KR101316732B1

KR101316732B1 - 인시츄 추출 발효를 이용하여 헥사노산을 생산하는 방법

Info

Publication number: KR101316732B1
Application number: KR1020120008539A
Authority: KR
Inventors: 엄영순; 상병인; 전병승; 최기은; 김연제
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2012-01-27
Filing date: 2012-01-27
Publication date: 2013-10-10
Also published as: KR20130087298A

Abstract

본 명세서에는 미생물을 이용하여 헥사노산을 생산하는 방법으로서, 헥사노산 생산 균주를 배양하는 동안, 배양액에 헥사노산을 추출하는 유기용매를 가하여 헥사노산을 추출하여 배지로부터 제거하는 방법이 개시된다. 상기 방법을 이용하면 탄소원으로서 수크로스를 이용하면서도 고수율로 헥사노산을 생산할 수 있으며 용이하게 회수할 수 있다.

Description

인시츄 추출 발효를 이용하여 헥사노산을 생산하는 방법{Method for producing hexanoic acid using in situ extractive fermentation}

본 명세서에 개시된 기술은 헥사노산을 생산하는 방법에 관한 것이다.

현재 세계 에너지 수요량의 86% 가량을 석유, 석탄, 천연가스 등 화석연료에 의존하고 있다. 광범위한 화석 연료의 이용으로 초래된 심각한 환경 기후 변화와 화석 자원 고갈로 인한 에너지 및 자원의 부족으로 인하여 재생 가능한 자원에서 연료를 생산하려는 노력이 증가되고 있다.

현재 이용 가능한 대체에너지로는 바이오 에너지, 태양열, 풍력, 지력, 조력 발전 등이 대두되고 있으나 바이오 에너지는 수송용 연료로서 그 활용도가 높으며 환경오염 물질의 배출을 적게는 30% 이상 많게는 90% 까지도 줄일 수 있는 장점으로 인하여 전 세계적으로 바이오 에너지에 대한 관심이 높아지고 있는 상황이다. 바이오 에너지란 자연계에 있는 바이오매스(biomass)로 부터 만들어지는 지속 가능한 에너지원(sustainable development energy resources)을 말하는데 옥수수, 사탕수수, 폐기용 셀룰로오스 등과 같은 식물이나 농업 및 환경 폐기물로부터 생산된다. 그렇기 때문에 지구 온난화의 주범이 되는 온실가스인 이산화탄소 (CO₂)를 증가시키지 않고 각종 유기성 폐기물을 이용함으로써 폐기물을 줄이는 효과가 있다. 또한 중금속 및 다른 유해물질을 포함하고 있지 않으며 액체 바이오 연료인 경우 기존의 자동차 액체 연료와 함께 혼합하여 사용할 수 있는 장점이 있다. 이러한 재생 가능한 식물성 원료 물질에서 유래한 바이오 연료로는 C2물질인 에탄올과 C4물질인 부탄올이 수송용 연료로서 이미 많은 연구가 진행되고 있지만 항공용 연료 등은 더욱 높은 탄소수를 가진 물질을 필요로 하기 때문에 새로운 바이오 연료의 개발이 필요하다.

6개의 탄소를 갖는 헥사놀은 에스테르화(esterification)을 통해서 개솔린, 디젤, 제트 연료로 사용될 수 있는데, 헥사노산(hexanoic acid)에서 단순 촉매 반응으로 헥사놀(hexanol)로 전환될 수 있으므로, 헥사노산은 바이오연료의 전구물질로서 중요하다.

헥사노산은 6개의 탄소를 가지는 직선형의 지방산으로서 향수, 약, 윤활 그리스, 고무, 염료 등을 만드는데 사용되고 있다.

미생물 발효를 이용한 헥사노산 생산은 1942년에 발표된 혐기성 세균인 클로스트리디움 클루이베리(Clostridium kluyveri)를 이용한 헥사노산 생산 관련 연구가 가장 많이 진행된 균 중에 하나이다. 위 균주는 에탄올과 아세테이트 혹은 숙시네이트를 이용하여 H₂, 부티르산, 헥사노산을 생산할 수 있다. 아세트산이 과잉 될수록 헥사노산이 주로 생산이 되는데 이들의 관계에서 부티르산이 헥사노산 합성과정에서 중간 물질로 사용된다는 사실이 밝혀졌다.

Rodick et al.은 헥사노산의 생산량을 증가시키기 위해서 이온교환 수지인 amberlite IRA-400가 포함된 배양기에서 고정화된 메가스페라 엘스데니(Megasphaera elsdenii)를 이용하여 유가 배양하여 헥사노산 생산 수율을 기존 6 g/L에서 19 g/L로 30% 증가시켰다고 보고하였다.

Roddick, F.A. and M.L. Britz, Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 1997 69(3) 383-391 Barker, H.A. and S.M. Taha, Clostridium kluyverii, an Organism Concerned in the Formation of Caproic Acid from Ethyl Alcohol. Journal of Bacteriology, 1942. 43(3): p. 347-63. Barker, H.A., M.D. Kamen, and B.T. Bornstein, The Synthesis of Butyric and Caproic Acids from Ethanol and Acetic Acid by Clostridium Kluyveri. Proc Natl Acad Sci U S A, 1945. 31(12): p. 373-81.

