JP2007503216A - 線虫類抽出抗凝血薬タンパク質(nap)を製造するためのプロセス - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ヒト血漿の抗凝血薬であるタンパク質を製造するためのプロセス、およびこのプロセスによって産生されたタンパク質に関する。具体的には、本発明は、精製された線虫類抽出抗凝血タンパク質(NAP)を製造するためのプロセスに関し、このプロセスによって製造された精製NAPに関する。特に、本発明は、NAP薬物物質およびNAP薬物製品(drug product)、ならびにこれらを製造するためのプロセスに関する。なお、本願は、2003年5月6日に出願された同時係属中の出願「Method of Treatment of Hemorrhagic Disease Using a Factor VIIa/Tissue Factor Inhibitor」の優先権の恩典を主張する。
医薬品として潜在的な価値を有する治療用タンパク質の発見および精製は、医薬品の大規模な商業産生に適さない材料と方法を用いて研究室で行われる。医薬品を商業規模で産生するために、バイオテクノロジー産生操業は、製品の品質を損なうことなく堅牢かつ拡張可能なものでなければならない(Gottschalk,2003,BioProcess Intl 1(4):54-61)。医薬品の製造プロセスは、経済的な方法、改善された製品収率、需要を満たす十分な能力をもたらすものでなければならず、理想的には、求められている変動に対応するプロセス拡張性をもたらすものでなければならない。治療用タンパク質の製造プロセスは、大量のタンパク質を機能する形で産生する経済的な方法、ならびにそのタンパク質を精製して目的の用途に適した純度の医薬品を得る方法を開発しなければならない。
本発明は、精製された線虫類抽出抗凝血タンパク質(NAP)を製造するためのプロセス、ならびにこのプロセスによって製造された、精製されたNAP薬物物質およびNAP薬物製品を提供する。本発明は、大量の(商業規模量の)NAP薬物物質およびNAP薬物製品を製造するプロセスを提供する。特に、本発明は、(a)適切な宿主においてNAPを産生する工程を含む発酵プロセスであって、少なくとも1つのNAPコード配列が宿主のゲノムに組み込まれている、発酵プロセス;(b)NAPを細胞および細胞片から分離する回収プロセス;および(c)NAP薬物物質から汚染物質を取り除く精製プロセスの工程を含む、NAP薬物物質を製造するためのプロセスを提供する。適切な宿主はピチア-パストリスである。プロセスは、NAP薬物物質を最終薬物製剤(drug formulation)に導入する工程をさらに含んでもよい。プロセスは、最終薬物製剤中のNAP薬物物質のバルク濾過(bulk filtratoin)を含む充填プロセス、および剤形の状態にある最終薬物製剤中のNAP薬物物質を分配してNAP薬物製品を得る工程を含み得る充填工程をさらに含んでもよく、NAP薬物製品の凍結乾燥をさらに含んでもよい。本明細書で提供されるプロセスは、rNAPc2(AcaNAPc2)、rNAPc2/プロリン(AcaNAPc2/プロリン)、AcaNAP5、AcaNAP6、AcaNAP23、AcaNAP31、AcaNAP42、AcaNAP48、AceNAP5、AceNAP7、AduNAP4、AcaNAP24、AcaNAP25、AcaNAP44、またはAcaNAP46から、精製されたNAP薬物物質またはNAP薬物製品を製造するのに使用することができる。
本発明は、精製された線虫類抽出抗凝血タンパク質(NAP)(例えば、米国特許(以下「US」)5,863,894;5,864,009;5,866,542;5,866,543;5,872,098;および5,945,275(これらの各々の全ての内容が参照として本明細書に組み入れられる)に開示されるNAP)を製造するためのプロセスを提供する。ここで、今日まで特徴付けられたNAPは、抗凝血活性および/またはセリンプロテアーゼ活性を有する。本発明は、請求されたプロセス方法によって製造された精製NAPを提供し、ここで、このような精製NAPは、NAP薬物製品として製剤化することができるNAP薬物物質である。本発明は、少なくとも1つのNAPドメインを含むポリペプチドの製造に特に適している可能性がある。本発明は、本明細書で開示されるプロセスによって製造されたNAP薬物物質およびNAP薬物製品を提供する。1つの態様において、本発明は、rNAPc2/プロリン薬物物質およびrNAPc2/プロリン薬物製品を製造するためのプロセスを提供し、本明細書で開示されるプロセスによって製造されたrNAPc2/プロリン薬物物質およびrNAPc2/プロリン薬物製品を提供する。
本発明は、NAPが適切な宿主において産生される発酵プロセスを提供する。提供されるように、1つまたはそれ以上のNAPコード配列が宿主ゲノムに組み込まれており、宿主は発酵プロセス間にNAPを産生する。1つの態様では、本明細書で提供されるように発酵プロセスにおいて、ピチア-パストリスによってrNAPc2/プロリンが分泌タンパク質として産生される。
本発明は、発酵工程からのNAPタンパク質の収率および純度を改善する回収プロセスを提供する。本明細書で提供される回収プロセスを使用すると、NAPを捕捉し、細胞および細胞片を除去することができる。ここで、本明細書で提供される回収プロセスは、精密濾過/限外濾過などの従来の方法と比較して効率的である。この理論に制限されるつもりはないが、本明細書で提供される回収効率の向上は、ピチア系の側面の組み合わせに(すなわち、ピチア-パストリスは発酵間に高密度のバイオマスを生じることに)起因する可能性がある。さらに、NAPタンパク質は比較的小さなタンパク質であり、従って、小さな孔径の限外濾過膜を必要とする。このような限外濾過膜は流出速度(flux rate)が遅いために、処理時間が長くなる。1つの局面によれば、回収プロセスは、NAPを細胞および細胞片から分離し、生成物を、後の精製工程に使用するのに適した緩衝液に交換するために、イオン交換クロマトグラフィー(流動床イオン交換クロマトグラフィー装置の使用を含む)を使用する。1つの態様において、Streamline SP XLイオン交換樹脂(Amersham Biosciences)流動床クロマトグラフィー装置が、本明細書に記載のNAP薬物物質の回収に用いられる。別の態様において、流動床クロマトグラフィーを使用して、rNAPc2発現宿主細胞の細胞破片からrNAPc2/プロリンが分離される。特に好ましい態様において、Streamline XLイオン交換装置からrNAPc2/プロリンが回収される。
