NO159807B - Fremgangsmaate for fremstilling av en antibiotisk forbindelse. - Google Patents

Description

Denne oppfinnelse angår en fremgangsmåte for frem-

stilling av antibiotiske stoffer. Det beskrives også en

ny stamme av Staphylococcus epidermidis som danner de antibiotiske stoffer, preparater inneholdende nevnte stamme og en metode for kosmetisk eller profylaktisk behandling av menneskehuden med et slikt preparat. De antibiotiske stoffer har baktericid virkning mot Gram-positive bakterier.

Staphylococci er kjent for å danne minst tre klasser

stoffer som har en hemmende virkning på bakterievekst, nemlig bakteriociner, bakteriolytiske enzymer og lav-molekylære antibiotika. Publikasjoner som beskriver fremstilling av lav-molekylære antibiotika fra stafylokokker, er som følger:

HSU, C-Y og Wiseman, G. M., Can. J. Microbiol, r7 (1971),

s. 1223-1226.

Loeb, L.J., Moyer A. og Murray, R. G. E., Can, J. Res. 28E

(1950), s. 212-216.

Pulverer, G og Jeijaszewicz, J., Proceedings of III International Symposium on staphylococci and staphylococcal infections,

s. 599-621. Utgitt av J. Jeijaszewicz.

Stuttgart: Fischer-Verlag.

Se(lwin, S., Marsh, P.D. og Sethna, T. N. , Chemother apy. Proceedings of the 9th International Congress of Chemotherapy",

5_ (1975), s. 391-396. Utgitt av J. D. Williams og A. M. Geddes New York.

Su, T. L. , Br. J. Exp. Pathol., 29^(1948 ), s. 473-481

Halbert, S. P., Swick, L. og Sonn, C, J- Immunol. , 22 d953 >

s. 400-410.

Ingen av de lavmolekylære antibiotika beskrevet i de ovennevnte publikasjoner er imidlertid vist å oppvise en baktericid virkning som resulterer i lyse av bakteriecellene.

I J. Med. Microbiol. _12 (1979), s. 71-82 er det beskrevet forsøk hvor en rekke stammer av bakterier fra menneskehud, omfattende 93 isolater av Proionobacterium acnes og 148

isolater av Micrococcaceae ble sortert med hensyn til sin evne til å hemme veksten av forskjellige indikator-stammer av P. acnes og Staphylococcus epidermidis. 53 stammer av de undersøkte viste en viss aktivitet mot minst én indikator-stamme, og både bred- og smal-spektret hemning ble påvist.

Stammene som ble undersøkt, var tatt fra 36 acne-pasienter og

8 kontrollindivider, og hovedformålet med undersøkelsene var å finne hvorvidt besittelse av hemmende stammer og omvendt besittelse av følsomme stammer hos pasienter resulterer i en disposisjon for acne. De særlige stammer av P. acnes og Micrococcaceae som ble sortert, er ikke identifisert annet

enn ved hjelp av en intern referanse. Videre er det ingen beskrivelse av noe forsøk på å utvinne de aktive stoffer som var ansvarlige for den iakttatte hemning.

Foreliggende oppfinnelse er basert på den oppdagelse at

en spesiell stamme av Staphylococcus epidermidis, dvs. Staphylococcus epidermidis NCIB 11536 (som ble deponert i National Collection of Industrial Bacteria, Torrey Research Station, P.O. Box 31, 135 Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG

3. oktober 1979) kan dyrkes for å danne et nytt lavmolekylart, antibiotisk polypeptid som oppviser bredspektret aktivitet mot Gram-positive bakterier og som adskiller seg fra de lav-molekylære antibiotika som hittil er fremstilt med stafylokokker, ved at de har en baktericid virkning som resulterer i lyse av bakteriecellene. I henhold til oppfinnelsen tilveiebringes således en fremgangsmåte for fremstilling av en polypeptid-forbindelse, eller syre-addisjonssalt derav, med en molekylvekt ikke over 10.000 og med baktericide og bakteriolytiske egenskaper overfor Gram-positive bakterier, idet nevnte forbindelse i sin molekylstruktur inneholder aminosyre-derivat-enheter med formlene

hvor NH--R.-C00H, NH_-R--C00H, NH.-R,-C00H, NH_-R.-C00H, 21 '22 '23 24 NH2-R5-C00H, NH2-R6-COOH og NH2-R?-C00H betyr henholdsvis isoleucin, fenylalanin, alanin, asparaginsyre, glutaminsyre, lysin og glycin, og

betyr prolin.

