DE19610984A1

DE19610984A1 - Alkohol-Dehydrogenase und deren Verwendung zur enzymatischen Herstellung chiraler Hydroxyverbindungen

Info

Publication number: DE19610984A1
Application number: DE19610984A
Authority: DE
Inventors: Werner Hummel; Bettina Riebel
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date: 1996-03-21
Filing date: 1996-03-21
Publication date: 1997-09-25
Also published as: EP0796914A2; EP0796914A3; JPH1028590A; US6225099B1; JP3950196B2; ES2201216T3; EP0796914B1; US6037158A; DE59710152D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue enantioselektive Alkohol-Dehydrogenasen (ADH) aus Mikroorganismen, wie beispielsweise der Lactobacillus-Art, insbesondere aus Lactobacillus brevis. Die neuen Enzyme sind besonders vorteilhaft zur Reduktion von organischen Ketoverbindungen zu den entsprechenden Hydroxyverbindungen geeig net, wobei diese Reduktionen enantioselektiv zu den entsprechenden R-Verbindungen führen. Der Enantiomerenüberschuß, der sich berechnet nach
ee (%) = (R)-Produkt - (S)-Produkt / (R)-Produkt + (S)-Produkt × 100,
beträgt dabei in aller Regel mehr als 95%. S-Hydroxy-Verbindungen waren bei Verwen dung der erfindungsgemäßen ADH nicht nachweisbar. Aufgrund des breiten Substrat spektrums können mit dem erfindungsgemäßen Enzym beispielsweise chirale Alkohole, chirale Hydroxyester (beispielsweise α- und β-Hydroxyester) oder auch Hydroxysäuren hergestellt werden.

Optisch aktive Hydroxyverbindungen sind wertvolle chirale Bausteine, die mit klas sischen chemischen Verfahren schwer zugänglich sind. Zur Herstellung chiraler Verbin dungen werden daher in der Regel biotechnologische Verfahren in Betracht gezogen, entweder unter Verwendung ganzer Mikroorganismen-Zellen oder mittels isolierter En zyme. Wie beispielsweise die Veröffentlichung von F. Aragozzini et al. (Appl. Micro biol. Biotechnol. (1986) 24, 175-177 zeigt, ergeben Verfahren mit ganzen Zellen häufig niedrige Ausbeuten, einen nur geringen Enantiomerenüberschuß (d. h. niedrige ee-Werte) und lange Umsetzungszeiten, so daß Enzyme, die in gereinigter und konzentrierter Form eingesetzt werden können, vorteilhafter sind. Für chirale Hydroxyverbindungen, wie bei spielsweise Alkohole, bieten sich Alkohol-Dehydrogenasen an, die die prochirale Ver bindung mit Hilfe eines Coenzyms (häufig NADH oder NADPH) reduzieren. Diese Re aktionen sind in der Regel hoch enantioselektiv. Die bisher verfügbaren Alkohol-De hydrogenasen (ADH) führen alle zu S-Alkoholen, teilweise ist bei diesen Enzymen das Substratspektrum relativ schmal (Hefe-ADH, Pferdeleber-ADH). Eine NADP-abhängige Alkohol-Dehydrogenase aus Lactobacillus kefir ist in DE 40 14 573 C1 beschrieben.

Diese führt zu R-Alkoholen. Es hat sich allerdings gezeigt, daß dieses Enzym relativ instabil ist, eine Reinigung bis zum homogenen Enzym war somit nur unter großen Verlusten (<98%) möglich.

Durch intensives Screening konnte nun überraschenderweise eine R-spezifische Alkohol-Dehydrogenase mit deutlich höherer Stabilität gefunden werden. Bestimmt man die ther mische Desaktivierung dieses Enzyms im Vergleich zu dem ähnlichsten vorbekannten ADH-Enzym, zeigt sich, daß das vorbekannte Enzym bei bereits 45°C zu 50% inaktiviert wird, während das erfindungsgemäße Enzym erst bei Temperaturen von ca. 65°C zu 50% inaktiviert ist. Die höhere Thermostabilität bedeutet zudem eine höhere Lagerstabilität bzw. Stabilität unter bestimmten Reaktionsbedingungen.

Ein entsprechend stabiles R-ADH-Enzym konnte insbesondere in Mikroorganismen der Gattung Lactobacillus, wie L. brevis und der Untergruppe Betabacterium (Gruppe A) ge funden werden. Bisher war von keinem Mikroorganismus bzw. Organismus bekannt, daß er eine stabile R-spezifische Alkohol-Dehydrogenase aufweist. Mit Hilfe eines Antikör pers gegen das L. kefir ADH-Protein konnte nun gezeigt werden, daß alle Lactobacillen der Untergruppe Betabacterium (Gruppe A) ein entsprechendes mit dem Antikörper re agierendes Protein besitzen. Eine besonders gute enzymatische Aktivität ist dagegen ins besondere bei Lactobacillus brevis nachweisbar. Die anderen Stämme dieser Gruppe be sitzen jedoch ebenfalls ein für solche Umsetzungen prinzipiell geeignetes Enzym, auch wenn sie unter den gegebenen Anzucht- und Testbedingungen etwas geringere Aktivität zeigen. Lactobacillen anderer Untergruppen (Thermobacterium, IA, Streptobacterium IB, Betabacterium Gruppe B) zeigen dagegen weder eine Reaktion im Antikörper-Test, noch verfügen sie über entsprechende enzymatische Aktivität.

Das stabile, aus L. brevis erhältliche Enzym konnte bis zur Homogenität gereinigt wer den. Entsprechende Daten zur Proteinsequenz wurden mit dem gereinigten Enzym er mittelt. Ein Sequenz-Vergleich der N-terminalen Aminosäuren zeigt, daß zwar größere Übereinstimmungen zwischen dem erfindungsgemäßen stabilen Enzym und ADHs anderen mikrobiellen Ursprungs vorliegen, einige Aminosäuren jedoch ausgetauscht sind.

Die nachfolgend aufgeführte biochemische Charakterisierung zeigt weitere Unterschiede des erfindungsgemäßen Enzyms gegenüber entsprechend vorbekannten Enzymen, z. B. bezüglich der relativen Aktivitäten gegenüber Ketonen. Die maximale Stabilität der er findungsgemäßen ADH liegt beispielsweise bei einem pH-Wert von ca. 9,0. Eine gute Stabilität weist das Enzym darüber hinaus bei ca. pH 5,5 auf. Dies gilt beispielsweise in einem 50 mM MES-Puffer (MES = 2-Morpholinoethansulfonsäure). Im selben Puffer system zeigt das erfindungsgemäße Enzym nach ca. 30 Minuten bei einer Temperatur zwischen 25°C bis 60°C noch eine Restaktivität von über 95%. Ein Stabilitätsmaximum weist das Enzym bei ca. 40°C auf. Ferner besitzt das Enzym ein Aktivitätsmaximum bei ca. 50°C.

Das erfindungsgemaße Enzym unterscheidet sich zudem auf Aminosäuresequenzebene von vorbekannten ADH-Enzymen. Beispielsweise weist das N-terminale Ende fünf Aminosäureaustausche auf einer Gesamtlänge von 38 Aminosäuren (AS) auf, was einen AS-Unterschied von über 12% bedeutet. Sämtliche Vergleiche zeigen somit, daß es vor teilhaft ist, für entsprechende Anwendungen die erfindungsgemäße Alkohol-Dehydrogenase, insbesondere die aus Lactobacillus brevis zu verwenden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Gewinnung des erfindungsgemäßen Enzyms aus geeigneten Mikroorganismen. Gute Enzymausbeuten wurden mit einem Stamm von Lactobacillus brevis erzielt, der unter der Nummer DSM 20054 am 06.06.1972 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, hinterlegt wurde und frei zugänglich ist.