본 명세서에 개시된 기술은 헥사노산을 높은 수율로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 명세서에 개시된 기술은 탄소원으로서 수크로스를 이용하여 헥사노산을 높은 수율로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일실시예에 따른 헥사노산 생산방법은, 미생물을 이용하여 헥사노산을 생산하는 방법으로서, 헥사노산 생산 균주를 배양하는 동안, 배양액에 헥사노산을 추출하는 유기용매를 가하여 헥사노산을 동시발효 추출하여 배지로부터 헥사노산을 제거하는 것을 포함한다.

본 발명에 다른 일실시예에 따른 헥사노산 생산방법은, 헥사노산 생산 균주를 배양액에 접종하여 배양시키는 단계; 상기 배양액에 유기용매를 가하는 단계; 상기 유기 용매를 가한 후에 상기 균주를 계속 배양시키는 단계; 및 상기 유기 용매를 제거하여 유기 용매 중의 헥사노산을 수득하는 단계를 포함할 수 있다.

본 명세서에 개시된 방법을 이용하면, 헥사노산을 고수율로 생산할 수 있고 용이하게 회수할 수 있다.

또한, 본 명세서에 개시된 방법을 이용하면, 다른 탄소원에 비해서 가격이 싸고 쉽게 구할 수 있으며 환경성과지수가 높은 수크로스를 이용하여 헥사노산을 효과적으로 생산할 수 있는 장점이 있다.

[도 1]
도 1은 초기 헥사노산의 초기 농도에 따른 세포 성장의 변화(a) 및 pH의 변화(b)를 나타낸 그래프이다.
[도 2]
도 2는 헥사노산의 초기 농도가 헥사노산 생성 효율에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
[도 3]
도 3은 초기 pH가 세포 성장과 pH 변화에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
[도 4]
도 4는 초기 pH 가 아세트산, 부티르산 및 헥사노산의 생성 효율에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
[도 5]
도 5는 효모 추출물이 세포 성장(a) 및 수크로스 소비(b)에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
[도 6]
도 6은 효모 추출물이 아세트산, 부티르산 및 헥사노산의 생성 효율에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
[도 7]
도 7은 아세테이트의 첨가가 세포 성장에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
[도 8]
도 8은 아세테이트의 첨가가 아세트산, 부티르산 및 헥사노산의 생산 효율에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
[도 9]
도 9는 부티르산 첨가가 세포 성장에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
[도 10]
도 10은 부티르산 첨가가 아세트산, 부티르산 및 헥사노산 생산 효율에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
[도 11]
도 11은 초기 수크로스 농도에 따른 헥사노산 추출 효율 변화를 나타내는 그래프이다.
[도 12]
도 12는 초기 헥사노산 농도에 따른 헥사노산 추출 효율 변화를 나타내는 그래프이다.
[도 13]
도 13은 pH 조절에 따른 헥사노산 추출 효율 변화를 나타내는 그래프이다.
[도 14]
도 14는 MES를 첨가하고 수크로스를 중간에 주기적으로 투입하여 유가배양한 결과 세포 성장, 용매 상의 헥사노산 농도, 배지 상의 수크로스 농도를 나타내는 그래프이다.
[도 15]
도 15는 MES를 첨가하고 수크로스를 중간에 주기적으로 투입하여 유가배양한 결과 배지 상의 부티르산 농도, 배지 상의 헥사노산 농도 및 pH를 나타낸 그래프이다.
[도 16]
도 16은 MES를 첨가하지 않고 수크로스를 중간에 주기적으로 투입하여 유가배양한 결과 세포 성장, 용매 상의 헥사노산 농도, 배지 상의 수크로스 농도를 나타내는 그래프이다.
[도 17]
MES를 첨가하지 않고 수크로스를 중간에 주기적으로 투입하여 유가배양한 결과 배지 상의 부티르산 농도, 배지 상의 헥사노산 농도 및 pH를 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명에 대해 더욱 구체적으로 설명한다. 본 발명의 일실시예에 따른 헥사노산 생산방법은, 미생물을 이용하여 헥사노산을 생산하는 방법으로서, 헥사노산 생산 균주를 배양하는 동안, 배양액에 헥사노산을 추출하는 유기용매를 가하여 헥사노산을 추출하여 배지로부터 제거하는 것을 포함한다.

상기 방법에 있어서, 배양 기간 동안 주기적으로 상기 배양액에 수크로스를 투입할 수 있다. 상기 수크로스는 상기 배양액 전체 부피를 기준으로 20g/L 내지 80g/L의 농도로 투입할 수 있다. 최적농도의 수크로스를 투입하면 헥사노산의 수율을 높일 수 있다. 20g/L 미만으로 투입하면 효과가 미미하고, 80g/L을 초과하면 더 이상 수율 상승이 이루어지지 않는다. 가장 바람직한 수크로스 농도는 60g/L이다.

상기 유기 용매는, 균주의 성장이 대수 증식기에 접어들 때 배양액에 가할 수 있다. 메가스페라 엘스데니 (Megasphaera elsdenii) NCIMB 702410의 경우 대략 22~26시간 또는 24시간 배양한 시점이 될 수 있다. 또한, 균체 수의 600nm OD 값이 6~8 또는 7 정도 되는 시점이 될 수 있다.