Særlig egnet blant de antibiotiske polypeptider fremstilt ifølge oppfinnelsen er et antibiotikum med molekylvekt ca. 950 og inneholdende i sin molekylstruktur en aminosyrederivatenhet med hver av de følgende formler og en ytterligere aminosyrederivat-enhet med formelen -NH-R^-CO-hvor NH2-R1-COOH, NH2-R2-COOH, NF^-R-j-COOH, NH2-R4"COOH,

NH2-R5~COOH, NH2-R?-COOH og

ovenfor.

er som definert

Det skal selvsagt forstås at antibiotiske polypeptider

kan beholde sine antibiotiske egenskaper når aminosyre-rekkefølgen eller -innholdet i polypeptidet endres. Antibiotiske polypeptider og addisjonssalter derav som definert ovenfor, ansees derfor å falle inn under foreliggende oppfinnelse når én eller flere, hensiktsmessig fra 1 til 3, av nevnte aminosyrederivat-formelenheter, med unntagelse av enhetene med formlene -NH-R^CO og -NH-Rj-CO- (hvor NH^R^COOH

og NH2~R2-COOH er som definert ovenfor), er fraværende eller erstattet med formelenheter avledet fra forskjellige aminosyrer.

I henhold til oppfinnelsen karakteriseres foreliggende fremgangsmåte ved aerobisk dyrkning av Staphylococcus epidermidis NCIB 11536 i eller på et egnet kulturmedium og derefter utvinning av nevnte antibiotiske forbindelse.

Som et alternativ til fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan det være mulig å fremstille de antibiotiske polypeptider ved ikke-mikrobiologiske prosesser som omfatter trinnvis oppbygning av polypeptidkjeden ved en rekke individuelle peptid-kondensasjoner.

Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen kan utføres under anvendelse av et flytende eller fast kulturmedium som inneholder karbon- og nitrogenkilder sammen med passende uorganiske salter og andre næringsstoffer. Egnede kulturmedier er f.eks. de følgende:

( i) Hjerne- hjerte- infusjonsagar ( BHIA)

Dette er et kommersielt medium som markedsføres av Difco Laboratories, Central Avenue, West Molesey, Surrey, England og inneholder infusjoner fra kalvehjerner og storfehjerter, proteose7pepton (Difco), bakto-dekstrose, natriumklorid og dinatriumfosfat.

( ii) Tryptikase- soya- buljong

Dette er et kommersielt medium som markedsføres av Becton Dickinson&Co, Limited, Empire Way, Wembley, Middlesex, England og inneholder bukspytt-fordøyelsesprodukt av kasein, papain-fordøyelsesprodukt av soyamel, natriumklorid og dinatriumfosfat.

( iii) Trypton L42/ gjarekstrakt L21 medium Dette er et medium som fremstilles for å inneholde 2 vekt% Trypton L42 og 1 vekt% gjærekstrakt L21, begge komponenter som markedsføres av Oxoid Limited, Southwark Bridge Road, London SEI 9HF, England

( lv) Syntetisk medium

Dette er et medium beskrevet av Griffith, C. J. og Melville, T.H., Arch. Oral. Biol., 19 (1974), s. 87-90,

med følgende sammensetning:

Dyrkningstrinnet utføres aerobisk, hensiktsmessig ved en temperatur på 35 til 40°C, fortrinnsvis ca. 37°C, i ca. 12 til 48 timer, fortrinnsvis 24 til 36 timer. Begynnelses-pH-verdien for kulturmediet er hensiktsmessig i området fra 4,5 til 7, idet pH-verdier fra 5 til 6,5 foretrekkes.

Efter fullførelse av dyrkningstrinnet utvinnes det nye antibiotiske stoff fra dyrkningsmediet. Metoder som er funnet å være nyttige ved utførelse av dette utvinningstrinn, er som følger:

1. F ryse- tine- ekstraksjon

Dette er en velkjent teknikk som f.eks. er beskrevet av McGeachie J., Zentrabl. Bakteriol. (Orig A) / lfMS (1965),

s. 377-384. Den ekstraherte væske kan sentrifugeres for å fjerne bakteriene. Den således erholdte urensede fryse-tine-ekstrakt, som eventuelt kan anvendes for å måle det antibiotiske stoff, kan steriliseres ved filtrering gjennom et cellulose-acetatmembranfilter (porediameter, 0,45<y>m, Oxoid Ltd.) og lagres ved 4°C inntil bruk. Ikke-steril ekstrakt kan lagres ved -20°C.

2. Inndampning

pH-verdien i den urensede fryse-tine-ekstrakt gjøres sur, fortrinnsvis til ca. pH 5 og hensiktsmessig ved tilsetning av ION HCl, før inndampning,, fordi den hemmende aktivitet hos

det nye antibiotiske stoff er varmestabilt bare under sure betingelser. Inndampning kan hensiktsmessig utføres ved 90°C på en rotasjonsinndamper (Rotavapor-EL, Buchi, Sveits) under

redusert trykk.

3. Ultrafiltrering

Konsentrering eller dialyse kan oppnås ved positivt-trykk-filtrering under anvendelse av den passende filtreringsmembran, f.eks. i en Amicon modell 52 (kapasitet 65 ml) som markeds-føres av Amicon Limited, HighWycombe, Buckinghamshire, England. Fem dobbelte volumutskiftninger med destillert vann anvendes hensiktsmessig for dialyse.