本発明は、NAP薬物物質から汚染物質が取り除かれる精製プロセスを提供する。本明細書で提供されるように、精製プロセスは、疎水性相互作用クロマトグラフィー、NAP画分の収集、NAP画分の少なくとも1回の限外濾過/ダイアフィルトレーション(UF/DF)、イオン交換クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーからのNAP画分の収集、もう1回のUF/DF工程、および最終濾過を含む。精製プロセスにおいて提供される各工程はNAP薬物物質の純度を高めることが理解され、当業者であれば、特定の用途に必要とされる純度の程度を確かめ、NAP薬物物質の純度の望ましいレベルを得るのに必要な工程および条件を選択することができる。全プロセス効率は、発酵ブロスから回収工程および第1の精製工程(Source 15PHE疎水性相互作用クロマトグラフィー)まで、溶液中の低pH(約3)を維持することによって向上した。これらの工程は、他のプロセスで必要とされるpH/緩衝液交換工程を無くすために同じpHで行われるように設計され、それによって必要とされる時間および労力が少なくなり、潜在的な生成物損失が小さくなった。これらの工程は、約5未満のpH、好ましくは約4未満のpH、より好ましくは約3のpHで行われる。1つの態様において、疎水性相互作用クロマトグラフィーは、pH約3.0±0.1でSource 15PHE疎水性相互作用クロマトグラフィー媒体を使用する。本明細書で提供されるように、精製プロセスは、汚染物質を除去するために疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用する。疎水性相互作用クロマトグラフィーにおいて、低pHを使用すると多量のNAPを疎水性媒体に結合させることが可能になり、勾配溶出を使用すると、密接に関連する不純物を分離することが可能になる。本明細書で提供されるように、疎水性相互作用クロマトグラフィー媒体から溶出されたNAP画分は、生成物を濃縮し、緩衝液交換を行うために限外濾過およびダイアフィルトレーション(UF/DF)にかけられる。この後に、適切な緩衝液中のNAPは、残存タンパク質および非タンパク質性汚染物質(密接に関連する汚染物質を含む)の大部分を除去するためにイオン交換媒体に適用される。最後に、本明細書で提供されるように、イオン交換クロマトグラフィーから収集されたNAP画分(高度に精製されたNAP薬物物質(API)を含有する)は、NAP薬物物質を濃縮し、最終的な製剤化緩衝液に交換するためにUF/DFにかけられる。
本明細書で提供されるように、最終製剤緩衝液中のNAP薬物物質は濾過および保存されてもよく、さらなる処理工程にかけられてもよい。1つの態様において、最終製剤中のNAP薬物物質は充填プロセスにかけられる。1つの態様において、バルクNAP薬物物質は、適切な無菌環境(例えば、製造施設の「クラス100エリア」)に移され、濾過されて滅菌容器に入れられる。1つの態様において、NAP薬物物質は、例えば、0.2μmフィルターを用いて濾過されて、適切な材料の加圧滅菌された容器(例えば、フッ化エチレンプロピレン(FEP)、エチレンテトラフルオロエチレンコポリマー(EFTE)、またはU.S. Federal Food Drug and CosmeticsのFood Additives Amendment およびUSP Class VI規格の規定を満たす他の材料で作られた容器)に入れられる。1つの態様において、バルクrNAPc2/プロリン薬物製品はクラス100エリアに移され、Millipak 0.2μmフィルターを用いて濾過されて、汚染をしない成型ライナーレスTefzel(登録商標)ETFEスクリューキャップ(screw closure)の付いた、加圧滅菌された1リットル成型Nalgene Tefzel(登録商標)FEP1600シリーズボトルに入れられ、この後に、ボトルは保存のために-20±10℃のフリーザーに移される。
1つの局面によれば、本発明は、NAP薬物物質を含む最終薬物製剤が、無菌のバイアル、容器、または他の包装容器に充填される充填工程をさらに提供する。充填工程は、さらなる濾過工程を含んでもよく、個々のバイアル、容器、または他の包装容器を充填する前に充填スイート(filling suite)を使用することを含んでもよい。充填工程によってNAP薬物製品のバイアルが得られてもよく、ここで、NAP薬物製品は最終剤形の状態にある。液体充填工程によって、液体の形をしたNAP薬物製品のバイアルを得ることができる。NAP薬物製品は、充填工程の間に導入された形(例えば、NAP薬物製品を含む溶液の単位用量)で使用することができる。または、NAP薬物製品の製剤は充填工程後にさらに操作されてもよい(例えば、液体充填工程後にバイアル中のNAP薬物製品が凍結乾燥されてもよい)。本明細書で提供されるように、望ましい最終濃度のNAP薬物物質を濾過して無菌の充填スイートに入れ、次いで、個々の予め滅菌されたバイアルに充填することができる。
本発明は、凍結乾燥NAP薬物製品を産生するための任意の凍結乾燥工程を提供する。充填工程の後に、バイアルまたは他の容器に入っているNAP薬物製品を凍結乾燥し、次いで、密封する(例えば、バイアルの栓を押し下げ、バイアルに蓋をする)。NAP薬物製品が過酷な温度ストレス(例えば、50℃で28日)にかけられた時に、凍結乾燥製剤は高い純度および持続的な安定性を維持する。
実施例1. NAP薬物物質発現系用の細胞バンクの調製
実施例1.1. rNAPc2/プロリン発現系
