ES2647069T3 - Reducción enzimática enantioselectiva de compuestos ceto - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de reducción enzimática enantioselectiva de un compuesto ceto de fórmula general I**Fórmula** en la que R representa un grupo protector para funciones amino y X >= -Cl,-CN, -OH, Br, F, en el compuesto hidroxi de fórmula general II (compuesto R, S)**Fórmula** en la que R y X tienen el mismo significado que en la fórmula I, reduciéndose el compuesto ceto con una oxidorreductasa en presencia del cofactor NADH o NADPH, caracterizado porque el cofactor oxidado NAD o NADP formado se regenera continuamente por oxidación de un alcohol secundario de fórmula general RXRyCHOH, en la que RX, Ry representan independientemente un grupo alquilo C1-C8 ramificado o no ramificado y Ctotal >=3, y el TTN (número total de renovaciones >= mol de compuesto reducido de fórmula I/mol de cofactor utilizado) es >= 103.

Description

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En una realización adicional, la adición de las oxidorreductasas según las SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 15 y/o del cosustrato también puede ocurrir poco a poco durante el procedimiento.

Una vez completada la reducción, se procesa la mezcla de reacción. Para este fin, por ejemplo, la fase acuosa se separa opcionalmente de la fase orgánica y la fase orgánica que contiene el producto se filtra. Opcionalmente, la

5 fase acuosa también se puede extraer y procesar adicionalmente como la fase orgánica. A continuación, el disolvente se evapora de la fase orgánica y se obtiene el producto de fórmula general II o III como un producto en bruto. El producto en bruto se puede purificar posteriormente o se puede utilizar directamente para la síntesis de un producto resultante.

A continuación, la invención se ilustra adicionalmente a modo de ejemplos.

10 Ejemplo 1

Clonación y suministro de una oxidorreductasa de Rubrobacter xylanophilus DSM 9941 (SEQ ID NO: 5)

A) Cultivo de Rubrobacter xylanophilus DSM 9941

Las células de Rubrobacter xylanophilus DSM 9941 se cultivaron en el medio siguiente a 50 °C (pH 7,2) y 140 rpm en un agitador para bacterias: 0,1 % de extracto de levadura, 0,1 % de triptona, 0,004 % de CaSO4 x 2 H2O, 0,02 %

15 de MgCl2 x 6 H2O, 0,01 % de ácido nitrilotriacético, 100 ml de tampón de fosfato [5,44 g/l KH2PO4, 43 g/l de Na2HPO4 x 12 H2O], 500 μl/l de citrato de Fe 0,01 M, 500 μl/l de elementos traza [500 μl/l H2SO4, 2,28 g/l de MnSO4 x H2O, 500 mg/l de ZnSO4 x 7 H2O, 500 mg de H3BO3, 25 mg/l de CuSO4 x 5 H2O, 25 mg/l de Na2MoO4 x 2 H2O, 45 mg/l de CoCl2 x 6 H2O]. Al día 6 del cultivo, las células se separaron del medio de cultivo por centrifugación y se almacenaron a -80 °C.

20 B) Amplificación del gen que codifica la oxidorreductasa selectiva

El ADN genómico se extrajo de acuerdo con el método descrito en "Molecular Cloning" por Manniatis & Sambrook. El ácido nucleico resultante sirvió como molde para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que implicaba cebadores específicos que se derivaron de la secuencia génica publicada bajo el número 46106817 en la base de datos NCBI. Al hacerlo, se proporcionaron los cebadores en una posición 5' terminal con sitios de restricción para las

25 endonucleasas Nde I y Hind III o Sph I, respectivamente (SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69), para su posterior clonación en un vector de expresión.

La amplificación se llevó a cabo en un tampón de PCR [Tris-HCl 10 mM, (pH 8,0); KCl 50 mM; MgSO4 10 mM; mezcla de dNTP 1 mM; en cada caso 20 pMol de cebador y 2,5 U de ADN Polimerasa Pfx Platinum (Invitrogen)] con 500 ng de ADN genómico y los siguientes ciclos de temperatura:

Ciclo 1: 94 °C, 2 min

Ciclo 2 x 30: 94°C, 15 s

54 °C, 30 s

68 °C, 60 s

Ciclo 3: 68 °C, 7 min

4 °C, ∞

30 El producto de la PCR resultante que tenía un tamaño de aproximadamente 750 pb se sometió a digestión con enzimas de restricción después de la purificación sobre un gel de agarosa al 1 % con la ayuda de las endonucleasas Nde I y Hind III o Sph I y Hind III, respectivamente, y se ligó en la cadena principal del vector pET21a (Novagen) o del vector pQE70 (Qiagen), respectivamente, cuya cadena principal se había tratado con las mismas endonucleasas. Después de transformar 2 μl del lote de ligación en células E. coli Top 10 F' (Invitrogen), se analizó

35 el ADN plasmídico de colonias resistentes a ampicilina para la presencia de un inserto que tenía un tamaño de 750 pb mediante un análisis de restricción con las endonucleasas Nde I y Hind III o Sph I y Hind III, respectivamente. Las preparaciones de plásmido de los clones que eran positivas para el fragmento se sometieron a un análisis de secuencia y posteriormente se transformaron en Escherichia coli BL21 Star (Invitrogen) y E. coli RB791 (material genético, Yale), respectivamente.

40 C.) Expresión eficiente del polipéptido SEQ ID NO: 5 en células de Escherichia coli

Para una expresión eficiente del polipéptido SEQ ID NO: 5 en células de Escherichia coli, se usó el ADN codificante de la SEQ ID NO: 70 como molde en una reacción de PCR para la clonación en un vector de expresión. En la región de la primera secuencia, esta secuencia de ADN difería en 153 bases de la secuencia de ADN previamente conocida (SEQ ID NO: 20). Esta modificación era conservativa y no produjo un cambio en la secuencia de

45 aminoácidos.

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Claims (1)

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