Das Verfahren zur Gewinnung bzw. Reinigung des ADH-Enzyms läuft im wesentlichen über folgende Verfahrensschritte: Aufschluß der kultivierten Zellen, beispielsweise me chanisch durch Glasperlen, Durchführung einer hydrophoben Chromatographie bzw. In teraktionschromatographie und anschließender Anionenaustausch- sowie Affinitätschro matographie. Es hat sich insbesondere als vorteilhaft erwiesen, wenn sämtliche Homo genisation- bzw. Elutionspuffer ca. 0,5 bis 5 mM Magnesium enthalten. Als besonders vorteilhaft hat sich hierbei eine Mg²⁺-Konzentration von ca. 1 mM erwiesen. Auf diese Weise wird das Enzym mit einer spezifischen Aktivität von mindestens 400 U/mg, in vielen Fällen bis zu 500 U/mg gewonnen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur enantioselektiven Reduktion von organischen Ketoverbindungen gemäß der allgemeinen Formel (I)

wobei R¹ und R², verschieden oder identisch, Wasserstoff, zusammen oder jeweils, ein geradkettiger oder verzweigter Alkyl- oder Alkenylrest, ein Aryl- oder Arylenylrest, je weils aus 1 bis 20 C-Atomen bestehend, die durch ein oder mehrere Halogenatome, Ni tro-, Hydroxyl- oder Alkoxyreste, wobei die Alkoxyreste 1 bis 20 C-Atome aufweisen, eine gegebenenfalls substituierte Stickstoff-, Sauerstoff- oder Schwefelheterocyclen sub stituiert sind, oder ein gegebenenfalls substituierter polykondensierter gesättigter und/ oder ungesättigter aromatischer Rest sein können, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Ketoverbindung bzw. ein entsprechendes Gemisch mit einer erfindungsge mäßen mikrobiellen Alkohol-Dehydrogenase behandelt. Hierbei kann sowohl das erfin dungsgemäße Enzym als solches, als auch eine Kultur von Mikroorganismen, welche dieses Enzym produzieren, bzw. das Enzym enthaltene Zellen verwendet werden. Die Reaktion erfolgt vorzugsweise in einem wäßrigen Puffer, z. B. Kaliumphosphat-, Tris/HCl- oder Triethanolamin (TEA)-Puffer in Gegenwart von Magnesiumionen, bei einem pH-Wert von 5 bis 10, vorzugsweise pH 6 bis 9, und einer Temperatur von 10° bis 70°C, vorzugsweise von 30° bis 60°C. Ferner sind in dem Reaktionsansatz ein entspre chendes Coenzym, wie z. B. NAD(P)H sowie ein zur Regenerierung von oxidiertem Co enzym geeignetes Mittel, wie beispielsweise Isopropanol vorhanden. Wenn ein ausrei chender Umsatz, wie vorzugsweise ein 50%iger Umsatz erreicht ist, wird die Reaktion abgebrochen, vorzugsweise durch direkt anschließende Extraktion, wie beispielsweise in Chloroform. Die Reaktion kann jedoch auch durch Erniedrigung des pH-Wertes, durch Erhitzen oder Zugabe eines geeigneten Enzyminhibitors abgebrochen werden. Anschlie ßend daran wird die erhaltene enantiomerenreine R-Hydroxyverbindung mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel extrahiert und gemäß bekannten Verfahren durch Chromatographie oder Destillation von nicht umgesetzter Ketoverbin dung bzw. anderen Ausgangsverbindungen bzw. Komponenten abgetrennt. Die Enan tiomerenreinheit wird zweckmäßigerweise über GC und/oder HPLC an einem chiralen Säulenmaterial oder über ein Polarimeter bestimmt. Insbesondere hat sich das erfin dungsgemäße Verfahren zur Reduktion von Ketonen, Ketoestern wie α-, β- oder γ-Ketoestern, bzw. cyclischen Aryl- und Alkylestern, bevorzugt von solchen mit durch bei spielsweise Halogen- bzw. Alkyl- substituierten Resten, als geeignet erwiesen. Beson ders gute Ergebnisse konnten bei Acetophenonderivaten, Methylcyclohexanonen, be stimmten Diketonen, wie 2,4-Pentandion, verschiedenen Acetessigsäureestern sowie Alkylestern, wie beispielsweise Ethylpyruvat erzielt werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer enantiose lektiven Hydroxyverbindung gemäß der allgemeinen Formel (II)

wobei R¹ und R² jeweils die oben angegebenen Bedeutungen haben, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein racemisches Gemisch einer organischen Hydroxyverbin dung mit einer erfindungsgemäßen mikrobiellen Alkohol-Dehydrogenase bzw. die ADH enthaltene Zellen in einem wäßrigen Puffer bei einem pH-Wert von 5 bis 10, vorzugs weise pH 6 bis 9 und einer Temperatur von 10° bis 70°C, vorzugsweise von 30° bis 60°C, behandelt und anschließend die erhaltene enantiomerenreine S-Hydroxyverbin dung isoliert. Ansonsten gelten die oben genannten bzw. dem Fachmann für entspre chende Reaktionen bekannten Bedingungen.

Die erfindungsgemäße ADH kann für die beschriebenen Reaktionen entweder vollstän dig oder teilweise gereinigt bzw. in Zellen enthaltend eingesetzt werden. Die Zellen kön nen dabei nativ, permeabilisiert oder lysiert vorliegen.

Die Erfindung wird in nachfolgenden Beispielen näher erläutert:

Beispiel 1 Screening nach R-Alkohol-Dehydrogenasen unter Stämmen der Gattung Lactobacillus

Die Gattung Lactobacillus wird aufgrund von physiologischen Merkmalen taxonomisch in drei Untergruppen aufgeteilt: Thermobacterium, Streptobacterium und Betabacterium, letztere noch einmal in die beiden Untergruppen A und B. Mit einem Antikörper gegen die Alkohol-Dehydrogenase aus Lactobacillus kefir wurden Typstämme aller Untergrup pen getestet, ob sie eine Reaktion gegen den Antikörper zeigen. Überraschenderweise zeigten alle getesteten Stämme der Untergruppe A von Betabacterium Reaktivität, alle anderen Stämme waren dagegen inaktiv. Rohextrakte der Stämme der Untergruppe A von Betabacterium wurden daraufhin im Enzymtest getestet, inwieweit auch enzyma tische Aktivität vorliegt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Diese zeigt, daß unter den gegebenen Anzucht- und Testbedingungen mehrere Stämme dieser Unter gruppe keine oder nur schwache Enzymaktivität zeigen, obwohl der Antikörpertest posi tiv ausfiel. Auffallend war allerdings eine besonders hohe Enzymaktivität an ADH in Proben von Lactobacillus brevis.

Tabelle 1

Vorkommen von R-Alkohol-Dehydrogenase in Stämmen der Gattung Lactobacillus

Beispiel 2 Gewinnung und Reinigung von Alkohol-Dehydrogenase aus Lactobacillus brevis A. Kultivierung von Lactobacillus brevis

Zur Enzymgewinnung wurde Lactobacillus brevis in folgendem Medium angezogen (Angaben g/L):
Glucose (20), Hefeextrakt (5), Trypton (10), Fleischextrakt (5), Di-Ammoniumhydro gencitrat (2), Natriumacetat (5), Magnesiumsulfat (0.1), Mangansulfat (0.05), Di-Ka liumhydrogenphosphat (2).