rNAPc2遺伝子を、PCRレスキューを用いて、ピチア-パストリス発現ベクターpYAM7sp8(Laroche et al.,1994,Biotechnology 12:1119-1124)にクローニングした。pYAM7sp8ベクター(図1)は、pHIL-D2(Despreaux and Manning,1993,Gene 106:35-41)の誘導体である。これは、ピチア-パストリスAOX1遺伝子のプロモーターおよび転写終結シグナル、分泌シグナルペプチド(ピチア-パストリス酸性ホスファターゼシグナル配列と、ハイブリッドS.セレビシエ(S.cerevisiae)α-接合因子のプロ配列の融合)、ならびにトランスフェクタント選択用のHIS4マーカーを含む。
マスター細胞バンク(MCB)を、シングルコロニー分離菌(GS115/AcaNAPc2P-55)のプレバンクを用いて調製した。2%グルコース含有YEPDフラスコ培地(バクトペプトン、酵母エキス、およびデキストロース)を含むフラスコに、0.5mLのプレバンクを接種し、0.5〜1.0の光学密度(A550nm)まで増殖させた。培養物を採取し、グリセロール(冷凍保存剤)で最終濃度15%まで希釈し、-60℃未満の温度で保管されたクライオバイアル(cryovial)に入れて冷凍した。
新たな製造者作業用細胞バンク(MWCB)をMCBのバイアルから製造した。MCBバイアルを用いて、酵母ペプトン培地(ペプトンおよび酵母エキス)ならびに2%デキストロースを含むフラスコに接種した。光学密度(A600nm)が17.0±5.0になるまで、フラスコを28±2℃および250rpmでインキュベートした。培養物を採取し、冷凍保存剤としてグリセロールを最終濃度9%まで添加した。1.1±0.1mLのアリコートを2.0mLクライオバイアルに充填し、凍結し、-70±10℃で保存した。
宿主同定
rNAPc2/プロリン細胞バンク培養物をトリプチケースソイ寒天(TSA)プレートに画線し、増殖のためにプレートをインキュベートした。Vitek(登録商標)同定システムを用いた同定のために、分離菌を準備した。Vitek(登録商標)同定システムでは、温度制御チャンバーと、26種類の従来の生化学試験用の基質を含むVitek(登録商標)酵母試験カードに接種された分離菌懸濁液の濁度の変化をモニタリングする測光センサー装置を使用する。rNAPc2/プロリン細胞バンク宿主同定のために、結果として得られた反応バイオパターンを、正の対照の生物(ピチア-パストリス,ATCC No.76273)反応バイオパターンと比較した。
rNAPc2/プロリン細胞バンクの生細胞濃度は、3種類の細胞バンクバイアル(それぞれ、初め、中間、および終わりからの細胞バンクバイアル)からの連続希釈液を調製することによって、生コロニー形成単位(CFU)を数えることによって測定した。希釈液をTSAプレートに3回繰り返してプレートし、インキュベートされたCFUを計数し、CFU/mLとして細胞濃度を求めるために計算を行った。
宿主ゲノムに組み込まれたrNAPc2/プロリン遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法を用いて増幅することによって遺伝子配列決定を行うために、細胞バンク培養物を調製した。PCR産物を精製し、濃度を求めた。次いで、PCR産物を、ジデオキシチェーンターミネーション(Sanger)法を用いて配列決定した。結果として得られた細胞バンクの遺伝子配列を、既知のrNAPc2 DNA配列と比較した。100%マッチによって同一性を確認した。
rNAPc2/プロリン発酵ブロスの非宿主汚染を、9枚のTSAプレートのそれぞれに100mLを接種することによって試験した。3枚のプレートを3種類の温度(20〜25℃、30〜34℃、および35〜39℃)でインキュベートした。7日間のインキュベーション期間の間、特徴的な宿主とは異なる(特に、コロニー形態、色、および/またはコロニーサイズにおいて違いを示す)微生物コロニーがあるかどうか、プレートを詳細に調べた。最終的なリードプレートにおいてグラム染色も行った。適切な負の対照もアッセイに含めた。
宿主同定
rNAPc2/プロリン細胞バンク培養物をサブローデキストロース寒天(SDA)プレートに画線し、プレートを20〜25℃で7日間増殖のためにインキュベートした。同時に、正の対照(K.パストリス(P.パストリスの別名)のATCC株)を同様にSDAプレートに画線した。次いで、増殖した選択コロニーをグラム染色で試験した。
rNAPc2/プロリン細胞バンクの生細胞濃度は、2つの細胞バンクバイアル(1つは細胞バンクを冷凍する前に引き抜かれたバイアル、1つは細胞バンクを冷凍した後に引き抜かれたバイアル)からの連続希釈液を調製することによって、生コロニー形成単位(CFU)を数えることによって測定した。それぞれの希釈液の100μLアリコートを2回繰り返してTSAにプレートし、5〜7日間インキュベートした。数えられるコロニー(30〜300CFU)のある全てのプレートを計数した。同じ試験試料希釈液のプレートから得られた数を平均し、希釈を掛け、CFU/mLとして結果を報告するために100μLアリコートサイズで割った。
総DNAを、新たに作成された細胞バンク(試験物)から単離した。NAPc2/プロリン遺伝子を、クローニングされたNAPc2/プロリン遺伝子の5'配列および3'配列に相同なプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で増幅した。結果として得られたDNA断片(約500bp)を標準的な方法を用いて精製し、Thermo Sequenase放射性標識ターミネーターサイクルシークエンシングキット(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)を使用して行うプライマーウォーキング法を用いるDNA配列決定用のテンプレートとして使用した。配列決定用フィルムをデジタル化によって読み取り、配列データを集め、Sequencher(商標)ソフトウェア,バージョン3.0(Gene Codes Corp.,Ann Arbor,MI)を用いて分析した。次いで、試験物から得られたコンセンサス配列を、NAPc2/プロリン遺伝子の理論配列と比較した。