상기 방법은, 균주의 전체 배양 기간 동안 pH가 6.0 내지 6.5로 유지될 수 있다. 더 바람직하게는 6.0 내지 6.3으로 유지될 수 있다. 상기 pH 범위 내에서는 균주가 성장에 제한을 받지 않아 헥사노산 생산 효율이 유지될 수 있다. pH 조절은 MES 첨가 등에 의하는데, 본 명세서에 기재된 방법에 의하면 MES 첨가에 의하지 않고서도 pH가 6.0 내지 6.3의 범위로 유지될 수 있다. 이는 추출 용매를 이용하여 배양 동안 헥사노산을 지속적으로 추출하여 제거해 내기 때문이다.

배양액과 유기용매의 부피비는 1:0.1 내지 1:5일 수 있다. 또한 상기 부피비는 1:0.5 이상, 1:0.8 이상, 1:0.9 이상일 수 있다. 한편, 1:5 이하, 1:4 이하, 1:3 이하, 1:2 이하일 수 있다. 이는 추출 효율을 보조하는 보조제의 존재 여부에 따라 적절히 조절될 수 있다. 즉, 추출 보조제의 존재 하에서는 유기용매의 부피는 더 적어질 수 있다.

본 발명에 따른 방법에서 추출을 위한 용매는, 배양기에서 직접 적용되기 때문에 유탁 (emulsion) 을 거의 형성하지 않아야 하며 배양액과는 상당히 다른 밀도와 높은 분배계수(Distribution coefficient)를 가져야만 추출이 용이하다. 분배계수는 다음과 같이 정의된다:

[수학식 1]

분배계수(Distribution coefficient)=

유기용매상에서의 용질의 농도/수용액상에서의 용질의 농도

또한 유기용매가 미생물에 독성을 미칠 수 있으므로 미생물 생육에 저해를 최소화 할 수 있는 유기용매이어야 한다. 상기와 같은 관점에서, 유기용매는 일차 알코올을 포함할 수 있다. 상기 일차 알코올은 탄소수 10 내지 22인 일차 알코올일 수 있다. 예컨대, 옥탄올(Octanol, C8), 1-노난올(Nonanol, C9), 1-데칸올(Decanol, C10), 운데칸올(Undecanol, C11), 도데칸올(Dodecanol, C12), 1-테트라데칸올(1-Tetradecanol, C14), 세틸 알코올(Cetyl alcohol, C16), 스테아릴 알코올(Stearyl alcohol, C18), 아라키딜 알코올(Arachidyl alcohol, C20), 도코사놀(Docosanol, C22), 테트라코사놀(Tetracosanol, C24), 헥사코사놀(Hexacosanol, C26), 옥타노솔(Octanosol, C28) 또는 트리콘타놀(Tricontanol, C30)을 들 수 있다. 또한, 이중결합을 포함한 올레일 알코올(oleyl alcohol), 리놀레일 알코올(linoleyl alcohol) 등도 포함한다. 특히 상기 일차 알코올은 올레일 알코올(oleyl alcohol)일 수 있다.

상기 유기용매의 추출 효율을 높이기 위해서 상기 유기용매에 추가 성분인 보조제를 넣을 수 있다. 예컨대, 상기 유기용매는 3차 아민(tertiary amine)을 더 포함할 수 있다. 상기 3차 아민은 트리-엔-옥틸아민(Tri-n-octylamine)일 수 있다. 구체적인 예로서, alamine®336을 들 수 있다.

상기 일차 알코올과 상기 3차 아민의 부피비는 85~95 : 15~5일 수 있다. 3차 아민의 량이 너무 적으면 효과가 미미하고 너무 많으면 독성이 유발될 수 있다.

상기 균주는 메가스페라 속 (Megasphaera sp.) 균주일 수 있다. 더 구체적으로, 상기 균주는 메가스페라 엘스데니 (Megasphaera elsdenii) 균주일 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 균주는 메가스페라 엘스데니 (Megasphaera elsdenii) NCIMB 702261 또는 메가스페라 엘스데니 (Megasphaera elsdenii) NCIMB 702410일 수 있다. 그 중에서 특히 메가스페라 엘스데니 (Megasphaera elsdenii) NCIMB 702410가 바람직하다.

소나 양의 위 확대증에 관여하는 위 미생물을 조사하는 과정에서 보고된 펩토스트렙토코쿠스 엘스데니(Peptostreptococcus elsdenii)는 유산으로부터 CO₂, H₂, 아세트산, 프로피온산, 부티르산 및 발레르산을 생산하고, 포도당 발효로 헥사노산(hexanoic acid)를 생산하는 그람 음성, 편성 혐기성 장내 미생물이다. 1959년에 처음 발표된 펩토스트렙토코쿠스 엘스데니(Peptostreptococcus elsdenii)은 1971년에 메가스페라 엘스데니(Megasphaera elsdenii)로 재 분류되었다. 편성 혐기성 미생물의 장점은 생물공학적 응용에서 매우 뛰어난 신진대사 능력을 갖고 있다는 점이다. 이 균은 그러한 장점을 가지고 있으면서 글루코스, 말토오스, 락테이트 및 수크로스를 이용하여 피루베이트의 대사에서 유도된 아세틸-코에이(acetyl-CoA)의 축합 반응으로 아세트산, 부티르산 그리고 최종적으로 헥사노산을 생산한다.

