KR20100065344A - 중간체의 거울상선택적인 효소 환원 방법 - Google Patents

중간체의 거울상선택적인 효소 환원 방법 Download PDF

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Abstract

일반식 I의 케토 화합물을 거울상선택적으로 효소 환원하는 방법
Figure pct00013
(I)
상기 식 I에서,
R은 아미노 관능기에 대한 임의의 보호기(t-부틸옥시카르보닐기(BOC), 벤질옥시카르보닐기, 9-플루오레닐메톡시카르보닐기)일 수 있으며,
X = -Cl, -CN, -OH, Br, F임.

Description

중간체의 거울상선택적인 효소 환원 방법{PROCESS FOR THE ENANTIOSELECTIVE ENZYMATIC REDUCTION OF INTERMEDIATES}
본 발명은 보조인자(cofactor)의 존재하에 산화환원효소를 이용하여 일반식 I의 화합물을 식 II(R,S-알코올) 및 III(S,S-알코올) 각각의 화합물로 거울상선택적으로 효소 환원하는 방법에 관한 것이다.
Figure pct00001
상기 식 I에서,
R은 아미노 관능기에 대한 임의의 보호기(t-부틸옥시카르보닐기, 벤질옥시카르보닐기, 9-플루오레닐메톡시카르보닐기)일 수 있으며,
X = -Cl, -CN, -OH, Br, F임.
Figure pct00002
Figure pct00003
바람직한 식 I의 화합물은 아미노 보호기로서 부틸옥시카르보닐기 또는 벤질옥시카르보닐기와 X 위치에 염소 원자를 포함한다.
일반식 II 및 III의 키랄 알코올은 HIV 치료를 위한 프로테아제 저해자의 제조에 있어 중요한 중간체이다. 이러한 프로테아제 저해자는 예컨대 Ritonavir, Amprenavir, Fosamprenavir, Atazanavir 또는 Darunavir이다.
식 II(R,S-알코올) 및 III(S,S-알코올) 각각의 중간체는, 예컨대 식 I의 대응되는 케토 화합물을, 현행 제조 방법으로 화학적으로 수행되는 거울상선택적인 환원에 의해 수득할 수 있다. 여기에서, 화학적으로 촉매화된 환원 반응은, 한편으로는 엄격한 반응 조건으로 인해 부산물의 발생을 초래할 수 있으며, 다른 한편으로는 만족스럽지 못한 거울상이성질체 및 부분입체이성질체 과잉을 초래할 수 있다는, 문제점이 있으며, 기술적으로는 상당한 노고를 통해서만 실현가능하다. 그에 따라, 거울상이성질체적으로 다량으로 존재하는 형태인 식 II (R,S-알코올)의 중간체는 식 III(S,S-알코올) 보다 화학적으로 수득하기 더 어렵다.
이런 이유로, 꽤 오랜 시간 동안, 상기 중간체를 거울상선택적으로 환원시킬 수 있는 생물촉매적 과정을 개발하기 위한 노력을 기울여왔다. 생물촉매적 과정은 일반적으로 온건한 조건에서 이루어지기 때문에, 추가적인 부산물의 생성없이 식 I의 케토 화합물을 환원시킬 수 있을 것으로 예상할 수 있었다. 그러나, 지금까지, 분리된 효소를 이용한 효소적 환원을 가능하게 하는 적합한 생물 촉매를 찾는 것은 불가능하였다.
지금까지, 전체 세포 프로세스로 로도코커스 또는 스트렙토마이세스 균주를 이용한 식 I의 케톤 반응이 개시되어 있는 공개문헌은 수개에 불과한 것으로 알고 있다(Tetrahedron Asymmetry 14 (2003) 3105-3109, Tetrahedron Asymmetry 8 (1997) p. 2547). 그러나, 그에 따른 반응은 천연 균주의 전체 세포 및 세포용혈물 각각에서만 이루어졌으며, 코엔자임의 재생 없이 2% 이하의 꽤 낮은 농도에서만 수행되었다. 공업적인 규모로 이용가능한 효소 환원 프로세스는 지금까지 존재하지 않으며, 이 반응에 관여하는 효소는 지금까지 분리 또는 동정되지 않았다.
본 발명의 목적은 거울상이성질체적으로 순수하며, 각각 거울상이성질체적으로 풍부한 일반식 II 및 III의 중간체를 고수율로, 그리고 임의의 부산물 없이 높은 거울상이성질체 순도로 경계적으로 제조할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에서, 상기 목적은 식 II(R,S-알코올)의 화합물의 제조에 사용되는 산화환원효소가
(a) 서열번호 1, 2, 3 또는 4에 따른 아미노산 서열을 포함하거나,
(b) 서열번호 1, 2, 3 또는 4의 아미노산 서열과 60% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하거나,
(c) 서열번호 1, 2, 3 또는 4의 아미노산 서열과 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하거나,
(d) 서열번호 16, 17, 18 또는 19의 핵산 서열에 의해 코딩하거나,
(e) 엄격한 조건하에서 서열번호 16, 17, 18 또는 19와 혼성화되는 핵산 서열에 의해 코딩되거나, 또는
(f) 아미노산 220 내지 260개의 길이이며, 서열번호 31 내지 51의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 수종의 부분 서열을 포함하며, 식 I의 화합물을 바람직하게는 식 II의 화합물로 환원시키는 것을 특징으로 하는, 최초로 언급된 유형의 프로세스에 의해 달성된다.
nalvtgasrgig (31) nalvtggsrgig (32), gysvt (33), gynvt (34), gygitl (35), gygvt (51)
vlaklp (36), vkaklp (37)
fkgaplpa (38), frgaplpa (39), lkgaplpa (40),
spialtk (41), spvaltk (42), sqialtq (43),
avysask (44), avysatk (45), gvysatk (46),
pikgwi (47), piegwi (48), piggwi (49) and pisgwi (50),
또한, 상기 목적은 식 III(S,S-알코올)의 화합물의 제조에 사용되는 산화환원효소가
(a) 서열번호 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15에 따른 아미노산을 포함하거나,
(b) 서열번호 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15에 따른 아미노산 서열과 60% 이상 동일한 아미노산을 포함하거나,
(c) 서열번호 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30의 핵산 서열에 의해 코딩되거나,
(d) 엄격 조건하에서 서열번호 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30과 혼성화되는 핵산 서열에 의해 코딩되거나, 또는
(e) 아미노산 220 내지 260개의 길이이며, 서열번호 31 내지 66의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 수종의 부분 서열을 포함하며, 식 I의 화합물을 바람직하게는 식 III의 화합물로 환원시키는 것을 특징으로 하는, 최초로 언급된 유형의 프로세스에 의해 달성된다.
nalvtgasrgig (31) nalvtggsrgig (32), gysvt (33), gynvt (34), gygitl (35), gygvt (51)
vlaklp (36), vkaklp (37)
fkgaplpa (38), frgaplpa (39), lkgaplpa (40), fkaaplpa (52), fkgsplpa (53)
spialtk (41), spvaltk (42), sqialtq (43),
avysask (44), avysatk (45), gvysatk (46),
pikgwi (47), piegwi (48), piggwi (49) and pisgwi (50),
gigrat (54), gigrasa (55), gigret (56),
nnagig (57), nnagieg (58),
irvvaiapg (59), irvnaiapg (60), irvnaicpg (61), irvvgiapg (62),
peqiagav (63), peaianav (64), peevanav (65), peaianav (66)
식 I의 화합물을 바람직하게는 식 II의 화합물로 환원시키는 폴리펩타이드는, 최적 반응 조건 하에서 달성가능한 R,S-알코올의 최대 거울상이성질체 과잉이 50% 이상인 폴리펩타이드인 것으로 이해된다. 최적 반응 조건은 폴리펩타이드가 R,S-알코올의 최고 거울상이성질체 과잉을 도출하는 폴리펩타이드 반응 조건인 것으로 이해된다.
서열번호 1, 2, 3 및 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 산화환원효소 활성을 나타내며, 식 I의 화합물을 바람직하게는 식 II(R,S-화합물)의 화합물로 환원시키는데 사용할 수 있는 것으로 확인되었다. R,S-알코올의 달성가능한 거울상이성질체 과잉은 >50%이고, 바람직하기로는 >80%, 특히 바람직하게는 >95%이다. 서열번호 1을 사용하였을 때 달성되는 거울상이성질체 과잉은, 예컨대 R,S-화합물(식 II)의 최대 >99%이다.
유사하게, 서열번호 5 내지 15의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 산화환원효소 활성을 나타내며, 식 I의 화합물을 바람직하게는 식 III(S,S-화합물)로 환원시키는데 사용할 수 있는 것으로 확인되었다. R,S-알코올의 달성가능한 거울상이성질체 과잉은 >80%이며, 바람직하게는 >90%이며, 특히 바람직하게는 >95%이다. 서열번호 5, 6, 9 또는 12를 이용하였을 때 달성되는 거울상이성질체 과잉은 R,S-화합물(식 II)의 최대 >99%일 수 있다.
예컨대 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7 및 15 등의 언급된 다수의 산화환원효소는, 2차 알코올을 환원시켜 환원 과정 동안에 형성되는 산화된 보조인자를 재생할 수 있다는 추가적인 이점을 가진다. 따라서, 상기 산화환원효소의 특히 경제적인 이점은, 추가적인 효소가 종래의 방법과는 대조적으로 보조인자 재생에 사용되지 않는다는 것이다.
DNA 서열 서열번호 20은 서열번호 5를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 것으로서, 예컨대 루브로박터 자일라노필러스(Rubrobacter xylanophilus) DSM 9941로부터 수득가능한다.
DNA 서열 서열번호 21은 서열번호 6을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 것으로서, 예컨대 유기체 지오바실러스 써모데니트리피칸스(Geobacillus thermodenitrificans) DSM 465의 게놈으로부터 수득가능하다.
DNA 서열 서열번호 22는 서열번호 7을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 것으로서, 예컨대 유기체 클로로플렉수스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus) 636의 게놈으로부터 수득가능하다.
DNA 서열 서열번호 23 또는 DNA 서열 서열번호 24는 서열번호 8 또는 9 각각을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하며, 예컨대 칸디다 마그놀리애(Candida magnoliae) DSMZ 70638로부터 수득가능하다.
DNA 서열 서열번호 26은 서열번호 11을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 것으로서, 예컨대 칸디다 마그놀리애(Candida magnoliae) DSMZ 70639로부터 수득가능하다.
