JPS6192596A - 固定化酵素もしくは固定化微生物による光学活性インドリン−２−カルボン酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分身） 本発明は、固定化酵素あるいは固定化微生物を用いて、
インドリン−２−カルボン酸エステルを光学分割し、医
薬品として有用な光学活性インドリン−２−カルボン酸
を製造する方法に関する。

更に詳しくは、一般式ｌ （式中、几はＣ雪〜Ｃ８の脂肪族炭化水素基を表わす） で表わされる（Ｒ，８）−インドリン−２−カルボン酸
エステルＩと、担体に固定化された立体選択的エステラ
ーゼ活性を有する酵素もしくは微生物とを接触、反応さ
せて、不斉加水分解を行い、式（式中、峯は不斉炭素を
表わす） で表わされる光学活性インドリン−２−カルボン酸と、
弐Ｉ＊ （式中、Ｒは０２〜Ｃ８の脂肪族炭化水素を表わす） で表わされる光学活性インドリン−２−カルボン酸エス
テルを生成させ、固定化に用いた担体との親和性の差を
利用して、親水性のインドリン−２−カルボン酸を水ま
たは級街液で回収、採取し、次に、折体に吸着・結合し
ているインドリン−２−カルボン酸エステルを有機溶剤
で溶出、採取する方法に関する。即ち、不斉加水分解反
応と、生成物インドリン−２−カルボン酸の反応液から
の分離、回収を同時に行うことを特徴とするインドリン
−２−カルボン酸の製造方法に関する。

本発明の場合、立体選択的二ステラーゼを活性を有する
酵素あるいは微生物を選択することにより不斉加水分解
生成物として（Ｒ）−インドリン−２−カルボン酸と（
８）−インドリン−２−カルボン酸エステル、あるいは
その逆の（Ｓ）−インドリン−２−カルボン酸と（Ｒ）
−インドリン−２−カルボン酸エステルの組合わせの生
成物を得ることができ、各光学活性体を随時採取するこ
とができる。

これら光学活性インドリン−２−カルボン酸類化合物は
種々医薬品の原料となりつる重要な化合物である。例え
ば（Ｓ）−インドリン−２−カルボン酸はアンジオテン
シンＩ変換酵素の阻害剤として有用な血圧降下剤（Ｓ）
　−１−Ｃ（８）　−３−メルカプト−２−オキソプロ
ピル〕−インドリンー２−カルボン酸 構造式： ％式％ 等に利用できる。〔文献　Ｊ、Ｈｅｄ、　Ｏｈｅｍ、　
、　２６　＊８９４　（１９８Ｂ）〕 （従来の技術と問題点） 従来、酵素反応は遊石の酵素を反応器に加え、回分法で
反応が行われ、反応終了後、酵素は使いすてにされてい
たが、酵素は一般的に高価であるためコスト的に不利と
なり、また不安定でもあるため酵素の工業的利用は限ら
れていた。さらに回分法ては酸素反応終了後、反応生成
物を反応液から分数する方法として、 １）有機溶媒で抽出分ダする方法。

２）反応液を一旦有機溶媒に転溶した後、又は反応液を
そのままカラムクロマトグラフィー処理することによっ
て分離する方法。

８）反応液を一旦有機溶媒に転溶した後、又は反応液を
そのまま分留する二とによって分離する方法。

などが行われてきたが、操作が繁雑で収率が悪かったり
、時間がかかったり、特別の装置が必要であったりして
コストか高くなるという欠点があった。

これらの酵素の回分法による使いすて、生産物の回収方
法等の問題点を解決するため、近年、酵素や微生物の固
定化が研究され、酵素や微生物のくり返し使用、さらに
はカラムに充填して連続的に反応を行うことも可能とな
ってきた。しかし、固定化酵素を用いてセラミ体を原料
として不斉加水分解と同時に反応生成物を分離し、更に
それを連続的に行って成功した例はこれまで報告されて
いない。

（問題点を解決するための手段及び作用効果）本発明者
らは、さきに、インドリン−２−カルボン酸エステル■
に作用し、光学活性インドリン−２−カルボン酸■来と
光学活性インドリン−２−カルボン酸エステルＩ＊とに
立体選択的に分割する酵素、あるいは微生物を見出し、
光学分割によるインドリン−２−カルボン酸の製造方法
を見出して提案している。

本発明者らは、これら酵素あるいは微生物の固定化と、
より簡便な生成物の分離技術を確立すべく鋭意努力を重
ねてきた。その結果、担体として、基質と生成物に対し
て親和性に差がある担体を選択し、該担体で酵素あるい
は微生物を固定化することによって、基質インドリン−
２−カルボン酸エステルの加水分解と、生成物インドリ
ン−２−カルボン酸の分離、回収とを同時に行うことに
成功し、本発明を完成した。以下、本発明の詳細な説明
する。