상기 배양액은 수크로스 및 효모 추출물을 포함하는 것일 수 있다. 상기 배양액은 트립토판, 펩톤, 비프 추출물, K₂HPO₄, 시스테인-HCl x H₂O, 염 용액, 헤민(hemin) 용액 및 비타민 K1 용액을 더 포함하는 M-PYS 배지일 수 있다. 상기 효모 추출물은 배양액 전체 부피를 기준으로 2g/L 이상, 4g/L 이상, 6g/L 이상, 8g/L 이상, 또는 10g/L 이상일 수 있다. 효모 추출물의 첨가 농도가 높을수록 미생물의 성장이 빨라지면서 수크로스를 이용하는 속도가 빨라진다. 상한선은 80g/L 이하, 60g/L 이하, 40g/L 이하, 또는 20g/L 이하일 수 있다. 한편, 수크로스 농도는 20g/L 이상, 40g/L 이상, 또는 60g/L 이상일 수 있다. 수크로스 농도가 높아질수록 수크로스의 생산성이 높아진다. 예컨대, 하기 표 1의 조성을 갖는 M-PYS 배지를 사용할 수 있다.

구성성분	농도 (g/L)
수크로스(Sucrose)	20
트립토판(Tryptone)	5
펩톤(Peptone)	5
효모 추출물(Yeast extract)	10
비프 추출물(Beef extract)	5
K₂HPO₄	2
Cysteine-HCl x H₂O	0.5
염 용액 (하기 표 2)	40 ml
증류수	950 ml
헤민 용액(Hemin solution, 1N NaOH 1ml에 헤민 50mg을 용해시키고 증류수를 더하여 100ml를 만들어 냉장 보관함)	10 ml
Vitamin K1 용액 (95%에탄올 20ml에 비타민 K1 0.1ml를 용해시킨 후 여과 멸균하여 갈색 병에서 냉장 보관함)	0.2 ml

상기 염 용액의 구성은 하기 표 2와 같다.

Components	Concentration (g/L)
CaCl₂ x 2 H₂O	20
MgSO₄ x 7 H₂O	5
K₂HPO₄	5
KH₂PO₄	3
NaHCO₃	10
NaCl	5
증류수	1000 ml

상기 방법은, 배양액 내의 헥사노산 농도를 배양액 전체 부피를 기준으로 8g/L 미만으로 유지시키는 것을 포함할 수 있다. 헥사노산 농도가 너무 높으면 미생물이 독성을 받기 때문에 지속적으로 헥사노산을 생산할 수 없다. 헥사노산 생성과 추출량이 줄어들기 때문이다. 이는 유기용매에 의한 헥사노산의 인 시츄 추출에 의해 해결 가능하다.

상기 방법은, 배양액 내에 아세테이트 및 부티레이트 중 하나 이상을 배양액 전체 부피를 기준으로 2g/L 이상의 농도로 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 아세테이트 및/또는 부티레이트를 첨가하면 헥사노산 수율이 높아진다. 특히, 부티레이트를 첨가하면 헥사노산 수율이 많이 높아지는데, 이는 부티레이트의 첨가로 인해 미생물의 대사 경로가 헥사노산을 생산하는 쪽으로 유도되어 나타나는 것으로 보인다. 또한, 부티레이트의 첨가로 인해 미생물 발효과 진행되는 과정에서 생산된 산에 대해서 pH완충작용을 함으로써 배지의 pH가 저하되는 것을 방지함에 따른 결과인 것으로 보여진다.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명하나, 이것은 예시적인 목적에 불과할 뿐 본 발명의 권리범위를 한정하는 것은 아님은 자명하다.

실시예 1 내지 4

동결건조 상태로 분양 받은 메가스페라 엘스데니(Megasphaera elsdenii) NCIMB 702410 균주를 RCM 배지에서 충분히 배양한 후 멸균한 50% 글리세롤과 1:1의 부피비로 혼합하여 -70 ℃에서 stock으로 보관하였다. Stock으로 냉장 보관 중인 미생물을 M-PYS 배지에 접종시킨 후 하룻밤 동안 37 ℃에서 전 배양을 하였다. 배양된 메가스페라 엘스데니(Megasphaera elsdenii) NCIMB 702410 균주는 50ml의 M-PYS 액체배지로서, 각각 20g/L(실시예 1), 40g/L(실시예 2), 60g/L(실시예 3) 및 80g/L(실시예 4) 농도의 수크로스가 초기에 주입된 배지가 함유된 125 ml용 혈청병에 액체배지의 10% (v/v) 가 되도록 접종하고 37 ℃, 151 rpm, 쉐이킹(Shaking) 인큐베이터에서 배양하였다. 24시간 후 대수 증식기에 접어들었을 때, 올레일 알코올 (DHW)과 alamine® 336 (Cognis)을 9:1의 부피비로 혼합한 유기용매를 주입하고 배양을 120시간 동안 계속한 후 용매를 수거하고 용매 중의 헥사노산을 수득하였다.

실시예 5 내지 실시예 10

초기 배지 내의 헥사노산의 농도를 1M (실시예 5), 0.5M (실시예 6), 0.25M (실시예 7), 0.1M (실시예 8), 0.05M (실시예 9) 및 0.01M (실시예 10)로 달리하고 최초 pH는 6.0으로 고정하였다. 올레일 알코올과 alamine® 336이 9:1로 혼합된 유기 용매를 주입하여 37 ℃에서 1시간 동안, 20 rpm 속도로 반복적으로 역전시켜 주었다. 그 외의 조건은 상기 실시예 1 내지 4와 동일하게 하였다.