Die Lösung wurde auf 1 L aufgefüllt und der pH-Wert auf 6.5 eingestellt, anschließend wurde das Medium bei 121°C (2 bar) für 10 min sterilisiert. Der Stamm wird ohne wei tere Sauerstoffzufuhr oder pH-Regulierung bei 30°C kultiviert.

Im 10 L Maßstab wurde das Medium im Fermenter nach Sterilisation und Temperierung auf 30°C mit einer 4%igen Vorkultur (OD₆₆₀ 0.35) beimpft. Für diesen Ansatz wurde bei spielhaft der Verlauf des Zellwachstums und der Enzymaktivität über die Zeit bestimmt, indem zu bestimmten Zeitpunkten Proben entnommen wurden, die dann auf OD₆₆₀, Frischgewicht und Enzymaktivität nach Aufschluß der Zellen untersucht wurden. In Abb. 1 ist ein solcher Verlauf dargestellt, die Aktivität der Alkohol-Dehydrogenase aus L. brevis zeigt nach Erreichen der stationären Phase des Wachstums den maximalen Aktivitätswert, der nur für 1.5 h gehalten wird.

Im 220 L Maßstab wurde der Organismus unter den gleichen Bedingungen kultiviert, nach 13 h bei einem pH-Wert von 5.3 und einer OD₆₆₀ von 2,2 wurden nach Zentrifuga tion 700 g Zellmasse gewonnen. Die Zellmasse kann bei -20°C gelagert werden, ohne daß über mehrere Monate ein Aktivitätsverlust meßbar ist. Fig. 1 zeigt das Wachstum (dargestellt als optische Dichte) und die Enzymbildung (U/G Zellen und U/mg Protein) in Abhängigkeit von der Fermentationszeit.

B. Enzymisolierung (Rohextraktherstellung)

Die Enzymfreisetzung aus den Zellen wurde durch Naßvermahlung mit Hilfe von Glas perlen (0.3 mm) erreicht, kann aber auch durch jede andere Methode zum Aufschluß von Bakterienzellen erzielt werden. Die Bakterienmasse wird mit 0.1 M Acetatpuffer pH 4.0 + 1 mM MgCl₂ unter Zusatz von Antischaummittel (Polypropylenglycol) zu einer 40%igen Suspension verdünnt. Diese wurde unter Zugabe von Glasperlen im Verhältnis von 1 : 2 im Disintegrator (Fa. IMA) bei 4000 rpm einem 20minütigen Aufschluß bei ständiger Kühlung unterzogen. 8 g Bakterien ergaben 10 ml Rohextrakt mit einer Volu menaktivität von 40 U/ml und einem Proteingehalt von ca. 3 mg/ml. Der Enzymtest ent hält 970 µl Triethanolaminpuffer (100 mM; pH 7.0; mit 11 mM Acetophenon), 20 µl NADPH (Endkonzentration 0.19 mM) und Enzymlösung.

Definition der Enzymeinheiten: 1 U entspricht der Enzymmenge, die benötigt wird, um 1 µmol Substrat (Acetophenon) pro 1 min umzusetzen.

C. Reinigung der Alkohol-Dehydrogenase aus Lactobacillus brevis

Das Enzym kann über hydrophobe Interaktions-Chromatographie mit nachfolgenden Anionenaustauschchromatographie und Affinitätschromatographie bis zur Homogenität gereinigt werden. Dabei empfiehlt sich ein Zusatz von Mg²⁺-Ionen von ca. 1 mM zu allen Puffern. Bei Entzug dieser Ionen kann das Enzym irreversibel geschädigt werden.

1. Hydrophobe Interaktionschromatographie

5 ml eines Rohextrakts (entsprechend Beispiel 2 B) werden über kleine Gelfiltrations säulen (PD10, Pharmacia) in 50 mM Triethanolaminpuffer pH 7.0 mit 1 mM MgCl₂ und 0.6 M (NH₄)₂SO₄ umgepuffert und auf eine Phenyl-Sepharose CL-6B (Fa. Pharmacia, Freiburg, Deutschland) aufgetragen. Die Säule ist mit 50 mM Triethanolaminpuffer pH 7.0, 1 mM MgCl₂ und 0.6 M (NH₄)₂SO₄ äquilibriert worden. Nach Auftrag und Spülen der Säule mit dem Äquilibrierungspuffer wird das Enzym mit einem fallenden linearen Salzgradienten (6 bis 0 M (NH₄)₂SO₄, Fluß 1 ml/min) bei 0.36 M (NH₄)₂SO₄ eluiert. Die aktiven Fraktionen werden zusammengefaßt und auf eine Konzentration von 1.2 M (NH₄)₂SO₄ gebracht. Diese Proteinlösung wird auf eine Octyl-Sepharosesäule aufge tragen, die mit 50 mM Triethanolaminpuffer pH 7.0, 1 mM MgCl₂ und 1.2 M (NH₄)₂SO₄ äquilibriert wurde. Nach Auftrag der Proteinlösung und anschließendem Spülen der Säule wird das Enzym mit einem fallenden linearen Salzgradienten (1.2 bis 0 M (NH₄)₂SO₄, Fluß 1 ml/min) bei 1.0 M (NH₄)₂SO₄ eluiert. Die erzielte Anreicherung ist in Tabelle 2 zusammengefaßt.

2. Anionenaustauschchromatographie

Die Fraktionen mit der höchsten Aktivität der letzten oben verwendeten Säule werden über Gelfiltrationssäulen (PD10, Pharmacia) in 50 mM Tris/HCl-Puffer pH 9.0 mit 1 mM MgCl₂ umgepuffert und auf eine ebenso äquilibrierte Mono Q-Säule (Fluß 1 ml/min; Druck 1.5 MPA; FPLC-Chromatographiesystem; Fa. Pharmacia, Freiburg, Deutschland) aufgetragen. Nach erfolgtem Spülen der Säule wird die Alkohol-Dehydrogenase mit einem linearen Salzgradienten von 0 bis 0.6 M NaCl eluiert, wobei das En zym bei 0.36 M NaCl erscheint.

3. Affinitätschromatographie

Die aktiven Fraktionen werden über Gelfiltrationssäulen (PD10, Fa. Pharmacia), die mit 50 mM Morpholinethansulfonsäurepuffer pH 5.5 und 1 mM MgCl₂ äquilibriert wurden, umgepuffert und auf eine ebenso äquilibrierte 2′,5′-AMP-Sepharosesäule (Fa. Pharmacia) aufgetragen. Anschließend wird mit 100 mM NaCl, gelöst im gleichen Puffer, gespült. Anschließend erfolgt die Elution mit einem linearen NADP-Gradienten von 0 bis 10 mM NADP. Die Dehydrogenase eluiert bei 3.33 mM NADP. Die Chromatographie wurde mit einer Flußrate von 0.25 ml/min durchgeführt. Die komplette Reinigung des Enzyms ist in Tabelle 2 zusammengefaßt.