新たに作成された細胞バンク(試験物)を凍結する前に、バイアルを非宿主試験にかけた。ブロスの試料を食塩水で1000倍に希釈した。9種類の培地タイプのデュプリケートプレートに、100μLの希釈試験試料を接種した。さらに、正の対照(K.パストリス(P.パストリスの別名)のATCC株)を希釈し、同様にプレートに接種した。別のプレートセットには接種せず、負の対照プレートと名付けた。SDAを除く全てのプレートを30〜35℃で48〜72時間インキュベートした。SDAプレートは20〜25℃で7日間インキュベートした。1日後、2日後、または3日後に、プレートの増殖を調べた。さらに、7日後にSDAプレートの増殖を調べた。API試験およびグラム染色によって、全ての異常なコロニーを同定した。
rNAPc2/プロリン薬物物質を産生するための製造プロセスは、発酵、回収、精製、ならびにバルク濾過および充填からなった。以下のセクションでは、プロセスの各段階の単位操作それぞれについて説明する。各単位操作の流れ図を図2〜図4に示す。図2〜図4には、流れ図によって、装置、緩衝液、成分、ならびに入力および出力パラメータがまとめられている。International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) Active Pharmaceutical Ingredient (API) Good Manufacturing Protocol (GMP)の規定に遵守しながら、必要に応じて、等価な供給業者および材料が代わりに用いられてもよい。
本セクションでは、rNAPc2/プロリンを産生するための発酵手順について説明する。rNAPc2/プロリンタンパク質をピチア-パストリスによって分泌タンパク質として産生した。rNAPc2/プロリンの発酵プロセスは、種フラスコ(seed flask)、種発酵、および産生発酵からなった(図2、発酵流れ図)。全ての培地成分には純水,USPが用いられている。
種フラスコ単位操作の目的は、種発酵用の適切な密度のある接種材料を供給することであった。3個のMWCBバイアルを解凍し、1ミリリットルを、加圧滅菌培地(pH6.0±0.1)(表1)250mLを含む、バッフル付き2リットル振盪フラスコ(baffled shake flask)3個のそれぞれに無菌的に接種するのに使用した。フラスコに覆いをし、250±5rpmおよび28±2℃でインキュベーターシェーカーに移した。細胞湿重量(WCW)で測定される細胞密度が30g/L以上になるまで、フラスコを27.5±2.0時間インキュベートした。これらの2つのパラメータが得られたら、フラスコのうちの2個の内容物を、加圧滅菌した接種用ボトルに無菌的に移した。
種発酵の目的は、産生発酵用の適切な密度の接種材料を供給することであった。PTM4微量塩(Trace salt)(表3)を含む種発酵用培地(表2)を種ファーメンターに移した。培地を蒸気滅菌し、冷却させ、濾過滅菌した28〜30%水酸化アンモニウムを用いてpHを5.0±0.2に調節した。次いで、50%メタノールに溶解した5%(v/v)KF0880からなる濾過滅菌した消泡液を、セプタムに通して0.5mL/Lの濃度まで添加した。温度が28.0±1.0℃で安定したら、培地に、種フラスコ接種用ボトルの内容物を2.5%の比で接種した。ファーメンターの培養pHを、28〜30%水酸化アンモニウムで5.0±0.2に維持した。発酵の増殖を、細胞湿重量(WCW)を測定することによってモニタリングした。
産生発酵の目的は、高濃度のrNAPc2/プロリンタンパク質を産生することであった。これを実現するために、rNAPc2/プロリン遺伝子を誘導する前に、培養物を高細胞密度まで増殖させた。産生発酵用培地(表4)を産生用ファーメンター内で調製した。これらの培地成分を溶解し、純水USPと混合し、次いで、蒸気滅菌した。タンクを、28.0±1.0℃の初期動作温度まで冷却した。次いで、50%メタノールに溶解した5%(v/v)KF0880からなる濾過滅菌した消泡液を添加した。pHを、濾過滅菌した28〜30%水酸化アンモニウムで5.0±0.3の初期動作範囲まで調節した。初期動作条件が得られたら、培地に種発酵接種材料用缶の内容物を、初回回分培地(接種前重量)10kgあたり1kg接種材料の比で接種した。
本セクションでは、rNAPc2/プロリンを産生するための回収手順について説明する。rNAPc2/プロリンの回収プロセスは、図3の流れ図に示すように、流動床クロマトグラフィー単位操作からなった。
Streamline SP XLイオン交換クロマトグラフィー工程の目的は、rNAPc2/プロリンを細胞破片から分離し、生成物を第1の精製クロマトグラフィー工程に適した緩衝液に交換することであった。分離を行うために使用した媒体は、Streamline SP XL樹脂(Amersham Biosciences)の流動床イオン交換クロマトグラフィーカラムであった。
本セクションでは、rNAPc2/プロリンを産生するための精製手順について説明する。rNAPc2/プロリンの精製製造プロセスは、図4に示すように、疎水性相互作用クロマトグラフィー工程、限外濾過およびダイアフィルトレーション工程、イオン交換クロマトグラフィー工程、それに続く、限外濾過/ダイアフィルトレーション工程、ならびにrNAPc2/プロリン薬物物質(原薬(API)とも呼ばれる)の最終濾過および充填からなった。
初回精製工程では、Source 15PHE疎水性相互作用クロマトグラフィー媒体(Amersham Biosciences)カラムを用いて一部のタンパク質および非タンパク質性汚染物質をrNAPc2/プロリンから除去することによって、生成物を部分的に精製した。
UF/DF#1の目的は、生成物を濃縮し、rNAPc2/プロリンを、Source 15Qクロマトグラフィーに用いられる緩衝液に交換することであった。3kD分子量孔径の再生セルロース限外濾過フィルターを使用した。
最終クロマトグラフィー単位操作では、Source 15Qイオン交換クロマトグラフィー媒体(Amersham Biosciences)のカラムを用いて、rNAPc2/プロリンから、残存するタンパク質および非タンパク質性汚染物質の大部分を除去した。
