JPS61158997A - ポリペプチド抗生物質 - Google Patents
ポリペプチド抗生物質Info
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- JPS61158997A JPS61158997A JP60247876A JP24787685A JPS61158997A JP S61158997 A JPS61158997 A JP S61158997A JP 60247876 A JP60247876 A JP 60247876A JP 24787685 A JP24787685 A JP 24787685A JP S61158997 A JPS61158997 A JP S61158997A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、抗生物質活性を有するポリペプチド（以下、
二ンデルミノという）、この物質に抵抗性な示すスタフ
ィロコッカス・エビデルミゾイス（８ｔａｐｈｙｌｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）の新株を用いる
その製造方法、この新規な抵抗法、活性物質エピデルミ
ンを富有する抗生物質製剤、感染疾患の治療のためのこ
の活性物質の利用に関する。
二ンデルミノという）、この物質に抵抗性な示すスタフ
ィロコッカス・エビデルミゾイス（８ｔａｐｈｙｌｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）の新株を用いる
その製造方法、この新規な抵抗法、活性物質エピデルミ
ンを富有する抗生物質製剤、感染疾患の治療のためのこ
の活性物質の利用に関する。
／Ｃタフイロコツカス・エビデルミゾイスの特定の株、
すなわちスタフィロコッカス・エビデルミゾイスＮＣよ
り１１５３６Ｃナシヨナル・コレクション・オプ・イン
ダストリアル・バクテリア（ｎａｔｉｏｎａｌ ０ｏｌ
ｌｅｃｔ４ｏｎ ｏｆ工ｎｃｌｕｓｔｒｉａｌ Ｂａｃ
ｔｅｒｉａ）アバディーン（Ａｔ）ｅｒｄｅｅｎ）に寄
託〕がグラム陽性病原菌に対して広範な活性を有し、細
菌細胞を溶解する低分子量抗生物質ポリペプチドを産生
ずることは、 ＥＰ−Ａ−０，０２乙７１０号によって
知られている。
すなわちスタフィロコッカス・エビデルミゾイスＮＣよ
り１１５３６Ｃナシヨナル・コレクション・オプ・イン
ダストリアル・バクテリア（ｎａｔｉｏｎａｌ ０ｏｌ
ｌｅｃｔ４ｏｎ ｏｆ工ｎｃｌｕｓｔｒｉａｌ Ｂａｃ
ｔｅｒｉａ）アバディーン（Ａｔ）ｅｒｄｅｅｎ）に寄
託〕がグラム陽性病原菌に対して広範な活性を有し、細
菌細胞を溶解する低分子量抗生物質ポリペプチドを産生
ずることは、 ＥＰ−Ａ−０，０２乙７１０号によって
知られている。
筐り、スタフィロコッカス・エビデルミゾイスＭＦ ２
Ｄ ５ ［ティラー（８，Ｍ、 Ｔａｙｌｏｒ）ほか
：インターナショナル・ジャーナル・マス・スペクトロ
メトリー・アンｒ・イオン・フイジクス（工ｎｔ。
Ｄ ５ ［ティラー（８，Ｍ、 Ｔａｙｌｏｒ）ほか
：インターナショナル・ジャーナル・マス・スペクトロ
メトリー・アンｒ・イオン・フイジクス（工ｎｔ。
Ｊ、 Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ、Ｉｏｎ Ｐｈｙｓ
ｉｃｓ）、４８巻、１６１〜１６４．１９８３）がグラ
ム＠包菌に対して有効なオリイペプチドを産生ずること
も知られている。しかし、この報告からは、この菌株が
上述の株ｎａより１１５！＋６と同一かどうかについて
は明らかでな１０ 本発明は、１９８４年１０月２６日に、ジャーマン・コ
レクション着オデ・マイクロオーガニズムズ（Ｇｅｒｍ
ａｎ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇ
ａｎｉａｍｓ）にＤＢＭ ５０９５０番号で寄託され、
上述のＮＣｊより１１５３６株と類縁のスタフィロコッ
カス・エビデルミゾイスの抵抗性変異株が、改良製造方
法および後処理方法によれば、とくにグラム陽性菌に対
して抗生物質作用を有する類似のポリペプチド、エピデ
ルミンを産生ずること、またエピデルミンをスタフィロ
コッカス・エビデルミゾイスＮＯより１１５３６および
ＭＰ２０５の産生物と比較すると、とくにアミノ酸組成
においてかなりの差を示すことｆｔ発見したものである Ａｓｎ １ −
Ａｔｉｘ
２ １Ｇ４ｘ
３ １Ｐｒｏ
１ １
１ＡＩＩ！Ｌ２ ２
１工１θ ２ ２
１Ｐｈｅ ２
２ １Ｌｙｅ
２ ２ １Ｌａ
ｎ Ｑ −−
β−ＩＪｅ−Ｌａｎ １Ｄｈｔ）
ｉ −−Ｔ７ｒ
１ １８−（２
−Ａｍｉｎｏｖｉｎｙｌ）− Ｄ−０７１１ｔｅｉｎ８ ｉ
＋Ｄｈｂ ： α、β−デヒドロアミノｔ
ｌｌＩ＋！１１゜ムａｘ、ＧＪＸはそれぞれＡｓｎ／Ａ
ｓｐ、ＣｋＬｎ／ＧＡｕを示す。
ｉｃｓ）、４８巻、１６１〜１６４．１９８３）がグラ
ム＠包菌に対して有効なオリイペプチドを産生ずること
も知られている。しかし、この報告からは、この菌株が
上述の株ｎａより１１５！＋６と同一かどうかについて
は明らかでな１０ 本発明は、１９８４年１０月２６日に、ジャーマン・コ
レクション着オデ・マイクロオーガニズムズ（Ｇｅｒｍ
ａｎ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇ
ａｎｉａｍｓ）にＤＢＭ ５０９５０番号で寄託され、
上述のＮＣｊより１１５３６株と類縁のスタフィロコッ
カス・エビデルミゾイスの抵抗性変異株が、改良製造方
法および後処理方法によれば、とくにグラム陽性菌に対
して抗生物質作用を有する類似のポリペプチド、エピデ
ルミンを産生ずること、またエピデルミンをスタフィロ
コッカス・エビデルミゾイスＮＯより１１５３６および
ＭＰ２０５の産生物と比較すると、とくにアミノ酸組成
においてかなりの差を示すことｆｔ発見したものである Ａｓｎ １ −
Ａｔｉｘ
２ １Ｇ４ｘ
３ １Ｐｒｏ
１ １
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１Ｐｈｅ ２
２ １Ｌｙｅ
２ ２ １Ｌａ
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β−ＩＪｅ−Ｌａｎ １Ｄｈｔ）
ｉ −−Ｔ７ｒ
１ １８−（２
−Ａｍｉｎｏｖｉｎｙｌ）− Ｄ−０７１１ｔｅｉｎ８ ｉ
＋Ｄｈｂ ： α、β−デヒドロアミノｔ
ｌｌＩ＋！１１゜ムａｘ、ＧＪＸはそれぞれＡｓｎ／Ａ
ｓｐ、ＣｋＬｎ／ＧＡｕを示す。
６Ｎ塩酸を用ｂ（１８時間％１１０°Ｃ）、エピデルミ
ンを完全加水分解したのち、イオン交換クロマトグラフ
ィーによりアミノ酸の定量分析を行うと〔ビオトａニッ
ク（ＢｉＯｔｒＯｎｉｋ） ＬＯ６０００Ｅ型装置を用
い標準プログラムにょる〕以下のα−アｉノ酸組成が得
られた。
ンを完全加水分解したのち、イオン交換クロマトグラフ
ィーによりアミノ酸の定量分析を行うと〔ビオトａニッ
ク（ＢｉＯｔｒＯｎｉｋ） ＬＯ６０００Ｅ型装置を用
い標準プログラムにょる〕以下のα−アｉノ酸組成が得
られた。
Ａｓｐ（１，００）、 Ｐｒｏ（Ｑ、９５）、 ｅＪｙ
（２，０９）、 ｕａ（２−０３Ｌ ＩＪｅ（２，０３
）−Ｔ７ｒ（０−３０）−Ｐｈ’（２−０２）、−Ｄｙ
ｅ（２，００） （第１図参照）。チオグリコール酸の
ｆｆ＆加により、完全加水分解物中のチロシン言置は、
はぼ化学を論値の０．９６に上昇する。
（２，０９）、 ｕａ（２−０３Ｌ ＩＪｅ（２，０３
）−Ｔ７ｒ（０−３０）−Ｐｈ’（２−０２）、−Ｄｙ
ｅ（２，００） （第１図参照）。チオグリコール酸の
ｆｆ＆加により、完全加水分解物中のチロシン言置は、
はぼ化学を論値の０．９６に上昇する。
タンパク質アミノ酸のコンフィギユレーションは、完全
加水分解物からペンタフルオロプロピオニルアミノ酸の
ｎ−プロピルエステルのガスクロマトグクフイーくよっ
て決定した。分離はキテル固定相としてＬ−バリン−ｔ
ｅｒｔ −７”チルアミド−ポリシロキサン（０ｈｉｒ
ａａ １１４ａｌ ）な用いて行った。フンフイイユレ
ーション既知のアミノ酸の試験化合物と比較して、上記
構成はＬ−コンフィギユレーションな有するものとして
分類された（ＷＬ２図参照）。
加水分解物からペンタフルオロプロピオニルアミノ酸の
ｎ−プロピルエステルのガスクロマトグクフイーくよっ