Tabelle 2

Reinigung der Alkohol-Dehydrogenase aus Lactobacillus brevis

D. Reinigung der Alkohol-Dehydrogenase aus Lactobacillus kefir

Lactobacillus kefir besitzt eine intrazelluläre NADP-abhängige Alkohol-Dehydrogenase (DE 40 14 573 C1), die in einigen biochemischen Eigenschaften (Produktion von R-Alkoholen, Coenzym-Spezifität) der Alkohol-Dehydrogenase aus Lactobacillus brevis ähnelt. Um die Unterschiede beider Enzyme deutlich zu machen und die Vorzüge des Enzyms aus L. brevis aufzuzeigen, wurde die Alkohol-Dehydrogenase aus L. kefir ana log zum L. brevis-Enzym bis zur Homogenität gereinigt und im Verlauf der Charakteri sierung des L. brevis-Enzyms mitunter vergleichend geprüft (z. B. Temperaturstabilität, N-terminale Aminosäure-Sequenz). Anzucht von Lactobacillus kefir, die Enzymiso lierung und Reinigung bis zum homogenen Enzym wurden wie in Beispiel 2A)-2C) für L. brevis beschrieben durchgeführt. Tabelle 3 faßt die Reinigung des L. kefir-Enzyms zu sammen.

Tabelle 3

Reinigung der Alkohol-Dehydrogenase aus Lactobacillus kefir

Beispiel 3 Biochemische Charakterisierung der Alkohol-Dehydrogenase aus Lactobacillus brevis A. pH-Stabilität

Die Abhängigkeit der Aktivität des Enzyms bei Lagerung in Puffern mit verschiedenen pH-Werten wurde im Bereich von pH 4 bis 11 untersucht. Es wurden je nach Pufferka pazität verschiedene Puffer im pH-Bereich von 4 bis 11 angesetzt und das homogene Enzym darin für 30 min inkubiert. Davon wurde 1 µl entnommen und zu dem normalen Testansatz von 970 µl Triethanolaminpuffer (100 mM; pH 7.0 mit 11 mM Acetophenon) und 20 µl NADPH (Endkonzentration 0.19 mM) hinzugegeben. Die Reaktion wurde über 1 min bei 30°C und 340 nm verfolgt. Dabei zeigten sich 2 Maxima der pH-Stabilität, ein kleineres bei pH 5.5 und ein großes bei pH 9.0. Die Stabilität ist in Tabelle 3 dar gestellt.

Tabelle 4

pH-Stabilität der Alkohol-Dehydrogenase

B. Temperaturstabilität

In analoger Weise wie unter A. beschrieben wurde die Temperaturstabilität für den Be reich von 25 bis 70°C bestimmt. Die homogene Enzymlösung wurde für 30 min den je weiligen Temperaturen ausgesetzt und anschließend direkt bei 30°C mit dem obigen Testansatz gemessen. Die Alkoholdehydrogenase ist in dem Temperaturbereich zwischen 25 und 60°C für den angegebenen Zeitraum stabil (s. Tabelle 5), sie zeigt ein Maximum bei 40°C. Demgegenüber ist die ADH aus L. kefir nur bis 40°C stabil mit einem Maxi mum bei 37°C, danach sinkt die Aktivität rapide ab. Das Maximum dieses Enzym liegt bei 37°C.

Tabelle 5

Temperaturstabilität der Alkohol-Dehydrogenase aus L. brevis

C. Temperaturoptimum

Zur Bestimmung der optimalen Testtemperatur wurde die Enzymaktivität zwischen 25 und 70°C gemessen. Der Testansatz entsprach den Standardkonzentrationen an Aceto phenon und NADPH und wurde jeweils 5 min bei den angegebenen Temperaturen inku biert. Das Enzym hat seine optimale Testtemperatur bei 50°C, wie aus der Tabelle 6 er sichtlich wird. Die Alkohol-Dehydrogenase aus L. kefir hat dagegen ein Optimum von 37°C und bei höheren Testtemperaturen als 45°C sinkt die Aktivität rapide ab (Tabelle 5).

Tabelle 6

Temperatur-Optimum für die Aktivität der Alkohol-Dehydrogenase aus Lactobacillus brevis (im Vergleich zu der Alkohol-Dehydrogenase aus Lactobacillus kefir)

D. Substratspektrum der Alkohol-Dehydrogenase

Es wurden anstelle von Acetophenon eine Reihe von anderen Ketonen und Ketoestern und getestet, ob diese enzymkatalysiert reduziert werden können.

Folgender Testansatz wurde dafür verwendet:
970 µl Triethanolaminpuffer (50 mM; pH 7.0, mit 10 mM Ketoverbindung)
20 µl NADPH (0.19 mM im Test)
10 µl gereinigtes Enzym (s. Beispiel 2, nach Affinitätschromatographie, 1 : 10 verdünnt).

Teilweise wurden die Ketone auch in einer Konzentration von 1 mM getestet, um eine mögliche Substrathemmung bei 10 mM zu verifizieren. Es stellte sich jedoch heraus, daß eine solche Überschuß-Inhibierung bei einer Keton-Konzentration von 10 mM nicht auf trat. Die für die entsprechenden Substrate erhaltenen Aktivitäten sind in Tabelle 7 wiedergegeben.

Für Substrate wie p-Cl-Acetophenon, Methyl-1-naphtylketon und Methylcyclohexanon kann aufgrund von Literaturangaben ein direkter Vergleich zwischen der Alkohol-Dehydrogenase aus L. kefir und der aus L. brevis gezogen werden (Hummel, W. Appl. Micro biol. Biotechnol. (1990), 34, 15-19). Dieser Vergleich zeigt, daß die erfindungsgemäße ADH die genannten Verbindungen mit höherer Aktivität umsetzt; die Aktivitäten liegen ca. um 50 bis 100% höher als die für ADH aus L. kefir.

Tabelle 7

Substratspektrum der Alkohol-Dehydrogenase aus L. brevis

E. Molekulargewicht der Alkohol-Dehydrogenase aus Lactobacillus brevis

Gereinigte Alkohol-Dehydrogenase aus Lactobacillus brevis wurde auf eine Gelfiltra tionssäule Superdex G-200 (Fa. Pharmacia, Freiburg) aufgetragen. Das Molekularge wicht wurde gemäß einer Eichgerade, die mit Proteinen bekannten Molekulargewichts erhalten wurde, bestimmt. Der Puffer bei der Gelfiltration hatte den für die Reinigung üblichen pH-Wert von 7.0 (100 mM TEA, pH 7.0, 0.2 M NaCl, 1 mM MgCl₂). Unter diesen Bedingungen wurde für die L. brevis-ADH ein Molekulargewicht von ca. 104 kD bestimmt, was dem der L. kefir-ADH entspricht.

F. Bestimmung der N-terminalen Sequenz der Alkohol-Dehydrogenase

Die N-terminale Sequenz wurde mit einem Pulsed Liquid Sequencer Model 477A mit on-line HPLC Model 120A der Firma Applied Biosystems/U.S.A. bestimmt und mit der N-terminalen Sequenz der Alkohol-Dehydrogenase aus L. kefir verglichen.

S-N-R-L-D-G-K-V-A-I-V-T-G-G-T-L-G-I-G-L-A-I-A-T-K-F-V-E-E-G-A-K-V-M--I-T- T-R (SEQ. ID NO: 1).