本発明の基質として用いられる、一般式で表わされるイ
ンドリン−２−カルボン酸エステルは、置換基孔がＣ２
〜Ｃ８の脂肪族炭化水素基の化合物であり、好ましくは
エチル、ブチル、アミル、ヘキシル基からなるエステル
である。またで表わされる（１．８）−インドリン−２
−カルボン酸に溶媒と反応試剤とを兼ねたアルコールを
加え、インドリン−２−カルボン酸の濃度５〜２０％（
Ｗ／Ｖ）の範囲で、強酸性下、５０℃〜還流温度の範囲
で１〜５時間間抜反応を行う。更に、この反応液をｐＨ
７，０に調整後、減圧濃縮により週刊のアルコールを除
去する。濃縮液に水又は飽和重炭酸ソーダを加え、酢酸
エチル又はヘキサン等のような疎水性有機溶媒を用いて
抽出し、更に濃縮すれば高純度の（Ｒ，８）−インドリ
ン−２−カルボン酸エステルＩが得られる。

本発明に＄いて、構造式（Ｒ）−ｎ で表わされる光学活性（Ｒ）−インドリン−２−カルボ
ン酸を生成させる場合、酵素としてはビオフラーゼＡＬ
−１５（起源；バチルス・サブチリスＢａｃｉｌｌｕｓ
　５ｕｂｔｉｌｉｓ　、長潮産業■！！１）、プロテア
ーゼ［アマノＪＰ（起源；アスペルギルス・メレウスＡ
ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｍｅｌｌｅｕｓ、大野製薬■製
）、ステアプシン（起源；豚膵臓、和光純薬■製）、膵
臓性消化酵素ＴＡ（大野製薬■製）、リパーゼｋ　Ｌ　
−８１２６（起源；豚膵臓、シクマ社製）等が使用でき
る。

更に微生物としてはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、
あるいはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）　
属等ｔｃ属する微生物があり、更に詳しくはバチルス・
サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）　
Ｉ　ＰＯ８０１Ｂ或いはアスペルギルス・メレウス（Ａ
ｓｐｅｒｇｉ　ｌｌｕｓｍｅｌｌｅｕｓ）　ＩＦＯ４４
２０がある。

又、構造式（８）　−ｎ で表わされる光学活性（８）−インドリン−２−カルボ
ン酸（８）−１１を生成させる場合、酵素としては例え
ばリポプロティン　リバーゼアマノ３（ＬＰＬ、起源；
シュードモナス・アエルギノサ（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、大野製薬ｕｐｉやリパー
ゼＡＰ−４及びリパーゼＡＰ−６（起源；アスペルギル
ス−ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）　
。

大野製薬Ｈ製）等を使用することができる。

微生物を用いて（８）−ＩＩを生成させる場合、例えば
シュードモナス６４　（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）或い
はアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）　属等に
属する微生物があり、更に詳しくはシュードモナス・ア
エルギ／　４Ｊ−（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕ
ｇｉｎｏｓａ）　Ｉ　ＦＯ８０８０、ＩＦｏ　　１８１
８０やアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓ　ｎｉｇｅｒ）　ＩＦＯ４４０７がある。

これら微生物の菌体を得るには、栄養源として通常資化
しうる炭素源、窒素源、ビタミン及びミネラルを適宜配
合したもの、たとえばグルコース、ペプトン、ｒｎｍエ
キス、肉エキス等からなる栄養培地が用いられる。培養
は、温度１０〜４０℃、好ましくは２５〜８５℃で、ｐ
Ｈは８〜８、好ましくは６〜７であり、好気的に培砲し
、通常２４〜４８時間行えばよい。こうして得られた菌
体は遠心分類あるいはｐ過等の処理で集菌し、そのまま
崩脂で固定し、固定化菌体とするが、微生物菌体を破砕
後、硫安分画やアセトン処理して得られる粗酵素として
から固定化して固定化酵素として使用することができる
。

酵素あるいは微生物固定化用担体としては、疎水性をも
つ種々の担体が用いられる。疎水性をもつ担体とは、水
もしくはＨｅｒ液中では不斉氷解反応によって生成した
親水性化合物■”を吸着せず、エステル化合物Ｉ”を疎
水的相互作用によっテ吸着し、さらにこの１吸着してい
るエステル化合物Ｉ“は低極性溶媒中では速やかに脱着
するような性質をもつ担体であることが望ましい。更に
具体的な担体としては、例えば疎水性をもつ合成吸着剤
、疎水クロマトグラフィー用樹脂、疎水性を持つ光架橋
性樹脂、疎水性のウレタンプレポリマー樹脂、疎水基を
化学結合させて心入した高分子物質等が挙げられる。