DNA 서열 서열번호 16은 서열번호 1을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 것으로서, 예컨대 칸디다 마그놀리애(Candida magnoliae) CBS 6396으로부터 수득가능하다.
또한, 서열번호 2, 3, 4, 12, 13, 14 및 15의 산화환원효소는, 예컨대 균주 칸디다 마그놀리애 CBS 5659, CBS 7318, CBS 2798, JCM 9448, 칸디다 지오카레스(Candida geochares) MUCL 29832, 칸디다 spec. MUCL 40660, 칸디다 그로펜기에세리(Candida gropengiesseri) MUCL 29836 중에서 상동성 스크리닝에 의해 수득가능하다.
따라서, 본 발명은, 화합물 II 또는 III 중 하나가, 서열번호 1 내지 15의 아미노산 서열 중 하나를 포함하는 폴리펩타이드, 또는 서열번호 1 내지 15의 아미노산 서열 중 하나와 50% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 즉 하나 이상의 아미노산의 치환, 삽입, 결손 또는 부가에 의해 서열번호 1 내지 15의 서열로부터 유래될 수 있는 폴리펩타이드를 이용하거나, 또는 서열번호 16 내지 30의 핵산 서열들 중 하나 또는 서열번호 16 내지 30의 서열들 중 하나와 엄격 조건하에서 혼성화되는 핵산 서열에 의해 코딩되는 폴리펩타이드를 이용하여, 명백하게 과잉으로 형성되는 것을 특징으로 하는, 일반식 I의 케토 화합물을 일반식 II 및 III 각각의 화합물로 환원시키는 방법에 관한 것이다.
예컨대 서열번호 16과 엄격한 조건하에서 혼성화되는 핵산 서열은 콜로니 혼성화 방법, 플라그 혼성화 방법, 서든 혼성화 방법 또는 동종 방법을 통해 서열번호 16을 DNA 프로브로서 이용하여 동정할 수 있는 폴리뉴클레오티드인 것으로 이해된다.
이를 위해, 필터에 고정시킨 폴리뉴클레오티드는, 0.7-1 M NaCl 용액 중에서 60 ℃의 온도에서 예컨대 서열번호 16과 혼성화시킨다. 혼성화는 예컨대 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 또는 유사한 공개문헌에 기술된 바와 같이 수행한다. 그 후, 필터를 0.1 내지 2배의 SSC 용액으로 65 ℃에서 헹구고, 이때 1x SSC 용액은 150 mM NaCl 및 15 mM 소듐 시트레이트로 구성된 혼합물이다.
또한, 본 발명은 아미노산 서열들 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14 및 서열번호 15의 폴리펩타이드 뿐만 아니라 아미노산 서열 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14 및 서열번호 15 중 하나와 55% 이상, 바람직하게는 65% 내지 75%, 특히 바람직하게는 75% 이상 동일한 폴리펩타이드, 즉, 하나 이상의 아미노산의 치환, 삽입, 결손 또는 부가에 의해 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14 및 서열번호 15로부터 유래될 수 있는 폴리펩타이드에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 핵산 서열들 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29 또는 서열번호 30에 의해 코딩되는 폴리펩타이드, 또는 서열들 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29 또는 서열번호 30 중 하나와 엄격 조건하에서 혼성화되는 핵산 서열에 의해 코딩되는 폴리펩타이드에 관한 것이다.
본 발명에 따른 방법에서, 서열번호 1-15의 서열을 포함하는 폴리펩타이드 및 상기 폴리펩타이드로부터 유도할 수 있는 폴리펩타이드는, 각각 완전히 정제된 상태, 부분적으로 정제된 상태 또는 서열번호 1-15의 폴리펩타이드들 중 하나를 포함하는 세포 중 어느 하나로 사용할 수 있다. 그에 따라 사용되는 세포는 천연 상태, 투과화된 상태 또는 용혈된 상태로 제공될 수 있다. 서열번호 1-15의 서열 및 그로부터 유도가능한 유도체를 포함하는 폴리펩타이드는 각각 예컨대 에스케리치나 콜리(Escherichia coli) 등의 적합한 숙주 유기체에서 과발현시키고, 재조합 폴리펩타이드는 일반식 I의 하이드록시 케톤의 환원에 사용한다.
본 발명에 따른 효소적 환원은, 식 I의 불안정한 화합물의 분해, 즉 원하지 않는 부산물의 형성을 최대한 피할 수 있는 온건한 조건 하에서 진행한다. 본 발명에 따른 방법에서는, 사용되는 폴리펩타이드에 따라, 식 II(R,S-화합물)의 화합물의 거울상이성질체 순도는 R,S-화합물이 50% 이상, 최대 99% 이상이다.
식 III(S,S-화합물)의 화합물의 경우, 본 발명에 따른 방법에서, 사용되는 폴리펩타이드에 따라, 식 III(S,S-화합물)의 화합물의 거울상이성질체 순도는 R,S-화합물이 80% 이상, 최대 99%이다.
본 발명의 바람직한 구현예는, 이 방법에 사용되는 보조인자를 공동기질(cosubstrate)을 이용하여 계속적으로 환원시키는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, NAD(P)H는 보조인자로 사용되며, 환원 반응으로 생겨나는 NAD(P)는 공동기질에 의해 NAD(P)H로 다시 환원된다.
본 발명에 따른 방법에서, 산화환원효소/탈수소효소에 의해 생성된 산화된 보조인자 NAD 또는 NADP는 바람직하게는 연속적으로 재생된다.
본 발명에 따른 모든 방법들에 대한 바람직한 구현예에서, 산화된 보조인자 NAD 또는 NADP는 알코올의 산화에 의해 재생된다.
2-프로판올, 2-부탄올, 2-펜탄올, 3-펜탄올, 4-메틸-2-펜탄올, 2-헵탄올, 2-옥타놀 또는 사이클로헥사놀 등의 2차 알코올이 공동기질로서 바람직하게 사용된다. 특히 바람직한 구현예에서, 2-프로판올 또는 4-메틸-2-펜탄올이 코엔자임 재생에 사용된다. 재생에서의 공동기질의 양은 총 부피를 기준으로 5 내지 95 부피 %일 수 있다.
바람직하게는, 일반식 RXRYCHOH의 이차 알코올은 보조인자 재생에 사용되며, RX 및 RY는 독립적으로 수소, 분지 또는 비분지형의 C1-C8-알킬기이고, Ctotal ≥ 3이다.
본 발명에 따른 방법에 대한 추가적인 바람직한 구현예에서, 추가적인 산화환원효소/탈수소효소를 보조인자의 재생을 위해 첨가한다.
추가적으로 바람직한 구현예에서, 추가적인 알코올 탈수소효소를, 또한, 보조인자의 재생을 위해 첨가할 수 있다. 적합한 NADH-의존적인 알코올 탈수소효소로는, 예컨대, 빵 효모, 칸디다 파랍실로시스(Candida parapsilosis)(CPCR) (US 5,523,223 및 US 5,763,236, Enzyme Microb. Technol., 1993, 15(11):950-8), 피키아 캡술라타(Pichia capsulata)(DE 10327454.4), 로도코커스 에리트로폴리스(Rhodococcus erythropolis)(RECR)(US 5,523,223), 노르카르디아 푸스카(Norcardia fusca )(Biosci. Biotechnol. Biochem., 63(10), 1999, p. 1721-1729; Appl. Microbiol. Biotechnol,. 2003, 62(4):380-6; Epub 2003, Apr. 26) 또는 로도코커스 루베르(Rhodococcus ruber )(J. Org. Chem., 2003, 68(2):402-6)로부터 수득가능하다. 이들 알코올 탈수소효소에 적합한 공동기질은, 예컨대 2-프로판올(이소프로판올), 2-부탄올, 2-펜탄올, 4-메틸-2-펜탄올, 2-옥탄올 또는 사이클로헥산올 등의 이미 언급한 2차 알코올이다.
NADPH의 재생에 적합한 이차 알코올 탈수소효소는 예컨대 전술한 것이며, 락토바실랄레 목의 유기체, 예컨대 락토바실러스 케피르(Lactobacillus kefir) (US 5,200,335), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis )(DE 19610984 A1; Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 2000 Dec; 56 Pt 12:1696-8), 락토바실러스 마이너(Lactobacillus minor )(DE 10119274), 루코노스톡 카르노섬(Leuconostoc carnosum)(A 1261/2005, Kl. C12N)으로부터 분리된 것 또는 기술된 바와 같이 써모아네로븀 브로키(Thermoanerobium brockii), 써모아네로븀 에탄올리쿠스(Thermoanerobium ethanolicus) 또는 클로스트리듐 베이어린키(Clostridium beijerinckii) 유래의 것이다.
그러나, 다른 효소 시스템도 원칙적으로 보조인자 재생에 사용할 수 있다. 예컨대, 보조인자 재생은 NAD- 또는 NADP-의존적인 포르메이트 탈수소효소를 이용하여 수행할 수 있다(Tishkov et al., J. Biotechnol. Bioeng. [1999] 64, 187-193, Pilot-scale production and isolation of recombinant NAD and NADP specific formate dehydrogenase). 포르메이트 탈수소효소의 적합한 공동기질은, 예컨대 암모늄 포르메이트, 소듐 포르메이트 또는 칼슘 포르메이트 등의 포름산의 염이다.
본 발명에 따른 방법에서, 일반식 I의 화합물은 반응 배치에 총 부피를 기준으로 바람직하게는 10 g/L 내지 500 g/L, 바람직하게는 25 g/L 내지 300 g/L, 특히 바람직하게는 50 g/L 내지 200 g/L의 양으로 사용된다.
효소 환원이 진행되는 반응 혼합물의 수계 부분에는, 바람직하게는 pH 5-10, 바람직하게는 pH 6-9의 버퍼, 예컨대 포타슘 포스페이트, 트리스/HCl 또는 트리에탄올아민 버퍼가 포함된다. 또한, 버퍼에는 예컨대 아연 이온 또는 마그네슘 이온 등의 효소를 안정화 또는 활성화시키기 위한 이온이 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 방법 수행시, 온도는 적합하게는 약 10 ℃ 내지 70 ℃, 바람직하게는 20 ℃ 내지 45 ℃의 범위이다.