4. Ammoniumsulfat- utfeining

Ammoniumsulfat settes til fryse-tine-ekstrakten for å oppnå 25 til 30% metning. Efter omrøring kan det derved ut-felte protein fjernes, f.eks. ved sentrifugering. Væsken på toppen bringes derefter til 50-60% metning ved tilsetning av ytterligere (NH^^SO^, igjen fulgt av omrøring og sentrif ugering. Bunnfallet, som inneholder det antibiotiske stoff, kan derefter suspenderes påny i et minimumsvolum buffer, f.eks. 0,05M fosfat-buffer, pH 6,0. Ved utførelse av dette rensningstrinn tilsettes (NH4)2S04 fortrinnsvis først for å oppnå 30% metning og tilsettes derefter for å oppnå ca. 50% metning.

5. Ionebytter- kromatograf i

En prøve delvis renset ved inndampning eller ammoniumsulfat-utfelning tilføres en Sephadex C-25 kationebytterkolonne. Ubundne stoffer elueres med utgangsbuffer, f.eks. 0,05M fosfat-buffer, pH 6.0. Bundne stoffer kan derefter elueres ved en strømningshastighet på 15 ml/time under anvendelse av en lineært økende ionestyrke-gradient på 0 - 0,5M (400 ml) NaCl i 0,5M fosfatbuffer, pH 6,0, og 5,5 ml fraksjoner oppsamles.

6. Gelfiltreringskromatografi

En prøve delvis renset ved inndampning, ammoniumsulfat-utfelning og/eller ionebytterkromatografi tilføres en Sephadex G-50 kolonne og elueres, f.eks. med 0,05M fosfat-buf f er, pH 6,0. Eventuelt kan Sephadex G-25, Sephadex G-15 eller Biogel P2 kolonner anvendes istedenfor Sephadex G-50-kolonnen.

Ved ionebytter- og gelfiltreringstrinnene ovenfor er det funnet at det nye eluerte antibiotiske polypeptidfremstilt ifølge oppfinnelsen ofte har et betydelig NaCl innhold. Dette skyldes den meget kationiske natur til og det aromatiske residuum i polypeptidet som medfører at det bindes sterkt til gelfiltrerings-medier (enten'det er polyakrylamid eller dekstran-geler), og det må derfor anvendes buffere med høy ionestyrke for å fri-

gjøre det.

I praksis er derfor tre alternative kombinasjoner av ionebytter- og gelfiltrerings-kromatografi-trinn utviklet for anvendelse på prøver som er delvis renset ved inndampning eller ved ammoniumsulfat-utfelning:

(a) for å få en høy titer inneholdende NaCl: ved eluering

gjennom en Biogel P2 eller Sephadex G15 kolonne fulgt av

eluering gjennom en Sephadex C25 kolonne;

(b) for å oppnå en lavere titer med lavt NaCl-innhold:

ved eluering gjennom en Sephadex G25 kolonne fulgt av

eluering gjennom en Sephadex G10 kolonne; og

(c) for å kombinere fjernelse av høymolekylært materiale med fjernelse av NaCl: ved eluering gjennom en Sephadex G15 kolonne fulgt av eluering gjennom en Sephadex C25 kolonne fulgt av eluering gjennom en Sephadex G10 kolonne.

Det skal forstås at rensningstrinnene beskrevet ovenfor

er eksempler, og at disse trinn kan modifiseres eller erstattes med andre rensningstrinn efter ønske. F.eks. kan det være mulig å erstatte ammoniumsulfat-utfelningstrinnet ved et lignende trinn hvor det anvendes andre felningsmidler så som etanol eller aceton.

Fortrinnsvis omfatter gjenvinningstrinnet fryse-tine-ekstraksjon, ammoniumsulfat-utfeining, ionebytterkromatografi og gelfiltreringskromatografi.

Som et alternativ til fryse-tine-ekstraksjon omfatter et ytterligere foretrukket gjenvinningstrinn sentrifugering av det inkuberte medium ved ca. 3000g i ca. 30 minutter for å fjerne cellemateriale, hvorefter væsken på toppen underkastes ammonium-sulf at-utf eining og påfølgende trinn som beskrevet for fryse-tine-ekstrakten. Dette er særlig hensiktsmessig når inkuberingen er utført i hjerne-hjerte-infusjonsbuljong.