て決定した。分離はキテル固定相としてＬ−バリン−ｔ
ｅｒｔ −７”チルアミド−ポリシロキサン（０ｈｉｒ
ａａ １１４ａｌ ）な用いて行った。フンフイイユレ
ーション既知のアミノ酸の試験化合物と比較して、上記
構成はＬ−コンフィギユレーションな有するものとして
分類された（ＷＬ２図参照）。
これらのタンパク質アミノ酸に加えて、以下の非タンパ
ク質アミノ駿が存在する二うンチオニン（２） 、β−
メチルランチオ二ン（１）およびα、β−デヒドロアミ
ノ酪酸（１）。ランチオ二ンはメンコンフィギユレーシ
ョンを有するカ、β瞬メチルランチオ二ンは２Ｂ、３８
．６Ｒコンフイイユレーシヨンを有する。工ｔデルミノ
はさらに、８−（２−７ミノビニル）−Ｄ−システイン
成分を含有する。
ク質アミノ駿が存在する二うンチオニン（２） 、β−
メチルランチオ二ン（１）およびα、β−デヒドロアミ
ノ酪酸（１）。ランチオ二ンはメンコンフィギユレーシ
ョンを有するカ、β瞬メチルランチオ二ンは２Ｂ、３８
．６Ｒコンフイイユレーシヨンを有する。工ｔデルミノ
はさらに、８−（２−７ミノビニル）−Ｄ−システイン
成分を含有する。
ｆ＃規化合物、エピデルミンは、以下の特徴を有する。
（ｉ） 外観；無色粉末
（１） ｆｆ１−解性；水／氷酢酸またはメタノール
／氷酢酸の混合物にきわめて易浴、低級アルコールに可
溶、クロロホルム、アセトン、ジエチルエーテル、石油
エーテルに不溶 （ｉｉｉ）シリカゾル板上の発色反応：二ンヒｙ リン
、塩素／ ＴＤＭ Ｉ：ＴＤＭ ＝ ４ 、４’−ビス
−（ジメチルアミノ）ジフェニルメタン〕、オルシン／
＠ｅ＆、アニスアルデヒｖ／＠酸。紫外光２５４ｎｍに
おける水噴霧での非分解検出 （１ｖ）薄層クロマドグ５フイー〔既製のシリカデル板
６０１Ｐ２＋５４（メルク）を使用〕、システムＡ；り
ｏｎホルム／メタノール／１７％アンモニア（２／２／
１ ）、Ｒ，＝０．７３、システムＢ；クロロホルム／
メタノール／１７％アンモニア（７０１５５／１０ ）
ＲＩＦ＝０．３０、システムｃ；ｎ−デタノール／木
酢ｉｌｌ／水（４／１／１）、Ｒ，＝ ０．０５ （ｖ） ＨＰＩＩＯ；第７図参照 ｗＤ 安定性；ｐＨ２〜７において安定。ただしそれ
以上高い−でを工活注の急激な低下が起こる（ｖｌ ）
分子量；２１６０付近（陰イオンなしで）（ｖ＋ｉＤ紫
外部吸収スペクトル；水溶液、２６７ｎｍに長波長調極
大（第６図） （ｉｘ］ 赤外部吸収スペクトル；サングルリ臭化カリ
ウム錠の工Ｒスペクトル（第４図） （Ｘ） 核ａ器共鳴スペクトル； ’Ｈ−ＮＭＲスペク
トル（ｗｃＳ図）、１３ａ−ｍＭｎｘ４：り）ル（ｇ６
ＬＩＱ ）エビデルメノの配列決定に適当なフラグメン
トはトリプシン分解（よつ℃得られた。トリプシンとの
反応により、抗生物質活性は容易に失われる。
／氷酢酸の混合物にきわめて易浴、低級アルコールに可
溶、クロロホルム、アセトン、ジエチルエーテル、石油
エーテルに不溶 （ｉｉｉ）シリカゾル板上の発色反応：二ンヒｙ リン
、塩素／ ＴＤＭ Ｉ：ＴＤＭ ＝ ４ 、４’−ビス
−（ジメチルアミノ）ジフェニルメタン〕、オルシン／
＠ｅ＆、アニスアルデヒｖ／＠酸。紫外光２５４ｎｍに
おける水噴霧での非分解検出 （１ｖ）薄層クロマドグ５フイー〔既製のシリカデル板
６０１Ｐ２＋５４（メルク）を使用〕、システムＡ；り
ｏｎホルム／メタノール／１７％アンモニア（２／２／
１ ）、Ｒ，＝０．７３、システムＢ；クロロホルム／
メタノール／１７％アンモニア（７０１５５／１０ ）
ＲＩＦ＝０．３０、システムｃ；ｎ−デタノール／木
酢ｉｌｌ／水（４／１／１）、Ｒ，＝ ０．０５ （ｖ） ＨＰＩＩＯ；第７図参照 ｗＤ 安定性；ｐＨ２〜７において安定。ただしそれ
以上高い−でを工活注の急激な低下が起こる（ｖｌ ）
分子量；２１６０付近（陰イオンなしで）（ｖ＋ｉＤ紫
外部吸収スペクトル；水溶液、２６７ｎｍに長波長調極
大（第６図） （ｉｘ］ 赤外部吸収スペクトル；サングルリ臭化カリ
ウム錠の工Ｒスペクトル（第４図） （Ｘ） 核ａ器共鳴スペクトル； ’Ｈ−ＮＭＲスペク
トル（ｗｃＳ図）、１３ａ−ｍＭｎｘ４：り）ル（ｇ６
ＬＩＱ ）エビデルメノの配列決定に適当なフラグメン
トはトリプシン分解（よつ℃得られた。トリプシンとの
反応により、抗生物質活性は容易に失われる。
肉眼的にはゼリ一様の白色沈殿がトリプシン分解により
生じ、この沈殿は遠心分離で除去できた。
生じ、この沈殿は遠心分離で除去できた。
上澄液を凍結乾燥し、１％酢酢酸上セファデックスＧ２
５７アルマシア（ｐｈａｒｍａｃｉａ）製デキストラン
ｒル〕上ｒルククマトグラフイーに付した。
５７アルマシア（ｐｈａｒｍａｃｉａ）製デキストラン
ｒル〕上ｒルククマトグラフイーに付した。
ニンヒドリン、塩素／ ＴＤＭおよび水で染色できる化
学的に均一な分画（以下Ｐ１分画と呼ぶ）は、エビデル
メノのトリプシン分解のＮ末端フラグメントであること
がわかった（下記参照）。
学的に均一な分画（以下Ｐ１分画と呼ぶ）は、エビデル
メノのトリプシン分解のＮ末端フラグメントであること
がわかった（下記参照）。
著しく疎水性のゼリ一様沈殿は数種の化学成分からなり
、全分子のＣ末端フラグメントのトリプシン分解時に生
成したものである。沈殿なりメチルホルムアミドに溶解
し、ついでジメチルホルムアミドを浴出液として用いセ
ファデックスＬＨ−２０〔セファデックスＧ−２５の３
ドロキシｆｒ：ｌぎル化によりて得られるデキストラン
ダル、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）製〕上ｒル
クＯマドグラフィーに付すと、化学的に均一な生成物（
以下Ｐ２と呼ぶ）が得られた。Ｐ２は水、塩素／ ＴＤ
Ｍおよび紫外線下に検知できた。Ｐ２はニンヒドリン反
応陰性であった。
、全分子のＣ末端フラグメントのトリプシン分解時に生
成したものである。沈殿なりメチルホルムアミドに溶解
し、ついでジメチルホルムアミドを浴出液として用いセ
ファデックスＬＨ−２０〔セファデックスＧ−２５の３
ドロキシｆｒ：ｌぎル化によりて得られるデキストラン
ダル、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）製〕上ｒル
クＯマドグラフィーに付すと、化学的に均一な生成物（
以下Ｐ２と呼ぶ）が得られた。Ｐ２は水、塩素／ ＴＤ
Ｍおよび紫外線下に検知できた。Ｐ２はニンヒドリン反
応陰性であった。
フラグメントＰ１のアミノ酸分析結果は、ｐｒ。
（１）、 Ｌａｎ（１）、β−Ｍｅ−Ｌａｎ（１）、
Ｇｊｙ（１）、 Ａｌａ（２）＊ｘＪｅ（２）、 Ｐｈ
８（１）、 Ｌｙｓ（２）であった。全分子のダンシル
化（よりＮ末端アミノ酸はインロイシンと決定され℃い
ること、フラグメント’Ｐ２）！イソロイシンを富まな
いことから、フラグメントＰ１は全分子のＮ末端分解物
と考えられる。トリプシン分解によったことから、フラ
グメントＰ１のＣ末端はリジンであると考えられる。
Ｇｊｙ（１）、 Ａｌａ（２）＊ｘＪｅ（２）、 Ｐｈ
８（１）、 Ｌｙｓ（２）であった。全分子のダンシル
化（よりＮ末端アミノ酸はインロイシンと決定され℃い
ること、フラグメント’Ｐ２）！イソロイシンを富まな
いことから、フラグメントＰ１は全分子のＮ末端分解物
と考えられる。トリプシン分解によったことから、フラ
グメントＰ１のＣ末端はリジンであると考えられる。
Ｐｌの構造をさらに明瞭にするため、カル〆キシペゾチ
ダーゼＢ（ベーりンガーマンノ１イム）を用いて、Ｏ末
端アミノ酸のリジンを＃素的に除去した。生成したフラ
グメントＰ１２ｔエセ７アデツクスＧ−２５上ｒルクロ
マトグラフイー（１チ酢酸）Ｋより純粋に単離すること
ができた。Ｐｌ２は、次のアミノ酸： Ｐｒｏ（１）、
Ｌａｎ（１）ｓβ−ｙｅ−Ｌａｎ（１） ５Ｇｊｙ（
１） 、 Ａｊ、ａ（２）、工Ｊｅ（２）、 ｐｈｅ（
１）、 Ｌｙｓ（１）カらなる。
ダーゼＢ（ベーりンガーマンノ１イム）を用いて、Ｏ末
端アミノ酸のリジンを＃素的に除去した。生成したフラ
グメントＰ１２ｔエセ７アデツクスＧ−２５上ｒルクロ
マトグラフイー（１チ酢酸）Ｋより純粋に単離すること
ができた。Ｐｌ２は、次のアミノ酸： Ｐｒｏ（１）、
Ｌａｎ（１）ｓβ−ｙｅ−Ｌａｎ（１） ５Ｇｊｙ（
１） 、 Ａｊ、ａ（２）、工Ｊｅ（２）、 ｐｈｅ（
１）、 Ｌｙｓ（１）カらなる。
千オニーチルアミノ酸、ランチオニンおよびβ−メチル