본 발명에 따른 방법의 다른 바람직한 구현예에서, 효소 반응은 제한된 수준으로만 물에 분산가능하거나 물에 분산되지 않는, 유기 용매의 존재하에서 수행된다. 상기 용매는, 예컨대 대칭 또는 비대칭 디(C1-C6)알킬 에테르, 직쇄 또는 분지쇄의 알칸 또는 사이클로알칸, 또는 동시에 공동기질인 수불용성 이차 알코올이다. 바람직한 유기 용매는 디에틸 에테르, t-부틸 메틸 에테르, 디이소프로필 에테르, 디부틸 에테르, 부틸 아세테이트, 헵탄, 헥산, 2-옥타놀, 2-헵타놀, 4-메틸-2-펜탄올 및 사이클로헥사놀이다. 이 경우, 용매도 보조인자 재생의 공동기질로서 제공될 수 있다.
수불용성 용매 및 공동기질을 각각 사용하는 경우, 반응 배치는 수상 및 유기상으로 구성된다. 이의 용해성에 따라, 상기 식의 화합물은 유기상과 수상으로 분별된다. 일반적으로, 유기상은 총 반응 부피를 기준으로 5-95%, 바람직하게는 10-90%의 비율이다. 2가지 액체 상은 바람직하게는, 서로 큰 표면적을 형성하도록 기계적으로 혼합한다. 또한, 이러한 구현예에서, 예컨대 효소 환원 반응 동안에 형성되는 NAD(P)는 전술한 바와 같은 공동기질을 이용하여 NAD(P)H로 다시 환원할 수 있다.
보조인자, 특히 NADH 또는 NADPH 각각의 농도는 수상에서 일반적으로 0.001 mM - 10 mM, 특히 0.01 mM - 1　mM 범위이다.
본 발명에 따른 방법에서 달성되는 TTN(총 턴오버 수 = 식 I의 환원된 화합물의 mol/사용한 보조인자의 mol)은 정상적으로 102 - 105, 바람직하게는 ≥103의 범위이다.
본 발명에 따른 방법에서, 또한 산화환원효소/탈수소효소의 안정화제를 사용할 수 있다. 적합한 안정화제로는 예컨대, 글리세롤, 소르비톨, 1,4-DL-디티오트레이톨(DTT) 또는 디메틸 설폭사이드(DMSO)이다.
본 발명에 따른 방법은, 예컨대 유리 또는 금속으로 제조된 밀폐된 반응 용기내에서 수행된다. 이를 위해, 성분을 각각 반응 용기로 옮기고, 예컨대 질소 또는 공기 대기 하에서 교반한다.
본 발명의 또다른 가능한 구현예에서, 산화된 공동기질(예, 아세톤)은 계속적으로 제거할 수 있으며, 및/또는 공동기질(예, 2-프로판올)은 반응 산물쪽으로 반응 평형을 이동시키기 위해 연속적인 방식으로 새롭게 첨가할 수 있다.
다른 구현예에서, 서열번호 1 -15에 따른 산화환원효소의 첨가 및/또는 공동기질의 첨가는 또한 공정이 진행되는 동안에 조금씩 투입할 수 있다.
반응이 종료된 후, 반응 혼합물을 가공한다. 이를 위해, 예컨대 수상을 유기상으로부터 선택적으로 분리하고, 산물이 포함된 유기상을 여과한다. 선택적으로, 수상을 또한 추출하여 유기상과 같이 추가적으로 가공할 수 있다. 그 후, 용매를 유기상으로부터 증발시켜, 일반식 II 또는 III의 산물을 조산물로 수득한다. 이 조산물은 결과물의 합성에 직접 사용하거나 또는 추가적으로 정제할 수 있다.
하기에서 본 발명은 실시예를 들어 추가적으로 설명된다.
실시예 1
루브로박터 자일라노필러스 DSM 9941로부터 산화환원효소(서열번호 5) 클로닝 및 제공
A) 루브로박터 자일라노필러스 DSM 9941의 배양
루브로박터 자일라노필러스 DSM 9941 세포를 하기 배지에서 50 ℃(pH7.2)에서 140 rpm으로 박테리아-교반기에서 배양하였다: 0.1% 효모 추출물, 0.1% 트립톤, 0.004% CaSO4 x 2 H2O, 0.02% MgCl2 x 6 H2O, 0.01% 니트릴로트리아세트산, 100 ml 포스페이트 버퍼[5.44 g/L KH2PO4, 43 g/L Na2HPO4 x 12 H2O], 500 ㎕/L0.01 M Fe 사이트레이트, 500 ㎕/L 미량 원소[500 ㎕/L H2SO4, 2.28 g/L MnSO4 x H2O, 500 mg/L ZnSO4 x 7 H2O, 500 mg H3BO3, 25 mg/L CuSO4 x 5 H2O, 25 mg/L Na2MoO4 x 2 H2O, 45 mg/L CoCl2 x 6 H2O]. 배양 6일째에, 원심분리에 의해 세포를 분리하고, -80 ℃에 저장하였다.
B) 선택적인 산화환원효소를 코딩하는 유전자의 증폭
게놈 DNA를 "Molecular Cloning" by Manniatis & Sambrook에 기술된 방법에 따라 추출하였다. 수득되는 핵산은, NCBI 데이타베이스에서 46106817로 공개된 유전자 서열로부터 유래된 특이적인 프라이머를 사용한 중합효소 연쇄 반응(PCR)의 주형으로서 제공하였다. 프라이머는 5'-말단 위치에 제공되며, 이후 발현 벡터에 클로닝하기 위한 엔도뉴클레아제 Nde I 및 Hind　III 또는 Sph I 각각의 제한효소 부위(서열번호 67, 68, 69)가 있다.
증폭은 PCR 버퍼 [10 mM Tris-HCl, (pH 8.0); 50 mM KCl; 10 mM MgSO4; 1 mM dNTP Mix; 각각의 프라이머 20 pMol 및 2.5 U의 Platinum Pfx DNA 중합효소(Invitrogen)]에서 500 ng의 게놈 DNA를 사용하여 수행하였고, 하기 온도 사이클을 사용하였다:
사이클 1: 94 ℃, 2 min
사이클 2 x 30: 94 ℃, 15 sec
54 ℃, 30 sec
68 ℃, 60 sec
사이클 3: 68 ℃, 7 min
4 ℃, ∞
약 750 bp 크기의 제조되는 PCR 산물을 1% 아가로스겔 상에서 정제한 후 엔도뉴클레아제 Nde I 및 Hind III 또는 Sph I 및 Hind III 각각을 사용하여 절단한 다음, 동일한 엔도뉴클레아제로 처리한 pET21a 벡터(Novagen) 또는 pQE70 벡터(Qiagen)의 벡본에 각각 삽입하였다. 라이게이션 배치 2 ul를 E. coli Top 10 F` 세포(Invitrogen)에 형질전환한 후, 암피실린-내성 콜로니의 플라스미드 DNA에서 엔도뉴클레아제 Nde I 및 Hind III 또는 Sph I 및 Hind III 각각을 이용한 제한효소 분석에 의해 750 bp의 삽입체 존재를 조사하였다. 이 단편을 가지고 있는 클론의 플라스미드 조제물을 서열분석한 후, E.coli BL21 Star (Invitrogen) 및 E. coli RB791 (genetic stock, Yale)에 각각 형질전환하였다.
C) E. coli 세포에서 폴리펩타이드 서열번호 5의 효율적인 발현
서열번호 5의 폴리펩타이드를 E.coli에서 효율적으로 발현시키기 위해, 서열번호 70의 코딩 DNA를 발현 벡터에 클로닝하기 위한 PCR 반응에 주형으로서 사용하였다. 첫번째 영역에서, DNA 서열은 종래에 공지된 DNA 서열(서열번호 20)과는 153개의 염기가 상이하였다. 이러한 변형은 보존적인 변형이며, 아미노산 서열에는 차이가 없었다.
증폭은, PCR 버퍼[10 mM Tris-HCl, (pH 8.0); 50 mM KCl; 10 mM MgSO4; 1 mM dNTP Mix; 각각 20 pMol의 프라이머(서열번호 71, 서열번호: 68) 및 2,5 U의 Platinum Pfx DNA 중합효소(Invitrogen)] 중에서 50 ng의 서열번호 70의 DNA를 주형으로 이용하고, 하기 온도 사이클로 수행하였다:
사이클 1: 94℃, 2 min
사이클 2 x 30: 94℃, 40 sec
56℃, 30 sec
68℃, 60 sec
사이클 3: 68℃, 7 min
4℃, ∞
약 750 bp 크기의 제조되는 PCR 산물을 1% 아가로스겔 상에서 정제한 후 엔도뉴클레아제 Nde I 및 Hind III을 사용하여, 동일한 엔도뉴클레아제로 처리한 pET21a 벡터(Novagen) 벡본에 각각 삽입하였다. 라이게이션 배치 2 ul를 E. coli Top 10 F` 세포(Invitrogen)에 형질전환한 후, 암피실린-내성 콜로니의 플라스미드 DNA에서 엔도뉴클레아제 Nde I 및 Hind III를 이용한 제한효소 분석에 의해 750 bp의 삽입체 존재를 조사하였다. 이 단편이 있는 클론의 플라스미드 조제물을 서열분석한 후, E.coli BL21 Star (Invitrogen)에 형질전환하였다.
D.) 루브로박터 자일라노필러스 DSM 9941로부터 산화환원효소의 제조
발현 구조체로 형질전환된 각각의 E. coli 균주 BL21 Star (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) 및 RB791 (E. coli genetic stock, Yale, USA)을 암피실린 (50 ㎍/ml)이 첨가된 배지(1% 트립톤, 0.5% 효모 추출물, 1% NaCl)에서 550 nm에서 광학밀도가 0.5가 될 때가지 배양하였다. 여기에 이소프로필티오갈락토시드(IPTG)를 0.1 mM로 첨가하여, 재조합 단백질의 발현을 유도하였다. 25 ℃, 220 rpm에서 16시간 유도한 후, 세포를 회수하여 -20 ℃에서 동결시켰다.
효소 회수를 위해, 세포 30 g을 150 ml의 트리에탄올아민 버퍼(100 mM, pH = 7, 2 mM MgCl2, 10% 글리세롤)에 현탁하고, 고압 호모게나이저로 분쇄하였다. 그 후, 효소 용액에 150 ml의 글리세롤을 혼합한 다음 -20 ℃에 보관하였다.
이렇게 수득한 효소 용액은 식 I의 환원 반응에 사용하였다(실시예 3).
실시예 2에 언급된 방법과 유사하게, 서열번호 6 및 7의 산화환원효소도 제공할 수 있다.