Im Vergleich zur Sequenz aus L. kefir wurden bei den ersten 38 Aminosäuren (AS) fol gende fünf Aminosäureaustausche verzeichnet:
Pos. 1 von Thr nach Ser (kein Unterschied im chemischen Verhalten der AS);
Pos. 2 von Asp nach Asn (saure, geladene AS wird gegen ungeladene ausgetauscht);
Pos. 5 von Lys nach Asp (basische wird gegen saure AS ausgetauscht);
Pos. 24 von Asp nach Thr (saure gegen hydrophile AS ausgetauscht);
Pos. 34 von Val nach Met (hydrophobe gegen schwefelhaltige AS ausgetauscht).

In vier von fünf Fällen liegen solche Aminosäureaustausche vor, die entgegengesetzte Polaritätseigenschaften an diesen Positionen im Enzym hervorrufen.

Beispiel 4 Bestimmung von Aminosäure-Teilsequenzen nach Spaltung des Enzyms

Homogene Alkohol-Dehydrogenase aus Lactobacillus brevis wurde einer Spaltung mit Endoproteinase Lys-C Protease (Boehringer Mannheim, 476 986) unterworfen. Dafür mußte das Protein vorher denaturiert und carboxymetyliert werden. Die ADH-Probe wurde direkt in 60 µl Guanidinium-Puffer pH 8.5 aufgenommen [2 mg/ml] und bei RT 30 min inkubiert. Nach Ablauf der Inkubation wurde 1/10 Volumen einer 111 mM DTT-Lösung hinzugegeben und erneut für 30 min bei 37°C inkubiert. Zuletzt wurde 1/10 Volumen einer 360 mM Iodessigsäurelösung hinzugegeben und die Probe für 30 min im Dunkeln bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wurde mit β-Mercaptoethanol abgestoppt. Nach Umpuffern auf einen Harnstoff-haltigen (2 M) Puffer wurde 1% (Endkonzentra tion) Triton X-100 (reduziert) und 4.6 µg Lys-C Protease (1/25 der Proteinmenge [w/w]) hinzugegeben und über Nacht bei 37°C inkubiert. Nach Ablauf der Zeit (mind. 16-18 h) wurde die Reaktion durch Zugabe von 1/10 Volumen 10% TFA abgestoppt. Von dem Ansatz wurden dreimal je 2 × 150 µl und schließlich 1 × 100 µl in die HPLC eingespritzt. Jeder proteinhaltige Peak wurde getrennt gesammelt und nach Vergleich der einzelnen Laufe gleiche Peaks zusammengenommen und in einer Vakuum-Zentrifuge eingeengt. Diese Proben (insgesamt 18) wurden dann direkt zum Sequenzieren verwendet.

Sequenzdaten (aufgeführt sind lediglich die wichtigsten Daten von Fraktionen mit eindeutiger, vollständiger Sequenzinformation):
Das Protein in Peakfraktion Nummer 3 hat folgende Sequenz V-M-I-T-G-R-H-S-D-V-G- E-K (SEQ. ID NO: 2) und knüpfte damit direkt an das N-terminale Ende an.

Die Sequenzen der Proteinfraktionen Nummer 5 (D-Y-D-V-R-V-N-T-V-H-P-G-Y-I-K, (SEQ. ID NO: 3)) und Nummer 6 konnten ebenfalls bestimmt werden.

Bei letzterer, F-A-T-G-S-E-F-V-V-D-G-G-Y-T-A-Q (SEQ. ID NO: 4), handelt es sich um das C-terminale Ende des Monomers der ADH aus Laktobacillus brevis.

Die Sequenzen der restlichen 12 Fraktionen sind hier nicht angeführt. Sämtliche Teilsequenzen konnten jedoch durch entsprechende Klonierungsexperimente bestätigt werden.

Beispiel 5 Klonierung des Enzyms A. Präparation genomischer DNA aus Lactobacillus brevis

Zellen von Lactobacillus brevis wurden mit 50 ml high TE-Puffer (25 mM Tris, 10 mM EDTA pH 8.0) gewaschen und bei 6000 rpm zentrifugiert. Das Pellet wurde in 10 ml TE (25 mM Tris, 10 mM EDTA pH 8.0) resuspendiert und unter Zugabe von 100 µl Lyso zym (100 mg/ml) für 1.5 h bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde über Nacht bei 50°C unter Zugabe von 340 µl 30% Natriumlaurylsarcosin, 100 µl Qiagen Protease (Qiagen, Hilden; 20 mg/ml) und 25 µl RNAse A (40 mg/ml) zu den lysierten Zellen das Zellpro tein denaturiert und die RNA abgebaut. Im nächsten Schritt wurde aus dem Zellysat die DNA durch Phenolfällungen vom restlichen Zellinhalt abgetrennt. (Dazu wurde immer im Volumenverhältnis 1 : 1 zuerst reines Phenol (mit TE abgesättigt), dann Phenol/IAA/ CHCl₃ (25 : 24 : 1) (IAA = Isoamylalkohol) und zuletzt IAA/CHCl₃ (24 : 1) auf die wäßrige Phase gegeben.) Die bereinigten, wäßrigen Phasen wurden durch sanftes Schwenken ca. 5 min lang vermischt und dann durch Zentrifugation bei 20000 rpm getrennt. Die letzte wäßrige Oberphase wurde mit 0.0625 Volumen 8 M LiCl vermischt und dann mit zwei Volumenteilen kaltem Ethanol (100%) vorsichtig überschichtet. Die an der Grenzschicht ausfallende, genomische DNA wurde auf eine Pasteurpipette aufgewickelt und zweimal mit kaltem, 70%igem Ethanol gewaschen. Nach Trocknung in der Vakuumzentrifuge wurde die DNA in 2 ml TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA) pH 8.0 aufgenommen. Zur Überprüfung des Reinheitsgrades der isolierten DNA wurde die Lösung 1 : 50 verdünnt und der Quotient 260 : 280 nm photometrisch als 2,0 bestimmt. Damit konnten Protein verunreinigungen ausgeschlossen werden. Die Konzentration der DNA wurde aus dem Gel mit 70 ng/µl bestimmt, aus 3 g Zellen wurden 140 µg genomische DNA isoliert.

B. Oligonucleotide als 5′- und 3′-Primer für die PCR (Polymerase chain reaction)

Aufgrund enzymatischer Peptidspaltungen (s. Beispiel 4) konnten das N-terminale und C-terminale Ende der Proteinsequenz der ADH aus L. brevis bestimmt werden. Mit Hilfe dieser Informationen wurden Primer für die PCR synthetisiert. Dabei wurden bekannte Präferenzen für bestimmte Codons in Laktobacillen berücksichtigt. Vor jeden 5′primer wurde das Codon ATG (Met) als Startcodon vorgesetzt, was der Proteinsequenz fehlt, und hinter jeden 3′primer wurden 2 Stopcodons als Zeichen für die Beendigung der PCR gesetzt. Die Primerkonstrukte sind im folgenden aufgelistet (In Klammern sind die variablen Nucleinsäuren aufgeführt, die alternativ zu der vor der Klammer stehenden Nukleinsäure eingebaut wurden, so daß der tatsächlich eingesetzte Primer ein Gemisch aus den sich ergebenden Kombinationen ist):

5′primer 5′LB:
5′ATG-TCA-AAC-CGT-TTA(G)-GAT-GGT(C)-AAG-GTT(A)-GCT(A)-ATT(C)-3
(SEQ. ID NO: 5)

3′primer 3′LB:
5′CTA-CTA-TTG-A(T)GC-AGT-GTA-A(G)CC-A(G)CC-ATC-A(T)AC-A(T)AC- GAA-3′
(SEQ. ID NO: 6).