Det er funnet at i ionebytterkromatografi- eller gel-

filtreringskromatografi-trinnet, skjer det en separering av

to antibiotiske stoffer. Ved ammoniumsulfat-utfeining fulgt av gelfiltreringskromatografi som beskrevet ovenfor, ble det således f.eks. påvist to topper med hemmende aktivitet mot valgte indikatorstammer av S. epidermidis (code number MF 87) og S. cohnii (code number MF 121). En kvantitativ bestemmelse av hemmende aktivitet foretas ved en modifikasjon av fremgangsmåten ifølge Dajani og Wannamaker, J. Bacteriol., 9J_ (1969), s. 985-991. Flere 2-dobbelte fortynninger av preparatene av antibiotiske stoffer ble foretatt i enten hjerne-herte-infusjons-medium (urensede preparater oppnådd ved fryse-tine-ekstraksjon) eller 0,05M fosfatbuffer, pH 6,0 (kolonnefraksjoner) under anvendelse av 0,5 ml volumer. Et 0,02 ml volum av hver for-tynning ble anbragt som en flekk på overflaten av en kimpodet plate av hver indikator-organisme og fikk tørre. Platene ble inkubert aerobt i 6-7 timer ved 37°C. Fortynningen som frem-kalte en tydelig reduksjon i tettheten av veksten av indikatorstammen, ble ansett som endepunktet og ble ansett å inneholde 1 enhet av hemmende aktivitet pr- ml. Figur 1 i de ledsagende tegninger illustrerer de resultater som ble oppnådd med kolonnefraksjoner oppnådd ved gelfiltreringskromatografi, og det vil sees at det er en mindre topp som ble eluert i det volum som ble kastet, og en hovedtopp som ble holdt tilbake av gelen. Resultatene illustrert på figur 1 er for ammoniumsulfat-utfelt inhibitor eluert gjennom Sephadex G50 under"anvendelse av en 0,05M fosfatbuffer ved pH 6,0. Den totale gjenvinning av aktivitet fra kolonnen var 84,3%. Det er fastslått at den mindre topp utgjøres av et stoff med forholdsvis høy molekylvekt (muligens over 30.000) og at hovedtoppen utgjøres av et stoff med forholdsvis lav molekylvekt (under 10.000). Det var en 20-dobbeltøkning i den spesifikke aktivitet hos det lav-molekylære antibiotiske stoff, det antibiotiske polypeptid (fra 2,0.6 til 40 enheter pr. mg protein mot MF121) , men ikke for det høymolekylære antibiotiske stoff som vist i den følgende tabell 1:

Fraksjoner av det høymolekylære antibiotiske stoff hemmet ikke indikatorstammen S. epidermidis (MF 87) før det var konsentrert ved ultrafiltrering. De representerte bare 4,0%

av aktiviteten som ble utvunnet fra kolonnen. Det er det antibiotiske stoff med forholdsvis lav molekylvekt, ansvarlig for hovedtoppen i figur 1, som er det antibiotiske stoff som er av hovedinteresse i foreliggende oppfinnelse.

Virkningsmåten for det lavmolekylære antibiotiske stoff fremstilt ifølge oppfinnelsen mot S. epidermidis (MF 87) er undersøkt i vekstmedium (BHI) og ikke-vekst-medium (fosfat-buffer)for å bestemme hvorvidt virkningsmåten'er bakteriostatisk, baktericid eller bakteriolytisk. For å bestemme virkningsmåten ble Staphylococcus epidermidis (MF 87) dyrket natten over ved 37°C og anvendt som substrat i en begynnelseskonsentrasjon på IO8 celler pr. ml BHI eller 0,5M fosfatbuffer, pH 6,0. Inaktiv inhibitor ble anvendt som kontroll og ble oppnådd ved auto-klavering ved 121°C i 0,25 time ved pH 9,0. pH ble regulert på-ny til 6,0 før bruk. Aktivt,stoff ble oppnådd enten ved Sephadex G50 kromatografi av et inndampet konsentrat (for under-søkelser i vekstmedium) eller ved ionebytterkromatografi av det lavmolekylære stoff på Sephadex C-25 (for undersøkelser i ikke-vekst-medium) . Like volumer av celler og antibiotisk stoff (eller autoklavert antibiotisk stoff) ble blandet ved T , og

o o porsjoner av hver blanding ble inkubert ved 37 C i kuvetter som ble holdt i et automatisk dobbeltstråle-spektrofotometer

(SP1800, Pye Unicam) innstilt på 600 nm med avlesning med

mellomrom på 0,08 time. Resten av hver blanding (også inkubert ved 37°C) ble anvendt for å oppnå avlesninger av levedyktighet-telling. Det mikroskopiske utseende av bakteriene ble bestemt hver time ved Gram-farvning.

Figur 2 i de vedlagte tegnine^r viser forandringene i levedyktighet-telling og optisk tetthet for en suspensjon av celler av S. epidermidis (MF 87), i vekstmedium, i nærvær og fravær av antibiotikum. I fravær av antibiotikum vokste organismene og nådde den stasjonære fase efter 5,2 5 timers inkubasjon. I nærvær av antibiotikum begynte imidlertid levedyktighet- tellingen å falle umiddelbart og var redusert til 10% av sin opprinnelige verdi efter 0,17 time, uten noe reduksjon i optisk tetthet. Kort tid efter begynte den optiske tetthet å avta, og efter 6 timers inkubasjon hadde den nesten nådd null. På dette punkt var levedyktighet-tellingen 10 organismer pr. ml. Gram-farvede filmer av kontrollkulturen ved alle tidspunkter viste intakte Gram-positive kokker. Kulturen som inneholdt antibiotikumet, begynte å lyseres efter 0. 17 time (Gram-negative celler, betydelig morfologi, Gram-negativt materiale utenfor cellene), og graden av lyse økte med fortsatt inkubering. Efter 4 timers inkubasjon var det tilbake få intakte celler.

I ikke-vekst-medium ble tilsvarende resultater oppnådd selv om virkningen av inhibitoren ble redusert slik at levedyktighet-tellingen falt til 10% av sitt opprinnelige nivå efter 0,5 time (sammenlignet med 0,17 time i vekst-mediet).