실시예 2
분자 스크리닝에 의한 칸디다 마그놀리애로부터 산화환원효소(서열번호 1)의 클로닝 및 제공
A) 산화환원효소의 분자 스크리닝
칸디다 마그놀리애 CBS 6396 세포로부터 분리한 게놈 DNA를 PCR을 통한 분자 스크리닝의 주형으로 사용하였다. 증폭은 PCR 버퍼[16 mM (NH4)2SO4 ; 67 mM Tris-HCl pH 8.3 (25℃); 1.5 m MgCl2; 0.01% Tween 20; 0.2 mM dNTP Mix; 각각 30 pMol의 프라이머(서열번호: 72, 서열번호: 73) 및 1.25 U의 Bio Therm Star 중합효소(Genecraft)] 중에서 칸디다 마그놀리애 CBS 6396 세포에서 분리한 게놈 DNA 50 ng을 주형으로 이용하여, 하기 사이클로 수행하였다:
사이클 1: 95℃, 7 min
사이클 2 x 28: 94℃, 40 sec
온도 감소 시작 63℃ -0.5℃/단계, 30 sec
68℃, 60 sec
x 20: 94℃, 40 sec
53℃, 40 sec
70℃, 60 sec
사이클 3: 70℃, 7 min
4℃, ∞
PCR 배치 전체를 1% 아가로스겔에서 분리한 후, 약 400 bp 밴드를 확인하여, DNA 서열분석을 위한 Topo-TA 벡터(Invitrogen)에 오버행잉(overhanging) 아데노신 모이어티를 통해 클로닝하였다.
이러한 스크리닝 반응으로부터 제조된 DNA 밴드는 137개의 아미노산 잔기로 구성된 산화환원효소 단편에 해당되는 오픈 리딩 프래임을 나타내었다.
B) 분리(전체 및 mRNA)
신선한 세포 600 mg을 빙냉한 LETS 버퍼 2.5 ml에 재현탁하였다. 질산으로 헹구고 3 ml 페놀(pH 7.0)으로 평형화한 유리 비드 5 ml (약 20 g)을 상기 세포 현탁물에 첨가하였다. 전체 배치를 30초간 볼텍싱 및 얼음 위에서 30초간 냉각을 교대로 총 10분간 처리하였다. 그런 후, 빙냉한 LEST 버퍼 5 ml을 첨가하여, 다시 잘 볼텍싱하였다. 이 세포 현탁물을 4 ℃에서 11,000g로 5분간 원심분리하였다. 수층을 회수하고, 동일 부피의 페놀 : 클로로포름: 이소아밀 알코올(24:24:1) 혼합물로 2번 추출하였다. 그런 후, 클로로포름으로 추출하였다. 최종 추출 후, 5 M LiCl2을 1/10 부피비로 첨가하여, 4시간 동안 -20 ℃에서 총 RNA를 침전시켰다.
이렇게 수득된 총 RNA 1 mg은 Oligo-dT 셀룰로스 (NEB Biolabs)에 사용하여 mRNA 분자 증폭을 실시하였다.
산화환원효소를 코딩하는 전체 서열의 결정은 "Molecular Cloning" by Manniatis & Sambrook에 기술된 방법에 따라 RACE(cDNA 말단의 빠른 증폭)에 의해 수행하였다.
산화환원효소를 코딩하는 유전자 서열은 720 bp를 포함하며, 이는 239개의 아미노산 잔기 길이에 해당하였다.
C) 칸디다 마그놀리애 CBS 6396으로부터 PCR 에 의한 단쇄 ADh 를 코딩하는 전장 전사체의 합성
전장의 전사체를 적합한 발현 시스템에 클로닝하기 위한, 특이적인 프라이머를 제작하였다. 이를 위해, Nde 　I 인지 서열이 있는 5'-프라이머와 Hind III 인지 서열이 있는 3'-프라이머를 만들었다(서열번호:74, 서열번호:75). 칸대다 마그놀리애 CBS 6396 세포로부터 분리한 게놈 DNA는 중합효소 연쇄 반응에 주형으로 사용하였다. 증폭은 PCR 버퍼[10 mM Tris-HCl (pH 8.0); 50 mM KCl; 10 mM MgSO4; 1 mM dNTP Mix; 각각 20 pMol의 프라이머 및 2.5 U의 Platinum Pfx DNA 중합효소 (Invitrogen)] 중에서 주형 50 ng을 이용하여, 하기 사이클로 수행하였다:
사이클 1: 94℃, 2 min
사이클 2 x 30: 94℃, 15 sec
58℃, 30 sec
68℃, 75 sec
사이클 3: 68℃, 7 min
4℃, ∞
제조되는 PCR 산물을 1% 아가로스겔 상에서 정제한 후 엔도뉴클레아제 Nde I 및 Hind III을 사용하여 절단하고, 동일한 엔도뉴클레아제로 처리한 pET21a 벡터(Novagen) 벡본에 삽입하였다. 라이게이션 배치 2 ul를 E. coli Top 10 F` 세포(Invitrogen)에 형질전환한 후, 암피실린-내성 콜로니의 플라스미드 DNA에서 엔도뉴클레아제 Nde I 및 Hind III를 이용한 제한효소 분석에 의해 750 bp의 삽입체 존재를 조사하였다. 발현 구조체 pET21-MIX를 서열분석하였다. 단쇄 산화환원효소를 코딩하는 칸디다 마그놀리애 유래 유전자는 총 720 bp(서열번호 16)의 오픈 리딩 프래임을 나타내었으며, 이는 239개의 아미노산으로 이루어진 단백질(서열번호 1)에 해당되었다.
D) E. coli 세포에서 재조합 산화환원효소의 발현
컴피턴트 E. coli StarBL21(De3) 세포(Invitrogen)와 RB791 세포(E.coli genetic stock, Yale, USA)를 각각 산화환원효소를 코딩하는 발현 구조체 pET21-MIX로 형질전환하였다. 그런 후, 발현 구조체로 형질전환된 E. coli 콜로니는 50 ㎍/ml의 암피실린 또는 40 ㎍/ml의 카나마이신 각각이 첨가된 LB 배지(1% 트립톤, 0.5% 효모 추출물, 1% NaCl) 200 ml에서, 550 nm에서의 광학 밀도가 0.5가 될 때까지 배양하였다. 여기에 이소프로필티오갈락토시드(IPTG)를 0.1 mM로 첨가하여, 재조합 단백질의 발현을 유도하였다. 25 ℃, 220 rpm에서 16시간 유도한 후, 세포를 회수하여 -20 ℃에서 동결시켰다. 활성 테스트를 위해, 세포 10 mg을 100 mM TEA 버퍼 pH 7.0, 500 ㎕, 1 mM MgCl2 및 500 ㎕ 유리 비드와 혼합한 다음, 글로브 밀(globe mill)을 이용하여 10분간 분쇄하였다. 수득되는 분해물을 각 측정에 대한 희석 상태로 사용하였다.
활성 테스트는 다음과 같이 준비하였다: 960 ㎕의 100 mM TEA 버퍼 pH 7.0, 1 mM MgCl2, 160 ㎍ NADPH, 10 ㎕의 희석된 세포 분해물. 반응은, 반응 혼합물에 100 mM 기질 용액 10　㎕를 첨가하여 시작하였다.
효소를 대량 회수하기 위해, 세포 30 g을 150 ml의 트리에탄올아민 버퍼(100 mM, pH = 7, 2 mM MgCl2, 10% 글리세롤)에 현탁하고, 고압 호모게나이저로 분쇄하였다. 그 후, 효소 용액에 150 ml의 글리세롤을 혼합한 다음 -20 ℃에 보관하였다.
실시예 2에 언급된 방법과 유사하게, 서열번호 2, 3, 4, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15의 산화환원효소도 제공할 수 있다.
실시예 3:
식 I의 화합물의 환원 특성과 관련있는 , 서열번호 1 내지 15의 산화환원효소의 특징
식 I의 화합물의 변환에 대해 서열번호 1 내지 15의 산화환원효소를 다음과 같이 평가하였다.
반응 배치 A (코엔자임 재생 안함 )
160 ㎕ 버퍼(트리에탄올아민 100 mM pH = 7, 1mM MgCl2, 10% 글리세롤)
150 ㎕ NAD(P)H (40 mg /ml)= 6 mg
20 ㎕ 2-프로판올
2 mg 식 I의 화합물
50 ㎕ 실시예 1D에 따른 효소 용액
반응 배치 B (코엔자임 재생함)
400 ㎕ 버퍼(트리에탄올아민 100 mM pH = 7, 1mM MgCl2, 10% 글리세롤)
0.05 mg NAD(P)H
50 ㎕ 2-프로판올
10 mg 식 I의 화합물
50 ㎕ 실시예 1D에 따른 효소 용액
샘플 A 및 B를 24시간 인큐베이션한 다음, 아세토니트릴 1 ml을 각각에 첨가하여, 반응을 종료시킨 다음, 반응 배치를 원심분리하고, HPLC 분석 바셀로 이동시켰다(1 mg/ml).
반응 배치는 HPLC(Nucleodur 100 5 C18 ec, 125 mm, 직경 4 mm, Macherey-Nagel)로 분석하였다. 아세토니트릴(B)와 물(A)의 용매 시스템을 유속 1 ml/min으로 사용하였다. 아세토니트릴을 40%에서 80%로 증가시키면서 선형 농도 구배하는 10분동안에 식 I, II 및 III의 화합물을 분리할 수 있었다.
반응 시간은 (케톤 식 I) 10.0분; (R,S-식 II의 화합물) 9.3분 및 (S,S-식 III의 화합물) 8.5분이었다.