最終UF/DFの目的は、生成物を濃縮し、rNAPc2/プロリンを最終製剤緩衝液に交換することであった。3kD分子量孔径の再生セルロース限外濾過フィルターを使用した。
精製rNAPc2/プロリンAPIをクラス100エリアに移し、Millipak 0.2μmフィルターを用いて濾過して、汚染をしない成型ライナーレスTefzel(登録商標)ETFE(エチレンテトラフルオロエチレンコポリマー)スクリューキャップの付いた、加圧滅菌した1リットル成型Nalgene Tefzel(登録商標)FEP(フッ化エチレンプロピレン)1600シリーズボトルに入れた。ボトルを、保管のために-20±10℃のフリーザーに移した。
プロセス間合格基準を含む、モニタリングされた条件をプロセスの流れ図(図2〜図4)に列挙した。プロセス間試験方法の簡単な説明を以下に列挙した。
pH.試験の直前にNISTトレーサブルpHスタンダードで較正されたpHメーターを用いて、試料を測定した。試料のpHを25±2℃で測定した。
溶液の電解質成分は、測定しようとする範囲をひとまとめにしている伝導率標準で標準化された伝導率計を用いて測定した。試料の伝導率は約25℃で測定した。
約1.5mLの発酵試料を、風袋をはかった微量遠心管に添加し、10,000rpmで約5分間遠心分離した。それぞれの管からの上清をデカンテーションし、固形物を含む管を秤量した。細胞湿重量は、正味重量を、元の試料体積で割ったものに等しかった。
種発酵試料および産生発酵試料の最終ブロスに非宿主汚染があるかどうかを、100μLを、9枚のTSAプレートのそれぞれに接種することによって試験した。3枚のプレートを、3種類の温度(20〜25℃、30〜34℃、および35〜39℃)でインキュベートした。7日間のインキュベーション期間の間、特徴的な宿主とは異なる(特に、コロニー形態、色、および/またはコロニーサイズにおいて違いを示す)微生物コロニーがあるかどうか、プレートを詳細に調べた。最後の測定日にはグラム染色も行った。適切な負の対照もアッセイに含めた。
産生発酵試料の上清、およびStreamline SP XL試料を0.22μmのフィルターで濾過し、次いで、Kromasil C8,4.6×250mm逆相カラムに注入した。試料注入前に、カラムを22%アセトニトリル,0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)で平衡化した。次いで、rNAPc2/プロリン物質を溶出させるために、0.1%TFAに溶解した22〜28%アセトニトリルの直線勾配を、1mL/minで20分間にわたって行った。rNAPc2/プロリンmg/mL対ピーク面積の線形回帰に基づいて検量線を作成するために、既知濃度のrNAPc2/プロリン標準希釈液を使用した。試料中のrNAPc2/プロリン量を検量線から外挿し、試料中のrNAPc2/プロリン濃度を求めるために、注入された試料の体積で割った。rNAPc2/プロリン純度は総ピーク面積のパーセントとして計算した。
Source 15PHEから最終UF/DF工程までの各精製プールの濃度は、適切に較正された分光光度計における280nmでの吸光度を用いて求めた。この計器は、試験試料を測定する前に、適切な緩衝溶液を用いてゼロにされた。試験試料は、直線範囲内(0.13〜1.62AU)で希釈することによって調製した。濃度(mg/mL)を得るために、280nmでの平均吸光度を吸光率[0.59AU/cm-1(mg/mL)-1]で割り、希釈率を掛けた。
15PHE画分およびプール、UF/DF#1プール、Source 15Q画分およびプール、ならびに最終UFDFプールの純度をそれぞれC 18逆相アッセイで分析した。直線勾配逆相クロマトグラフィーによって、rNAPc2/プロリンを試料の他の成分から分離した。必要に応じて、試料をcPBSで約1mg/mLまで希釈し、30μLを、78%移動段階A(水に溶解した0.1%TFA)および22%移動段階B(アセトニトリルに溶解した0.1%TFA)で平衡化されたWaters Symmetry C18逆相カラム(5μm粒子,4.6mm内径×250mm長さ,Waters Corp.,Bedford MA)に注入した。次いで、移動段階Bのパーセンテージを、1mL/min流速を用いて、20分にわたって26%まで直線的に上げた。ピークを、210nmでUV検出器でモニタリングした。rNAPc2/プロリンの純度は、クロマトグラムのrNAPc2/プロリンピーク面積を総ピーク面積で割り、その比をパーセンテージとして表すことによって計算した。
外観、pH、および濃度:
試験物のアリコートを、色、透明度、および目に見える異物の存在について目視検査した。試験の直前にNISTトレーサブルpHスタンダードで較正されたpHメーターを用いて、試料を測定した。試料のpHは25±2℃で測定した。試料の濃度は、適切に較正された分光光度計における280nmでの吸光度を用いて求めた。この計器は、試験試料を測定する前に、試料希釈剤を用いてブランクにされた。3つの同じ試験試料は、方法バリデーションの間に確かめられた直線範囲内(0.13〜1.62AU)で希釈することによって調製した。濃度(mg/mL)を得るために、280nmでの平均吸光度を0.59AU/cm-1(mg/mL)-1(吸光率)で割り、希釈率を掛けた。
rNAPc2/プロリン試験物およびrNAPc2/プロリン参照標準を、酵素消化の前に還元およびアルカリ化した。rNAPc2/プロリンを、高濃度の塩酸グアニジンで処理することによって変性させ、次いで、ジチオスレイトールで還元した。次いで、還元型システインをヨードアセトアミドでアルキル化した。還元およびアルキル化されたrNAPc2/プロリン調製物を、2%w/wトリプシンで約16時間、37±2℃で消化した。次いで、クロマトグラムの形をした断片パターンすなわち「フィンガープリント」を得るために、それぞれの消化rNAPc2/プロリンタンパク質試料からのトリプシンペプチドを逆相クロマトグラフィーで分離した。ピーク保持時間を用いて、試料溶出プロファイルを標準溶出プロファイルと視覚的に比較した。これらのプロファイルは、新たなピークも失われるピークもなく、同等のものでなければならない。
