CN115960975A - 一种分离提纯（-）γ-内酰胺的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域，公开了一种分离提纯(‑)γ‑内酰胺的方法。通过调控反应体系中的理化因素，利用筛选得到的产(+)γ‑内酰胺酶菌株高立体选择性降解(±)γ‑内酰胺中的(+)γ‑内酰胺，得到(‑)γ‑内酰胺，进而对(‑)γ‑内酰胺进行分离提纯，以期来满足工业生产的需要。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，本发明涉及一种分离提纯(-)γ-内酰胺的方法。
背景技术
γ-内酰胺酶属于酰胺酶的一种，是催化酰胺类化合物γ-内酰胺酰胺键的一种新型酰胺酶，由于其能选择性降解工业上的(±)γ-内酰胺，因而被命名为γ-内酰胺酶。γ-内酰胺酶包括(+)γ-内酰胺酶以及(-)γ-内酰胺酶，其中(+)γ-内酰胺酶能够高效率动力学拆分外消旋体γ-内酰胺，获得光学纯的(-)γ-内酰胺。光学纯的(-)γ-内酰胺是制备抗病毒药物的手性中间体，是抗艾滋病药物(-)阿巴卡韦和(-)卡巴韦的合成原料，也是抗流感药物帕拉米韦的合成原料。
临床上已知阿巴卡韦的药理活性来源于(-)阿巴卡韦，因而科学工作者们的目光都锁定在了挖掘(+)γ-内酰胺酶上，试图利用(+)γ-内酰胺酶拆分(±)γ-内酰胺，得到的(-)γ-内酰胺，再进行分离提纯，以满足生产需要。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供一种分离提纯(-)γ-内酰胺的方法，该方法主要是利用从海泥中筛选产酶菌株，通过调控反应体系中的理化因素，利用筛选得到的产(+)γ-内酰胺酶菌株高立体选择性降解(±)γ-内酰胺中的(+)γ-内酰胺，得到光学纯的(-)γ-内酰胺，进而对(-)γ-内酰胺进行分离提纯。运用生物酶法进行工业化生产(-)γ-内酰胺，具有反应条件温和，产物光学纯度高，环境友好等优点。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：
一种分离提纯(-)γ-内酰胺的方法，具体包括以下步骤：
(1)微生物发酵产(+)γ-内酰胺酶；
(2)酶液样品制备与浓缩；
(3)固定化酶制备；
(4)生产(-)γ-内酰胺；
(5)分离提纯(-)γ-内酰胺。
本发明与现有技术相比的有益效果是：
本发明提供一种分离提纯(-)γ-内酰胺的方法，该方法主要是利用从海泥中筛选产酶菌株，通过调控反应体系中的理化因素，利用筛选得到的产(+)γ-内酰胺酶菌株高立体选择性降解(±)γ-内酰胺中的(+)γ-内酰胺，得到光学纯的(-)γ-内酰胺，进而对(-)γ-内酰胺进行分离提纯。运用生物酶法进行工业化生产(-)γ-内酰胺，具有反应条件温和，产物光学纯度高，环境友好等优点。本发明对(-)γ-内酰胺进行分离提纯，纯度达到95.62％。
附图说明
图1是(±)γ-内酰胺的转化进程。
具体实施方式
下面通过具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从商业途径获得。
实施例1
(1)微生物发酵产(+)γ-内酰胺酶
选择菌株BH24作为种子，在20～28℃、150～220r/min条件下培养1d获得得种子液。再以体积分数1.0％～3.0％接种量接入装有产酶发酵培养基的发酵罐，装液量20％～35％、培养温度25℃～30℃、转速为150～180r/min、通气量1vvm～3vvm、初始pH5.0～8.0、培养30h～50h后收集发酵液；
产酶发酵培养基：葡萄糖5.0g/L，酵母膏5.0g/L，KH2PO4 7.0g/L，Na2HPO4 2.0g/L，MgSO4 0.4g/L，FeSO40.02 g/L，CaCl2 0.02g/L，NH4Cl 5.0g/L，调节pH7.0。
(2)酶液样品制备与浓缩