결과
배치 A 배치 B
변환율 (환원된 케톤%) 거울상선택성
(거울상이성질체 [ee]		 변환율 (환원된 케톤%) 거울상선택성
(거울상이성질체 [ee]
서열번호 1 38% R,S (99%) 38% R,S (99%)
서열번호 2 39% R,S (80% ) 55% R,S (82% )
서열번호 3 100% R,S (50%) 100% R,S (50%)
서열번호 4 50% R,S (60%) 50% R,S (60%)
서열번호 5 75% S,S (>99%) 20% S,S (>99%)
서열번호 6 85% S,S (>98%) 40% S,S (>98%)
서열번호 7 90% S,S (>90%) 80% S,S (>90%)
서열번호 8 80% S,S (80%) 50% S,S (80%)
서열번호 9 100% S,S (>99%) 90% S,S (>99%)
서열번호 10 90% S,S (>80%) 90% S,S (>80%)
서열번호 11 95% S,S (96%) 95% S,S (96%)
서열번호 12 60% S,S (>98%) 30% S,S (>98%)
서열번호 13 50% S,S (90%) 80% S,S (90%)
서열번호 14 100% S,S (80%) 100% S,S (70%)
서열번호 15 34% S,S (70%) 40% S,S (70%)
실시예 4:
서열번호 1의 산화환원효소에 의한, 식 I의 화합물의 식 II 의 화합물(R,S-화합물)로의 변환
식 I의 화합물을 식 II의 화합물(R,S-화합물)로 변환시키기 위해, 서열번호 1(실시예 1D)의 효소 현탁물 2.25 ml과 써모에어로븀 브로키에서 과다발현시킨 알코올 탈수소효소 75 units (= 2 ml)을, 각각의 경우에, 버퍼(100 mM TEA, pH = 8, 10% 글리세롤), 식 I의 화합물 1.5 g, 0.3 mg NADP 및 7 ml 4-메틸-2-펜탄올 혼합물 3 ml에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 일정하게 전체적으로 혼합하면서 인큐베이션하였다. 48시간 후에, 사용한 식 I의 화합물 중 95% 이상이 식 II의 화합물로 환원되었다. 거울상이성질체 과잉은 > 98%이었다.
실시예 5:
서열번호 5의 산화환원효소에 의한, 식 I의 화합물의 식 III 의 화합물(S,S-화합물)로의 변환
식 I의 화합물을 식 III의 화합물(S,S-화합물)로 또 변환시키기 위해, 600 ㎕의 버퍼(100 mM TEA, pH = 9), 200 ㎕ 2-프로판올, 식 I의 화합물 50 mg, 0.1 mg NAD 및 200 ㎕의 서열번호 5의 효소 현탁물(실시예 1D 참조)로 구성된 혼합물을, 에펜도르프 반응 용기에서 인큐베이션하였다. 반응 혼합물을 실온에서 일정하게 전체적으로 혼합하면서 인큐베이션하였다. 48시간 후에, 사용한 식 I의 화합물 중 90% 이상이 식 III의 화합물(S,S)로 환원되었다. 거울상이성질체 과잉은 > 98%이었다.
서열목록
아미노산 서열
서열번호 1:
칸디다 마그놀리애 CBS 6396 단백질 서열 카르보닐 환원효소
1 mnalvtggsr gigeaiatkl aedgysvtia srgidqlnkv kaklpvvreg qthhvwqldl
61 sdaeaassfk gaplpassyd vlvnnagvtd pspiakqsds eihklfsvnl lspvaltkty
121 vqavtgkpre tpahiifiss gvairgypnv avysatksgl dgfmrslare lgpegvhvnt
181 vspgltktem asgvslddfp pspiggwiqp eaiadavryl vksknitgti lsvdngitv
서열번호 2:
칸디다 마그놀리애 JCM 9448 단백질 서열 카르보닐 환원효소
1 mpstlnalvt ggsrgigeat avklaeegyg itlaardikk lndvkaklpt ikqgqehhvw
61 qldladvqaa lelkgaplpa skydllvana gvsahvptae hddahwqnvi tinlssqial
121 tqalvraige rsdeapfhiv yvssiaalrg npmsavysas kagldgfars isrelgpkgi
181 hvntvhpglt ktdmtvrmrp aedqpikgwv lpdaiadavv flaksknitg tnivvdngrv
241 v
서열번호 3:
칸디다 지오카레스 MUCL 29832 단백질 서열 카르보닐 환원효소
1 mssvpassss ssptlnalvt gasrgigeat aiqlasqgys vtlasrgleq lkavkaklpl
61 vrqgqthhvw qldladvaaa gsfkgaplpa ssydvlvsna gvalfspigd qadedwqrml
121 avnltspial tkalvkaiad kprenpahii fvssavslrg yplvgvysat kagldgftrs
181 lahelgpkri hvntvnpglt ktemakdvel dsfggnvpis gwiqvdaiad avsflvnskn
241 itgtslvvdn gisv
서열번호 4:
칸디다 마 그놀리애 CBS 5659 단백질 서열 카르보닐 환원효소
1 mnalvtggsr gigeataiql aqegygvtlv argarqlnev laklpvvrdg qthhiwqldl
61 sdpeaaaafr gaplpassyd vlinnagvss lspfvaqsde vqktilavnl lspialtkaf
121 vkaavgkpre rpahiifiss gaalrgfanm avysatkggl dsfmrslare lgpqgihvns
181 vnpgftetem tattdlndyp ptpiegwiqp raiadailfl lksrnitgtn vtvdngitv
서열번호 5:
루브로박터 자일라노필러스 DSM 9941 단백질 서열 카르보닐 환원효소
1 mlegkvavit gagsgigrat alrfaregar vvvaelderr geevvreile sggeavfvrt
61 dvsefeqvea averaveeyg tldvmfnnag ighyaplleh dpehydrvvr vnqygvyygi
121 laagrkmael enpgviinta svyaflaspg vigyhaskga vkmmtqaaal elaphgirvv
181 aiapggvdtp iiqgykdmgl gerlargqmr rrlqtpeqia gavvllatee adaingsvvm
241 tddgyaefk
서열번호 6:
지오바실러스 카우스토필러스 JCM 12893 ( HTA426 ) 단백질 서열 카르보닐 환원효소
1 mrlkgkaaiv tggasgigra tairfaeega kvavsdinee ggeetvrlir ekggeaifvq
61 tdvadskqvs rlvqtavdaf gglhilfnna gighsevrst dlseeewdrv invnlkgvfl
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서열번호 7:
클로로플렉수스 아우라티아쿠스 DSMZ 635 (J-10- fl ) 단백질 서열 카르보닐 환원효소
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서열번호 8:
칸디다 마그놀리애 DSM 70638 단백질 서열 카르보닐 환원효소
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241 t
서열번호 9:
칸디다 마그놀리애 DSM 70638 단백질 서열 카르보닐 환원효소
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241 a
서열번호 10:
칸디다 마그놀리애 ATCC 12573 단백질 서열 카르보닐 환원효소
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서열번호 11:
칸디다 마 그놀리애 DSM 70639 단백질 서열 카르보닐 환원효소
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서열번호 12:
칸디다 마그놀리애 CBS 2798 단백질 서열 카르보닐 환원효소
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서열번호 13:
칸디다 그로펭오에세리 MUCL 29836 단백질 서열 카르보닐 환원효소
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241 gtsa
서열번호 14:
칸디다 sp. MUCL 40660 단백질 서열 카르보닐 환원효소
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241 lqvdngagi
서열번호 15:
칸디다 백시니 CBS 7318 단백질 서열 카르보닐 환원효소
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241 i
서열번호 16:
칸디다 마그놀리애 CBS 6396 핵산 서열 카르보닐 환원효소
1 atgaacgctc tagtgaccgg tggtagccgt ggcattggcg aggcgatcgc gaccaagctg
61 gccgaagatg gctacagcgt gacaatcgcc tcgcgcggaa tcgatcagct caacaaggta
121 aaggctaaac ttccggttgt gagggagggc cagacccacc acgtgtggca gcttgatttg
181 agcgacgccg aggccgcgtc gtccttcaag ggcgctcctt tgccagcaag cagctacgat
241 gtccttgtca acaacgccgg agtaacggat ccgagtccca ttgcgaagca gtcggatagc
301 gagattcaca agctgtttag cgtgaatctg ctgtcaccag ttgctttgac aaagacgtac
361 gtccaggcgg ttaccggaaa gcctcgtgag acgccagctc acattatttt tatctcgtca
421 ggcgttgcca ttcgaggcta cccaaacgtc gctgtatact cggctactaa gagcgggctc
481 gacggtttca tgaggtctct ggcgcgcgag cttggccccg agggcgtcca tgtgaacact
541 gtcagcccgg gtctcaccaa aaccgagatg gccagcggcg tcagcctcga cgacttcccg
601 ccatcgccga ttgggggctg gatccagccc gaggccatcg ctgatgcagt gaggtacctg
661 gtgaagtcga agaacatcac aggcacgatt ctgtcagttg acaacggaat cacggtttaa
서열번호 17:
칸디다 마그놀리애 JCM 9448 핵산 서열 카르보닐 환원효소
1 mpstlnalvt ggsrgigeat avklaeegyg itlaardikk lndvkaklpt ikqgqehhvw
61 qldladvqaa lelkgaplpa skydllvana gvsahvptae hddahwqnvi tinlssqial
121 tqalvraige rsdeapfhiv yvssiaalrg npmsavysas kagldgfars isrelgpkgi
181 hvntvhpglt ktdmtvrmrp aedqpikgwv lpdaiadavv flaksknitg tnivvdngrv
241 v
서열번호 18:
칸디다 지오카레스 MUCL 29832 단백질 서열 카르보닐 환원효소
1 atgccttcta ctctgaacgc tcttgtcact ggcggcagtc gcggtattgg cgaggctacc
61 gcagtgaagc tcgccgagga gggctacggt atcacacttg ctgcgcgcga tatcaaaaaa
121 ctgaatgacg tgaaggccaa actacccaca atcaagcagg gtcaagagca ccacgtctgg
181 cagcttgact tggccgatgt gcaggctgcg cttgagctca agggcgcacc actgcctgcg
241 agcaagtacg acctgttggt cgcgaatgcg ggcgtttccg cacacgttcc tacggccgag
301 cacgacgatg cgcactggca gaacgtcata actatcaact tgagctcgca gattgcgctc
361 acgcaggccc tagttagggc cattggcgag aggtctgatg aagcgccttt ccacattgtg
421 tatgtgtcct cgatcgccgc cctgcgcggt aaccccatga gcgcggtgta cagtgcctcg
481 aaggccggac ttgatggatt tgctcgttcc atctctcgcg agctcggccc gaagggtatt
541 catgtgaata cggtgcaccc gggactcacg aagacggaca tgaccgttcg catgcggcct
601 gctgaggacc agccgatcaa gggctgggta ctgcccgatg caattgctga tgccgttgtg
661 ttcctcgcga agtctaaaaa catcacgggc acaaacatcg ttgtcgacaa cggccgggtg
721 gtctaa
서열번호 19:
칸디다 마그놀리애 CBS 5659 단백질 서열 카르보닐 환원효소
1 atgaacgcgt tagtgaccgg cggaagccgc gggatcggcg aggccacggc catacagctg
61 gctcaggagg gctacggtgt gacattggtt gcgcgaggag cccgccagct caatgaagtg
121 ttggcaaagc taccagttgt gagagacgga cagacgcacc acatttggca gctagatctg
181 agcgatcctg aggcggccgc tgccttcagg ggtgctcctt tgcccgccag cagctacgac
241 gtgctgatca ataacgcagg tgttagtagt ctcagcccgt tcgtcgcgca gtctgatgag
301 gtccagaaaa ctattttagc ggtgaatctt ttgtcgccaa tcgcgttgac gaaggcgttc
361 gtgaaggcag cggtgggcaa gccgcgtgag aggccggcgc atatcatttt catctcttcg
421 ggcgctgccc tgcgcggttt cgcgaacatg gcagtgtata gtgcaacgaa aggcggcctt
481 gacagtttca tgcgctcgct agctagagag ctaggtcccc agggcatcca cgtcaactca
541 gtcaatccgg gctttactga aacagaaatg acagccacta cagatttgaa tgactacccc