실시예 11

헥사노산 58 g/L (0.5M)을 첨가한 배지액을 사용하였다. 1L M-PYS 배지액을 생물반응기에 먼저 넣은 후, 올레일 알코올과 alamine® 336을 9:1로 혼합한 유기용매를 1L주입하여 배지 내에 존재하는 헥사노산을 추출하였다. 반응기 pH는 6.0으로 조절하였다. pH는 5N HCl로 유지하였고 37℃에서 100 rpm으로 12시간 동안 교반시켰다. 그 외의 조건은 상기 실시예 6과 동일하게 하였다.

실시예 12

1L modified M-PYS 배지액의 수크로스 농도는 60 g/L로 하였으며 헥사노산 생산량을 높이기 위하여 소디움 부티레이트(sodium butyrate) 를 5 g/L 첨가하였다. 먼저 2.5 L 의 생물반응기에 배지를 넣은 후, 밤새 키운 균주를 10% (v/v) 접종하였다. 24시간 후 대수 증식기에 접어들었을 때, 올레일 알코올과 alamine 336®을 9:1로 혼합한 유기용매를 1L 주입하여 배지 내에서 생산되는 헥사노산을 in-situ 상태에서 추출하였다. 전체 배양은 28일간 진행되었다. 배양이 진행됨에 따라 감소된 수크로스 농도를 회복시키기 위해서 2차례에 걸쳐 60g/L의 수크로스를 배지에 첨가해 주었다. MES의 필요성에 대해 실험하기 위해 대조군으로서(비교예 1) 100mM의 MES를 배지에 첨가한 것을 제외하고는 실시예 12와 동일하게 배양하였다. 그 외 조건은 상기 실시예들과 동일하였다.

실험예 1: 균주의 선택

헥사노산 발효를 위해서 혐기성 균주인 메가스페라 엘스데니(Megasphaera elsdenii) NCIMB 702261, NCIMB 702262, NCIMB 702264, NCIMB 702331 및 NCIMB 702410 균주를 NCIMB (National Collection of Industrial Bacteria)에서 분양 받았다. 위 균주는 RCM (Reinforced Clostridial Medium) (표 3) 배지에 접종하여 37 ℃에서 pH 6.8로 적정하여 혐기 상태로 배양하였다. 48 시간 배양 후의 발효 결과물을 하기 표 4에 나타내었다. 수크로스를 탄소원으로 이용가능하며 헥사노산 생산력이 좋은 메가스페라 엘스데니(Megasphaera elsdenii) NCIMB 702410을 선택하게 되었다.

구성성분	농도 (g/L)
Glucose	20
Tryptone	5
Peptone	5
Yeast extract	3
Beef extract	10
Sodium chloride	5
Soluble starch	1
Cysteine-HCl x H₂O	0.5
Sodium acetate	3
Distilled water	1000 ml

48시간 후 대사산물(g/L)	NCIMB로부터 얻은메가스페라 엘스데니 균주(Megasphaera elsdenii)
	702261	702262	702264	702331	702410
아세트산	2.86	2.95	2.99	2.84	0.22
부티르산	3.83	3.74	3.43	2.99	1.36
헥사노산	2.21	0.00	0.00	0.00	3.27

실험예 2: 유기용매의 선택

실제로 미생물을 배양하는 과정에서 헥사노산의 추출 용매가 미생물에게 미치는 독성 영향을 살펴보기 위하여 생균수를 측정하였다. 대조군(Control)과 올레일 알코올(oleyl alcohol) 100 %, 그리고 올레일 알코올에 alamine® 336을 10%-30 %로 각각 다르게 하여 혼합하여 메가스페라 엘스데니(Megasphaera elsdenii) NCIMB 702410 균주에 처리하였다. 그 결과는 하기 표 5에 나타난 바와 같다.

	Control	Oley alcohol 100 %	Oley alcohol : Alamine 336® (9:1)	Oley alcohol : Alamine 336® (8:2)	Oley alcohol : Alamine 336® (7:3)
CFU ml^-1	24.0(± 2.2) × 10⁷	25.0 (± 2.9) × 10⁷	20.0 (± 2.2) × 10⁷	16.0 (± 2.2) × 10⁷	3.7 (± 0.5) × 10⁷

상기 표에 나타난 바와 같이, control과 oleyl alcohol 100%의 생균수는 큰 차이가 없었다. 이것으로 oleyl alcohol 100%가 미생물에 독성을 주지 않는 것으로 관찰되어졌다. 그러나, alamine® 336의 혼합 비율이 높아질수록 생균수가 급격하게 낮아지기 때문에 미생물에 독성을 덜 주는 범위에서 추출효율을 높이기 위해서는 올레일 알코올:alamine®336의 부피비는 85-95 : 15-5로 조절하는 것이 바람직하다. 가장 바람직한 부피비는 90:10이었다.

실험예 3: 배지 내의 헥사노산 농도에 따른 헥사노산 생산 효율의 변화

배양배지에서 생산된 헥사노산이 균주 성장 및 헥사노산 생산에 미치는 영향을 조사하기 위해 헥사노산이 0 g/L에서 최대 생산할 수 있는 8 g/L까지의 조건에서 미생물을 배양하고 균체 성장량과 헥사노산 생산량을 분석하였다.