かかる担体への酵素の固定化は、公知の種々の方法によ
って行うことができろ。例えば物理的吸着法、共有結合
法、イオン結合物、架橋法、包括法等が挙げられる。微
生物の場合にも包括法等が挙げられる〔福井・子細・鈴
木編、酵素工学、１５７−２４８頁、閘談社（１９８１
）；　子細一部組、固定化酵素、ε１４談社（１９７５
））。　これらの固定化酵素或いは固定化微生物の調製
法のうち、方法の簡便さ、担体の物理的強度及び安価さ
などにより、酵素では疎水性を持つ合成吸着剤に酵素を
物理的に吸着させる方法、微生物では疎水性を持つ光架
橋性樹脂或いは疎水性のウレタンプレポリマー樹脂に微
生物菌体を包括する方法が工業的に望ましい。

酵素或いは微生物の担体への担持量は、担体の担持能に
よって左右されるので、必ずしも一義的ではないが、酵
素では担体の１ｉｉｔ　Ｉｉ当り約０、１　ｍＪ乃至約
１００ｍ、ｐ、通常的１ｍ、９乃至約２０　ｍ、７程度
であれはよく、微生物菌体では担体の湿ｌ【量ＩＩ当り
湿菌体０．１ｙ乃至Ｉ１１通幇約０．１６．５１乃至約
０．５１程度であればよい。

本固定化酵素或いは固定化微生物に負荷できる基質の電
としては、固定化した担体によって変わるが、基質を負
荷した時に未反応の基質が遊離する限界ｋまで可能であ
る。例えば合成吸着剤アンバーライｌ−Ｘ　Ａ　Ｔ）　
−７を担体とした固定化酵素をカラムに充填した場合、
そのカラム容積の１７８ｆｆｌｔでの基質を負荷するこ
とが可能である。

化合物Ｉの水Ｉこ対する溶解度は一般に低いが、例えば
アセトン、メタノール等の有様溶媒や界面活性剤等を反
応に支障とならない程度加えても良い。

固定化酵素もしくは固定化微生物を用いて不斉加水分解
を行う場合、反応温度は通常１０〜６０℃の範囲で可能
であるが、２０〜４０℃で行うことが好ましい。本不斉
加水分解反応はｐＨ４，５〜ｐＩ１１０の範囲で可能で
あるが、反応速度が大であるｐＥＩ６〜ｐＨ８，５の範
囲で行うことが望ましい。また本反応では不斉加水分解
の進行に伴いインドリンカルボン酸を生じｐＨが低下す
る。そのため基質化合物の負荷量が多いときには、緩衝
液を使用するなどしてｐＨを一定の範囲内に制御するこ
とが望ましい。この目的に適する緩衝液としては無機酸
塩、有機酸塩いずれの緩衝液も使用することができる。

カラムを用いて反応を行う場合、固定化酵素或いは固定
化微生物をカラムに充填し、まず緩衝液を流し、次に基
質のエステル化合物（Ｒ，８）−Ｉを負荷し、負荷し終
わったら再び緩衝液を流すことによってカラム内で不斉
加水分解反応を行う。

生成する親水的な化合物■　はａ衝液に溶けてカラムか
ら溶出される。この緩衝液画分を高速液体クロマドグ９
フイー（Ｆｉｎｅｐａｋ　８ＩＬ　　０１Ｂ　。

展開液；アセトニトリル：水＝　１．５　：　１　（ｖ
／ｖ）、検出ｓ　Ｕ　Ｖ　　２１５７１＋１！　）によ
り分析し、両分中に化合物■８がほとんど認められなく
なった時点で゛ａ街液にかえて低極性溶媒を流し、カラ
ム内の固定化酵素或いは固定化微生物に吸着している未
反応の化合物Ｉ＊を溶出する。この溶媒画分を液体クロ
マトグラフィー（条件上と同じ）で分析し、両分中に化
合物Ｉ”がほとんど認められなくなれば、低極性溶媒に
かえて再び緩衝液を流すことによってカラム内を緩衝液
で置換し、基質のエステル化合物（Ｒ，８）−Ｉを負荷
する。これらの一連の操作をくり返すことによって化合
物（Ｒ，８）−Ｉの不斉加水分解と反応生成物の分取を
パルス的に連続して行うことが可能である。

本固定化酵素或いは固定化微生物を用いて回分法でラセ
ミ体化合物Ｉの不斉加水分解を行う場合には、生成する
光学活性な親水性化合物■”を含む水層と光学活性な疎
水性化合物Ｉ”を吸着している固定化酵素或いは固定化
微生物とを濾過もしくはゆるやかに遠心することによっ
て分離し、さらに低極性溶媒で固定化酵素或いは固定化
微生物を洗浄することによって化合物工”を得ることが
でき、固定化酵素或いは固定化微生物は再び反応に用い
ることができる。