601 ccgaccccca ttgagggctg gattcagcct cgcgcaatcg ccgacgctat acttttccta
661 ctgaagtcca gaaacatcac tggcacaaat gtgaccgtcg acaacggcat cactgtttga
서열번호 20:
루브로박터 자일라노필러스 DSM 9941 단백질 서열 카르보닐 환원효소
1 atgctcgagg ggaaggtcgc ggtcatcacg ggggccggca gcggcatagg ccgggccacc
61 gcgctcaggt tcgcccgcga aggggcccgg gtggtcgtgg cggagctcga cgagcggagg
121 ggggaggagg tcgtccggga gatcctcgag tccggcgggg aggccgtctt cgtgaggacg
181 gacgtctcgg agttcgagca ggttgaggcc gccgtcgagc gcgccgtcga ggagtacggg
241 acgctggacg tcatgttcaa caacgccggc atcgggcact acgcccccct gctggagcac
301 gacccggagc actacgaccg ggtggtccgg gtgaaccagt acggcgtcta ctacgggata
361 ctcgccgccg gcaggaagat ggccgagctg gagaaccccg gcgtgatcat caacaccgcc
421 tcggtctacg ctttcctggc ctcccccggt gtgatcggct atcacgcttc caagggggcg
481 gtgaagatga tgacccaggc cgcagccctg gagctcgccc cccacggcat acgggtcgtc
541 gccatcgccc cgggcggggt ggacaccccg atcatccagg gctacaagga catgggcctc
601 ggtgagcggc tggcccgcgg ccagatgcgt cgcaggctcc agacccccga gcagatcgcc
661 ggcgccgtcg tcctgctcgc caccgaggag gcagacgcca taaacggctc ggtggtgatg
721 accgacgacg gctacgcgga gttcaagtaa
서열번호 21:
지오바실러스 카우스토필러스 JCM 12893 ( HTA426 ) 단백질 서열 카르보닐 환원효소
1 atgaggctaa aaggaaaagc ggcgattgtc accggcggcg cgagcggcat cggccgggcg
61 acggcgattc gctttgcgga agaaggcgcc aaagtggcgg tgagcgacat caatgaggaa
121 ggaggggaag aaacggtccg cctgattcgg gaaaaaggag gggaggcgat ttttgtccaa
181 acggacgtag ccgattccaa gcaagtgagc cgccttgtcc aaacggcggt tgatgccttt
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301 gacttgtctg aagaagagtg ggaccgggtc atcaacgtta atttgaaagg agtgttcctt
361 ggcatcaaat acgcggtgcc cgtgatgaag caatgcggtg gcggggccat tgtcaacaca
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661 gtggcgaacg cggtgttgtt tttggcgtcc gatgaagcgt cgtttatcac cggcgcgaca
721 ttgtcggtcg acggcggcgg gctgacgttt tag
서열번호 22:
클로로플렉수스 아우라티아쿠스 DSMZ 635 (J-10- fl ) 단백질 서열 카르보닐 환원효소
1 atggagccac ctttcattgg gaaggttgcg ctggtcaccg gcgcagcagc cggtattggt
61 cgtgcttcag cactggcgtt tgcccgtgag ggtgccaagg ttgtcgttgc tgatgtgaat
121 gtcgagggcg gggaagagac gattgcgctg tgtcgggctt tgaataccga tgcaatgttc
181 gtgcgttgtg atgtttcgca acgcgatgaa gtggagcgat taattgctct ggcagttgac
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301 ctggccgatt atcccgaaga ggtctgggat cgggtgatcg agatcaacct caaaggggtc
361 tggttgtgta tgaagtacga aatccggcac atgctcaagc agggtggcgg tgcgattgtg
421 aatacctcat cggtcgccgg tctggccgga tcacgtggcg tttcggcgta tgtagccagc
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721 ggagcgacac tggcggttga tggtggccgc ctggcgtaa
서열번호 23:
칸디다 마그놀리애 DSM 70638 단백질 서열 카르보닐 환원효소
1 atgacatcta cacctaatgc cctcatcacg ggaggcagcc gcggcattgg cgcttccgcc
61 gccatcaaac tggctcaaga agggtacagc gtcacgctgg cgtcccgcga ccttgagaaa
121 cttactgagg tcaaggacaa gctgccaatc gtgagaggtg gacagaaaca ctacgtttgg
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241 agcagctacg atttgtttgt ttcgaacgcc ggaattgccc agttctcgcc tacggcagag
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721 acgtaa
서열번호 24:
칸디다 마그놀리애 DSM 70638 단백질 서열 카르보닐 환원효소
1 atgacgacta cttcaaacgc gcttgtcact ggaggcagcc gcggcattgg cgctgcctcc
61 gccattaagc tggctcagga gggctacaat gttacgctgg cctctcgcag tgttgataaa
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301 cacgatgata aggagtggca gaacttgctt gccgtgaact tgtcgtcgcc cattgccctc
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721 gcttaa
서열번호 25:
칸디다 마그놀리애 ATCC 12573 단백질 서열 카르보닐 환원효소
1 atgtcttatc aaatgtcttc ttctgctcca tcctccacct ccctgaatgc gcttgtcacg
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서열번호 26:
칸디다 마그놀리애 DSM 70639 단백질 서열 카르보닐 환원효소
1 atgaccacct cctccacctc ctcctccacc tcctcccgct ctctaaacgc tcttgtcacc
61 ggcgctagcc gcggcattgg cgaggccact gcaatcaagc tagcatctga gggatacagc
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서열번호 27:
칸디다 마그놀리애 CBS 2798 단백질 서열 카르보닐 환원효소
1 atgaatgcct tagttactgg tgcgagccgc gggatcggcg aagcaattgc ggtgaagctg
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721 tga
서열번호 28:
칸디다 그로펭오에세리 MUCL 29836 단백질 서열 카르보닐 환원효소
1 atgccctctg gactcaatgc tcttgtcact ggcggcagcc gcggaatcgg cgctgccgct
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481 aagagtgcgc tcgacgggct gacgcggtcg ctggcgaagg agctggggcc ccagaacatc
541 cgggtcaact ccgtgaaccc cggcttcacg aggaccgagc tggccagcgg cgtcgacatt
601 gacgccgtga cgcagagctc tccgatcaag gggtgggttg agccggaggc gattggcgat
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721 ggcactagcg cgtag
서열번호 29:
칸디다 sp. MUCL 40660 단백질 서열 카르보닐 환원효소
1 atgtcctcct cttcctcctc gactcctctc aacgctctcg tcaccggtgc cagccgcggc
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121 cgcagtcttg acgacctcaa tgcggtgaag gctaagctcc ctatcgtaag ggatgcccag
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241 tcgcccctgc cggccgagaa gtacgatctg ttcgtcagca acgccggcgt ggtcgacttc
301 gctccgcttg tccaccagag ccccgagagc atcagcagcc tgttcaatgt gaacctaatc
361 gcgcctgttg ccttgacaaa agctcttctt aaggcgttcg gtgacagccc tcgcaagact
421 acgactcact ttatctacgt ttcgtccgtt gttgccctcc gcggcttccc caatgttgcg
481 gtttacagct cctccaagag cggcctcgac gggtttgtgc gctcccttgc cgccgaggtt
541 gctccgctca acatccgcgt caactccatt aacccaggcc ctaccaagac tgagatgacc
601 gcttccctgg atgttgaggc gtttactgcg ggcaacccca tcaagggttg gatttacccc
661 gatgctattg ctgatggagt ggtgtacctg gcgaagtcga agaacattac tggtatcacc
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서열번호 30:
칸디다 백시니 CBS 7318 단백질 서열 카르보닐 환원효소
1 atgaggtcga cacctaacgc ccttgtgact ggcggcagcc gcggcattgg cgcggccgct
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cgtttatcac cggcgcgaca 720 ttgtcggtcg acggcggcgg gctgacgttt tag 753 <210> 22 <211> 759 <212> DNA <213> Chloroflexus auratiacus <400> 22 atggagccac ctttcattgg gaaggttgcg ctggtcaccg gcgcagcagc cggtattggt 60 cgtgcttcag cactggcgtt tgcccgtgag ggtgccaagg ttgtcgttgc tgatgtgaat 120 gtcgagggcg gggaagagac gattgcgctg tgtcgggctt tgaataccga tgcaatgttc 180 gtgcgttgtg atgtttcgca acgcgatgaa gtggagcgat taattgctct ggcagttgac 240 acgttcggtc ggatcgactt tgcgcacaac aacgccggga ttgaaggcgt gcaggcaatg 300 ctggccgatt atcccgaaga ggtctgggat cgggtgatcg agatcaacct caaaggggtc 360 tggttgtgta tgaagtacga aatccggcac atgctcaagc agggtggcgg tgcgattgtg 420 aatacctcat cggtcgccgg tctggccgga tcacgtggcg tttcggcgta tgtagccagc 480 aagcacggta ttgttggtat taccaaagcg gcagcccttg agtatgcgcg taacggtatt 540 cgtgtcaacg caatctgtcc aggtacgatt catactgcga tgatcgaccg ctttacccag 600 ggtgatcccc aactgcttgc ccagttcgct gagggtgaac cgattggtcg gctcggctcg 660 cctgaagagg tcgccaatgc ggtgatctgg ctctgctcag ataaggcttc gtttgtgacc 720 ggagcgacac tggcggttga 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atgacgacta cttcaaacgc gcttgtcact ggaggcagcc gcggcattgg cgctgcctcc 60 gccattaagc tggctcagga gggctacaat gttacgctgg cctctcgcag tgttgataaa 120 ctgaatgaag taaaggcgaa actcccaatt gtacaggacg ggcagaagca ctacatttgg 180 gaactcgatc tggctgatgt ggaagctgct tcgtcgttca agggtgctcc tttgcctgct 240 cgcagctacg acgtctttgt ttcgaacgcg ggcgtcgctg cgttctcgcc cacagccgac 300 cacgatgata aggagtggca gaacttgctt gccgtgaact tgtcgtcgcc cattgccctc 360 acgaaggccc tcttgaagga tgtctccgaa aggcctgtgg acaagccact gcagattatc 420 tacatttcgt cggtggccgg cttgcatggc gccgcgcagg tcgccgtgta cagtgcatct 480 aaggccggtc ttgatggttt tatgcgctcc gtcgcccgtg aggtgggccc gaagggcatc 540 catgtgaact ccatcaaccc cggatacacg aagactgaaa tgaccgcggg cattgaagcc 600 