然后，每12h补加一次油酸，使油酸质量浓度为10％，控制发酵液pH7.5，发酵120h，制得发酵液；

所述步骤(1)中的发酵培养基，组分如下：

葡萄糖50g/L、(NH₄)₂SO₄1g/L、玉米浆1g/L、酵母膏2g/L、VB₁0.1g/L、NaCl2g/L、KH₂PO₄6g/L、Na₂HPO₄·12H₂O10.08g/L、尿素3g/L、Mg₂SO₄·7H₂O6g/L、乳化剂0.02g/L、消泡剂3g/L，水配制，pH6.2。

(2)调节步骤(1)制得的发酵液pH至12，加热至90℃，高温处理30min，经7000转/分离心5min除菌体，降温，调节pH至2.95，然后加热至90℃保持30min，然后降至室温，7000转/分下离心5min，取沉淀，制得十二碳二元酸。

所述步骤(1)中的热带假丝酵母种子液，制备步骤如下：

取一支甘油管保藏的热带假丝酵母CICC1798菌种2mL移入装有100mL种子培养基的500mL三角瓶中，将热带假丝酵母接种于种子培养基中，在温度28～30℃、转速210转/分的条件下，摇床培养12小时，制得热带假丝酵母种子液；

所述种子培养基组分如下：

酵母浸粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L，水配制，pH自然。

用标准NaOH溶液滴定，计算二元酸含量，结果产量为5.2g/L，对样品进行甲酯化处理，并采用气相色谱-质谱联用法对所获二元酸制品进行分析，结果显示热带假丝酵母菌CICC1798发酵油酸所产二元酸中出现十二碳二元酸，表明该酵母能够催化油酸转化成为十二碳二元酸。

Claims (8)

1.热带假丝酵母在利用不饱和油脂生产十二碳二元酸中的应用，其特征在于，所述热带假丝酵母(Candidatropicalis)来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为CICC1798。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述不饱和油脂中饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的质量百分含量合计为50％以上，所述饱和脂肪酸为硬脂酸、软脂酸和/或肉豆蔻酸，不饱和脂肪酸为油酸、亚油酸和/或亚麻酸。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤如下：

(1)将热带假丝酵母种子液接种于发酵培养基中，在温度25～35℃、通风比1:0.3～0.7vvm、罐压0.08～0.12Mpa的条件下，流加葡萄糖溶液，使葡萄糖质量浓度为5.5～6.5％，控制发酵液pH4.0～6.0，发酵20～28h；然后，流加不饱和油脂，使油脂质量浓度为8～12％，控制发酵液pH6.5～8.5，发酵100～150h，制得发酵液；

(2)将步骤(1)制得的发酵液经提纯，制得十二碳二元酸。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中的热带假丝酵母种子液，制备步骤如下：

将热带假丝酵母接种于种子培养基中，在温度28～30℃、转速200～250转/分的条件下，摇床培养10～15小时，制得热带假丝酵母种子液；

所述种子培养基组分如下：

酵母浸粉5～10g/L、蛋白胨10～20g/L、葡糖糖20～30g/L，水配制，pH自然。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中的发酵培养基，组分如下：

葡萄糖40～60g/L、(NH₄)₂SO₄0.5～1g/L、玉米浆1～2g/L、酵母膏1～2g/L、VB₁0.1～0.2g/L、NaCl1～2g/L、KH₂PO₄4～8g/L、Na₂HPO₄·12H₂O5～10.08g/L、尿素2～3g/L、Mg₂SO₄·7H₂O5～6.15g/L、乳化剂0.02～0.5g/L、消泡剂3g/L，水配制，pH6.0～7.0。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的乳化剂为吐温60，消泡剂为泡敌。

7.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中的接种量为3～10％。

8.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中的提纯，步骤如下：

调节发酵液pH至10～12，加热至85～95℃，高温处理10～60min，经离心除菌体，降温，调节pH至2.5～3.0，然后加热至85～95℃保持10～60min，然后降至室温，离心，取沉淀，制得十二碳二元酸。