De følgende egenskaper hos de antibiotiske stoffer

(både lavmolekylære og høymolekylære) fremstilt ved kultur-prosessen ifølge foreliggende oppfinnelse, og de urensede preparater som de gjenvinnes fra, er iakttatt: 1. Protease- følsomhet ( for lavmolekylært antibiotisk stoff)

Det ione-byttede, lavmolekylære, antibiotiske stoff (inneholdende 1,75 mg/ml protein) var følsomt overfor trypsin (2,5 mg/ml) , men resistent mot termolysin (160 \ ig/ ml) , subtilisin (650 yg/ml) og pronase (1,5 mg/ml). Aktivitet ble målt ved pH 6,0 i 0,05M fosfatbuffer. Inkubering fant sted ved 37°C i 3 timer.

2. Hemningsspektra for det urensede preparat ( dvs, fryse- tine-ekstrakt) og' for de separerte lav- og høy- molekylære antibiotiske stoffer

Tabell 2 nedenfor viser hemningsspektra for den urensede fryse-tine-ekstrakt, det lavmolekylære antibiotiske stoff og det høymolekylære antibiotiske stoff. Disse ble separert ved gelfiltrering av et ammoniumsulfat-bunnfall på Sephadex G50.

HBA = oppvarmet blodagar

FMA = frisk blodagar

6HBIA = hjerne-hjerte-infusjonsagar, pH 6,0

+ = sone med total hemning i dråpeområdet

= sone med delvis hemning (redusert vekst) i dråpeområdet

- = ingen hemning

ND= ikke utført

Aktiviteten var begrenset til hemning av Gram-positive organismer. Spekteret for det lavmolekylære, antibiotiske stoff var identisk til det man hadde for det urensede preparat. Færre organismer ble hemmet av det høymolekylære antibiotiske stoff, men dette antas å reflektere dets lavere titer mer enn en virkelig forskjell i spektrum, eftersom de organismer som ikke hemmes, var de som viste størst motstandsevne mot det urensede preparat.

3. Andre egenskaper for det urensede preparat ( dvs, fryse- tine- ekstrakt)>

Virkningen av forskjellige behandlinger på aktiviteten

av urensede fryse-tine-ekstrakter av antibiotikumet (antibiotikaene) er vist i den følgende tabell 3.

Det er funnet at aktiviteten er meget varmestabil ved sure pH-verdier, slik at konsentrerte preparater kan oppnås ved inndampning av fryse-tine-ekstraktene ved pH 5,0. Hemningsaktiviteten var stabil ved 4°C hvis pH var sur, og ble absorbert på følsomme celler av S.epidermidis ved 37°C. Aktiviteten ble utfelt med ammoniumsulfat (0-50% metning). Under fremstillingen på BHI agar, passerte hemningsaktiviteten gjennom en dialyse-membran (retensjonsgrense molekylvekt 14.000) anbragt på over flaten av agaren mellom produsentkulturen og vekstmediet for indikatorstammen. Aktiviteten av rå-preparatene kunne imidlertid ikke gjenvinnes totalt ved dialyse mot destillert vann. Ultrafiltreringsmembraner innstilt på 10.000 og 30.000 molekylvekt holdt tilbake fra 18.75 til 25% av hemningsaktiviteten. Minst 99% av molekylene som er i stand til å passere gjennom membranen, skulle gjenvinnes ved denne metode. Disse resultater viser tilstedeværelsen av lavmolekylære og høymolekylære antibiotiske stoffer.

4. Aktivitet av antibiotiske stoffer overfor S. Epidermidis NCIB 11536

Det er funnet at det høymolekylære antibiotiske stoff hemmer sterk bakteriolytisk aktivitet med hensyn til S.Epidermidis NCIB 11536, mens ingen slik aktivitet iakttas for det lav-molekylære antibiotiske stoff. 5. Aminosyre- analyse av lavmolekylært antibiotisk stoff Aminosyreanalyse viste at det lavmolekylære antibiotiske stoff var et polypeptid avledet fra isoleucin, fenylalanin, alanin, asparaginsyre, glutaminsyre, lysin, glycin og prolin. Spesielt er en aminosyresammensetning av én enhet fra hver av isoleucin, fenylalanin, alanin, asparaginsyre, glutaminsyre, lysin og prolin og to enheter avledet fra glycin påvist. I de polypeptid-antibiotika som tidligere er kjent, er tilstedeværelsen av isoleucin og fenylalanin ikke påvist.

Hsu, C-Y og Wiseman, G.M. i Can J. Microbiol. 18 (1972) 121-5 har imidlertid rapportert epidermidiner som inneholder alanin, asparaginsyre, glutaminsyre, glycin, lysin og prolin, selv om det skal legges merke til at virkningsmåten for disse epidermidiner er bakteriostatisk og ikke baktericid og bakteriolytisk.