ランチオニンの硫黄橋カエトマｙ （肱ｍａｎ ）法に
よる配列解析の妨害くなる。したがって、Ｐｌ２をラネ
ーニッケルＷ２と反るさせて、硫黄を富まないドデカペ
プチドを得た。メノーＩ、ａｎはＤ−およびＬ−アラニ
ンに、β−メチルランチオ二ンはＤ−アミノ酪酸および
Ｌ−アラニンに変換された。このドデカペプチドの配列
はエドマン分解およびＦＡＢスペクトロメトリーにより
、次のように明らかにされた。
ランチオニンの硫黄橋カエトマｙ （肱ｍａｎ ）法に
よる配列解析の妨害くなる。したがって、Ｐｌ２をラネ
ーニッケルＷ２と反るさせて、硫黄を富まないドデカペ
プチドを得た。メノーＩ、ａｎはＤ−およびＬ−アラニ
ンに、β−メチルランチオ二ンはＤ−アミノ酪酸および
Ｌ−アラニンに変換された。このドデカペプチドの配列
はエドマン分解およびＦＡＢスペクトロメトリーにより
、次のように明らかにされた。
工ＩＪ”−Ａｌａ”−Ａｌ＆’−Ｌ７Ｂ’−Ｐｈｌｉｌ
’−工１６１’−Ａｌａ７− Ａｂｕ ’ −Ｐｒｏ
’ Ｇ １７１Ｏ−Ａｌａ１１＝Ａｌａ”７ラグメント
Ｐ１２内の硫黄橋の配＃ｔｌＣついては様々の検討を加
えた結果、次の構造す声明ら力１にされた。
’−工１６１’−Ａｌａ７− Ａｂｕ ’ −Ｐｒｏ
’ Ｇ １７１Ｏ−Ａｌａ１１＝Ａｌａ”７ラグメント
Ｐ１２内の硫黄橋の配＃ｔｌＣついては様々の検討を加
えた結果、次の構造す声明ら力１にされた。
トリプシン分解によって得られたＣ末端フラグメントＰ
２は次の構成からなることが明らかにされた： Ａｓｎ
（１）、 Ｌａｎ（１）、 ＧＪｙ（１）、 Ｐｈθ（
１）、 Ｔ７ｒ（１）−α−ケト酪酸および５−（２−
アミノビニル）−Ｄ−システイン。
２は次の構成からなることが明らかにされた： Ａｓｎ
（１）、 Ｌａｎ（１）、 ＧＪｙ（１）、 Ｐｈθ（
１）、 Ｔ７ｒ（１）−α−ケト酪酸および５−（２−
アミノビニル）−Ｄ−システイン。
このα−ケト酪酸は全分子配列中のりジン１３に続くデ
ヒドロアミノ酪酸に由来する。遊離のアミノ基をもつデ
ヒドロアミノ酸は不安定で、とくにα−ケト酸に変換さ
れや丁く、トリプシン分解ではデヒドロアミノ酪酸のア
ミノ基が除去される。
ヒドロアミノ酪酸に由来する。遊離のアミノ基をもつデ
ヒドロアミノ酸は不安定で、とくにα−ケト酸に変換さ
れや丁く、トリプシン分解ではデヒドロアミノ酪酸のア
ミノ基が除去される。
トリプシン分解フラグメン）Ｐ２はＮ末端がα−ケト酪
酸で遮閉されている（Ｐ２はニンヒドリン反応陰性であ
る）。完全加水分解およびアミノ酸分析で同定されたア
ミノ酸、ランチオニン、グリシン、フェニルアラニン、
チロシンおよびアスパラギン酸のほか（、Ｐ２＆Ｃは酸
完全加水分解で破壊される成分がさらに含まれている。
酸で遮閉されている（Ｐ２はニンヒドリン反応陰性であ
る）。完全加水分解およびアミノ酸分析で同定されたア
ミノ酸、ランチオニン、グリシン、フェニルアラニン、
チロシンおよびアスパラギン酸のほか（、Ｐ２＆Ｃは酸
完全加水分解で破壊される成分がさらに含まれている。
これは、工ぎデルメノ（第６図）およびフラグメントＰ
２（第８図）の１３□−核磁気共鳴スペクトルにおける
そのシグナルから明らかにされた。
２（第８図）の１３□−核磁気共鳴スペクトルにおける
そのシグナルから明らかにされた。
このアミノ酸の化学的性質についての情報はＰ２とラネ
ーニッケルＷ２との反応における２個の主生成物から得
られた。製造ＨＰＩ＋Ｏで単離された両生酸物を完全加
水分解すると、この反応によって生じたアミノ酸りロマ
トグラム中にさらＫＤ−アラニン基が示された。
ーニッケルＷ２との反応における２個の主生成物から得
られた。製造ＨＰＩ＋Ｏで単離された両生酸物を完全加
水分解すると、この反応によって生じたアミノ酸りロマ
トグラム中にさらＫＤ−アラニン基が示された。
この成分の構造は、もとの抗生物質の不拘−水素ｆｊ＆
加によって明らかにされた。４個の反応生成物）ｉｌ、
１ｆ２．Ｈ３およびＨ４を半製造）ＩＰＴ、、Ｏで精製
し、完全加水分解し、キラル固定相上ガスクロマトグラ
フィーに付した（ｌＥ１５図）。第２図のクロマトグラ
ムに比し、Ｈｌおよび）Ｈ３にはさらに１個のピークが
認められ、これはマススペクトルにより５−（２−アミ
ノエチル）−Ｄ−システインと一同定された。エピデル
ミン中では、このアミノ酸は、酸不安定成分、５−（２
−アミノビニル）−Ｄ−システインとして存在した。
加によって明らかにされた。４個の反応生成物）ｉｌ、
１ｆ２．Ｈ３およびＨ４を半製造）ＩＰＴ、、Ｏで精製
し、完全加水分解し、キラル固定相上ガスクロマトグラ
フィーに付した（ｌＥ１５図）。第２図のクロマトグラ
ムに比し、Ｈｌおよび）Ｈ３にはさらに１個のピークが
認められ、これはマススペクトルにより５−（２−アミ
ノエチル）−Ｄ−システインと一同定された。エピデル
ミン中では、このアミノ酸は、酸不安定成分、５−（２
−アミノビニル）−Ｄ−システインとして存在した。
Ｃ末端フラグメン）Ｐ２のラネーニッケルＷ２処理によ
って生じた２個のペプチドＰ２１およびＰ２２はアミノ
酸分析および０ｈｉｒａｓｉｌ−ｖａｌ上ガスクロマト
グラフィーによって次のように特徴づけることができた
。
って生じた２個のペプチドＰ２１およびＰ２２はアミノ
酸分析および０ｈｉｒａｓｉｌ−ｖａｌ上ガスクロマト
グラフィーによって次のように特徴づけることができた
。
反応生成物 Ｐ２１ Ｐ２２アミノ酸分
析 ２Ｄ−Ａｊ、ａ ＩＤ−Ａｊ、ａオヨび
０ｈｉｒａｓｉｌ−ＩＬ−ＡｊＬ メンーＬ
ａｎＶａｌ上ガスクｔｘ７１Ｌ−Ｐｈｅ １Ｌ
−Ｐｈｅトゲ２フィー ＩＬ−Ｔｙｒ
ＩＬ−ＴｙｒｌＬ−ムａｐ １Ｌ−Ａ８
ｐ ＩＧＪｙ ＩＧＪｙ さらに１両生成物ともＣ末端がエチルアミンで連閉され
ていた。脱硫と水素添加によって５−（２−アミノビニ
ル）−Ｄ−システインは分解し、Ｄ−アラニンとエチル
アミンを生成した。
析 ２Ｄ−Ａｊ、ａ ＩＤ−Ａｊ、ａオヨび
０ｈｉｒａｓｉｌ−ＩＬ−ＡｊＬ メンーＬ
ａｎＶａｌ上ガスクｔｘ７１Ｌ−Ｐｈｅ １Ｌ
−Ｐｈｅトゲ２フィー ＩＬ−Ｔｙｒ
ＩＬ−ＴｙｒｌＬ−ムａｐ １Ｌ−Ａ８
ｐ ＩＧＪｙ ＩＧＪｙ さらに１両生成物ともＣ末端がエチルアミンで連閉され
ていた。脱硫と水素添加によって５−（２−アミノビニ
ル）−Ｄ−システインは分解し、Ｄ−アラニンとエチル
アミンを生成した。
架橋のないヘゾタペプチドＰ２１の配列決定（部分加水
分解； ０．Ｉ Ｎ塩酸、９３℃、１６時間）により、
次の構造が明らかにされた。
分解； ０．Ｉ Ｎ塩酸、９３℃、１６時間）により、
次の構造が明らかにされた。
Ｈ３Ｏ−０Ｈ２−Ｏｏ−ｃｏ−Ｇ１７−１１）Ａｌａ−
Ｌ−Ｐｈａ−Ｌ −ＡＩｉｎ−〉んａ−１−Ｔｙｒ−Ｌ
−Ａｌａ−ＮＨ罰Ｐ２２中に存在するメンランチオニン
の架橋の配置は、部分加水分解およびＰ２１とＰ２２の
酵素７ラグメントについての各種化学的検討によって解
明され、トリプシン分解に由来するフラグメン）Ｐ２の
構造は次のように決定された。
Ｌ−Ｐｈａ−Ｌ −ＡＩｉｎ−〉んａ−１−Ｔｙｒ−Ｌ
−Ａｌａ−ＮＨ罰Ｐ２２中に存在するメンランチオニン
の架橋の配置は、部分加水分解およびＰ２１とＰ２２の
酵素７ラグメントについての各種化学的検討によって解
明され、トリプシン分解に由来するフラグメン）Ｐ２の
構造は次のように決定された。
５−Ｌ
Ｐ２フラグメントをＮ末端で連間して＾る２−ケト酪酸
な、もとの抗生物質に存在するアミノ酸デヒドロブチリ
ンによって当モル置換し、トリプシン分解ペプチドＰ１
とＰ２を縮合させると、次式で示されるヘテロブチツク
四環ペプチド、抗生物質エピデルミンが生成した。
な、もとの抗生物質に存在するアミノ酸デヒドロブチリ
ンによって当モル置換し、トリプシン分解ペプチドＰ１
とＰ２を縮合させると、次式で示されるヘテロブチツク
四環ペプチド、抗生物質エピデルミンが生成した。
リポソームで合成されたヘテロブチツク環状ｒコサペゾ
チド、抗生物質工ぎデルミノの構造：各チオエーテルア
ミノ酸のＮ末端に近い方の半分はＤコンフィギユレーシ
ョン（Ｒ、Ｓ ａ示法テは８コンフイギユレーシヨンに
相当）でアル。
チド、抗生物質工ぎデルミノの構造：各チオエーテルア
ミノ酸のＮ末端に近い方の半分はＤコンフィギユレーシ
ョン（Ｒ、Ｓ ａ示法テは８コンフイギユレーシヨンに
相当）でアル。
木兄ｔｑ ｔ’ｚ、エピデルミンとして知られた均な、
したがって純粋な生成物、その製造、単離および精製方
法に関する。