cttcctgatt tgcctatcaa ggggtggatc gagcccgagg caattgctga cgcggttctg 660 tttctggcaa agtccaagaa tatcaccggc acaaacattg tggtcgacaa tggcttgatt 720 gcttaa 726 <210> 25 <211> 759 <212> DNA <213> Candida magnoliae <400> 25 atgtcttatc aaatgtcttc ttctgctcca tcctccacct ccctgaatgc gcttgtcacg 60 ggcggcagcc 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agggatctcc gctgccggct 240 aagagctacg atgttgttgt tgttaacgcc ggcgtcgcga acctgagccc gctggctgcc 300 caggacgacg acgtcattca gaacattgtg accgtgaacc tgctgtcgcc gattgcgctg 360 gtgaagtcgc tgatcaaggc gtacggcgag ggtcctcgcg cgacaccggc ccacattgtg 420 tttgtgtcgt cggtggccgc gatccgtggg ttccccaacg gcgccgtcta tagctcgacg 480 aagagtgcgc tcgacgggct gacgcggtcg ctggcgaagg agctggggcc ccagaacatc 540 cgggtcaact ccgtgaaccc cggcttcacg aggaccgagc tggccagcgg cgtcgacatt 600 gacgccgtga cgcagagctc tccgatcaag gggtgggttg agccggaggc gattggcgat 660 gcgattttgt ttctcgcgac gtcgaaccac atcacgggca cgatcaccgt catcgacaac 720 ggcactagcg cgtag 735 <210> 29 <211> 750 <212> DNA <213> Candida sp. <400> 29 atgtcctcct cttcctcctc gactcctctc aacgctctcg tcaccggtgc cagccgcggc 60 atcggtgagg tcatctctct ccagctcgcc aacgagggct acaatgttac cctcgcagcc 120 cgcagtcttg acgacctcaa tgcggtgaag gctaagctcc ctatcgtaag ggatgcccag 180 aagcactctg tctggccgct cgacattagc gatatcgacg ccgtgacgaa cttcaaggga 240 tcgcccctgc cggccgagaa gtacgatctg ttcgtcagca acgccggcgt ggtcgacttc 300 gctccgcttg tccaccagag ccccgagagc atcagcagcc tgttcaatgt gaacctaatc 360 gcgcctgttg ccttgacaaa agctcttctt aaggcgttcg gtgacagccc tcgcaagact 420 acgactcact ttatctacgt ttcgtccgtt gttgccctcc gcggcttccc caatgttgcg 480 gtttacagct cctccaagag cggcctcgac gggtttgtgc gctcccttgc cgccgaggtt 540 gctccgctca acatccgcgt caactccatt aacccaggcc ctaccaagac tgagatgacc 600 gcttccctgg atgttgaggc gtttactgcg ggcaacccca tcaagggttg gatttacccc 660 gatgctattg ctgatggagt ggtgtacctg gcgaagtcga agaacattac tggtatcacc 720 ctccaagtcg acaacggcgc cggcatctaa 750 <210> 30 <211> 726 <212> DNA <213> Candida vaccinii <400> 30 atgaggtcga cacctaacgc ccttgtgact ggcggcagcc gcggcattgg cgcggccgct 60 gcaattaaac tcgccgaggc aggctacagc gtgacgctcg cgtcgcgcgg tctcgacaag 120 ctcaacgagg tgaaggccaa gcttcctgtc gtgaagcagg gccaggagca ccatgtatgg 180 cagcttgatc tcagcgacgt gcaggccgcg ctcgagttca agggcgcacc gctgcccgcg 240 agtaagtacg atttgtttgt ctcgaacgcc ggcgtggcta ctttctcgcc aacggctgag 300 catgacgaca aggactggca gaacattatt gccgtgaact tgacatcgcc cattgccatt 360 acgaaggcgc tcgttaaggc cgttggcgag cgctcaaacg ataacccgtt tcagatcgcg 420 ttcctgtcat cggcggccgc cctgcgcggt gtgccgcaga ccgctgttta cagcgctacg 480 aaggccggcc tcgacggctt cacgcgctcg ctcgccaagg agctcggccc aaagggcatc 540 catgtgaaca tcgtacaccc tggatggacg cagaccgaga tgactgcggg tgtagatgag 600 cctagggata cgcccatccc gggctggatc cagccggaag ccatcgccga ggccattgtg 660 tatctcgcga agtcaaagaa catcacggga acgaacatcg ttgtcgacaa cggcctgact 720 atttaa 726 <210> 31 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> partial amino acid sequence <400> 31 Asn Ala Leu Val Thr Gly Ala Ser Arg Gly Ile Gly 1 5 10 <210> 32 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> partial amino acid sequence <400> 32 Asn Ala Leu Val Thr Gly Gly Ser Arg Gly Ile Gly 1 5 10 <210> 33 <211> 5 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> partial amino acid sequence <400> 33 Gly Tyr Ser Val Thr 1 5 <210> 34 <211> 5 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> partial amino acid sequence <400> 34 Gly Tyr Asn Val Thr 1 5 <210> 35 <211> 6 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> partial amino acid sequence <400> 35 Gly Tyr Gly Ile Thr Leu 1 5 <210> 36 <211> 6 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> partial amino acid sequence <400> 36 Val Leu Ala Lys Leu Pro 1 5 <210> 37 <211> 6 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> partial amino acid sequence <400> 37 Val Lys Ala Lys Leu Pro 1 5 <210> 38 <211> 8 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> partial amino acid sequence <400> 38 Phe Lys Gly Ala Pro Leu Pro Ala 1 5 <210> 39 <211> 8 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> partial amino acid sequence <400> 39 Phe Arg Gly Ala Pro Leu Pro Ala 1 5 <210> 40 <211> 8 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> partial amino acid sequence <400> 40 Leu Lys Gly Ala Pro Leu Pro Ala 1 5 <210> 41 <211> 7 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> partial amino acid sequence <400> 41 Ser Pro Ile Ala Leu Thr Lys 1 5 <210> 42 <211> 7 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> partial amino acid sequence <400> 42 Ser Pro Val Ala Leu Thr Lys 1 5 <210> 43 <211> 7 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> partial amino acid sequence <400> 43 Ser Gln Ile Ala Leu Thr Gln 1 5 <210> 44 <211> 7 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> partial amino acid sequence <400> 44 Ala Val Tyr Ser Ala Ser Lys 1 5 <210> 45 <211> 7 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> partial amino acid sequence <400> 45 Ala Val Tyr Ser Ala Thr Lys 1 5 <210> 46 <211> 7 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> partial amino acid sequence <400> 46 Gly Val Tyr Ser Ala Thr Lys 1 5 <210> 47 <211> 6 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> partial amino acid sequence <400> 47 Pro Ile Lys Gly Trp Ile 1 5 <210> 48 <211> 6 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> partial amino acid sequence <400> 48 Pro Ile Glu Gly Trp Ile 1 5 <210> 49 <211> 6 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> partial amino acid sequence <400> 49 Pro Ile Gly Gly Trp Ile 1 5 <210> 50 <211> 6 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> partial amino acid sequence <400> 50 Pro Ile Ser Gly Trp Ile 1 5 <210> 51 <211> 5 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> partial amino acid sequence <400> 51 Gly Tyr Gly Val Thr 1 5 <210> 52 <211> 8 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> partial amino acid sequence <400> 52 Phe Lys Ala Ala Pro Leu Pro Ala 1 5 <210> 53 <211> 8 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> partial amino acid sequence <400> 53 Phe Lys Gly Ser Pro Leu Pro Ala 1 5 <210> 54 <211> 6 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> partial amino acid sequence <400> 54 Gly Ile Gly Arg Ala Thr 1 5 <210> 55 <211> 7 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> partial amino acid sequence <400> 55 Gly Ile Gly Arg Ala Ser Ala 1 5 <210> 56 <211> 6 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> partial amino acid sequence <400> 56 Gly Ile Gly Arg Glu Thr 1 5 <210> 57 <211> 6 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> partial amino acid sequence <400> 57 Asn Asn Ala Gly Ile Gly 1 5 <210> 58 <211> 7 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> partial amino acid sequence <400> 58 Asn Asn Ala Gly Ile Glu Gly 1 5 <210> 59 <211> 9 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> partial amino acid sequence <400> 59 Ile Arg Val Val Ala Ile Ala Pro Gly 1 5 <210> 60 <211> 9 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> partial amino acid sequence <400> 60 Ile Arg Val Asn Ala Ile Ala Pro Gly 1 5 <210> 61 <211> 9 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> partial amino acid sequence <400> 61 