本発明において疎水性の化合物Ｉ”を溶出するのに用い
る低極性溶Ｗｌは、固定化酵素の場合、担体に吸着して
いる酵素を脱着しない溶媒であって、米 かつ親水性化合物口　は殆んど溶解せず、一方疎水性の
化合物Ｉ”はよく溶解する溶媒が望ましい。

そのような溶媒としては、例えばベンゼン、トルエン、
キシレンのような芳香族炭化水素溶媒、ｎ−ヘキサン、
ｎ−へブタン、ｎ−オクタンのような脂肪族炭化水素溶
媒、シクロペンタン、シクロヘキサン、シクロヘプタン
のような脂環式炭化水素溶媒又はこれらの混合溶媒が好
適な溶媒として挙げられる。固定化微生物の場合にもま
ったく同様の溶媒を用いることができる。

固定化酵素、あるいは固定化微生物を用いた反応液から
のインドリン−２−カルボン酸、及びインドリン−２−
カルボン酸エステルの精製、採取は以下のようにすれば
よい。光学活性インドリン米 −２−カルボン酸■　を含む緩衝液画分を硫安で飽和後
、ｐＨを５．０付近に調整し、■“を酢酸エチル、塩化
メチレン等の有機溶媒で抽出することにより高純度の光
学活性化合物■”を得ることができる。必要に沁じて、
さらにアセトン等の有機溶媒中で晶析してもよい。

、疎水性溶媒中に回収された光学活性インドリン−２−
カルボン酸エステルは、そのまま濃縮すれば高光学純度
のエステル体で得られるが、更に次のようにして光学活
性インドリン−２−カルボン酸とすることかできる。即
ち、光学活性インドリン−２−カルボン酸エステル（８
）　−Ｉ又は（Ｒ）−１を室温下、ｐＨ１Ｏ〜１８．５
の範囲で２〜５時間アルカリ加水分解を行えば、各々（
８）　−ＩＩ又は（Ｒ）　−ｎが生成する。また、（８
）　−Ｉまたは（Ｒ）−■を加水分解する能力を有する
酵素、例えば（８）−■に対しては、リボプロティン　
リバーゼアマノ３を、一方（Ｒ）　−Ｉに対してはステ
アプシンを作用させて加水分解を行えば、各々（８）　
−ＩＩ又は（几）−ＩＩを得ることができる。

このようにして得られた加水分解液は、１）Ｈを４〜６
、好ましくは５．０付近に調整後、塩化メチレン、酢酸
エチル等の有機溶媒で抽出し、濃縮後、アセトン等の有
機溶媒中で晶析することにより高光学純度の（８）　−
ｎ又は００〜■を得ることができる。

（実施例） 以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発
明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１ （Ｒ，８）−インドリン−２−カルボン酸アミルの製造 （Ｒ，８）−インドリン−２−カルボン酸　（Ｉｔ。

８）−Ｉｆ　　５０，９をアミルアルコール５００ｍｌ
に溶解し、更に濃塩酸１００　ｍｊ’を添加し、９５〜
１００℃の範囲で８時間、縮合反応を行った。

反応後、一旦冷却してから１０％苛性ソーダ液でｐＨを
７．０に調整した。更に堝刺几のアミルアルコール及び
水を減圧濃縮換作により除去した。濃縮液中には、目的
物の（几、８）−インドリン−２−カルボン酸アミル　
（几ｌ５）−Ｉａ及び；俸（ｊト塩が含まれている。こ
の濃縮液に【１゛ト酸エチルｌｌを加え、飽和重炭酸ソ
ーダ水２００ｍＪで２回（計４００ｔｎｊ’）洸１）後
、酢酸エチル層を濃縮したところ（Ｒ，８）−Ｉ　ａが
６０．８，９，８５％の収率で得られた。