したがって純粋な生成物、その製造、単離および精製方
法に関する。
その産生菌、スタフィロコッカス・エビデルミディｘ
（ｓｔａｐｈｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄ
ｉａ） ＤＡＭ ３０９５は、組成：肉汁２〜４９６．
麦芽エキス１〜３９６および０ａＯ０３０，２５〜１％
もしくは０ａ（ＯＨ）２０．２５〜０．５％（％はとく
に指示のない限り重量ｓである）の複合メジウム中３７
℃で有気的に培養される。最大抗生物質活性は１８〜２
３時間後に達成される。
（ｓｔａｐｈｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄ
ｉａ） ＤＡＭ ３０９５は、組成：肉汁２〜４９６．
麦芽エキス１〜３９６および０ａＯ０３０，２５〜１％
もしくは０ａ（ＯＨ）２０．２５〜０．５％（％はとく
に指示のない限り重量ｓである）の複合メジウム中３７
℃で有気的に培養される。最大抗生物質活性は１８〜２
３時間後に達成される。
抗生物質を濃縮する試みは、たとえば、１０／の発酵槽
からの培養ろ液に対して行われ、各工程の効率はプレー
ト拡散試験によってチェックした０活性成分は培養ろ液
についてｎ−ブタノール抽出を行い、細胞および石灰を
除去することにより濃縮できた。しかしながら、ｎ−ブ
タノールによる抽出は、培養ろ液の自然の終ｐｉ−１８
，０においてのみ可能であった。エーテル沈殿で脂質の
夾雑物を分離することでさらに精製できた。このために
は、ブタノール抽出液を蒸発させ、残留物をメタノール
に溶解し、５倍址の冷ジエチルエーテル中に攪拌下に注
いだ。活性は完全に沈殿中に残留した（第９図）。
からの培養ろ液に対して行われ、各工程の効率はプレー
ト拡散試験によってチェックした０活性成分は培養ろ液
についてｎ−ブタノール抽出を行い、細胞および石灰を
除去することにより濃縮できた。しかしながら、ｎ−ブ
タノールによる抽出は、培養ろ液の自然の終ｐｉ−１８
，０においてのみ可能であった。エーテル沈殿で脂質の
夾雑物を分離することでさらに精製できた。このために
は、ブタノール抽出液を蒸発させ、残留物をメタノール
に溶解し、５倍址の冷ジエチルエーテル中に攪拌下に注
いだ。活性は完全に沈殿中に残留した（第９図）。
他のとくに適当な濃縮方法は、遠心分離培養ろ液の、ア
ンバーライト（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ） ＸＡＤ −８ま
たはアクリル酸エステルペースの類似ポリマー（８ｅｒ
ｖａ）への吸着である。エピデルミンは、単純な吸着の
みでなく、樹脂中の遊離アクリル散基の陽イオン交換活
性によっても付着する。これは、活性成分が樹脂から、
メタノール／濃塩酸（９９：１）での溶出によってはじ
めて放出できる事実から確認される。強酸性の溶出液は
アンモニアで中和してから、真空中で濃縮する。アンバ
ーライ） ＸＡＤ −８への吸着によって処理したのち
は、次にメタノール／エーテルからの再沈殿は不必要で
ある。
ンバーライト（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ） ＸＡＤ −８ま
たはアクリル酸エステルペースの類似ポリマー（８ｅｒ
ｖａ）への吸着である。エピデルミンは、単純な吸着の
みでなく、樹脂中の遊離アクリル散基の陽イオン交換活
性によっても付着する。これは、活性成分が樹脂から、
メタノール／濃塩酸（９９：１）での溶出によってはじ
めて放出できる事実から確認される。強酸性の溶出液は
アンモニアで中和してから、真空中で濃縮する。アンバ
ーライ） ＸＡＤ −８への吸着によって処理したのち
は、次にメタノール／エーテルからの再沈殿は不必要で
ある。
二ぎデルミノの吸着くよる単離は、微生物の培養中に培
養培地から直接実施することもできる。
養培地から直接実施することもできる。
安定性試験とクロマトグラフィーによる検討は、凍結乾
燥したブタノール抽出物について行った。
燥したブタノール抽出物について行った。
この抽出物を種々の−の水溶液とインキエベートしたと
ころ、活性はＰＩ−１１０以上では急速に低下したが、
この抗生物質は−２〜７の範囲で安定である。
ころ、活性はＰＩ−１１０以上では急速に低下したが、
この抗生物質は−２〜７の範囲で安定である。
ブタノール抽出液を蒸発させた残留物の薄層クロマトグ
ラフィーでは、各種のスプレー試薬で染色される複数個
の化合物が認められた。平行して行ったバイオオートグ
ラムにより、新規活性物質の性質について重要な情報が
得られた。酸性および全中性システムで、この抗生物質
は、シリカダル６０の薄層クロマトグラフィにおいてベ
ースラインに止まったが、アルカリ性溶出液でのクロマ
トグラフィーでは０．６〜０．７５のＲｆ値を与えた。
ラフィーでは、各種のスプレー試薬で染色される複数個
の化合物が認められた。平行して行ったバイオオートグ
ラムにより、新規活性物質の性質について重要な情報が
得られた。酸性および全中性システムで、この抗生物質
は、シリカダル６０の薄層クロマトグラフィにおいてベ
ースラインに止まったが、アルカリ性溶出液でのクロマ
トグラフィーでは０．６〜０．７５のＲｆ値を与えた。
アルカリ注システムでバイオオートグラフィーと薄層ク
ロマトグラフィーな組み合わせると、ニンヒドリンで染
色できる化合物との相関を示した。
ロマトグラフィーな組み合わせると、ニンヒドリンで染
色できる化合物との相関を示した。
これらの予備試験の結果、この抗生物質は強塩基性ペプ
チドであり、カラムから酸性または中性システムでハ溶
出できないので、シリカビル６０上でのカラムクロマト
グラフィーではさらに精製することはできないことがわ
かった。
チドであり、カラムから酸性または中性システムでハ溶
出できないので、シリカビル６０上でのカラムクロマト
グラフィーではさらに精製することはできないことがわ
かった。
脂質を言まないアンバーライトｘＡＤ洛出液またはブタ
ノール抽出物をセファデックスＬＨ−２０上クロマトグ
ラフイーに付し、メタノール／酢酸（９５：５）で溶出
すると、多数の小ペプチド、アミノ酸および塩が抗生物
質のメジウムから分離された（第９図）。
ノール抽出物をセファデックスＬＨ−２０上クロマトグ
ラフイーに付し、メタノール／酢酸（９５：５）で溶出
すると、多数の小ペプチド、アミノ酸および塩が抗生物
質のメジウムから分離された（第９図）。
クレーブ（Ｏｒａｉｇ）によって開発された操作に従っ
た以後の多段向流分配には、培養ろ液からの抗生物質の
抽出時に得られた経験を役立てることがテキた。鍛初の
、ｎ−ブタノール／酢酸エチル１０、ＩＮ酢酸（６：に
＋）システムによる液−液分配でを工、抗生物質はベ
ースライン上に残った。
た以後の多段向流分配には、培養ろ液からの抗生物質の
抽出時に得られた経験を役立てることがテキた。鍛初の
、ｎ−ブタノール／酢酸エチル１０、ＩＮ酢酸（６：に
＋）システムによる液−液分配でを工、抗生物質はベ
ースライン上に残った。
２−ブタノール１０．０５Ｎ酢酸アンモニア（１：１）
の中性システムでの第２のクレーブ分配で、抗生 、物
質は装置の中点にあった。酢酸アンモニウムは高真空下
の凍結乾燥により再び除去できた。
の中性システムでの第２のクレーブ分配で、抗生 、物
質は装置の中点にあった。酢酸アンモニウムは高真空下
の凍結乾燥により再び除去できた。
凍結乾燥後、エピデルミンは粉末として得られ、これは
使用したてべての薄層システムにおいて均一であった。
使用したてべての薄層システムにおいて均一であった。
ヨーロッパ特許出願第０．０２７．７１０号の操作では
、精製を工、凍結／融解抽出、抽出剤の蒸発、限外ろ過
、＠酸アンモニウムによる沈殿、セファデックスＧ−５
０，Ｇ−２５もしくはＧ−１５上また１エバイオｒル（
Ｂｉｇｇｅｒ） Ｐ ２上イオン交換クロマトグラフイ
ーおよびデルろ過によって行われるの九対し、本発明の
精製法では、アンバーライ） ｘＡＤ −８への遠心分
離培養ろ液の牧着、ついでセファデックスＬＨ−２０上
ｒルクロマトクラフイー、ついでクレーブ（よる２重向
流分配に工って均一、純粋な生成物が得られる。すなわ
ち、上記ヨークツバ特許出願と本発明の単離、精製方法
は、全く異なっている。
、精製を工、凍結／融解抽出、抽出剤の蒸発、限外ろ過
、＠酸アンモニウムによる沈殿、セファデックスＧ−５