Die synthetisierten Primer wurden mit kaltem NH₃ von den Säulen eluiert. Diese NH₃-Lösung wurde für 1 h bei 70°C inkubiert und anschließend mit 1 ml Butanol ausge schüttelt. Die Proben wurden bei 14000 rpm 2 min abzentrifugiert und der entstandene Überstand abdekantiert. Die Proben wurden zum Trocknen 5 min in die Vakuum-Zentrifuge gestellt und das Pellet in 500 µl H₂O aufgenommen. Die Primer wurden in einer Konzentration von 100 pmol/µl eingesetzt.

C. PCR (Polymerase chain reaction) mit der genomischen DNA aus L. brevis

Im folgenden wurde die Templatekonzentration (genom. DNA) variiert, alle anderen Parameter wurden konstant gehalten. Als Annealingtemperatur wurde 52°C gewählt.

Tabelle 8

PCR-Ansatz

Die jeweiligen Ansätze hatten ein Volumen von 100 µl, die molaren Angaben sind als Endkonzentrationen zu verstehen, das Template und die Taq DNA-Polymerase (Boeh ringer Mannheim) wurden in der in Tab. 8 aufgeführten Menge dem Gesamtansatz zu gegeben. Der Puffer (PCR reaction buffer; Boehringer Mannheim) lag in 10facher Kon zentration vor. Die PCR wurde mit 25 Cyclen über Nacht angesetzt. Es wurde ein PCR Gerät von Perkin Elmer mit beheizbarem Deckel verwendet.

Für die Analytik wurden 10% des Ansatzes (Volumenanteil) auf ein 1%iges Agarosegel aufgetragen und bei konstant 100 V elektrophoretisch aufgetrennt. Die PCR zeigt eine deutliche Amplifikation eines DNAstücks von a 750 bp. Das Signal liegt zwischen den Markerbanden von 697 bp und 925 bp, wobei es näher an 697 bp reicht. Bei einem durch SDS-PAGE ermittelten Molekulargewichts des Monomers der ADH von 27 kD (245 AS) findet sich hier eine gute Übereinstimmung von Aminosäurelänge des ADH-Proteins und der Basenpaarlänge für das gesuchte Gen. In einem Restriktionsverdau mit den Enzymen Eco R¹ und Hind III (4 µl PCR-Fragment, 2 µl Puffer B (Boehringer), 1 µl Eco R1 bzw. Hind III), 13 µl H₂O; Inkubation für 1 Std. bei 37°C; Analytik mittels Agarose gel) konnte nachgewiesen werden, das das amplifizierte Gen-Fragment keine Restrik tionsschnittstellen besitzt.

D. Reinigung der PCR-Produkte mit dem Qiaquick® PCR purification kit (Qiagen, Hilden)

Zu 100 µl PCR-Lösung wurden 500 µl Puffer PB pipettiert und direkt auf eine Quia quick® Säule (ohne Äquilibrierung) aufgetragen. Die DNA wurde durch Zentrifugation (1 min, 14000 rpm) an die Säule gebunden, der Durchlauf wurde verworfen. Die Säule wurde mit 750 µl Puffer PE durch Zentrifugation (1 min, 14000 rpm) gewaschen und der Durchlauf verworfen. Die Säule wurde erneut kurz abzentrifugiert, um Reste des in dem Puffer PE enthaltenen Ethanols zu entfernen. Anschließend wurde die Säule unter Zu gabe von 50 µl 2 mM Tris/HCl pH 8.0 durch Zentrifugation (1 min, 14000 rpm) eluiert. Von diesem Eluat wurde zur Kontrolle je 1 µl auf ein analytisches 0.8%iges Agarosegel aufgetragen und unter 60 V konstant elektrophoretisch aufgetrennt. Die Konzentrations bestimmung ergab 70 ng/µl für PCR3/1 und 90 ng/µl für PCR3/2. PCR3/2 wurde weiter verarbeitet, PCR3/1 wurde bei -20°C aufbewahrt. PCR3/2 wurde auf 16 Nil in der Speed vac eingeengt und direkt für die Blunting/kinasing Reaktion des sureclone kits eingesetzt (16 µl PCR, 1 µl Klenow Fragment, 2 µl 10× Puffer, 1 µl Polynucleotidkinase; 30 min bei 37°C inkubieren). Das Reaktionsgemisch wurde direkt auf ein präparatives 0.8% Agarosegel (2 h, 80 V konstant) aufgetragen. Die bei 750 bp sichtbare Bande wurde aus dem Gel ausgeschnitten und über Jetsorb® (Genomed, Bad Oeynhausen) aus dem Gel isoliert. Die Plasmid DNA wurde aus dem Jetsorbmaterial mit 50 µl 2 mM Tris/HCl pH 8.0 eluiert. Diese Lösung wurde mit Hilfe einer Vakuumzentrifuge auf 9 µl eingeengt. Davon wurde 1 µl für ein analytisches Agarosegel verwendet.

Aus der Konzentration des PCR Fragments im Gel (150 ng/µl) ergibt sich eine Gesamt konzentration an DNA von 1.2 µg. Diese Probe wurde in den Ligaseansatz des sureclone kits eingesetzt.

E. Jetsorb® DNA Isolierung aus dem Gel

Pro 100 mg Gelmaterial wurden 300 µl Puffer A1 und 10 µl der Jetsorbsuspension ver mischt und bei 50°C für 15 min inkubiert. Dabei wurde von Zeit zu Zeit die Lösung neu gemischt, um eine komplette Bindung an das Jetsorbmaterial zu gewährleisten. Anschlie ßend wurde die Suspension 30 sec bei 11000 rpm abzentrifugiert, der Überstand verwor fen, das Pellet in 300 µl Puffer A2 resuspendiert und erneut bei 11000 rpm abzentrifu giert. Dieser Schritt wurde komplett wiederholt und anschließend der Überstand sauber abpipettiert und das Pellet bei 50°C 5 min getrocknet. Dann wurde das Pellet in 30 µl 2 mM Tris/HCl ph 8.0 resuspendiert und 5 min bei 50°C inkubiert. Nach erfolgter Zentri fugation (11000 rpm, 30 sec) wurde der Überstand gesammelt und das Pellet erneut in 20 µl 2 mM Tris/HCl pH 8.0 resuspendiert und wie oben weiter behandelt. Die resultieren den Überstände wurden vereinigt und in der Speed vac auf 18 µl eingeengt. Davon wurde 1 µl auf eine analytisches Agarosegel aufgetragen. Die Konzentrationsbestimmung über dieses Gel ergab eine DNA Konzentration von 10 ng/µl, also eine Gesamtkonzentration von 160 ng.

F. Ligation mit dem Sureclone Kit (Fa. Pharmacia)

Eingesetzt wurden 7 µl PCR (1 µg), 1 µl pUC18 Vektor (50 ng), 1 µl DTT, 10 µl zwei fachen Ligasepuffer, 1 µl Ligase. Von diesem Ansatz wurden 3 µl entnommen und in einem neuen Ligaseansatz eingesetzt, um die PCR-Fragmentkonzentration zu erniedri gen. Ein zweiter Ansatz entspricht bis auf die PCR-DNA Konzentration (157 ng, d. h. ein Verhältnis von 1 : 3 Vektor : PCR) in der Zusammensetzung dem ersten Ansatz (Verhäl tnis von 1 : 20 Vektor : PCR). Beide Ansätze wurden für 1,5 h bei 16°C inkubiert und an schließend je 100 µl kompetente Zellen (Escherichia coli XL 1 Blue) damit transfor miert. Von Ligaseansatz 1 wurden 1 µl und von Ligaseansatz 2 wurden 4 µl zu den kompetenten Zellen pipettiert. Von der Zellsuspension wurden je 300 µl auf LB_amp- Agarplatten ausplattiert (LB=Caseinpepton/Hefeextrakt; pH 7,5).