6. Vlrkningsmåte for de antibiotiske stoffer

Råpreparatet (dvs. fryse-tine-ekstrakten) oppviser en baktericid virkning sem resulterer i lyse av cellene. Det er iakttatt at lysen som skyldes at S. epidermidis-celler utsettes for det lavmolekylære, antibiotiske stoff, ikke primært var en virkning av adsorpsjon av det antibiotiske stoff, eftersom over 90% av cellene var døde før lyse begynte. Aktiviteten opp-vises også i ikke-vekst media.

På grunn av sin baktericide virkning og sitt brede

spektrum av aktivitet mot Gram-positive bakterier, er det lav-molekylære, antibiotiske stoff fremstilt ifølge oppfinnelsen potensielt nyttig ved behandling av Gram-positive bakterieinfeksjoner, særlig slike infeksjoner i huden. Det lavmolekylære, antibiotiske stoff er av særlig interesse som potensielt nyttig ved behandling av hudinfeksjoner så som infisert eksem, impetigo, byller, cellulitt og særlig acne,

og aktiviteten av stoffet mot et stort antall indikator-

stammer av P.acnes er blitt påvist. Det antas at det lav-molekylære antibiotikum, som fremstilles av en organisme som normalt er til stede på huden, sannsynligvis har større stabilitet og aktivitet på huden enn antibiotika som for tiden er i bruk.

Den antibiotiske polypeptid-forbindelse eller et addisjonssalt derav, fremstilt ifølge oppfinnelsen, kan anvendes ved en metode for behandling av menneske- eller dyrekroppen for å bekjempe Gram-positive bakterieinfeksjoner, særlig Gram-positive bakterielle hudinfeksjoner hos mennesker så som acne, impetigo eller infisert eksem.

Den antibiotiske forbindelse fremstilt ifølge oppfinnelsen kan anvendes som aktiv bestanddel i et farmasøytisk preparat sammen med et farmasøytisk bæremiddel eller hjelpestoff.

Preparatene kan f.eks. være i en form som er egnet for oral, parenteral, enteral eller topisk anvendelse. Preparater for topisk anvendelse foretrekkes, og slike preparater kan f.eks. være i form av oppløsninger, emulsjoner, geler, væsker, salver, kremer elle.r pulvere. Vanlige farmasøytiske bæremidler og hjelpestoffer, såvel som de vanlige fremstillingsmetoder,

kan anvendes for fremstilling av farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen.

Antibiotiske forbindelser fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes ved en metode for behandling av menneske-eller dyrekroppen for å bekjempe Gram-positive bakterieinfeksjoner, hvilken metode omfatter at kroppen behandles med en antibiotisk forbindelse fremstilt ifølge oppfinnelsen.

En foretrukket utførelsesform for behandlingsmetoden på menneske- eller dyrekroppen, omfatter behandling av acne, impetigo eller infisert eksem hos mennesker ved lokal påføring på menneskehuden av et farmasøytisk preparat ifølge foreliggende oppfinnelse i en form som er egnet for nevnte topiske anvendelse.

Stammen S. epidermidis NCIB 11536 ble isolert fra ansiktshuden hos et voksent menneske og ble identifisert i henhold til skjemaet ifølge Kloos, W.E. og Schleifer, K.H. J. Clin.. Microbiol., 1 (1975), s. 82-88. De kjente karakteristika for denne stamme er som følger:

Historie

Original farvebeskrivelse: gråhvit, proteolytisk

(på sjokolade-agar)

Isolasjons- dato: Mai, 1976

Kilde: Ansiktshudoverflate fra frisk, hvit mann (ingen acne vulgaris eller tegn på noen annen hudsykdom), alder 25 år.

L agring: I 40% (volum/volum) glycerol/fosfatbufret salt-oppløsning (PBS)

Vekstbetingelser: Flytende kultur - hjerne-hjerte-infusjon, inkubering natten over, 37°C aerob.

Podestoff: 0,1 ml fra glycerol/PBS lagerkultur.

(bemerk: langvarig lagrede frysetørrede kulturer og kulturer holdt i flytende nitrogen).

Karakteristika:

Næring (aerob vekst)

1. Vitaminkrav: nikotinsyre tiamin

biotin (kan erstattes med oljesyre)

2. Aminosyrekrav: ikke fullstendig bestemt, men vil vokse på syntetisk medium inneholdende 7 aminosyrer.• 3. Krever ikke guanin, uracil eller adenin for vekst.

Staphylococcus epidermidis NCIB 11536, hensiktsmessig i

.et sterilt medium, anvendes ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen .

Forsøk rapportert av Selwyn, S., March P.D., og Sethna

T.N. i Proe. 9th Int. Cong. of Chemotheraphy 5 (1975) 391-6 viser at Staphylococcus-bakterier kan overføres til frisk hud som de kan vokse godt på.

Et kosmetisk eller profylaktisk preparat inneholdende Staphylococcus epidermidis NCIB 11536 sammen med et sterilt bæremiddel eller hjelpestoff, kan anvendes ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.

De kosmetiske eller profylaktiske preparater vil fortrinnsvis være i former som er egnet for lokal påføring på huden.