０，Ｇ−２５もしくはＧ−１５上また１エバイオｒル（
Ｂｉｇｇｅｒ） Ｐ ２上イオン交換クロマトグラフイ
ーおよびデルろ過によって行われるの九対し、本発明の
精製法では、アンバーライ） ｘＡＤ −８への遠心分
離培養ろ液の牧着、ついでセファデックスＬＨ−２０上
ｒルクロマトクラフイー、ついでクレーブ（よる２重向
流分配に工って均一、純粋な生成物が得られる。すなわ
ち、上記ヨークツバ特許出願と本発明の単離、精製方法
は、全く異なっている。
上記ＩＣＰ−Ａ−０，０２７，７１０号に従って既知方
法との他の相違は、複合栄養液の選択にある。公知の栄
養溶液、編心臓潅流液（３７、＠ ＢＨ工／ｌ）では抗
生物質の収ｔはきわめて低いが、２〜４％肉汁、１〜３
％糖もしくは糖アルコール、たとえば麦芽エキス、マル
トース、ガラクトース、ラクトース、マニトール、グル
コースもしくはグリセロール、および０．２５〜１％炭
酸カルシウムもしくは０．２５〜０．５％水酸化カルシ
ウムからなる本発明の栄養浴液ではきわめて良好な結果
が得られた。最良の生産は以下の組成の栄養液によって
達成された。
法との他の相違は、複合栄養液の選択にある。公知の栄
養溶液、編心臓潅流液（３７、＠ ＢＨ工／ｌ）では抗
生物質の収ｔはきわめて低いが、２〜４％肉汁、１〜３
％糖もしくは糖アルコール、たとえば麦芽エキス、マル
トース、ガラクトース、ラクトース、マニトール、グル
コースもしくはグリセロール、および０．２５〜１％炭
酸カルシウムもしくは０．２５〜０．５％水酸化カルシ
ウムからなる本発明の栄養浴液ではきわめて良好な結果
が得られた。最良の生産は以下の組成の栄養液によって
達成された。
すなわち６％肉汁、２％麦芽エキスおよび０．３７僑水
酸化カルシウムである。すべての炭素源のうち、麦芽エ
キスについでマルトースがもつともよい産生な示した。
酸化カルシウムである。すべての炭素源のうち、麦芽エ
キスについでマルトースがもつともよい産生な示した。
グルコースは他り炭素源との組合せとしてのみ使用すべ
きである。ラクトースとマルトースまたはガラクトース
とマルトースの組合せも良好な結果を与えた。他の慣用
の炭素源はすべて全く産生なみないか、収率はきわめて
低かった。全２０種σ）アミノ＃ｔを各２１／ｌの濃度
とした窒素源も肉エキスと同じ結果を与えた。カサｉ
／ ＦＩＬ （Ｄｉｒｃｏ） ％１、トリプトファンｔ
ｉ 〜２Ｕｌ）とビタミンを′Ｍ＆加した場合には窒素
源として適して込る。適当なげタミノとしては（カッコ
内は好ましい濃度）、ビオチン（０，００６■／ｌ）、
ニコチｙｌＩ！（２，３１１１１／ ／ ） 、チアミ
ン（１，ＯＭｌ／ｌ）、ピリドキシン塩酸塩（１２，Ｏ
ＷＩｇ／／ ）、パントテン酸カルシウム（１，２ａｖ
／／）がある。
きである。ラクトースとマルトースまたはガラクトース
とマルトースの組合せも良好な結果を与えた。他の慣用
の炭素源はすべて全く産生なみないか、収率はきわめて
低かった。全２０種σ）アミノ＃ｔを各２１／ｌの濃度
とした窒素源も肉エキスと同じ結果を与えた。カサｉ
／ ＦＩＬ （Ｄｉｒｃｏ） ％１、トリプトファンｔ
ｉ 〜２Ｕｌ）とビタミンを′Ｍ＆加した場合には窒素
源として適して込る。適当なげタミノとしては（カッコ
内は好ましい濃度）、ビオチン（０，００６■／ｌ）、
ニコチｙｌＩ！（２，３１１１１／ ／ ） 、チアミ
ン（１，ＯＭｌ／ｌ）、ピリドキシン塩酸塩（１２，Ｏ
ＷＩｇ／／ ）、パントテン酸カルシウム（１，２ａｖ
／／）がある。
発酵は５４〜３７ ’Ｃの温度で、良好な通気下に実施
する。最良の産生パターンは発酵前の−が６．０〜７．
０のときに得られる。２価の陽イオンの炭酸塩または水
酸化物、たとえば炭酸カルシウムまたは水酸化カルシウ
ムの非存在下には産生は起Ｃラｒｔい。炭酸カルシウム
の添加後、たとえば−厘は特徴的なパターンを示し、酸
性域に低下し、この場合、産生は起こらない。ついで−
値をわずかにアルカリの範囲まで上昇させてやると、産
生が始まる。炭酸カルシウムの代わりに炭酸マグネシウ
ムを使用することもできるが、炭酸カルシウムよりも水
酸化カルシウムの方が好結果を与える。
する。最良の産生パターンは発酵前の−が６．０〜７．
０のときに得られる。２価の陽イオンの炭酸塩または水
酸化物、たとえば炭酸カルシウムまたは水酸化カルシウ
ムの非存在下には産生は起Ｃラｒｔい。炭酸カルシウム
の添加後、たとえば−厘は特徴的なパターンを示し、酸
性域に低下し、この場合、産生は起こらない。ついで−
値をわずかにアルカリの範囲まで上昇させてやると、産
生が始まる。炭酸カルシウムの代わりに炭酸マグネシウ
ムを使用することもできるが、炭酸カルシウムよりも水
酸化カルシウムの方が好結果を与える。
５ Ｑ ｍＭの水酸化カルシウムで、２５ｍＭの炭酸カ
ルシウムの場合に比べて、産生は増加する。炭素源（楯
）が醒株によって利用されると、生成した有機酸は２価
の陽イオンとコンプレツクを形成し、同時にメジウムを
緩衝化する。
ルシウムの場合に比べて、産生は増加する。炭素源（楯
）が醒株によって利用されると、生成した有機酸は２価
の陽イオンとコンプレツクを形成し、同時にメジウムを
緩衝化する。
ＩＥ１０図は、結果な生菌数と、ミクロカッカス・ルテ
ウ／Ｃ（Ｍｉｃｒｏｃｏａａｕｓ １ｕｔｅｕａ） Ａ
’ｌ”ａＣ９３４１に対する阻止面積な關で表示した抗
生物質の産生について示した曲線で、本発明のメジウム
と前記ヨーロッパ特許Ｉ／ｃおける編心臓潅流メジウム
（Ｄｉｒｃｏ）とを比較したものである。
ウ／Ｃ（Ｍｉｃｒｏｃｏａａｕｓ １ｕｔｅｕａ） Ａ
’ｌ”ａＣ９３４１に対する阻止面積な關で表示した抗
生物質の産生について示した曲線で、本発明のメジウム
と前記ヨーロッパ特許Ｉ／ｃおける編心臓潅流メジウム
（Ｄｉｒｃｏ）とを比較したものである。
最大生産の瞬間における活性の増大を検量線を用いたプ
レート拡散試験で測定した結果は欠のとおりであった。
レート拡散試験で測定した結果は欠のとおりであった。
編心ｌｌ１ｉｆ＃Ａ流栄養液における活性を１００％と
した。
した。
ａ）編心臓Ｓ流アガール １００％ｔ））３
９６肉エキス、２％麦芽エキス、２５ ｍＭ炭酸カルシ
ウム ２００％ａ＞ ３％肉エキス、２％麦
芽エキス、５ Ｑ ｍＭ水酸化カルシウム ３２
０％これらのデータは絶対産生量とは一致しない。
９６肉エキス、２％麦芽エキス、２５ ｍＭ炭酸カルシ
ウム ２００％ａ＞ ３％肉エキス、２％麦
芽エキス、５ Ｑ ｍＭ水酸化カルシウム ３２
０％これらのデータは絶対産生量とは一致しない。
しかしながら、プレート拡散試験で得られた値の比較で
は、既知の操作と比較し、本発明の操作な用いた場会、
存意な収率の増加が明らかに示されている。
は、既知の操作と比較し、本発明の操作な用いた場会、
存意な収率の増加が明らかに示されている。
エピデルミンの産生に用いられる菌株は、シュライファ
ーほか（８ｃｈ’１ｅｉｆｅｒ ＆ Ｋｌｏｏｓ）によ
り、次のように特徴づけされている〔インターナショナ
ル・ジャーナル・フォア・システマトｃｘｙ−・オシ・
バクテリア（工ｎｔ、 Ｊ、 ５ｙｓｔ、 ｎａｃｔ、
） ２５巻、５０〜６１．１９７５）。
ーほか（８ｃｈ’１ｅｉｆｅｒ ＆ Ｋｌｏｏｓ）によ
り、次のように特徴づけされている〔インターナショナ
ル・ジャーナル・フォア・システマトｃｘｙ−・オシ・
バクテリア（工ｎｔ、 Ｊ、 ５ｙｓｔ、 ｎａｃｔ、
） ２５巻、５０〜６１．１９７５）。
（ｉ） グラム染色：陽性
（ｉｉ） 細胞サイズ：直径０−５〜０．８ ｔｓｍ
ｔ＋ｉｉ ）コロニーのサイズ：直径約１１ＩＪＩＩＧ
Ｖ） コロニーの外観：平坦、光沢あり、中央がわず
かに盛り上がる （ｖ） コロニーの色：灰色がかった白色（ｖｌ）培
養液中の細胞：通常、単独または２個の群をなす。大き
なクランプをなすことは稀（ｖｉ＋） 浴血：血液スラ
イド上に゛培養液を広げると強い浴血を示す （ｖ＋＊＋）無気的生育：無気的条件下にもこの株は生
育する （ｉｘ） ライン１戸−ム感受注：２Ｗｑ／ｍｌまで
はライン・戸−ムに対し細胞は抵抗す る（ｘ） ライソスタフイン感受注：２０μｇ／ｍｌ
でもライソスタフインに対し細胞は感受性を示す（ｘｉ
）二−デルミノ抵抗注＝１ｑ／ｍｌまで認められる （ｘｉ）その他の抵抗性：液体培養においてこの株はス
トレプトマイシン（１ｑ／ｍｌまで）、スペクチノマイ
シン（０，５１Ｈｉ／ｆｌｔまで）に対し著しい抵抗性