Gewachsene Kolonien wurden abgeimpft und in 4 ml Flüssigkultur (LB_amp-Medium) über Nacht bei 37°C kultiviert. Von dieser Zellsuspension wurden je 2 ml zur Plasmid präparation (entsprechend dem Qiagen miniprep Protokoll (Qiagen, Hilden); s. u.) ein gesetzt. Die Plasmid DNA wurde aus der zellfreien Lösung direkt mit 0,7 Volumenteilen Isopropanol gefällt, mit 70% kalten Ethanol gewaschen, in der Vakuumzentrifuge ge trocknet und in 10 µl 2 mM Tris/HCl-Puffer (pH 8.0) aufgenommen. Von dieser Plas midpreparation wurde ein Restriktionsverdau mit Eco R1 und Hind III angesetzt (1 U/µl Enzym, 6 µl Plasmid DNA, 37°C, 1 h). Der komplette Verdau wurde auf ein 0.8%iges Agarosegel aufgetragen, 2 Std. bei konstant 80 V elektrophoretisch aufgetrennt (Nach weis des 750 kb-Inserts) und die Plasmide daraufhin gegebenenfalls für die Sequenzie rung eingesetzt.

G. Plasmid-Präparation (Qiagen Miniprep)

4 ml der Flüssigkultur wurden bei 5000 rpm 5 min abzentrifugiert und das Pellet in 300 µl Puffer P1 resuspendiert. Zu dieser Suspension wurden 300 µl Puffer P2 gegeben und die Zellsuspension bei Raumtemperatur für 5 min inkubiert. Anschließend wurde den lysierten Zellen 300 µl kalter Puffer P3 hinzupipettiert und für 10 min auf Eis unter mehrmaligem Schwenken inkubiert, um Nukleinsäuren und Proteine zu denaturieren. Die denaturierten Bestandteile wurden durch Zentrifugation (11000 rpm, 15 min) abgetrennt; der Überstand direkt auf neue, mit 1 ml QBT Puffer (Qiagen, Hilden) äquilibrierte Qiagen 20 Tip Säulen (Qiagen, Hilden) gegeben. Die Säulen wurden mit 4 × 1 ml Puffer QC gewaschen und anschließend die Plasmid DNA mit 0.8 ml Puffer QF von den Säulen eluiert. Aus dieser Lösung wurde die DNA mit 0.7 Vol Isopropanol nach 30 min Zentrifugation bei 14000 rpm gefällt. Das resultierende Pellet wurde 2 × 10 min mit 70% Ethanol während der Zentrifugation bei 14000 rpm gewaschen und dann in der Vakuumzentrifuge getrocknet. Die DNA wurde in 10 µl 2 mM Tris/HCl pH 8.0 aufgenommen und beispielsweise für Analysen mittels Restriktionsenzymen eingesetzt.

H. DNA Sequenzierung der Plasmide a. Fertigen des Sequenzgels

Die Sequenzierung wurde mit dem autoread laser fluorescent Sequencer (ALF) der Firma Pharmacia durchgeführt, dementsprechend wurde der autoread Sequencing kit (Pharma cia) für die Sequencierungsreaktion verwendet. Das Gel wies standardmäßig eine Dicke von 0.5 mm auf. An der Stelle des Laserdurchtritts wurde ein entsprechendes Glasplätt chen (Dicke 0.35 mm) eingesetzt. Sequenzgels: 21 g Harnstoff (ultra pure), 12 g H₂O (Millipore), 7.5 ml Acrylamid (Roth, zur DNA Sequenzierung), 200 µl APS, 45 µl TEMED, 6 ml 10-fach TBE. Als Laufpuffer diente 0.6 × TBE (Tris/Borat/EDTA-Puffer entsprechend Pharmacia-Angaben).

b. Sequenzierungsreaktion mit dem AutoRead^TM Sequencing kit

Von den Plasmiden wurden je 5 µl (4 µg) DNA pro sequencing primer eingesetzt.

Es wurden 5 µl Plasmid DNA, 5 µl H₂O, 2 µl Primer (universal oder reversal), 1 ,5 µl 1 M NaOH zusammenpipettiert und für 5 min bei 65°C zur DNA Denaturierung inkubiert. Dann wurden die Proben direkt nach 37°C überführt und die Reaktion mit 1,5 µl 1 M HCl neutralisiert. Es wurden 2 µl Annealingpuffer hinzugegeben, kurz abzentrifugiert (15 sec, 14000 rpm) und 10 min bei 37°C, anschließend weitere 10 min bei Raumtem peratur inkubiert. Nach erfolgter Zentrifugation wurden 1 µl Extensionpuffer und 3,5 µl Dimethylsulfoxid mit dem Ansatz vermischt und pro Ansatz 2 µl der mit Enzymdilu tionspuffer verdünnten T7-Polymerase pipettiert. 5,2 µl dieser Lösung wurden direkt in eine bei 37°C vorinkubierte Platte pipettiert, die pro Plasmid 4 Spuren mit 3 µl des jeweiligen NTP-Mixes (A, C, G, T, in der Reihenfolge) enthielt. Nach 5 min Inkubation bei 37°C wurde die Sequenzierungsreaktion nach Sanger (Sanger, F., Nickler, S., Coulson, A. R. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467) durch Zugabe von 6 µl Stopmix abgestoppt, und das Reaktionsgemisch für 2-3 min bei 90°C erhitzt, danach direkt auf Eis gekühlt, um ein Renaturieren der Stränge zu verhindern. Dann wurden direkt 6 µl dieses Gemisches auf das Sequenzgel aufgegeben und der Sequencer ge startet. Von den ausgewählten Plasmiden wies nur das Plasmid 3/1 die richtige DNA-Sequenz auf; diese Daten können nun in die entsprechende Proteinsequenz übersetzt wer den (Abb. 1). Der universal Primer zeigt das C-terminale Ende der Sequenz und der reversal Primer das N-terminale Ende (5′codierender Strang). Daher ist das Insert in der richtigen Orientierung plaziert. Die Sequenz auf Grund der DNA-Sequenzierung zeigt völlige Übereinstimmung mit den durch Proteinsequenzierung erhaltenen Sequenzdaten.

Beispiel 6 Enzymkatalysierte Herstellung von R-Phenylethanol

Für die enzymkatalysierte Synthese von (R)-Phenylethanol aus Acetophenon wurden ge reinigtes Enzym (Beispiel 2C) und das erforderliche Coenzym (NADP) eingesetzt. Das oxidierte Coenzym wurde durch gleichzeitig anwesendes Isopropanol kontinuierlich re generiert, so daß die Reaktion nur katalytische Mengen an Coenzym erfordert. Der An satz enthielt im einzelnen (in Klammern aufgeführt sind die Endkonzentrationen der Komponenten im Test): 20 µl NADP (0,05 mM), 7,7 µl Isopropanol (0,1 M), 0,6 µl Acetophenon (5 mM), 921,7 µl Triethanolamin-Puffer (50 mM; pH 7,0, mit 1 mM MgCl₂) und 50 µl Alkohol Dehydrogenase aus Lactobacillus brevis (4,5 Units). Dieser Ansatz mit einem Gesamtvolumen von 1 ml wurde für 24 Std. bei 30°C inkubiert, dann wurde eine Probe gaschromatographisch analysiert. Dazu wurden 100 µl entnommen, mit 100 µl Chloroform ausgeschüttelt, die Phasen durch Zentrifugation getrennt und aus der Unterphase (Chloroform) ein Aliquot für die GC entnommen.