将步骤(1)中获得的发酵液低温4℃高速离心，分离并收集菌体，得到的湿菌体经磷酸钠缓冲液(0.05mol/L，pH7.0)洗涤3-5次，将菌体悬于磷酸钠缓冲液中(0.05mol/L，pH7.0)，进行细胞破碎，破碎后12000r/min离心，取上清液为粗酶液，低温储存，备用，将所得的(+)γ-内酰胺酶粗酶液，低温透析浓缩得到浓缩酶液，测定浓缩酶液酶活、计算(+)γ-内酰胺酶回收率；
(3)固定化酶制备
采用戊二醛交联方法，在25℃下交联化，摇床转速为200～250r/min，戊二醛浓度为3％～5wt％，戊二醛溶液与树脂质量比为4：1，交联结束后用去离子水清洗未参加反应的戊二醛分子，防止与酶固定化时发生酶中毒。交联好后的树脂按照树脂1g：25mL酶液进行固定化，一般的条件为：摇床转速220r/min，温度25℃，固定化时间8h，固定化结束后用滤布将满载酶的树脂分离，得到的固定化酶用去离子水清洗三遍去除表面附着的酶；
(4)生产(-)γ-内酰胺
利用步骤(3)中获得的固定化酶无菌转化(±)γ-内酰胺；其中，转化体系的温度为20℃～30℃，搅拌速度为200～250r/min，转化20～50h，得到的(-)γ-内酰胺产物用手性HPLC分析(-)γ-内酰胺的浓度；
(5)分离提纯(-)γ-内酰胺
利用有机溶剂二氯甲烷对产物(-)γ-内酰胺进行萃取，将反应体系放大到500mL～700mL，菌体浓度为40g/L，底物浓度为200g/L，底物分六次添加，反应30h。产物的e.e.值99.14％，转化率为54.82％，对映选择率E值为52.5。用等体积二氯甲烷萃取3次后，通过蒸发结晶，产生的淡黄固体(-)γ-内酰胺，产物的回收率为79.65％。产物经HPLC检测，e.e.值和纯度分别为99.59％和95.62％。
实施例2
(1)微生物发酵产(+)γ-内酰胺酶
选择菌株BH24作为种子，在20～28℃、150～220r/min条件下培养1d获得得种子液。再以体积分数1.0％～3.0wt％接种量接入装有产酶发酵培养基的发酵罐，装液量20％～35％、培养温度25℃～30℃、转速为150～180r/min、通气量1vvm～3vvm、初始pH5.0～8.0、培养30h～50h后收集发酵液；
产酶发酵培养基：葡萄糖5.0g/L，酵母膏5.0g/L，KH2PO4 7.0g/L，Na2HPO4 2.0g/L，MgSO4 0.4g/L，FeSO40.02 g/L，CaCl2 0.02g/L，NH4Cl 5.0g/L，调节pH7.0。
(2)酶液样品制备与浓缩
将步骤(1)中获得的发酵液低温高速离心，分离并收集菌体，得到的湿菌体经磷酸钠缓冲液(0.05mol/L，pH7.0)洗涤3-5次，将菌体悬于磷酸钠缓冲液中(0.05mol/L，pH7.0)，进行细胞破碎，破碎后12000r/min离心，取上清液为粗酶液，低温储存，备用，将所得的(+)γ-内酰胺酶粗酶液，低温透析浓缩得到浓缩酶液，测定浓缩酶液酶活、计算(+)γ-内酰胺酶回收率；
(3)固定化酶制备
采用戊二醛交联方法，在25℃下交联化，摇床转速为200～250r/min，戊二醛浓度为3％～5％，戊二醛溶液与树脂质量比为4：1，交联结束后用去离子水清洗未参加反应的戊二醛分子，防止与酶固定化时发生酶中毒。交联好后的树脂按照树脂1g：25mL酶液进行固定化，一般的条件为：摇床转速220r/min，温度25℃，固定化时间8h，固定化结束后用滤布将满载酶的树脂分离，得到的固定化酶用去离子水清洗三遍去除表面附着的酶；
(4)生产(-)γ-内酰胺
利用步骤(3)中获得的固定化酶无菌转化(±)γ-内酰胺；其中，转化体系的温度为20℃～30℃，搅拌速度为200～250r/min，转化20～50h，得到的(-)γ-内酰胺产物用手性HPLC分析(-)γ-内酰胺的浓度；
(5)分离提纯(-)γ-内酰胺
利用有机溶剂二氯甲烷对产物(-)γ-内酰胺进行萃取，将反应体系放大到500mL～700mL，菌体浓度为40g/L，底物浓度为200g/L，底物分六次添加，反应30h。产物的e.e.值96.85％，转化率为52.64％，对映选择率E值为50.8。用等体积二氯甲烷萃取3次后，通过蒸发结晶，产生的淡黄固体(-)γ-内酰胺，产物的回收率为76.89％。产物经HPLC检测，e.e.值和纯度分别为97.82％和92.73％。