還元剤と共に、または還元剤を伴わずに、Novex NuPAGE(登録商標)LDS試料調製緩衝液(pH8.4)を用いて、試験試料、rNAPc2/プロリン参照標準、およびrNAPc2/プロリン強度マーカーを、それぞれ、0.5mg/mL、0.5mg/mL、および0.005mg/mLの最終濃度まで希釈した。タンパク質標準(Novex Mark 12(登録商標))の混合物を製造業者の説明書に従って希釈した。還元された試料は95±2℃で5分間加熱した。還元試料および非還元試料を別々のゲルで測定した。10μg試料ロードの参照標準および試験試料、0.1μg試料ロードの強度マーカー(1%の試料ロード)、ならびに適切な質量のMark 12標準を、Novex NuPAGE(登録商標)プレキャスト4〜12%アクリルアミドBis-Trisゲルに(pH6.4)での電気泳動によって分析した。ゲルを、Novexコロイドクマシーブルー染色液で染色した。同一性を確認するために、主要なバンドを、参照標準およびタンパク質標準の混合物と視覚的に比較した。不純物バンドの強度を、1%強度マーカーバンドと視覚的に比較した。マーカーより大きな全ての不純物バンドを報告した。マーカーより大きな不純物バンドが存在しなければ、純度は参照と同等のものであると報告した。rNAPc2/プロリンバンドは、予想される分子サイズで現れなかったことに留意のこと。rNAPc2/プロリンは非球形であるために、より大きな見かけの分子サイズで移動した。非還元ゲルでは、rNAPc2/プロリンバンドは21.5〜31kDa標準の間に移動したのに対して、還元ゲルでは、rNAPc2/プロリンバンドは21.5kDa標準と共に移動した(Novex製品はInvitrogen Corp.,Carlsbad CAから入手できる)。
rNAPc2/プロリンを、直線勾配逆相HPLCによって試料の他の成分から分離した。rNAPc2/プロリンの純度は、クロマトグラムのrNAPc2/プロリンピーク面積を総ピーク面積で割り、パーセンテージとして表した比として報告した。cPBSで希釈した約1mg/mLの試料希釈液30μL体積を、78%移動段階A(水に溶解した0.1%TFA)および22%移動段階B(アセトニトリルに溶解した0.1%TFA)で平衡化されたWaters Symmetry C18逆相カラム(5μm粒子,4.6mm内径×250mm長さ, Bedford MA)に注入した。次いで、移動段階Bのパーセンテージを、1mL/min流速を用いて、20分にわたって26%まで直線的に上げた。ピークを、210nmでUV検出器でモニタリングした。
エンドトキシンの測定はUSP方法に従って行った。
rNAPc2/プロリンは、トロンボプラスチン添加によって開始するヒト血漿の凝固時間を濃度依存的に延長した。ヒト血漿凝固に及ぼすrNAPc2/プロリンの抗凝血作用は、凝固を開始するのにウサギ脳トロンボプラスチン(組織因子,Simplastin-Excel)を使用する自動化プロトロンビン時間(PT)凝固アッセイで直接測定した。rNAPc2/プロリン参照標準およびrNAPc2/プロリン試料を両方ともアッセイ緩衝液で1035nMまで希釈した。次いで、試験装置(Coag-A-Mate(登録商標)MAX,Organon Teknika,現在、bioMerieux,Durham NCが所有)は、ヒト血漿に溶解して出発調製物から一組の希釈液を作成し、結果として生じる凝固時間(CT)(秒)を測定した。曲線は、rNAPc2/プロリンの対数CT対希釈濃度の線形回帰フィットによって定義した。次いで、試験物の生物活性を、試験物の曲線の傾きと参照標準の曲線の傾きの比×参照標準の活性として計算した。
試料の総好気性菌数(Total Aerobic Count:TAC)および総酵母/カビ数(Total Yeast/Mold Count:TYMC)は、2つの10mLアリコートを別々の0.45μmセルロース-エステル膜フィルターに通して濾過することによって求めた。フィルター膜を調製し、一方を、TSA寒天プレート上で30〜35℃で48〜72時間インキュベートし、他方を、SDA寒天プレート上で20〜25時間で5〜7日間インキュベートした。インキュベーション期間の後、両方の種類の寒天上のコロニー形成単位(CFU)の数を数えた。10mL試料あたりの合計CFU数を報告した。
Threshold Total DNAアッセイ(Molecular Devices Corp.Sunnyvale CA)は一本鎖DNAに特異的であった。このアッセイには3つの段階があった。反応段階において、一本鎖DNAは標識試薬中で2種類の結合タンパク質と反応した。一方の結合タンパク質は、ビオチンに結合した、大腸菌由来の高親和性一本鎖DNA結合タンパク質(SSB)であった。ストレプトアビジンも存在すれば、SSB結合体のビオチンに密接に結合した。他方の結合タンパク質は、酵素ウレアーゼに結合した、一本鎖DNAに対するモノクローナル抗DNA抗体であった。これらの結合タンパク質は37℃の溶液中でDNAと複合体を形成した。
rNAPc2/プロリンを、分子サイズの違いに基づいてサイズ排除クロマトグラフィーによって試料の他の成分から分離した。rNAPc2/プロリンの同一性は、3つの試料複製の平均保持時間(RT)と、5つのシステム適性標準(system suitability standard)を比較することによって確認した。%RTは97.0〜103.0%でなければならない。rNAPc2/プロリンの純度は、クロマトグラムのrNAPc2/プロリンピーク面積を総ピーク面積で割り、これをパーセンテージとして表すことによって計算した。試料希釈液を約1mg/mlの基準濃度までcPBSで調製し、サイズ排除カラム(Superdex 75 10/30,Amersham Biosciences)に注入した。流速は0.5mL/minに維持した。ピークを210nmでのUV検出によってモニタリングした。
分子量は、VG Bio-Q(Quattro II Upgrade)四重極質量分析計(Micromass,Danvers,MAによって製造され、現在、Waters Corp.,Bedford,MAが所有している)を用いたエレクトロスプレー質量分析によって求めた。試料は、0.1%トリフルオロ酢酸水溶液で約1mg/mLまで希釈し、予め洗浄したTrap Cartridgeに注入して、脱塩した。次いで、カートリッジを、質量分析計の注入口に入れて溶出させた。