회분식 발효에 사용한 배지는 아르곤 가스로 탈기를 시킨 후 125 ml 혈청병(serum battle) 에 유효 용적이 50 ml이 되도록 분주 하였고, 회분식 발효추출에 사용한 배지는 15 ml hungate tube (16 x 125mm) 에 유효 용적이 10 ml이 되도록 분주 하였다. 혈청병은 부틸 고무마개로 막아서 121 ℃, 15 psig에서 20분간 오토클레이브(autoclave)하여 멸균하였다.

균주의 성장 및 증식은 실린지를 이용하여 샘플 2 ml을 취한 후 스펙트로포토미터(spectrophotometer) (UV-1700, SHIMAZU)를 이용하여 광학밀도(optical density, OD)를 측정하였다. 취한 샘플은 원심분리기를 이용하여 12000 RPM, 10 ℃, 5분 동안 원심분리 하여 펠릿(cell Pellet)을 제거한 후 상등액 만을 취하여 분석하였다.

유기산의 농도 분석은 GC-FID (Gas Chromatography Flame Ionization Detector: Agilent technology 6890N Network GC system)를 이용하였다. 컬럼은 HP-INNOWax column (30 m x 250 micrometer x 0.25 micrometer, Agilent Technologies)을 사용하였다. 오븐 온도는 50 ℃에서 170 ℃까지, 10 ℃/min으로 설정하여 증가시켰다. 인젝터(Injector)와 디텍터(detector)의 온도는 250 ℃/min 설정하였으며 He 가스를 운반(carrier) 가스로 이용하였다.

그 결과는 도 1 및 도 2에 나타나 있다. 저농도의 헥사노산 에서는 셀 성장에 큰 차이는 보이지 않았으나 8 g/L 이상 헥사노산에서는 유도기가 길어지면서 셀 성장에 저해를 받았다(도 1의 (a)). 한편, 헥사노산 생산량이 많아질수록 배지 내의 pH는 크게 감소하였다(도 1의 (b)). 도 2에서 보면 헥사노산이 4 g/L 이상 존재할 경우, 36 시간에서 헥사노산 농도가 감소하다가 48 시간 이후부터는 증가하는 경향을 보였다. 대조군에서의 헥사노산 생산량은 4.26 g/L였고, 배지 내의 초기 헥사노산 농도가 높을수록, 생산되는 헥사노산 생산량은 감소하였다.

이하 다른 실험예에서 특별히 언급하지 않는 한 실험예 3의 조건과 동일하게 수행하였다.

실험예 4: 초기 pH의 영향

배양배지의 초기 pH가 균주 성장 및 헥사노산 생산에 미치는 영향을 조사하기 위해 pH 5.0부터 8.0까지의 조건에서 미생물을 배양하고 균체 성장량과 헥사노산 생산량을 분석하였다. 분석 방법은 상기 실험예 3과 동일하게 하였다. 그 결과는 도 3에 나타나 있다.

도 3 에서 보는 바와 같이 초기 pH에 따라 두 가지 명확한 차이점을 보였다. 초기 pH 5.5~6.0 조건은 급격한 세포성장을 가져왔지만 24 시간 이후로 급격한 사멸 속도를 보였다. 이와는 반대로 최초 pH 6.5~8.0의 미생물들은 성장에 있어서 유도기가 길었지만 36 시간 이후에서는 미생물 성장 속도가 급격히 증가하면서 pH 6.0~6.5 사이로 유지 되었다. 초기 pH가 높을수록 급격하게 pH가 낮아졌는데 그 이유는 미생물의 성장이 증가하면서 생산되는 산의 양이 축적되어 배지의 pH를 낮아지게 하는 것으로 보였다. pH로 인하여 저해를 받은 미생물들은 성장이 멈추게 되면서 pH가 일정하게 유지가 되었다(도 3). 헥사노산의 최대 생산량은 최초 pH가 7.0인 조건에서 4.39 g/L 였으며, 헥사노산 생성율은 0.24 g 헥사노산/ g 수크로스 였다. Megasphaera elsdenii NCIMB 702410의 각각 다른 초기 pH 조건에서 생선된 최종 생성물의 농도는 도 4에 요약하였다.

실험예 5: 효모 추출물의 영향

효모 추출물은 세균배양 배지에 첨가하는 영양성분으로서 질소화합물, 당, 무기영양소 및 유기영양소 등을 함유하고 있기 때문에 좋은 영양 성분으로 활용되고 있다. 효모 추출물이 탄소원 소비 속도와 헥사노산 생산에 미치는 영향을 조사하기 위하여 각각 다른 농도로 첨가하여 균체 성장속도와 헥사노산 생산량을 조사하였다. 수크로스의 소모를 알아보기 위하여 HPLC ＆ RI detector (Agilent technology 1200)를 이용하여 분석하였다. 컬럼은 Hi-Plex H (300 x 7.7 mm, VARIAN)을 사용하였다. 온도는 65 ℃에서 유동상 물질로서 0.005 M 황산을 사용하였고 속도는 0.5 ml/min으로 설정하였다. 그 결과는 도 5에 나타나 있다.