を示す （ｘｔｉｉ ＞食塩含量の増大：食塩含量１５重量％ま
ではなお良好な生育を示す。
ｔ＋ｉｉ ）コロニーのサイズ：直径約１１ＩＪＩＩＧ
Ｖ） コロニーの外観：平坦、光沢あり、中央がわず
かに盛り上がる （ｖ） コロニーの色：灰色がかった白色（ｖｌ）培
養液中の細胞：通常、単独または２個の群をなす。大き
なクランプをなすことは稀（ｖｉ＋） 浴血：血液スラ
イド上に゛培養液を広げると強い浴血を示す （ｖ＋＊＋）無気的生育：無気的条件下にもこの株は生
育する （ｉｘ） ライン１戸−ム感受注：２Ｗｑ／ｍｌまで
はライン・戸−ムに対し細胞は抵抗す る（ｘ） ライソスタフイン感受注：２０μｇ／ｍｌ
でもライソスタフインに対し細胞は感受性を示す（ｘｉ
）二−デルミノ抵抗注＝１ｑ／ｍｌまで認められる （ｘｉ）その他の抵抗性：液体培養においてこの株はス
トレプトマイシン（１ｑ／ｍｌまで）、スペクチノマイ
シン（０，５１Ｈｉ／ｆｌｔまで）に対し著しい抵抗性
を示す （ｘｔｉｉ ＞食塩含量の増大：食塩含量１５重量％ま
ではなお良好な生育を示す。
コロニーまたは塗布した培養液は著しい粘着性を示す。
各種炭素源の利用性と酸の形成および他の酵素反応はア
ビ−スタフ・システム（Ａｐｌ−ｓｔａｐｈ９ｙｓｔｅ
ｍ、バイオメリュ−（Ｂｉｏｍｓｒｉｅｕｚ） 、 ニ
ュルテインｒン（Ｎｕｒｔｉｎｇｅｎ）を用いて決定し
た。このシステムは、クルースはか（Ｋｌｏｏｓ ＆
８ｃｈｌｅｉｆｅｒ）の分類にあてはめることが可能な
２０種の生化学反６の組合せく基づくものである〔ジャ
ーナル・オシ・クリニカル・マイクロバイオロジー（Ｊ
。
ビ−スタフ・システム（Ａｐｌ−ｓｔａｐｈ９ｙｓｔｅ
ｍ、バイオメリュ−（Ｂｉｏｍｓｒｉｅｕｚ） 、 ニ
ュルテインｒン（Ｎｕｒｔｉｎｇｅｎ）を用いて決定し
た。このシステムは、クルースはか（Ｋｌｏｏｓ ＆
８ｃｈｌｅｉｆｅｒ）の分類にあてはめることが可能な
２０種の生化学反６の組合せく基づくものである〔ジャ
ーナル・オシ・クリニカル・マイクロバイオロジー（Ｊ
。
０１１ｎ０Ｍｉｃｒｏｔ）ｉｏｌ、）第１巻、８２〜８
Ｂ、１９７５］。
Ｂ、１９７５］。
Ｄ−グルコース ＋ ｎ、ｄ、
＋Ｄ−フラクトース ＋ 十
十り−マンノース （＋）
（＋） ＋マルトース
＋ 十 十ラクトース
（＋）（→ 十Ｄ−）レバロース
−−− Ｄ−マエトール −−− キシリトール −−− Ｄ−メチぎオース − ｎ、ｄ、−ラ
フィノース − ｎ、ｄ、
−Ｄ−キシロース −−− シェフロース ＋ 十
十α−メチルグリコシド ｎ
、ｄ、 −Ｎ−アセチルグｌサミン −
ｎ、ｄ、 士硝酸塩還元
＋ 十 ±ホスファターゼ
＋ 千 十アセチルメチルカル
ビノール ＋ ｎ−ｄ、 −１−
の生成 （ボーＣスープｂスコイアー 反応） アル岬５号、ｇｓヒドロラーゼ − ｎ
、ｄ、 ±ウレアーゼ ＋
ｎ、ｄ、十十陽注反応 一隘注反応 （→明らかな陽性反応は遅れる ±結果が一定しない ｎ、（１，データなし スタフィロコッカス・エビデルミゾイスＤＳＭ３０９５
の菌株を、斜面チューブ上、以下の組成のメジウムに接
種した。
＋Ｄ−フラクトース ＋ 十
十り−マンノース （＋）
（＋） ＋マルトース
＋ 十 十ラクトース
（＋）（→ 十Ｄ−）レバロース
−−− Ｄ−マエトール −−− キシリトール −−− Ｄ−メチぎオース − ｎ、ｄ、−ラ
フィノース − ｎ、ｄ、
−Ｄ−キシロース −−− シェフロース ＋ 十
十α−メチルグリコシド ｎ
、ｄ、 −Ｎ−アセチルグｌサミン −
ｎ、ｄ、 士硝酸塩還元
＋ 十 ±ホスファターゼ
＋ 千 十アセチルメチルカル
ビノール ＋ ｎ−ｄ、 −１−
の生成 （ボーＣスープｂスコイアー 反応） アル岬５号、ｇｓヒドロラーゼ − ｎ
、ｄ、 ±ウレアーゼ ＋
ｎ、ｄ、十十陽注反応 一隘注反応 （→明らかな陽性反応は遅れる ±結果が一定しない ｎ、（１，データなし スタフィロコッカス・エビデルミゾイスＤＳＭ３０９５
の菌株を、斜面チューブ上、以下の組成のメジウムに接
種した。
ペグトン １０ｇ
リン酸−水素ナトリウム ２ｙ
肉エキス ８．９
グルコース １０ｙ（別個にオートクレーブ
処理）食塩 ６Ｉ −７，２ ついで−夜６７°Ｃでインキュベートｔ、、−２０’Ｇ
Ｋ凍結した。長期に保存すると活性の消失をみるので各
試験混合物用に新鮮なチューブを解凍した。
処理）食塩 ６Ｉ −７，２ ついで−夜６７°Ｃでインキュベートｔ、、−２０’Ｇ
Ｋ凍結した。長期に保存すると活性の消失をみるので各
試験混合物用に新鮮なチューブを解凍した。
以下に抗生物質のさらに詳細な製造方法を述べる。
発酵は適当な振盪フラスコ中で行い、大鎗の物質を製造
するには容ｔ２００ｊ以上の７アーメンターを使用する
。
するには容ｔ２００ｊ以上の７アーメンターを使用する
。
フラスコ試験には、糊口のある５００−のエルレンマイ
ヤーフラスコを用いた。フラスコに栄養液１００−を９
口え、１２１℃で２０分間、オートクレーブ処理した。
ヤーフラスコを用いた。フラスコに栄養液１００−を９
口え、１２１℃で２０分間、オートクレーブ処理した。
接ａｌＫは４時間目の１％予備培養液を使用した。接種
は３７℃で、１４０ ｒｌ）ｍで回転させた振盪嚢中で
行った。
は３７℃で、１４０ ｒｌ）ｍで回転させた振盪嚢中で
行った。
１０／のスケールでの発酵には、有効容量１０１のファ
ーメンタ−〔二ニー・デルンスクイック・サイエンティ
フィック（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｌｃｋ ５ｃｉｅｎ−
ｔｉｆｉｃ ）社（米国）製のＭＦ −１４型〕に９．
９１！の栄養溶液を加え、１３４℃で３０分間、オート
クレーブ処理した。冷却後、４時間目の予備培養液１０
０−で栄養浴液を接種し、６７℃、Ｑ、６ｖｖｍ。
ーメンタ−〔二ニー・デルンスクイック・サイエンティ
フィック（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｌｃｋ ５ｃｉｅｎ−
ｔｉｆｉｃ ）社（米国）製のＭＦ −１４型〕に９．
９１！の栄養溶液を加え、１３４℃で３０分間、オート
クレーブ処理した。冷却後、４時間目の予備培養液１０
０−で栄養浴液を接種し、６７℃、Ｑ、６ｖｖｍ。
２４０ ｒ胃の速度のブレード攪拌器を用いて発酵を行
った。滅菌ポリオールなくり返し添加して比較的強い発
泡をおさえる。
った。滅菌ポリオールなくり返し添加して比較的強い発
泡をおさえる。
２５／スケールの発酵には、２５１の７アーメンター〔
再循環システム付きブラウン／メルスンｒ）（Ｂｒａｕ
ｎ ／ Ｍｅｌｇｕｎｇｅｎ ）製ｂ２５型〕に栄養浴
液２５７を満たし、ポリオール６−を卯えて、そのまま
１２１℃で５０分間滅菌した。接種に督４時間目の予備
培養液３００−を用いた。発酵は！１７℃、０．６ ｖ
ｖｍ、 １０００ ｒｐｍで実施した。
再循環システム付きブラウン／メルスンｒ）（Ｂｒａｕ
ｎ ／ Ｍｅｌｇｕｎｇｅｎ ）製ｂ２５型〕に栄養浴
液２５７を満たし、ポリオール６−を卯えて、そのまま
１２１℃で５０分間滅菌した。接種に督４時間目の予備
培養液３００−を用いた。発酵は！１７℃、０．６ ｖ
ｖｍ、 １０００ ｒｐｍで実施した。
陶工、キス３０Ｉ、麦芽エキス２０．９および炭酸カル
シウム５．ｌｃ’Ｉ ｊ中に含む栄養溶液中、１０１の
スケールで実施した発酵過程を第１１図に示す。供給炭
素源の利用と酸の形成を伴う強力な生育が、−値の低下
として検知できる。アルカリ化の開始とともに、抗生物
質が培養ろ液中に検出できる。産生は１２〜１８時間後
にビーク（達する。
シウム５．ｌｃ’Ｉ ｊ中に含む栄養溶液中、１０１の
スケールで実施した発酵過程を第１１図に示す。供給炭
素源の利用と酸の形成を伴う強力な生育が、−値の低下
として検知できる。アルカリ化の開始とともに、抗生物
質が培養ろ液中に検出できる。産生は１２〜１８時間後
にビーク（達する。
発酵過程のモニターには、発酵開始後の種々の時間に滅
菌条件下にサンプルを採取し、次の各項目について評価
した。
菌条件下にサンプルを採取し、次の各項目について評価
した。
ａ） ｐ）１値：実験室用−メーター〔ニック（Ｋｎｉ
Ｏｋ）ｐＨｍＶメーター〕で測定 ｂ）生育過程：生存ａｍ数の増加を観察して生育をモニ
ターできる。この目的には、培養液０．５−を滅菌条件
下に採収し、食塩水で希釈し、この希釈液０．１−をス