実施例２ （Ｒ）−選択的エステラーゼ活性を有するリパーゼ（ス
テアプシン）（和光補薬■製）ＩＬＳ’を１）Ｈ７，０
（７）０．１Ｍリン酸緩衝液１００ｍ１！に加えて混和
し、θ５過によって不溶物を除いた。Ｆ液にローム・ア
ンド・ハース社製メタクリレート系多孔質吸Ｓｔ剤アン
バーライトＸＡＤ−７をメタノールと水でｌ’Ｌ１ヤ後
、湿重母６０ｙ（含水率７１％）を加え、低温室（４℃
）で−夜ゆっくり撹拌し、酵素を吸Ｎ固定化した。固定
化酸素懸濁液をグラスフィルターを用いて吸引濾過し、
さらにｐＩＩＩ７．０の０．１Ｍリン酸ｆｋ　＆ｉ液１
００ｍｊ？で８回洗浄後、吸引濾過して湿潤固定化酵素
を得た。この固定化リパーゼを内径２．２−のカラムに
高さ１５ｃｍに充填し、３８℃に保温してラセミ体のイ
ンドリン−２−カルボン酸アミル　（Ｒ１）−Ｉａ　　
５Ｉを負荷し、ｐＨ７，０の０．１　Ｍ　！Ｊン酸緩街
液を毎時６ｍ／の流速で流して反応させた。カラムから
の溶出液を１２ｍＪずつフラクションコレクターで分取
し、液体クロマトグラフィーで分析した。

このリン酸緩衝液画分には、不芥加水分解され生成した
親水的なインドリン−２−カルホン酸のみが含まれてい
た。該リン酸龜街液の１分１８０ｒｎＪに飽和になるま
でａ酸アンモニウムを加え、更にｐＨを６．０に調整し
た。次に等ＤｉのＭ’ｔ＝Ｆエチルを加え、８口膣イン
ドリンー２−カルボン酸を抽出し、脱水後、減圧濃縮し
、乾固物をアセトン−ヘキサン（５ｍＪ−１ｍＪ）で再
結した。真空で屹メチルホルムアミド（以下Ｄ　ＡＸ　
Ｆ　Ａという）〕（文献値、Ｄ、Ｈ，Ｒｉｍ　ｅｔ　ａ
ｉ！、　　Ｊ、　Ｍｅｄ、Ｃｈｅｍ、　。

０．９１　、ＤＭＦＡ））を有する白色の粉末（Ｒ）−
インドリンー２−カルボン酸（Ｒ）　−１１か１．２６
，９［（Ｒ，８）−Ｉａよりの収率７２％〕得られた。

リン酸緩衝液を１８０ｍＪ流した時点で、　リン酸緩衝
液にかえでへキサンを毎分り、Ｏｍ／の流速で流し、カ
ラム内の固定化醇素の担体に吸着していた未反応の疎水
的なインドリン−２−カルボン酸アミルを溶出した。カ
ラムからの溶出ヘキサン溶液を１０ｍｊ’ずつフラクシ
ョンコレクターで分取し、インドリン−２−カルボン酸
アミルを含む画（Ｃ＝１．０．エタノール）を有するシ
ロップ（８）−１ａが２．８８ＩＣ（Ｒ，５）−Ｉａか
らの収率９５％〕得られた。得られた（８）−Ｉａ　　
２．８８ｙにＩＮ苛性ソーダ１５ｍ１！加え、室温１約
８時間加水分解を行い、反応液をＩＮ塩酸でｐＨ５，０
に調製後、ｆ作酸エチル１５ｍＪで４回抽出操作を行っ
た。缶水硫酸ソーダで脱水処理後、減圧濃縮し、乾固物
をアセトン−ヘキサン（６ｍＪ−１ｍＩりＤＭＦＡ）を
有する白色の粉末（Ｓ）−インドリン−２−カルボン酸
　（８）　−Ｉｆが１．２３１　Ｃ（Ｒ，８）−Ｉａよ
りの収率　７０％〕得られた。なお、上記リン酸緩衝液
セよびヘキサンによる溶出において酵素の脱着は認めら
れなかった。

実施例８ 実施例２にたいて使用した固定化ステアプシン充填カラ
ムに１）Ｈ７，０の０．１Ｍリン酸緩衝液５０ｍ１！を
流してから実施例２と同様にしてラセミ体のインドリン
−２−カルボン酸アミル（１，８）−Ｉａ　　６．Ｆを
負荷し、リン酸緩衝液による反応および生成するカルボ
ン酸の溶出ならびにヘキサンによる未反応エステルの溶
出を行った。さらＩこ乙の一連の反応、溶出操作を２０
回くり返し連続して行い、毎回リン酸緩衝液画分とヘキ
サン溶出画分とを実施例２と同様の操作で処理した。そ
の結−３８，１°（ｃ＝ｔ、ｏ　、ＤＢ（ＦＡ）を有す
る（Ｒ）−インドリン−２−カルボン酸（Ｒ）−Ｕを１
．２１、Ｆ　〜１．２７ｇＣ（Ｒ，８）−Ｉａよりの収
率　６９〜７８％〕の範囲で得た。また各回のヘキサン
溶ＤＭＦＡ）を有する（８）−インドリン−２−カルボ
ン酸（Ｓ）−■を１．１８，９〜１．２４．Ｆ［、（Ｒ
，８）−４ａからの収率６８％〜７１％〕の範囲で得た
。