实施例3
(1)微生物发酵产(+)γ-内酰胺酶
选择菌株BH24作为种子，在20～28℃、150～220r/min条件下培养1d获得得种子液。再以体积分数1.0％～3.0wt％接种量接入装有产酶发酵培养基的发酵罐，装液量20％～35％、培养温度25℃～30℃、转速为150～180r/min、通气量1vvm～3vvm、初始pH5.0～8.0、培养30h～50h后收集发酵液；
产酶发酵培养基：葡萄糖5.0g/L，酵母膏5.0g/L，KH2PO4 7.0g/L，Na2HPO4 2.0g/L，MgSO4 0.4g/L，FeSO40.02 g/L，CaCl2 0.02g/L，NH4Cl 5.0g/L，调节pH7.0。
(2)酶液样品制备与浓缩
将步骤(1)中获得的发酵液低温高速离心，分离并收集菌体，得到的湿菌体经磷酸钠缓冲液(0.05mol/L，pH7.0)洗涤3-5次，将菌体悬于磷酸钠缓冲液中(0.05mol/L，pH7.0)，进行细胞破碎，破碎后12000r/min离心，取上清液为粗酶液，低温储存，备用，将所得的(+)γ-内酰胺酶粗酶液，低温透析浓缩得到浓缩酶液，测定浓缩酶液酶活、计算(+)γ-内酰胺酶回收率；
(3)固定化酶制备
采用戊二醛交联方法，在25℃下交联化，摇床转速为200～250r/min，戊二醛浓度为3％～5％，戊二醛溶液与树脂质量比为4：1，交联结束后用去离子水清洗未参加反应的戊二醛分子，防止与酶固定化时发生酶中毒。交联好后的树脂按照树脂1g：25mL酶液进行固定化，一般的条件为：摇床转速220r/min，温度25℃，固定化时间8h，固定化结束后用滤布将满载酶的树脂分离，得到的固定化酶用去离子水清洗三遍去除表面附着的酶；
(4)生产(-)γ-内酰胺
利用步骤(3)中获得的固定化酶无菌转化(±)γ-内酰胺；其中，转化体系的温度为20℃～30℃，搅拌速度为200～250r/min，转化20～50h，得到的(-)γ-内酰胺产物用手性HPLC分析(-)γ-内酰胺的浓度；
(5)分离提纯(-)γ-内酰胺
利用有机溶剂二氯甲烷对产物(-)γ-内酰胺进行萃取，将反应体系放大到500mL～700mL，菌体浓度为40g/L，底物浓度为200g/L，底物分六次添加，反应30h。产物的e.e.值97.53％，转化率为53.69％，对映选择率E值为51.7。用等体积二氯甲烷萃取3次后，通过蒸发结晶，产生的淡黄固体(-)γ-内酰胺，产物的回收率为77.38％。产物经HPLC检测，e.e.值和纯度分别为98.49％和93.95％。
以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的全部实施例。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。
Claims (5)
1.一种分离提纯(-)γ-内酰胺的方法，其特征是，通过菌株BH24发酵生产的产(+)γ-内酰胺酶，制备固定化酶，利用固定化酶无菌转化(±)γ-内酰胺，对产物(-)γ-内酰胺进行分离提纯。
2.如权利要求1所述的菌株BH24登记于中国普通微生物菌种保藏管理中心，登记号：NR114581。
3.如权利要求1所述的菌株BH24筛选于渤海海泥，通过双层平板法进行初筛、复筛所得。
4.如权利要求1所述的一种分离提纯(-)γ-内酰胺的方法，其特征是，所述制备固定化酶是采用戊二醛交联方法，其中戊二醛浓度为3～5wt％，戊二醛溶液与树脂质量比为4：1，交联结束后用去离子水清洗未参加反应的戊二醛分子。
5.如权利要求2所述的一种分离提纯(-)γ-内酰胺的方法，其特征是，转化体系的温度为20℃～30℃，搅拌速度为200～250r/min，转化20～50h。
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