ライド上に塗布した（メジウム：１１あたり、ペグトン
１０．？、肉エキス８．？１食塩３．１ リン酸−水素
ナトリウム２ｇ、グルコース１０ｙ）。６７℃で１８時
間インキュベートしたのちには各コロニーを数えること
ができた。
Ｏｋ）ｐＨｍＶメーター〕で測定 ｂ）生育過程：生存ａｍ数の増加を観察して生育をモニ
ターできる。この目的には、培養液０．５−を滅菌条件
下に採収し、食塩水で希釈し、この希釈液０．１−をス
ライド上に塗布した（メジウム：１１あたり、ペグトン
１０．？、肉エキス８．？１食塩３．１ リン酸−水素
ナトリウム２ｇ、グルコース１０ｙ）。６７℃で１８時
間インキュベートしたのちには各コロニーを数えること
ができた。
Ｃ）抗生物質濃度：サンプルをエペンドルフ遠心分離機
６２００で２分間遠心分離し、その上澄液２０μｍにつ
いてプレート拡散試験を実施した。
６２００で２分間遠心分離し、その上澄液２０μｍにつ
いてプレート拡散試験を実施した。
同時に、既知濃度で検緻曲線をプロットした。
最大産生（到達したのち、培養液を連続遠心分離〔ロー
エル・ラント・ゼエーネ、ルーシュトル −７／ロツ
ト（ＬＯｈｅｒ ＆ ５ｏｈｎｅ、 Ｒｕｈｓｔｏｒｆ
／ ＲＯｔｔ）、ＬＡ７１ｂ−４型〕によって１５８０
ｒｐｍで分離した。細胞の至適分離のためには、流速
をきわめて低く保つ必要があった。活性成分の最初の濃
縮は、以下の例１に記載するように、前述のアンバーラ
イトＸＡＤ −８への吸着によって行った。
エル・ラント・ゼエーネ、ルーシュトル −７／ロツ
ト（ＬＯｈｅｒ ＆ ５ｏｈｎｅ、 Ｒｕｈｓｔｏｒｆ
／ ＲＯｔｔ）、ＬＡ７１ｂ−４型〕によって１５８０
ｒｐｍで分離した。細胞の至適分離のためには、流速
をきわめて低く保つ必要があった。活性成分の最初の濃
縮は、以下の例１に記載するように、前述のアンバーラ
イトＸＡＤ −８への吸着によって行った。
例１
培養ろ液８０／を約８１のアンバーライトＸＡＤ−８上
に注いだ。通過液には活性は全く検出されなかった。つ
いで水で洗浄したが、この場合も活性は浴出しなかった
。続いてメタノール１３／で洗浄した。洗浄液には活性
は検出されなかった。
に注いだ。通過液には活性は全く検出されなかった。つ
いで水で洗浄したが、この場合も活性は浴出しなかった
。続いてメタノール１３／で洗浄した。洗浄液には活性
は検出されなかった。
溶出はメタノール／塩酸９９：１を用いて行す。
以下の分画な得た。
分画ｉ：ｏ、ｓｌ 活性
分画２：４．５／ 主な活性分画
分画３： ２１ 活性
分画４： ２１ 活性なし
分画５： １１ 活性なし
各分画について薄層クロマトグラフィーを行い、エピデ
ルミン装置を調べ、ついで活性分画を合して、ａ−タリ
ーエバポレーターで蒸発乾固させた（ ８１．２ ｇ
）。残留物なメタノール／酢酸（９５１５）４０（ｌｄ
Ｋ取り、遠心分離して不溶成分を除き、５０−のセファ
デックスＴ、＋Ｈ−５Ｑ（カラム１００１００Ｘ５を用
い、バッチ法でｒルクロマトグラフィを行った（溶出液
：メタノール／酢ａＩ９５１５）。陽性分画を合し、蒸
発濃縮した（１４．８．Ｆ）。
ルミン装置を調べ、ついで活性分画を合して、ａ−タリ
ーエバポレーターで蒸発乾固させた（ ８１．２ ｇ
）。残留物なメタノール／酢酸（９５１５）４０（ｌｄ
Ｋ取り、遠心分離して不溶成分を除き、５０−のセファ
デックスＴ、＋Ｈ−５Ｑ（カラム１００１００Ｘ５を用
い、バッチ法でｒルクロマトグラフィを行った（溶出液
：メタノール／酢ａＩ９５１５）。陽性分画を合し、蒸
発濃縮した（１４．８．Ｆ）。
フレークによる多段分配には、ラボルテック（Ｌａｂｏ
ｒｔｅｃ 、 Ｂａ５ｌｅ ）のＶ＆置を使用した。最
初の分離は５０ｍの装置で、ｎ−ブタノール／酢酸エチ
ル１０．１Ｍ部＃ｌ（３／１／３）のシステムを用いて
行りた。サンプル（５，Ｖ）な下相（１００ｊ）Ｋ＃解
し、以下の条件で分離した。
ｒｔｅｃ 、 Ｂａ５ｌｅ ）のＶ＆置を使用した。最
初の分離は５０ｍの装置で、ｎ−ブタノール／酢酸エチ
ル１０．１Ｍ部＃ｌ（３／１／３）のシステムを用いて
行りた。サンプル（５，Ｖ）な下相（１００ｊ）Ｋ＃解
し、以下の条件で分離した。
段数 １６０
各段の振動移動 ７０ 。
振動の強度 ４５
分離時間 ２０分
最終精製には、得られた粗生成物（４，２ｇ）を２ｙの
バッチで、２−ブタノール／ ０．０５ Ｎ酢酸アンモ
ニウムシステムの下相（５０ｍｇ）に溶解し。
バッチで、２−ブタノール／ ０．０５ Ｎ酢酸アンモ
ニウムシステムの下相（５０ｍｇ）に溶解し。
エレメント４４０の１０ｄｆｃ置で精製した。
段数 ４４０
各段の振動移動 ５０
振動の強度 ５０
分離時間 １０分
エピデルミンを富むエレメントを会し、蒸発濃縮し、水
に取り、高真空下に数回凍結乾燥した。
に取り、高真空下に数回凍結乾燥した。
抗生物質（２，６＃）は実施したすべての試験において
均一であった。
均一であった。
エピデルミンの製造および単離過程での生物学的特徴の
検査、すなわち活性スペクトルの記録および産生、後処
理、濃縮のモニターにはプレート拡散試験を用いた。試
験は、グライナー（Ｇｒｅｉｎｓｒ。
検査、すなわち活性スペクトルの記録および産生、後処
理、濃縮のモニターにはプレート拡散試験を用いた。試
験は、グライナー（Ｇｒｅｉｎｓｒ。
Ｎｕｒｔｉｎｇｌｉｎ） ＃のペトリ皿、径６１ｕｌＩ
のろ過ディスク〔マシェリー・ラントナーデルＣＭａｃ
ｈｅｒｅｙ ＆ｓａｇｅ４． Ｄｉｉｒｅｎ）］を用い
、ツェナーほか（ｚＡｈｎｅｒ ＆Ｍａａｓ ）のバイ
オロジー・オデ・アンティバイオティックス（Ｂ１０１
０ｇ７ ｏｆ ＡｎｔｉｔｌｉＯｔｉ（ＩＬ １３Ｐｒ
ｉｎｇｌｒＶａｒｌａｇ、 Ｂｅｒｌｉｎ−ＨｅｉｃＬ
ｅｌｔ）ｅｒｇ−Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 １９７２ ）の
記載に従って実施した。ろ過ディスクを適当な試験液２
０μＪで湿らせ、室！においてガラススライド上で乾燥
させ、試験プレート上に置いた。
のろ過ディスク〔マシェリー・ラントナーデルＣＭａｃ
ｈｅｒｅｙ ＆ｓａｇｅ４． Ｄｉｉｒｅｎ）］を用い
、ツェナーほか（ｚＡｈｎｅｒ ＆Ｍａａｓ ）のバイ
オロジー・オデ・アンティバイオティックス（Ｂ１０１
０ｇ７ ｏｆ ＡｎｔｉｔｌｉＯｔｉ（ＩＬ １３Ｐｒ
ｉｎｇｌｒＶａｒｌａｇ、 Ｂｅｒｌｉｎ−ＨｅｉｃＬ
ｅｌｔ）ｅｒｇ−Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 １９７２ ）の
記載に従って実施した。ろ過ディスクを適当な試験液２
０μＪで湿らせ、室！においてガラススライド上で乾燥
させ、試験プレート上に置いた。
試験プレートを６７℃でインキエペートシ、生育阻止を
約１６時間後に評価した。ルーチンの試験細菌としては
、操作上の問題が少ないので、ストレゾトコツカス奉パ
イロジエン：Ｊ： （８ｔｒｅｐｔｏｃｏｃａｕｓｐｙ
ｒｏｇｅｎｅａ） ＡＴＯＣ８６６Ｂと、ミクロコツカ
ス・ルテウｘ （Ｍｉｃｒｏｃｏａｃｕｓ １ｕｔｓｕ
ｓ） ＡＴ（！０９３４１ ｔ’用いた・ ストレプトコッカス・パイロジエンズＡＴＯＯ８６６８
の試験グレート：試験プレートの！Ｉｌｌ前に、試験細
菌を血液プレート上にムチンと新たに接種する必要があ
る〔メジウム： ｐ）１７．４アガール５００−１五チ
ン溶液（１０重量係）１６０ｄ、グルコース溶液（５０
重量ｑｂ） ３．５−およびヒツジ血液７０−〕。１１
５〜１８時間６７℃でインキユベートしたのち、食塩懸
濁液（１！ｊｓｒｅ Ｏ，５）を調製し、この懸濁液１
−を栄養ぺ＝ス〔メジウム：ペプトン１０ｙ１肉工Φス
８Ｉ１食塩３ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４２１％グ／ｌ／ ：ｆ
−Ｘ １Ｑ ７７ （ＬＡずし４１ ／あたり） 、ｐ
ｉ−１７，２１１００−中にピペットで加えた。１０−
のバッチをもつプレートは４℃に数日間保存できた。
約１６時間後に評価した。ルーチンの試験細菌としては
、操作上の問題が少ないので、ストレゾトコツカス奉パ
イロジエン：Ｊ： （８ｔｒｅｐｔｏｃｏｃａｕｓｐｙ
ｒｏｇｅｎｅａ） ＡＴＯＣ８６６Ｂと、ミクロコツカ
ス・ルテウｘ （Ｍｉｃｒｏｃｏａｃｕｓ １ｕｔｓｕ
ｓ） ＡＴ（！０９３４１ ｔ’用いた・ ストレプトコッカス・パイロジエンズＡＴＯＯ８６６８
の試験グレート：試験プレートの！Ｉｌｌ前に、試験細