Fremgangsmåten i henhold til foreliggende oppfinnelse kan anvendes for fremstilling av en antibiotisk forbindelse som kan benyttes ved en fremgangsmåte for kosmetisk eller profylaktisk behandling av menneskehuden for å unngå utbrudd av acne, impetigo eller infisert eksem på denne, hvilken metode omfatter lokal på-føring på menneskehuden av et kosmetisk eller profylaktisk preparat som inneholder en antibiotisk forbindelse fremstilt i henhold til foreliggende oppfinnelse sammen med et bæremiddel eller hjelpestoff.

De følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen:

Mikroorganismer

Indikator-stammene S.epidermidis MF 87 og S. cohnii MF 121, i likhet med den antibiotika-produserende stamme S.epidermidis NCIB 11536, ble isolert fra ansiktshuden hos et voksent menneske. Stammen ble .oppbevart i 40 % (volum/volum) glycerol/PBS under anvendelse av en modifikasjon av metoden ifølge Gore L.F. og Walsh P., J. Med. Lab. Technol., 21 (1964)., s. 244-246.

Kultur

Et isolat av stammen S.epidermidis. NCIB 11536 (tatt fra en lagerkultur oppbevart i 40 % (volum/volum) glycerol/PBS som beskrevet ovenfor) ble inkubert i hjerne-hjerte-infusjon (BHI) buljong i en mengde på 0,1 ml isolat pr. 10 ml buljong, idet inkuberingen foretas aerobisk natten over ved 37°C under anvendelse av en perifer rører.

0,1 ml porsjoner av buljongkulturen som således ble oppnådd, ble podet på to plater av hjerne-h^rte-infusjons-agar (BHIA), idet kulturmediet var slik som dét som markedsføres av Difco Laboratories og hadde den følgende sammensetning pr. liter medium:

Agar - tilsatt til sluttkonsentrasjon på 1% (vekt/volum) Kulturmediets pH-verdi er 6.

Platene ble derefter inkubert i 24 timer under aerobe betingelser ved en temperatur på 37°C.

Gjenvinning av antibiotiske stoffer

1. Fryse- tine- ekstraksjon

Dette trinn ble utført i henhold til en modifikasjon av metoden ifølge McGeachie J., Zentrabl. Bakteriol (orig A), 196, (1965), s. 377-384. Kulturen ble lagret natten over

ved en temperatur på -20°C, derefter tint ved romtemperatur, og den væske som derved ble utpresset, ble oppsamlet. Denne utpressede væske ble derefter underkastet sentrifugering ved 3000 gil time ved 4°C. Den således oppnådde væske på toppen er her omtalt som rå fryse-tine-ekstrakt.

la. Sentrifugering

I det alternative tilfelle hvor inkuberingen ble foretatt aerobt i 48 timer ved 37°C i hjerne-hjerte-infusjonsbuljong med anvendelse av en perifer rører, ble den inkuberte buljong sentrifugert ved 3000 g i 30 minutter for å fjerne cellematerialet. Den således oppnådde væske på toppen (supernatant) ble derefter behandlet på samme måte som beskrevet for den rå fryse-tine-ekstrakt.

2. A mmoniumsulfat- utfeining

Fast ammoniumsulfat (analar,B.D.H.) ble satt til den rå fryse-tine-ekstrakt for å gi 30% metning. Efter om-røring ved 4°C i 3 timer ble det derved oppnådde bunnfall

(som inneholdt noe av proteinet til stede i ekstrakten)

fjernet ved sentrifugering ved 3000 gil time ved 4°C. Ytterligere fast ammoniumsulfat ble derefter tilsatt for å gi 50% metning. Efter omrøring natten over ved 4°C ble det oppnådde bunnfall (som inneholdt de antibiotiske

stoffer som skulle utvinnes) igjen separert ved sentrifugering som beskrevet ovenfor. Dette annet bunnfall ble oppløst i minimumsmengden av 0,05M fosfatbuffer, pH 6,0 ved 4°C, og uoppløst bunnfall ble igjen fjernet ved

sentrifugering for å danne en supernatant for videre rensning.

3. Ionebytter- kromatografi

En 10 ml prøve av supernatanten oppnådd ved ammoniumsulfat-utfelning ble satt til en Sephadex C-25 kationebytterkolonne (kolonnedimensjoner 1,5 x 30 cm) som på forhånd var bragt i likevekt med 0,05M fos fatbuffer, pH 6,0. Ubundne stoffer ble eluert med utgangsbuffer ved romtemperatur. Bundne stoffer ble derefter eluert ved en strømningshastighet på 15 ml pr. time under anvendelse av en'lineært økende ionestyrke-gradient på 6-0,5M (400 ml) NaCl i 0,05M fosfat-buffer, pH 6,0 ved romtemperatur.

Det høymolekylære antibiotiske stoff var ubundet og ble oppnådd i eluatet med utgangsbufferen. Under elueringen

ble 5,5' ml fraksjoner oppsamlet, og de som inneholdt det lavmolekylære antibiotikum (identifisert ved hemmende aktivitet) ble oppsamlet.