Ile Arg Val Asn Ala Ile Cys Pro Gly 1 5 <210> 62 <211> 9 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> partial amino acid sequence <400> 62 Ile Arg Val Val Gly Ile Ala Pro Gly 1 5 <210> 63 <211> 8 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> partial amino acid sequence <400> 63 Pro Glu Gln Ile Ala Gly Ala Val 1 5 <210> 64 <211> 8 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> partial amino acid sequence <400> 64 Pro Glu Ala Ile Ala Asn Ala Val 1 5 <210> 65 <211> 8 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> partial amino acid sequence <400> 65 Pro Glu Glu Val Ala Asn Ala Val 1 5 <210> 66 <211> 8 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> partial amino acid sequence <400> 66 Pro Glu Ala Ile Ala Asn Ala Val 1 5 <210> 67 <211> 33 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 67 gggaattcca tatgatgctc gaggggaagg tcg 33 <210> 68 <211> 31 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 68 cacatgcatg cgaatgctcg aggggaaggt c 31 <210> 69 <211> 34 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 69 cccaagctta ttacttgaac tccgcgtagc cgtc 34 <210> 70 <211> 750 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> semisynthetic gene sequence from Rubrobacter xylanophilus <400> 70 atgctggaag gtaaagtggc agtcatcacc ggtgcaggca gcggcattgg gcgtgccact 60 gcgctgcgtt ttgcgcgtga aggcgctcgc gtcgttgtgg ccgagctgga tgaacgtcgc 120 ggtgaggaag ttgtacgtga gattctggaa tctggcgggg aggccgtctt cgtgaggacg 180 gacgtctcgg agttcgagca ggttgaggcc gccgtcgagc gcgccgtcga ggagtacggg 240 acgctggacg tcatgttcaa caacgccggc atcgggcact acgcccccct gctggagcac 300 gacccggagc actacgaccg ggtggtccgg gtgaaccagt acggcgtcta ctacgggata 360 ctcgccgccg gcaggaagat ggccgagctg gagaaccccg gcgtgatcat caacaccgcc 420 tcggtctacg ctttcctggc ctcccccggt gtgatcggct atcacgcttc caagggggcg 480 gtgaagatga tgacccaggc cgcagccctg gagctcgccc cccacggcat acgggtcgtc 540 gccatcgccc cgggcggggt ggacaccccg atcatccagg gctacaagga catgggcctc 600 ggtgagcggc tggcccgcgg ccagatgcgt cgcaggctcc agacccccga gcagatcgcc 660 ggcgccgtcg tcctgctcgc caccgaggag gcagacgcca taaacggctc ggtggtgatg 720 accgacgacg gctacgcgga gttcaagtaa 750 <210> 71 <211> 30 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 71 cctagctagc atgctggaag gtaaagtggc 30 <210> 72 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 72 cctttrcctg chagcagcta yg 22 <210> 73 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 73 ggctggatcc agcccttrat sgg 23 <210> 74 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 74 ggaattccat atgatgaacg ctctagtgac cggtggtag 39 <210> 75 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 75 cccaagctta ttaaaccgtg attccgttgt caactgac 38

Claims (19)

  1. 일반식 I의 케토 화합물을 일반식 II의 하이드록시 화합물(R,S-화합물)로 거울상선택적으로 효소 환원하는 방법으로서,
    보조인자(cofator)의 존재하에 상기 케토 화합물이 산화환원효소에 의해 환원되며,
    형성되는 산화된 보조인자 NAD 또는 NADP는 일반식 RXRYCHOH의 이차 알코올의 산화에 의해 계속적으로 재생되며, 상기 RX 및 RY는 독립적으로 수소, 분지 또는 비분지형의 C1-C8-알킬기이고, Ctotal ≥ 3인 것을 특징으로 하는 방법:
    Figure pct00004
    (I)
    상기 식 I에서,
    R은 아미노 관능기에 대한 임의의 보호기(t-부틸옥시카르보닐기(BOC), 벤질옥시카르보닐기, 9-플루오레닐메톡시카르보닐기)일 수 있으며,
    X = -Cl, -CN, -OH, Br, F임.
    Figure pct00005

    상기 식 II에서, R 및 X는 상기 식 I에서 정의된 바와 동일함.
  2. 일반식 I의 케토 화합물을 일반식 II의 하이드록시 화합물(R,S-화합물)로 거울상선택적으로 효소 환원하는 방법으로서,
    보조인자의 존재하에 상기 케토 화합물이 산화환원효소에 의해 환원되며,
    상기 산화환원효소가
    (a) 서열번호 1, 2, 3 또는 4에 따른 아미노산 서열을 포함하거나,
    (b) 서열번호 1, 2, 3 또는 4의 아미노산 서열과 65% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하거나,
    (c) 서열번호 1, 2, 3 또는 4의 아미노산 서열과 72% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하거나,
    (d) 서열번호 16, 17, 18 또는 19의 핵산 서열에 의해 코딩되거나, 또는
    (e) 엄격한 조건하에서 서열번호 16, 17, 18 또는 19와 혼성화되는 핵산 서열에 의해 코딩되거나, 또는
    (f) 아미노산 220 내지 260개의 길이이며, 서열번호 31 내지 51의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 부분 서열들 중 1종 또는 수종을 포함하며, 식 I의 화합물을, 바람직하게는 식 II의 화합물로 환원시키는 것을 특징으로 하는 방법:
    Figure pct00006
    (I)
    상기 식 I에서,
    R은 아미노 관능기에 대한 임의의 보호기(t-부틸옥시카르보닐기(BOC), 벤질옥시카르보닐기, 9-플루오레닐메톡시카르보닐기)일 수 있으며,
    X = -Cl, -CN, -OH, Br, F임.
    Figure pct00007

    상기 식 II에서, R 및 X는 상기 식 I에서 정의된 바와 동일함.
  3. 일반식 I의 케토 화합물을 일반식 III의 하이드록시 화합물(S,S-화합물)로 거울상선택적으로 효소 환원하는 방법으로서,
    보조인자의 존재하에 상기 케토 화합물이 산화환원효소에 의해 환원되며,
    형성되는 산화된 보조인자 NAD 또는 NADP는 일반식 RXRYCHOH의 이차 알코올의 산화에 의해 계속적으로 재생되며, 상기 RX 및 RY는 독립적으로 수소, 분지 또는 비분지형의 C1-C8-알킬기이고, Ctotal ≥ 3인 것을 특징으로 하는 방법:
    Figure pct00008
    (I)
    상기 식 I에서,
    R은 아미노 관능기에 대한 임의의 보호기(t-부틸옥시카르보닐기(BOC), 벤질옥시카르보닐기, 9-플루오레닐메톡시카르보닐기)일 수 있으며,
    X = -Cl, -CN, -OH, Br, F임.
    Figure pct00009

    상기 식 III에서, R 및 X는 상기 식 I에서 정의된 바와 동일함.
  4. 일반식 I의 케토 화합물을 일반식 III의 하이드록시 화합물(S,S-화합물)로 거울상선택적으로 효소 환원하는 방법으로서,
    보조인자의 존재하에 상기 케토 화합물이 산화환원효소에 의해 환원되며,
    상기 산화환원효소가
    (a) 서열번호 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15에 따른 아미노산을 포함하거나,
    (b) 서열번호 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15에 따른 아미노산 서열과 65% 이상 동일한 아미노산을 포함하거나,
    (c) 서열번호 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30의 핵산 서열에 의해 코딩되거나,
    (d) 엄격 조건하에서 서열번호 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30과 혼성화되는 핵산 서열에 의해 코딩되거나, 또는
    (e) 아미노산 220 내지 260개의 길이이며, 서열번호 31 내지 66의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 부분 서열들 중 1종 또는 수종을 포함하며, 식 I의 화합물을, 바람직하게는 식 III의 화합물로 환원시키는 것을 특징으로 하는 방법:
    Figure pct00010
    (I)
    상기 식 I에서,
    R은 아미노 관능기에 대한 임의의 보호기(t-부틸옥시카르보닐기(BOC), 벤질옥시카르보닐기, 9-플루오레닐메톡시카르보닐기)일 수 있으며,
    X = -Cl, -CN, -OH, Br, F임.
    Figure pct00011

    상기 식 II에서, R 및 X는 상기 식 I에서 정의된 바와 동일함.
  5. 제2항 또는 제4항에 있어서, 상기 형성되는 산화된 보조인자 NAD 또는 NADP가 연속 재생되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제2항, 제4항 또는 제5항 중 어느 한항에 있어서, 상기 형성되는 산화된 보조인자 NAD 또는 NADP가 일반식 RXRYCHOH의 이차 알코올의 산화에 의해 계속적으로 재생되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한항에 있어서, 2-프로판올, 2-부탄올, 2-펜탄올, 4-메틸-2-펜탄올, 2-헵탄올 또는 2-옥탄올이 각각 공동기질 또는 이차 알코올로 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한항에 있어서, 상기 보조인자의 재생을 위해 추가적인 산화환원효소/탈수소효소가 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한항에 있어서, 상기 식 I의 화합물이 반응 배치에 ≥20 g/L, 바람직하게는 >50 g/L, 특히 바람직하게는 >100 g/L의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한항에 있어서, TTN(총 턴오버 수 = 식 I의 환원된 화합물의 mol/사용한 보조인자의 mol)이 ≥103인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한항에 있어서, 수계 유기 2상 시스템에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한항에 있어서, 디에틸 에테르, t-부틸 메틸 에테르, 디이소프로필 에테르, 디부틸 에테르, 에틸 아세테이트, 부틸 아세테이트, 헵탄, 헥산 또는 사이클로헥산 등의 유기 용매가 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한항에 있어서, 케토 화합물로서 식 IV의 특정 화합물이 사용되는 것을 특징으로 하는 방법:
    Figure pct00012
  14. 서열번호 1, 2, 3, 4, 11, 12, 13, 14, 및 15의 아미노산 서열의 폴리펩타이드.
  15. 서열번호 1, 2, 3, 4, 11, 12, 13, 14, 및 15의 아미노산 서열들 중 하나와 65% 이상, 바람직하게는 70%이상, 특히 바람직하게는 75% 이상 동일한 폴리펩타이드.
  16. 하나 이상의 아미노산 서열의 치환, 삽입, 결손 또는 부가에 의해, 서열번호 1, 2, 3, 4, 11, 12, 13, 14, 및 15의 아미노산 서열들로부터 유래될 수 있는 폴리펩타이드.
  17. 서열번호 16, 17, 18, 19, 26, 27, 28, 29 또는 30의 핵산 서열에 의해 코딩되는 폴리펩타이드.
  18. 서열번호 16, 17, 18, 19, 26, 27, 28, 29 또는 30의 핵산 서열들 중 하나와 엄격 조건하에서 혼성화되는 핵산 서열에 의해 코딩되는 폴리펩타이드.
  19. 아미노산 220 내지 260개의 길이이며, 서열번호 31 내지 51의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 부분 서열들 중 1종 또는 수종을 포함하며, 식 I의 화합물을 바람직하게는 식 II의 화합물로 환원시키는 폴리펩타이드.
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