Procise N-Terminal Sequencing System(Applied Biosystems,Foster City,CA)を用いて、試験物のN末端から15残基までを配列決定した。試験物の前後に、βラクトグロブリン較正標準の15残基までを配列決定した。Cys(システイン)残基はProciseシステムでは観察されなかった。得られた配列を、試験物の理論配列と比較した。
実施例5.1. 液体薬物製品の製造
rNAPc2/プロリン液体薬物製品製造プロセスを図5の薬物製品の流れ図に描いた。冷凍したrNAPc2/プロリンAPIを-20℃の保管場所から取り出し、2〜8℃で解凍した。解凍したら、プールおよび混合のために、APIを調合区域に移した。薬物製品を作成するために、APIを、65mMリン酸ナトリウム/80mM NaCl(pH7.0)で、UVアッセイによる濃度(前記)によって測定されるように1.0±0.1mg/mLの最終濃度まで希釈した。この希釈は、指定の濃度が確実に得られるようにプロセス間濃度測定を伴う工程において行った。次いで、希釈したAPIを、0.2μm Millipore Millipakフィルターに通してろ過し、2〜8℃の短期間保管場所に置いた。
rNAPc2/プロリンバルク薬物物質の溶液(12±1.2mg/mL濃度,65mMリン酸ナトリウム/80mM塩化ナトリウム(pH7.0±0.1)に溶解)を、0.2Mアラニンおよび25mMリン酸二水素ナトリウム(pH7.0)の溶液に3mg/mLまで希釈した。次いで、希釈したrNAPc2/プロリンをアラニン/リン酸溶液で緩衝液交換した。次いで、rNAPc2/プロリン溶液を、アラニン/リン酸溶液で2mg/mL(UVアッセイによる濃度によって測定)まで希釈した。次いで、濃度が1.0±0.1mg/mL rNAPc2となるように、2mg/mL rNAPc2/プロリン溶液を等量の25mMリン酸ナトリウム,4%スクロース(pH7.0)で希釈した。最後に、1mg/mLの製剤化されたrNAPc2/プロリン溶液を、0.2μmフィルターを用いて濾過した。
本明細書で開示されるプロセスが他のNAP薬物物質およびNAP薬物物質の製造に適していることを確かめるために、様々なNAPの等電点(pI)を求めた。5,866,542に開示されるNAPタンパク質の配列をpI予測プログラムで計算した。表7は、ProtParamおよびAtalier BioInformatiqueによって計算された、USに開示されたNAPタンパク質のpIを示す。ProtParamは、Swiss Institute of Bioinformatics(SIB)によって開発されたExPASy(Expert Protein Analysis System)を使用し、North Carolina Supercomputing Center(NCSS)が主催しているhttp://us.expasy.ort/tools/protparam.htmlで見られる。Atalier BioInformatique(aBi)は、Universite Aix-Marseille Iが主催しているhttp://www.up.univ-mrs.fr/〜wabim/d abim/compo-p.htmlで見られる。
Claims (44)
- 以下を含む、線虫類抽出抗凝血タンパク質(NAP)薬物物質を製造するためのプロセス:
(a)適切な宿主においてNAPを産生する工程を含む発酵プロセスであって、少なくとも1つのNAPコード配列が宿主のゲノムに組み込まれている、発酵プロセス;
(b)NAPを細胞および細胞片から分離する工程を含む回収プロセス;および
(c)NAP薬物物質から汚染物質を取り除く工程を含む精製プロセス。 - 精製プロセスが、NAP物質を最終薬物製剤(drug formulation)に導入する工程をさらに含む、請求項1記載のプロセス。
- NAP薬物製品(drug product)を産生するための充填プロセスをさらに含む、請求項2記載のプロセス。
- NAPが、rNAPc2、rNAPc2/プロリン、AcaNAP5、AcaNAP6、AcaNAP23、AcaNAP31、AcaNAP42、AcaNAP48、AceNAP5、AceNAP7、AduNAP4、AcaNAP24、AcaNAP25、AcaNAP44、またはAcaNAP46からなる群より選択される、請求項1記載のプロセス。
- NAPがrNAPc2/プロリンである、請求項1記載のプロセス。
- NAPが、rNAPc2(AcaNAPc2)、rNAPc2/プロリン(AcaNAPc2/プロリン)、AcaNAP5、AcaNAP6、AcaNAP23、AcaNAP31、AcaNAP42、AcaNAP48、AceNAP5、AceNAP7、AduNAP4、AcaNAP24、AcaNAP25、AcaNAP44、またはAcaNAP46からなる群より選択される、請求項2記載のプロセス。
- NAPがrNAPc2/プロリンである、請求項2記載のプロセス。
- 宿主がピチア-パストリス(Pichia pastoris)である、請求項1記載のプロセス。
- 発酵プロセスが、宿主細胞を望ましい細胞密度まで増殖させる種発酵プロセスおよびNAPを望ましい力価まで産生する産生発酵プロセスを含む、請求項1記載のプロセス。
- 産生発酵プロセスが、グリセロール回分発酵、グリセロール流加発酵、メタノール適応発酵、およびメタノール誘導発酵を含む、請求項9記載のプロセス。
- メタノール適応発酵およびメタノール誘導発酵の間に、発酵のpH範囲を約2.9±0.1pH単位に制御する工程をさらに含む、請求項10記載のプロセス。
- 発酵の温度を制御する工程をさらに含む、請求項10記載のプロセス。
- 発酵のメタノール適応期の温度を、最初の約4時間、約28±2℃に維持し、メタノール適応期の残りの時間、約25±1℃に維持する工程を含む、請求項12記載のプロセス。
- 産生発酵が約7日間まで行われ、この間、NAP力価が増加し続ける、請求項10記載のプロセス。