도 5의 결과를 살펴보면 효모 추출물을 첨가하지 않은 대조군과 비교했을 때 yeast extract 첨가 농도가 높을수록 성장이 빨라지면서 수크로스를 이용하는 속도가 빨라지는 것을 관찰할 수 있었다. Megasphaera elsdenii NCIMB 702410는 탄소원인 수크로스를 직접 이용하여 헥사노산을 생산하기 때문에 yeast extract는 매우 중요한 인자이다. Yeast extract가 전혀 들어가지 않은 대조 군에서는 O.D 값이 최대 3 미만으로 초기에 주입된 수크로스 20 g/L의 상당량을 소비하지 못함으로써 헥사노산 도 1 g/L 미만으로 생산하였다. 헥사노산의 최대 생산량은 10 g/L의 yeast extract가 존재하는 조건에서 4.23 g/L 였으며, 헥사노산 생성율은 0.25 g 헥사노산/ g 수크로스 였다. yeast extract 농도에 따른 acid 생산량은 도 6에 나타내었다.

실험예 6: 아세테이트의 영향

헥사노산 생산에 미치는 아세트산 의 영향을 알아보기 위하여 각각 0, 1, 2, 3, 4, 5 g/L 의 농도로 sodium acetate를 주입하여 헥사노산을 생산하는 실험을 진행하였다. 그 결과는 도 7에 나타나 있다. 도 7에서 보는 바와 같이 주입된 acetate농도가 최소 2 g/L 이상이면 균주 성장량이 증대되는 것을 볼 수 있었다. 이와 함께 생산되는 부티르산의 농도도 증가하면서 헥사노산 생산량도 함께 증가되는 결과를 도 8에서 볼 수 있었다. 헥사노산의 최대 생산량은 5 g/L의 아세트염(acetate)이 존재하는 조건에서 6.82 g/L 였으며, 헥사노산 생성율은 0.37 g 헥사노산/ g 수크로스 였다.

실험예 7: 부티레이트의 영향

헥사노산 생산에 미치는 부티르산 의 영향을 알아보기 위하여 각각 0, 1, 2, 3, 4, 5 g/L 의 농도로 sodium 부티레이트를 주입하여 헥사노산을 생산하는 실험을 진행하였다. 도 9에서 보는 바와 같이 부티레이트의 농도와는 관계없이 균체 성장 속도는 큰 차이가 없었다. Acetate 영향 실험 결과와 비교 하였을 때 buyrate의 영향은 상대적으로 균체 성장량도 적고 대수 증식기에 접어드는데 있어서 지연 시키는 역할을 하는 것을 볼 수 있었다. 이는 부티레이트는 셀 성장과는 관계가 없는 것으로 보였다. 하지만 도 10을 살펴보면 acetate만 존재하는 조건에 비해서 헥사노산 생산량은 더욱 증가하였다. 부티레이트의 첨가로 인하여 미생물의 대사경로가 헥사노산을 생산하는 쪽으로 유도되어 나타난 것이라 생각되었다. 또한 부티레이트의 첨가로 인하여 미생물 발효가 진행되는 과정에서 생산된 산에 대해서 pH완충작용을 함으로써 배지의 pH가 저하되는 것을 방지함으로써 얻어진 결과라고 보였다. 헥사노산의 최대 생산량은 5 g/L의 부티레이트가 존재하는 조건에서 7.61 g/L 였으며, 헥사노산 생성율은 0.44 g 헥사노산/ g 수크로스 였다.

실험예 8: 실시예 1 내지 4의 수크로스 농도에 따른 추출 효율 비교

상기 실시예 1 내지 4에 따라 각각 20g/L(실시예 1), 40g/L(실시예 2), 60g/L(실시예 3) 및 80g/L(실시예 4)으로 초기 수크로스 농도를 달리한 결과, 도 11과 같은 결과를 얻었다. 60 g/L의 수크로스에서 25.83 g/L, 80 g/L의 수크로스 에서 23.33 g/L의 헥사노산 생산량을 얻었다. 80 g/L의 수크로스 의 productivity (0.19 g/L/h) 보다 60 g/L의 수크로스 의 productivity (0.22 g/L/h) 가 높았기 때문에 유가식 발효에서 수크로스 농도는 60 g/L인 것이 더 바람직한 것이다.

실험예 9: 실시예 5 내지 9의 헥사노산 초기 농도에 따른 추출 효율 비교

초기 배지 내의 헥사노산의 농도를 1M (실시예 5), 0.5M (실시예 6), 0.25M (실시예 7), 0.1M (실시예 8), 0.05M (실시예 9) 및 0.01M (실시예 10)로 달리하여 실험한 결과는 도 12에 나타난 바와 같다. 도 12에서 확인할 수 있듯이 헥사노산 농도가 증가할수록, 최종 pH가 높아지면서 배지액 층의 분배계수는 점점 감소하였다. 30 g/L 농도 이상에서는 분배계수가 거의 0에 가까워짐을 알 수 있었다. 헥사노산 58 g/L (0.5M)에서의 분배계수는 0.31 이다.