Trennbedingungen für die Trennung von (R)- und (S)-Phenylethanol am Gaschromato graphen: Stationäre Phase: Lipodex E, CD-Säule (Macherey und Nagel, Düren), Mobile Phase: Helium, Injektionsvolumen: 1 µl, Detektion: FID, Temperatur: 110°C. Unter die sen Bedingungen wird das Substrat Acetophenon bei 10,5 min eluiert, (S)-Phenylethanol bei 13,8 min und (R)-Phenylethanol bei 14,2 min. Die Retentionswerte für (S)- und (R)- Phenylethanol können mit einem kommerziell erhältlichen, racemischen Gemisch (Fa. Fluka, Buchs, Schweiz) erhalten werden. Nach 24 Std. sind mehr als 95% des Substrats umgesetzt worden, das GC-Chromatogramm zeigt folgende Werte: Acetophenon (Reten tionszeit 10,5 min): area = 9.800; (S)-Phenylethanol (Retentionszeit 13,8 min): area =< 500; (R)-Phenylethanol (Retentionszeit 14,2 min): area = 240.000.

Legende zu Abb. 1

DNA- und Proteinsequenz der rekombinanten ADH aus L. brevis in E. coli (obere Zeile jeweils die Nukleinsäuresequenz (SEQ. ID NO: 7), darunter die dem Triplettcode ent sprechende Aminosäure-Sequenz (im Einbuchstaben-Code, SEQ. ID NO: 8)). Die Se quenz beginnt mit Methionin, das über einen Start-Codon eingefügt worden ist. Dieses Methionin findet man nicht bei der entsprechenden Aminosäure-Sequenz, die durch Sequenzierung des reinen Proteins erhalten wurde (N-terminales Ende; s. Beispiel 3F und Beispiel 4).

Claims

1. Stabiles mikrobielles Enzym mit Alkohol-Dehydrogenase-Aktivität, dadurch ge kennzeichnet, daß es nach ca. 30 Minuten bei 20° bis 60°C mindestens 95% Restak tivität aufweist und bis zu einer spezifischen Aktivität von mindestens 400 U/mg reinigbar ist.

2. Enzym nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Stabilitätsmaximum bei ca. 40°C und pH 9.0 aufweist.

3. Enzym nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym ein Sta bilitätsmaximum bei pH 5.5 aufweist.

4. Enzym nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Aktivitätsmaximum des Enzyms bei ca. 50°C liegt.

5. Stabiles mikrobielles Enzym mit Alkohol-Dehydrogenase-Aktivität, dadurch ge kennzeichnet, daß es ein Molekulargewicht von ca. 104 kDa (Gelfiltration) aufweist und in Aminosäure-Position 1, 2, 5, 24 und/oder 34 entsprechend einen Serin-, Asparagin-, Asparaginsäure-, Theonin- und/oder Methioninrest aufweist.

6. Enzym nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym aus Stämmen der Gattung Lactobacillus erhältlich ist.

7. Enzym nach einem der vorangegangenen Ansprüche erhältlich aus Lactobacillus brevis (DSM 20054).

8. Stabile Alkohol-Dehydrogenase, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym im we sentlichen eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ. ID NO: 8 aufweist.

9. Stabile Alkohol-Dehydrogenase für die eine DNA-Sequenz gemäß SEQ. ID NO: 7 bzw. entsprechende Analoga codieren.

10. Verfahren zur Gewinnung des Enzyms nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß eine gegebenenfalls mit einem für ADH codierenden Gen trans formierte Mikroorganismusprobe aufgeschlossen wird und anschließend einer hy drophoben Interaktionschromatographie, einer Anionenaustausch- und Affinitäts chromatographie in geeigneten, Magnesiumionen enthaltenen Puffersystemen unter worfen wird.

11. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Mikroor ganismus um Lactobacillus brevis (DSM 20054) handelt.

12. Verfahren zur enantioselektiven Reduktion von organischen Ketoverbindungen, da durch gekennzeichnet, daß eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) wobei
R¹ oder R², verschieden oder identisch, Wasserstoff, zusammen oder einzeln, ein Alkyl-, Alkenyl-, Aryl- oder Arylenylrest, jeweils verzweigt oder geradkettig, be stehend aus 1 bis 20 C-Atomen, die durch ein oder mehrere Halogenatome, Nitro-, Hydroxyl- oder Alkoxyreste, wobei die Alkoxyreste aus 1 bis 20 C-Atomen auf weisen, eine gegebenenfalls substituierte C1-C10-Alkylengruppe, die durch ge sättigte, ungesättigte oder aromatische Stickstoff-, Sauerstoff- oder Schwefelhetero cyclen substituiert sind, oder ein gegebenenfalls substituierter polykondensierter ge sättigter und/oder aromatischer Rest sein können,
dadurch gekennzeichnet, daß eine Ketoverbindung bzw. ein entsprechendes Ge misch in Gegenwart einer Alkohol-Dehydrogenase gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 bzw. das Enzym enthaltenen Zellen zwischen ca. 20° und 60°C über einen Zeitraum von ca. 15 Minuten bis 3 Stunden inkubiert und die entsprechende R- Hydroxyverbindung isoliert wird.

13. Verfahren zur enantioselektiven Synthese von organischen Hydroxyverbindungen gemäß der allgemeinen Formel (II) wobei
R¹ oder R², verschieden oder identisch, Wasserstoff, zusammen oder einzeln, ein Alkyl-, Alkenyl-, Aryl- oder Arylenylrest, jeweils verzweigt oder geradkettig, be stehend aus 1 bis 20 C-Atomen, die durch ein oder mehrere Halogenatome, Nitro-, Hydroxyl- oder Alkoxyreste, wobei die Alkoxyreste aus 1 bis 20 C-Atomen auf weisen, eine gegebenenfalls substituierte C1-C10-Alkylengruppe, die durch ge sättigte, ungesättigte oder aromatische Stickstoff-, Sauerstoff- oder Schwefelhetero cyclen substituiert sind, oder ein gegebenenfalls substituierter polykondensierter ge sättigter und/oder aromatischer Rest sein können,
dadurch gekennzeichnet, daß ein racemisches Gemisch der organischen Hydroxyverbindung mit einer Alkohol-Dehydrogenase gemäß der Ansprüche 1 bis 9 bzw. das Enzym enthaltenen Zellen zwischen ca. 20° und 60°C über einen Zeit raum von ca. 15 Minuten bis 3 Stunden inkubiert und die entsprechende S-Hydroxyverbindung isoliert wird.

14. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß Magnesiumio nen zugegen sind und der pH-Wert zwischen 6 und 9 liegt.

15. Verfahren zur rekombinanten Herstellung einer stabilen Alkohol-Dehydrogenase, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleotidsequenz gemäß SEQ. ID NO: 7 in einer eukaryotischen oder prokaryotischen Zelle exprimiert wird.

16. Isoliertes DNA-Fragment, welches für eine stabile Alkohol-Dehydrogenase codiert, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ. ID NO: 7 bzw. eine damit hybridisierende Sequenz enthält.