- 回収プロセスが流動床イオン交換クロマトグラフィーを含む、請求項1記載のプロセス。
- Streamline SP XLイオン交換樹脂流動床クロマトグラフィーを含む、請求項15記載のプロセス。
- 精製プロセスが、疎水性相互作用クロマトグラフィー、NAP画分の収集、NAP画分の少なくとも1回の限外濾過/ダイアフィルトレーション(UF/DF)、イオン交換クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーからのNAP画分の収集を含む、請求項1記載のプロセス。
- イオン交換クロマトグラフィーからのNAP画分がNAP薬物物質を含む、請求項17記載のプロセス。
- 疎水性相互作用クロマトグラフィーが、pH約3.0±0.1でSource 15PHE疎水性相互作用クロマトグラフィー媒体を使用する工程を含む、請求項17記載のプロセス。
- イオン交換クロマトグラフィーが、Source 15Qイオンクロマトグラフィー媒体を使用する工程を含む、請求項17記載のプロセス。
- イオン交換クロマトグラフィーからの画分の少なくとも1回の最終UF/DFをさらに含む、請求項17記載のプロセス。
- UF/DFが、NAP薬物物質を、NAP薬物製品を生成するための最終薬物製剤緩衝液に交換する、請求項21記載のプロセス。
- 充填プロセスが最終薬物製剤中のNAP薬物物質のバルク濾過を含む、請求項3記載のプロセス。
- 剤形の状態にあるNAP薬物物質を分配してNAP薬物製品を得る充填工程をさらに含む、請求項23記載のプロセス。
- 充填プロセスがNAP薬物製品の凍結乾燥をさらに含む、請求項24記載のプロセス。
- 以下を含む、rNAPc2/プロリン薬物物質を製造するためのプロセス:
(a)少なくとも1つのrNAPc2/プロリンコード配列がゲノムに組み込まれているピチア-パストリスにおいてrNAPc2/プロリンを産生する発酵プロセスであって、宿主細胞を望ましい細胞密度まで増殖させる種発酵プロセス、ならびにグリセロール回分発酵、グリセロール流加発酵、メタノール適応発酵、およびメタノール誘導発酵を含む約7日間までの産生発酵プロセスを含む、発酵プロセス;
(b)rNAPc2/プロリンを細胞および細胞片から分離する、イオン交換流動床クロマトグラフィーを含む回収プロセス;および
(c)疎水性相互作用クロマトグラフィー媒体を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィー、rNAPc2/プロリン画分の収集、rNAPc2/プロリン画分の少なくとも1回の限外濾過/ダイアフィルトレーション(UF/DF)、イオン交換クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーからのrNAPc2/プロリン画分の収集を含む、精製プロセスであって、イオン交換クロマトグラフィーからのrNAPc2/プロリン画分はrNAPc2/プロリン薬物物質を含む、精製プロセス。 - 発酵の温度を制御する工程をさらに含む、請求項26記載のプロセス。
- メタノール適応発酵の温度を、最初の約4時間、約28±2℃に維持し、メタノール適応発酵の残りの時間、約25±1℃に維持する工程を含む、請求項27記載のプロセス。
- メタノール適応発酵およびメタノール誘導発酵の間に、pHを約2.9±0.1に維持する工程を含む、請求項26記載のプロセス。
- pH約3.2±0.2でのStreamline SP XLイオン交換樹脂流動床クロマトグラフィーを含む、請求項26記載のプロセス。
- pH約3.0±0.1でのSource 15PHE疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む、請求項26記載のプロセス。
- Source 15Qイオンクロマトグラフィーを含む、請求項26記載のプロセス。
- イオン交換クロマトグラフィーからの画分の少なくとも1回の最終UF/DFをさらに含む、請求項26記載のプロセス。
- rNAPc2/プロリン液体薬物製品を製造するためのプロセスであって、請求項26記載のプロセスを含み、rNAPc2/プロリン薬物物質を最終薬物製剤に導入する工程、最終薬物製剤中のrNAPc2/プロリン薬物物質のバルク濾過を含む充填プロセス、および剤形の状態にあるrNAPc2/プロリンを容器に分配してrNAPc2/プロリン液体薬物製品を生成する充填工程をさらに含む、プロセス。
- 請求項34記載のプロセスを含み、容器中のrNAPc2/プロリン液体薬物製品を凍結乾燥する工程をさらに含む、rNAPc2/プロリン凍結乾燥薬物製品を製造するためのプロセス。
- 請求項1のプロセスによって製造された、NAP薬物物質。
- NAPが、rNAPc2(AcaNAPc2)、rNAPc2/プロリン(AcaNAPc2/プロリン)、AcaNAP5、AcaNAP6、AcaNAP23、AcaNAP31、AcaNAP42、AcaNAP48、AceNAP5、AceNAP7、AduNAP4、AcaNAP24、AcaNAP25、AcaNAP44、またはAcaNAP46より選択される、請求項36記載のNAP薬物物質。
- NAPがrNAPc2/プロリンである、請求項37記載のNAP薬物物質。
- 請求項2記載のプロセスによって製造された、NAP薬物製品。
- NAPが、rNAPc2(AcaNAPc2)、rNAPc2/プロリン(AcaNAPc2/プロリン)、AcaNAP5、AcaNAP6、AcaNAP23、AcaNAP31、AcaNAP42、AcaNAP48、AceNAP5、AceNAP7、AduNAP4、AcaNAP24、AcaNAP25、AcaNAP44、またはAcaNAP46より選択される、請求項39記載のNAP薬物製品。
- NAPがrNAPc2/プロリンである、請求項40記載のNAP薬物製品。
- 請求項26記載のrNAPc2/プロリン薬物物質。
- 請求項34記載のrNAPc2/プロリン液体薬物製品。
- 請求項35記載のrNAPc2/プロリン凍結乾燥薬物製品。
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