4. Gel- filtrerings- kromatografi

10 ml topp-fraksjoner fra ionebytter-kromatografi inneholdende det lavmolekylære antibiotikum ble satt til en Sephadex G 25 kolonne (2,2 x 45 cm, Vq = 61,5 ml,

Vfc = 141 ml) som på forhånd var bragt i likevekt med 0,05M fosfatbuffer, pH 6. Kolonnen ble eluert med 0,05M fosfatbuffer, pH 6,0 ved en strømningshastighet på 12 ml/time ved romtemperatur, og 4 ml fraksjoner, hvorav noen inneholdt det lavmolekylære antibiotikum (igjen identifisert ved sin hemmende aktivitet mot MF 121) ble oppsamlet.

Den følgende tabell 4 oppsummerer de oppnådde resultater:

Protein- måling

I den ovenstående tabell og overalt ellers ble protein bestemt ved metoden ifølge Lowry, O.H., Rosgbrough, N.J.,

Farr A.L. og Randall R.J., J. Biol. Chem., 193 (1951),

s. 265-275, under anvendelse av storfeserumalbumin som referanse.

Undersøkelser av minimal næring

For å videre undersøke fremstillingen av de nye antibiotiske stoffer, er undersøkelse av minimal næring foretatt. Ved disse undersøkelser ble isolater av stammen S.epidermidis NCIB 11536 (tatt fra en lagerkultur oppbevart i 40 % (volum/ volum) glycerol/PBS som beskrevet ovenfor) inkubert aerobt i 24 timer ved 37°C med anvendelse av en perifer rører. Inkubering fant sted i et syntetisk medium som beskrevet ovenfor, men hvor flere komponenter var erstattet, utelatt eller var tilstede i andre konsentrasjoner. Under henvisning til det syntetiske medium beskrevet ovenfor, ble for undersøkelsene av minimal næring f osf atinnholdet redusert til 200 mg/l NaH-jPO^, PIPES ble erstattet med 10000 mg/l MES (2-(morfolino)-etansulfonsyre), K2HP04 ble erstattet med 500 mg/l KC1, og glukoseinnholdet ble innstilt på 2000 mg/l.

Ved anvendelse av dette syntetiske medium som grunnlag

for undersøkelsene av minimal næring, ble aminosyre-innholdene i de syntetiske medier variert ved at det fra mediene ble utelatt forskjellige aminosyrer. Det ble funnet at aminosyre-innholdet i det syntetiske medium kunne reduseres til

800 mg/l L-arginin,

400 mg/l L-cystein,

2000 mg/l L-glutaminsyre,

400 mg/l glycin

400 mg/l L-prolin

400 mg/l L-tryptofan og

400 mg/l L-histidin

uten å hindre veksten av S. epidermidis NCIB 11536 eller dannelse av de antibiotiske stoffer ifølge foreliggende oppfinnelse.

Ved disse undersøkelser ble det også funnet at hevning av total aminosyre-konsentrasjon fra 2800 mg/l til 11200 mg/l resulterte i en 8 til 16 ganger økning i titeren, mens bakterie-utbyttet bare steg med 1%.

Disse resultater viser at aminosyre-sammensetningen har

en markert virkning på antibiotika-produksjonen.

Ultrafiolette spektra

Figurene 3, 4 og 5 på de ledsagende tegninger illustrerer UV-spektra som er registrert i absorpsjonsområdet 200-300 nm med tre prøver av det lavmolekylære antibiotiske stoff oppnådd ved aerob dyrkning av S. epidermidis NCIB 11536. Hver av prøvene viste en absorpsjonstopp sentrert ved ca. 210 nm og en svakere absorpsjonstopp sentrert ved ca. 270-280 nm. Figurene 3 og 4 illustrerer UV-spektra for prøver av det antibiotiske stoff efter ionebytter-kromatografi ved eluering gjennom en Sephadex C-2 5 kationebytterkolonne og representerer henholdsvis titere på 256 og 512 enheter pr. ml. Figur 5 illustrerer UV-spekteret for en prøve av det antibiotiske stoff efter gelfiltreringskromatografi ved eluering gjennom en Sephadex G-25 kolonne.

Claims (3)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en antibiotisk forbindelse som har baktericid og bakteriolytisk aktivitet overfor Gram-positive bakterier og er et polypeptid (eller addisjonssalt derav) med molekylvekt ikke over 10000 og inneholder i sin molekylstruktur aminosyrederivat-enheter med formlene

betyr henholdsvis isoleucin, fenylalanin, alanin, asparaginsyre, glutaminsyre, lysin, glycin og prolin),karakterisertved at Staphylococcus epidermidis NCIB 11536 dyrkes aerobt i eller på et kulturmedium for denne, og derefter utvinnes nevnte antibiotiske forbindelse.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,karakterisert vedat nevnte kulturmedium som anvendes inneholder L-argininaL-cystein, L-glutaminsyre, glycin, L-prolin, L-tryptofan og L-histidin.

3. Fremgangsmåte som angitt i et av kravene 1 og 2,karakterisert vedat, ved utvinningen av nevnte antibiotiske forbindelse efter separering fra bakteriecelle-materialet, utfelles den antibiotiske forbindelse ved hjelp av ammoniumsulfat.