実施例４ 実施例２において、酵素を（８）選択的エステラーゼ活
性をもつリポプロティン　リバーゼアマノ８（ＬＰＬ）
にかえてアンバーライトＸＡＤ−７に同様に固定化した
。この固定化ＬＰＬを内径２、２　ｃｍのカラムに高さ
１５ｃｍに充填し、以下実施例２及び実施例８と同様の
抄作を行い、インドリン−２−カルボン酸アミル（Ｒ，
８）−Ｉ　ａの不斉加水分解と生成物の分離を１０回く
り返して行った。その結果、各回のリン酸緩衝液画分か
ら、有する（８）−インドリン−２−カルボン酸（８）
−収率７２％〜７６％〕の範囲で得た。また各回の（ｃ
ｍ　１．０　、ＤＭＦＡ）を有する（Ｒ）−インドリン
−２−カルボン酸（几）−ｎをｔ、ｏａｇ〜１．１１、
Ｆ［１，（Ｒ，５）−ｉａからの収率５９％〜６４％〕
〜 の範囲で得た。

実施例５〜８ 実施例２において、酵素及び基質のエステルを変えて実
施例２と同様の操作を行い、表１の結果を得た。基質の
負荷虻はすべて５Ｉｉである。

表　　１ （ＣＡＩｌ＋’ン８ 実施例９ 実施例２において、アンバーライトＸＡＤ−７のかわり
に三菱化成工業■製の合成吸着剤ダイヤイオンＨＰ　　
２ＭＧを用い、操作は実施例２と同様にして固定化リパ
ーゼ（ステアプシン）を調製した。この固定化リパーゼ
を内径２．２αのカラムに高さ１５ｃｍに充填し、イン
ドリン−２−カルボン酸アミル（Ｒ，８）−工ａ　　５
ｇを負荷し、　以下実施例２と同様の操作を行い、不斉
加水分解と生成物の分臼［を行った。その結果、リン酸
Ｍ街液画ＤΔ（ＦＡ）を有する（ＩＩＬ）−インドリン
−２−カルボンｅ（Ｒ）−１１１，２５Ｉｉを得た。　
またヘキサン１．０．Ｄ入１ＦＡ）を有する（８）−イ
ンドリン−２−カルボン酸　（８）−■　１．１７．９
を得た。

実施例１０ 下記の組成からなる栄養液体培地を調製し、２１坂ロフ
ラスコに４００　ｍｌずつ分注後、１２０℃、１５分殺
Ｃ百した。

〔培地組成〕

グルコース４％、イーストエキス０．３％、因エキス０
．８％、ペプトン０．８％、リン酸ニアンモニウム０．
２　％　、リン酸−カリウム０，１％（ｐＨ６，８）こ
れとは別に同じ組成の培地にて前培養をしたシュードモ
ナス命アエルギノサ（ｐｓｅｕａｏｍｏｎａｓａｅｒｕ
ｇｉｎｏｓａ）　ＩＦＯ８０８０のｌ液１０ｍ１！を前
培養培地に接種し、３０℃、２４時間抜とうを行った。

合計５本培養し、培養波計２１を得た。

この培養液を遠心し、菌体を集めた。この湿菌体２０．
９を２０ｍＭリン酸ｔＳ、−ＦＪ液（ｐＨ７，０）４０
ｍＪに懸濁し、それにウレタンプレポリマーＰＵ−８（
東洋ゴム工業鞠１ν）２０ｇを加え、４０℃にてすばや
く撹拌後４℃に冷却し、８０分間放ｔ１λした。こうし
て得られた固定化微生物を約２闘角に切断し、内径２．
２　ｃｍのカラム番こ高さ１５ｃｍに充填し、３８℃に
保温してｐＨ７，０の０．１八■リン酸緩衝液を５０ｒ
ｎ／流してから基質インドリン−２−カルボン酸アミル
（Ｒ，８）−Ｔａ　　４．Ｆを負荷した。ｐＨ７，０の
０．１　Ｍリン酸緩衝液を毎時４ｍ／の流速で流し不斉
加水分解反応を行わせ、カラムからの溶出液を１２ｍ１
！ずつフラクションコレクターで分取し、液体クロマト
グラフィーで分析した。このリン酸綴街斂画分には不斉
加水分解され生成した親水的なインドリン−２−カルボ
ン酸のみが含まれていた。このリン酸緩衝液の画分１８
０ｎ１１！　に飽和になるまで硫酸アンモニウムを加え
、虹にｐＨを５．０に調整し、等量の酢酸・エチルで８
同核インドリンー２−カルボン酸を抽出した。酢二チ層
を分離し、脱丞後、減圧濃縮し、乾固物をアセトン−ヘ
キサン（５ｒｎＩ！−１ｍＩりで再結しく　Ｃ＝　１．
０　、ｎＭｉｒＡ）を有する（８）−インドリン−２−
カルボン酸（８）　−Ｉｉが０．８９Ｊ得られた。