실험예 10: pH 조절에 따른 추출 효율의 변화

반응기의 pH를 6.0으로 조절한 것을 제외하고는 실시예 6과 동일하게 실험한 결과, 9 시간 이후로 배지액 층에서 hexanoic acid 농도가 5 g/L로 유지되면서 더 이상 추출되지 않은 것을 볼 수 있었다(도 13). 추출된 헥사노산 양은 52.76 g/L 였고 추출 효율을 90.88 %이다. 1시간 후의 분배계수는 0.93으로 앞에서 실험한 헥사노산 농도에 따른 추출 효과 실험(실시예 6)에서의 분배계수 값 0.31에서 3배나 증가한 것을 알 수 있었다.

실험예 11: 실시예 12 및 비교예 1의 유가식 발효에 의한 추출 효율

수크로스를 배양 도중에 첨가함에 따른 추출 효율 변화를 알아본 결과는MES도 14에 도시되어 있다. MES를 넣지 않은 배양기(실시예 12)에서 수크로스 소비 속도가 더 빠르고 헥사노산 생산 속도도 빨랐다. 28일 동안 운전한 결과 생산된 총 헥사노산 농도는 MES 를 넣은 배양기(비교예 1)에서는 58.41 g/L, MES를 넣지 않은 배양기(실시예 12)에서는 74.12 g/L 였다. 회분식 발효에 비해서 생산속도는 느렸지만 수율은 0.58 g/L로 높이는 결과를 얻었다.

Claims

미생물을 이용하여 헥사노산을 생산하는 방법으로서,
헥사노산 생산 균주를 배양하는 동안, 배양액에 헥사노산을 추출하는 유기용매를 가하여 헥사노산을 추출하여 배지로부터 제거하는 것을 포함하는 헥사노산 생산방법.
제1항에 있어서,
상기 방법은,
헥사노산 생산 균주를 배양액에 접종하여 배양시키는 단계;
상기 배양액에 유기용매를 가하는 단계;
상기 유기 용매를 가한 후에 상기 균주를 계속 배양시키는 단계; 및
상기 유기 용매를 제거하여 유기 용매 중의 헥사노산을 수득하는 단계를 포함하는 헥사노산 생산방법.
제1항에 있어서,
상기 방법은,
상기 배양 기간 동안 주기적으로 상기 배양액에 수크로스를 투입하는 것을 더 포함하는 헥사노산 생산방법.
제3항에 있어서,
상기 방법은,
상기 수크로스는 상기 배양액 전체 부피를 기준으로 20g/L 내지 80g/L의 농도로 투입하는 것인, 헥사노산 생산방법.
제1항에 있어서,
상기 유기 용매는,
균주의 성장이 대수 증식기에 접어들 때 배양액에 가하는 것인, 헥사노산 생산방법.
제1항에 있어서,
상기 방법은,
균주의 전체 배양 기간 동안 pH가 6.0 내지 6.5로 유지되는 것인, 헥사노산 생산방법.
제1항에 있어서,
상기 배양액과 유기용매의 부피비는 1:0.1 내지 1:5인, 헥사노산 생산방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 유기용매는 일차 알코올을 포함하는, 헥사노산 생산방법.
제8항에 있어서, 상기 일차 알코올은 탄소수 10 내지 22인 일차 알코올인, 헥사노산 생산방법.
제9항에 있어서, 상기 일차 알코올은 올레일 알코올(oleyl alcohol)인, 헥사노산 생산방법.
제8항에 있어서, 상기 유기용매는 3차 아민(tertiary amine)을 더 포함하는 것인, 헥사노산 생산방법.
제11항에 있어서, 상기 3차 아민은 트리-엔-옥틸아민(Tri-n-octylamine)인, 헥사노산 생산방법.
제11항에 있어서, 상기 일차 알코올과 상기 3차 아민의 부피비는 85~95 : 15~5인, 헥사노산 생산방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 균주는
메가스페라 속 (Megasphaera sp.) 균주인, 헥사노산 생산방법.
제14항에 있어서, 상기 균주는
메가스페라 엘스데니 (Megasphaera elsdenii) 균주인, 헥사노산 생산방법.
제15항에 있어서, 상기 균주는
메가스페라 엘스데니 (Megasphaera elsdenii) NCIMB 702261 또는 메가스페라 엘스데니 (Megasphaera elsdenii) NCIMB 702410인, 헥사노산 생산방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 배양액은 탄소원으로서 수크로스를 포함한 것인, 헥사노산 생산방법.
제17항에 있어서, 상기 배양액은, 효모 추출물을 더 포함하는 것인, 헥사노산 생산방법.
제18항에 있어서, 상기 배양액은 트립토판, 펩톤, 비프 추출물, K₂HPO₄, 시스테인-HCl x H₂O, 염 용액, 헤민(hemin) 용액 및 비타민 K1 용액을 더 포함하는 M-PYS 배지인, 헥사노산 생산방법.
제18항에 있어서, 상기 수크로스는 배양액 전체 부피를 기준으로 20g/L 이상이고 효모 추출물은 배양액 전체 부피를 기준으로 2g/L 이상인, 헥사노산 생산방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 방법은, 배양액 내의 헥사노산 농도를 배양액 전체 부피를 기준으로 8g/L 미만으로 유지시키는 것을 특징으로 하는, 헥사노산 생산방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 방법은, 배양액 내에 아세테이트 및 부티레이트 중 하나 이상을 배양액 전체 부피를 기준으로 2g/L 이상의 농도로 첨가하는 것을 특징으로 하는, 헥사노산 생산방법.