リン酸緩衝液を１８０ｍＪ流した時点で、リン酸緩衝液
に変えてヘキサンを毎分１．０　ｍｌの流速で流し、カ
ラム内の固定化微生物の担体に吸着していたインドリン
−２−カルボン酸アミルを溶出した。ヘキサン溶液を１
０ｍ／ずつフラクションコレクターで分Ｊｌ、インドリ
ン−２−カルボン酸アミルを含む両分８０ｍ１！を濃縮
し、比旋光度るシロップ００−インドリン−２−カルボ
ン酸アミル（Ｒ）−Ｉａが１．１５１　？Ｇ　ラｔ１．
り。

得られた（Ｒ）−Ｉａ　　１．１５．ｐｌｃＩＮ苛性ソ
ー苛性ソータ１如 反応液をＩＮ塩酸でｐＨ５．０に調整後、酢酸エチルｔ
ｏｍＩ！で４回抽出操作を行った。脱水処理後、減圧濃
縮し、乾固物をアセトン−ヘキサン（２．６ｍｌ！−　
０．　５　ｍｌり　テ再結ｔ　ルト比ｙｚ光ｉ　〔α，
！６−２１．７°（Ｃ冨１．０，ＤＭＦム）を有する（
Ｒ）−インドリ７−２−カルボン酸（Ｒ）　−　ＩＩが
ｏ．５８Ｉ得られた。

実施例１１．１２ 菌株を変えて、実施例１Ｏと同様の操作により、固定化
、不斉加水分解と分ｎＬ，生成物の分析を行い、表２に
示す結果を得た。基質は（Ｒ．８）−Ｉａを４Ｉ負荷し
た。

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. （１）一般式■ ▲数式、化学式、表等があります▼■ （式中、ＲはＣ＿２〜Ｃ＿８の脂肪族炭化水素基を表わ
   す） で表わされる（Ｒ，Ｓ）−インドリン−２−カルボン酸
   エステルと、疎水性の担体に固定化された立体選択的エ
   ステラーゼ活性を有する固定化酵素もしくは固定化微生
   物とを接触、反応させて、構造式■＾＊ ▲数式、化学式、表等があります▼■＾＊ で表わされる光学活性インドトン−２−カルボン酸と、
   構造式■＾＊ ▲数式、化学式、表等があります▼■＾＊ （式中、ＲはＣ＿２〜Ｃ＿８の脂肪族炭化水素基を表わ
   す） で表わされる光学活性インドリン−２−カルボン酸エス
   テルとに不斉加水分解し、親水性のインドリン−２−カ
   ルボン酸■＾＊を水または緩衝液で回収、採取後、固定
   化用担体に吸着・保持されているインドリン−２−カル
   ボン酸エステル■＾＊を低極性有機溶剤で溶出、採取す
   ることを特徴とする光学活性インドリン−２−カルボン
   酸の製造方法。
2. （２）不斉加水分解をカラムに充填した固定化酵素もし
   くは固定化微生物で行う特許請求の範囲第１項記載の製
   造方法。
3. （３）不斉加水分解を回分式で行う特許請求の範囲第１
   項記載の製造方法。
4. （４）酵素あるいは微生物のエステラーゼ活性が−（Ｒ
   ）−選択的で、生成する■＾＊の化合物が、構造式（Ｒ
   ）−■ ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｒ）−■ で表わされる光学活性（Ｒ）−インドリン−２−カルボ
   ン酸であり、 I ＾＊の化合物が、構造式（Ｓ）−■ ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｓ）−■ （Ｒは前記と同じ） で表わされる（Ｓ）−インドリン−２−カルボン酸エス
   テルである特許請求の範囲第１項乃至第８項のいずれか
   の項記載の製造方法。
5. （５）酵素或いは微生物がバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
   ）属又はアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属
   に属する微生物或いは該微生物由来の酵素である特許請
   求の範囲第１項乃至第４項のいずれかの項記載の製造方
   法。
6. （６）酵素が哺乳動物臓器由来の酵素である特許請求の
   範囲第１項乃至第４項のいずれかの項記載の製造方法。
7. （７）酵素あるいは微生物のエステラーゼ活性が（Ｓ）
   −選択的で、生成する■＾＊の化合物が、構造式（Ｓ）
   −■ ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｓ）−■ で表わされる光学活性（Ｓ）−インドリン−２−カルボ
   ン酸であり、■＾＊の化合物が、構造式（Ｒ）−■ ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｒ）−■ （Ｒは前記と同じ） で表わされる光学活性（Ｒ）−インドリン−２−カルボ
   ン酸エステルである特許請求の範囲第１項乃至第８項の
   いずれかの項記載の製造方法。
8. （８）酵素或いは微生物がシユードモナス （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属又はアスペルギルス（Ａ
   ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する微生物或いは該微生
   物由来の酵素である特許請求の範囲第１項乃至第８項の
   いずれかの項又は第７項記載の製造方法。
9. （９）疎水性を持つ酵素或いは微生物の固定化用担体が
   、合成吸着剤、疎水クロマトグラフィー用樹脂、疎水性
   光架橋性樹脂又は疎水基を化学結合させて導入した高分
   子物質である特許請求の範囲第１項乃至第８項のいずれ
   かの項記載の製造方法。
10. （１０）一般式■ ▲数式、化学式、表等があります▼■ （式中、ＲはＣ＿２〜Ｃ＿８の脂肪族炭化水素基を表わ
    す） で表わされる（Ｒ，Ｓ）−インドリン−２−カルボン酸
    エステルと、疎水性の担体に固定化された立体選択的エ
    ステラーゼ活性を有する固定化酵素もしくは固定化微生
    物とを接触、反応させて、構造式■＾＊ ▲数式、化学式、表等があります▼■＾＊ で表わされる光学活性インドリン−２−カルボン酸と、
    構造式■＾＊ ▲数式、化学式、表等があります▼■＾＊ （式中、ＲはＣ＿２〜Ｃ＿８の脂肪族炭化水素基を表わ
    す） で表わされる光学活性インドリン−２−カルボン酸エス
    テルとに不斉加水分解し、親水性のインドリン−２−カ
    ルボン酸■＾＊を水または緩衝液で回収採取後、固定化
    用担体に吸着・保持されているインドリン−２−カルボ
    ン酸エステル■＾＊を低極性有機溶剤で溶出、採取し、
    更に■＾＊を加水分解して構造式II＾＊の対掌体である
    光学活性インドリン−２−カルボン酸を生成させ、採取
    することを特徴とする光学活性インドリン−２−カルボ
    ン酸の製造方法。
11. （１１）不斉加水分解をカラムに充填した固定化酵素も
    しくは固定化微生物で行う特許請求の範囲第１０項記載
    の製造方法。
12. （１２）不斉加水分解を回分式で行う特許請求の範囲第
    １０項記載の製造方法。
13. （１３）酵素あるいは微生物のエステラーゼ活性が（Ｒ
    ）−選択的で、生成する■＾＊の化合物が、構造式（Ｒ
    ）−■ ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｒ）−■ で表わされる光学活性（Ｒ）−インドリン−２−カルボ
    ン酸であり、 I ＾＊の化合物が、構造式（Ｓ）−■ ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｓ）−■ （Ｒは前記と同じ） で表わされる（Ｓ）−インドリン−２−カルボン酸エス
    テルである特許請求の範囲第１０項乃至第１２項のいず
    れかの項記載の製造方法。
14. （１４）酵素或いは微生物がバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕ
    ｓ）属又はアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）
    属に属する微生物或いは該微生物由来の酵素である特許
    請求の範囲第１０項乃至第１３項のいずれかの項記載の
    製造方法。
15. （１５）酵素が哺乳動物臓器由来の酵素である特許請求
    の範囲第１０項乃至第１８項のいずれかの項記載の製造
    方法。
16. （１６）酵素あるいは微生物のエステラーゼ活性が（Ｓ
    ）−選択的で、生成する■＾＊の化合物が、構造式（Ｓ
    ）−■ ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｓ）−■ で表わされる光学活性（Ｓ）−インドリン−２−カルボ
    ン酸であり、■＾＊の化合物が、構造式（Ｒ）−■ ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｒ）−■ （Ｒは前記と同じ） で表わされる光学活性（Ｒ）−インドリン−２−カルボ
    ン酸エステルである特許請求の範囲第１０項乃至第１２
    項のいずれかの項記載の製造方法。
17. （１７）酵素或いは微生物がシユードモナス（Ｐｓｅｕ
    ｄｏｍｏｎａｓ）属又はアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇ
    ｉｌｌｕｓ）属に属する微生物或いは該微生物由来の酵
    素である特許請求の範囲第１０項乃至第１２項のいずれ
    かの項又は第１６項記載の製造方法。
18. （１８）疎水性を持つ酵素或いは微生物の固定化用担体
    が、合成吸着剤、疎水クロマトグラフィー用樹脂、疎水
    性光架橋性樹脂又は疎水基を化学結合させて導入した高
    分子物質である特許請求の範囲第１０項乃至第１２項の
    いずれかの項記載の製造方法。