菌を血液プレート上にムチンと新たに接種する必要があ
る〔メジウム： ｐ）１７．４アガール５００−１五チ
ン溶液（１０重量係）１６０ｄ、グルコース溶液（５０
重量ｑｂ） ３．５−およびヒツジ血液７０−〕。１１
５〜１８時間６７℃でインキユベートしたのち、食塩懸
濁液（１！ｊｓｒｅ Ｏ，５）を調製し、この懸濁液１
−を栄養ぺ＝ス〔メジウム：ペプトン１０ｙ１肉工Φス
８Ｉ１食塩３ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４２１％グ／ｌ／ ：ｆ
−Ｘ １Ｑ ７７ （ＬＡずし４１ ／あたり） 、ｐ
ｉ−１７，２１１００−中にピペットで加えた。１０−
のバッチをもつプレートは４℃に数日間保存できた。
２りａコツカス・ルテウスＡＴＯ０９３４１の試験フレ
ートニー夜培養液（メジウム：１ｊアｒ、：Ｑ、ペプト
ン１０Ｉ、肉エキス８１１、食塩３ｇ、Ｎ！Ｌ、ＨＰｏ
、 ２１ 、グルコース１０１１．ｐ）１７．２）を５
７９ｊｍの吸光度が１．０になるように希釈した。
ートニー夜培養液（メジウム：１ｊアｒ、：Ｑ、ペプト
ン１０Ｉ、肉エキス８１１、食塩３ｇ、Ｎ！Ｌ、ＨＰｏ
、 ２１ 、グルコース１０１１．ｐ）１７．２）を５
７９ｊｍの吸光度が１．０になるように希釈した。
アガール１００ｓｄＫこの懸濁液０．２５−を接種し、
バッチ１０−をスライｒ上に注いだ。試験プレートは４
℃で数日間保存できた。
バッチ１０−をスライｒ上に注いだ。試験プレートは４
℃で数日間保存できた。
活性スペクトル用試験プレート：
細菌の試験プレート：
α） 好気性細菌
一夜培養液を関連試験メジウム中で生育させ、プレート
はミクロコツカス・ルテウスＡＴＯＣ９３４１の場合と
同様にして調製した。
はミクロコツカス・ルテウスＡＴＯＣ９３４１の場合と
同様にして調製した。
β）嫌気性細菌
クロストリジウム・パストウリアナムＡＴＣ（！６１０
３およびプロピオニバクテリウム・アクネＤ８Ｍ １８
’９７の予備培養液を、ｔｉｔＸを除くために栄養溶液
な綿栓まで満たした試験管内で生育させた。この培養液
６−でアガール１００−を接種し、そのパッチ１０−を
プレート上に注いだ。無気ボッ ト （ＢＢＬ−Ｇａｇ
Ｐａｋ １ ０ ０ 、 Ｂｓｃｔｏｎ、
ＤｉｃｋｉｎａｏｎＧｍｌ））ｉ、 、Ｈｅｉ−ｄｅ
ｌｂｅｒｇ）中型適温度でインキュベーションな行った
。
３およびプロピオニバクテリウム・アクネＤ８Ｍ １８
’９７の予備培養液を、ｔｉｔＸを除くために栄養溶液
な綿栓まで満たした試験管内で生育させた。この培養液
６−でアガール１００−を接種し、そのパッチ１０−を
プレート上に注いだ。無気ボッ ト （ＢＢＬ−Ｇａｇ
Ｐａｋ １ ０ ０ 、 Ｂｓｃｔｏｎ、
ＤｉｃｋｉｎａｏｎＧｍｌ））ｉ、 、Ｈｅｉ−ｄｅ
ｌｂｅｒｇ）中型適温度でインキュベーションな行った
。
イースト撮画の試験プレート；
振盪培養器中、関連試験メジウムで１８〜２０時間、細
胞を生育させた。トーマの計数チャンバーで計数したの
ち、アガール１ｍあたりの細胞数が１０６個になるよう
に試験プレートに接種した。
胞を生育させた。トーマの計数チャンバーで計数したの
ち、アガール１ｍあたりの細胞数が１０６個になるよう
に試験プレートに接種した。
醒およびストレプトマイセスの試験プレート：試験微生
物は斜面チューブ上（メジウム：１１アｒ＝す、酵母エ
キス４ｇ、麦芽エキス１［１，！ｉ’、グルコース４．
９）、相当温度で胞子形成を生じるまで生育させた。胞
子を６−の食塩ツイーン８０（食塩水１０Ｄｄ６ｃツイ
ーン８０を１滴添加）Ｋ浮遊させ、試験プレート中に注
いだ。
物は斜面チューブ上（メジウム：１１アｒ＝す、酵母エ
キス４ｇ、麦芽エキス１［１，！ｉ’、グルコース４．
９）、相当温度で胞子形成を生じるまで生育させた。胞
子を６−の食塩ツイーン８０（食塩水１０Ｄｄ６ｃツイ
ーン８０を１滴添加）Ｋ浮遊させ、試験プレート中に注
いだ。
工ぎデルミノはきわめて優れた抗生物質活性を有するが
、とくにグラム陽性菌の系列に対して有効である。工ぎ
デルミノの抗生物質活性は、ナイシン（ｎｉｓｌｎ ：
ナイシンにつ＾てはとくにＤＩＣ−Ａ−２，０００，８
１８号または（）Ｂ−Ｂ−１，１８２，１５６号参照）
と比較して試験した。一部の臨床に関連する重快な細菌
についてはフシド酸も比較に富めた。
、とくにグラム陽性菌の系列に対して有効である。工ぎ
デルミノの抗生物質活性は、ナイシン（ｎｉｓｌｎ ：
ナイシンにつ＾てはとくにＤＩＣ−Ａ−２，０００，８
１８号または（）Ｂ−Ｂ−１，１８２，１５６号参照）
と比較して試験した。一部の臨床に関連する重快な細菌
についてはフシド酸も比較に富めた。
有効性はグレート拡散試験により最小阻止一度を求めて
決定した。
決定した。
ａ）グレート拡散試験
プレート拡散試験では、エピデルミンおよびナイシンに
対する各種微生物の感受性を調べた。第２表は、この両
抗生物質がグラム陽性菌にほぼ、もっばら作用すること
を示している。ナイシンは４０．０００単位の活性のも
のを使用した。
対する各種微生物の感受性を調べた。第２表は、この両
抗生物質がグラム陽性菌にほぼ、もっばら作用すること
を示している。ナイシンは４０．０００単位の活性のも
のを使用した。
ｂ）最小阻止一度
臨床的に関連ある細菌についての最小阻止濃度ｃμｇ／
ｍｌ）を、以下のメジウム中マイクロタイタープレート
で試験した。
ｍｌ）を、以下のメジウム中マイクロタイタープレート
で試験した。
蒸留水ｉ、ｏ ｏ ｏ−中、乳酸ナトリウム５−１ｌＪ
＆２８０４５ ｉ 、 Ｋ）１２ＰＯ４０−５１−Ｍｇ
Ｃ１ａ Ｏ−１１１−Ｎａ、ｃｊ５ｇ、ａルコ−ス１
ＯＮｓ ｔ′ｅ′ｙトｆン獣カルシウム５０μｇ、千ア
き７５０μｇ１葉！！ ０．２５μｇ、ナイアシ７５０
μｇ、ｐ−アミノ安息香酸２５μｇ％ぎキトキシン塩酸
塩５０μｇ、リポフラビ７２５μｇ０ 第６表には、エピデルミン、ナイシンおよびフシド酸の
最小阻止濃度（μｇ／ｍｌ）を比較試験によって示す。
＆２８０４５ ｉ 、 Ｋ）１２ＰＯ４０−５１−Ｍｇ
Ｃ１ａ Ｏ−１１１−Ｎａ、ｃｊ５ｇ、ａルコ−ス１
ＯＮｓ ｔ′ｅ′ｙトｆン獣カルシウム５０μｇ、千ア
き７５０μｇ１葉！！ ０．２５μｇ、ナイアシ７５０
μｇ、ｐ−アミノ安息香酸２５μｇ％ぎキトキシン塩酸
塩５０μｇ、リポフラビ７２５μｇ０ 第６表には、エピデルミン、ナイシンおよびフシド酸の
最小阻止濃度（μｇ／ｍｌ）を比較試験によって示す。
この場合用いたナイシンの活性は２５００単位であった
。
。
１ｙ２表に挙げたメジウムは以下に記載するとおりであ
る。メジウムは−を調整したのち、１２１℃で２０分間
、オートクレーブ処理した。
る。メジウムは−を調整したのち、１２１℃で２０分間
、オートクレーブ処理した。
以下の数値はすべて水１１中の値である。化学的に定義
されたメジウムの場合は脱イオン水な用いた＠ （２）グルコースーアガールメジウム ペデトン １０Ｉ 肉エキス ８ｇ Ｎ１！ＬＣｊ ５ｆｌ Ｎｌ！Ｌ２ＨＰＯ４２１ グルコース １０ＩＩ（別個にオートクレーブ処理
アガール ２０ｇ ｐＨ７，２ （３） 酵母−麦芽メジウム 酵母エキス ４１ 麦芽エキス １０ｇ グルコース ４１ アガール ２０＆ −７，６ （４） 細菌用オキノイドメジウム 肉エキス １０ｙ ペプトン １０＆ ＮａＣｊ ５ ｇ アが−ル ２１ ｐＨ７，２ （５）栄養肉汁（ＤｉｆＣＯ） ８ ＃アガール
２０＆ ｐ）１７．２ （６）細菌用最小培地〔ヒュツタ−（Ｈｕｔｔｅｒ）ほ
か、１９６６〕 Ｄ−グルコース ８ｙ 酒石酸ニアンモニウム ４ｙＮａ（Ｊ
５ＪＫ２ＨＰ０．
２ Ｊｉ１Ｍｇ８０４・７）１２０
１１ａ喝ｚ
Ｏ，２ｇＭｎ８０４・Ｈ２Ｏ０−０１１１ フエリオキサミンＢ Ｏ，０：ＩＩアガール
２０．９ −７．２ （７） りαストリジウム・パストウリアナム用メジ
ウム 肉エキス ３ｙ 酵母エキス ６Ｉ 麦芽エキス ６Ｉ ペプトン ２０Ｉ Ｄ−グルコース ５ｇ アスコルビン＃ｌ Ｏ，２ｇアガール
２０．９ −７．０ （８） ゾロビオニバクテリウム・アクネ用プリュー
アー（Ｂｒｅｗｅｒ）チオグリコレートメジウムチオグ
リコレートメジウム ４０．１１アガール
２０ＩＩ メ１７．２ 二ぎデルミノは耐容性に優れ、局所的に用いたＩ！１６
会、ｌＩｌ性作用は認められない。
されたメジウムの場合は脱イオン水な用いた＠ （２）グルコースーアガールメジウム ペデトン １０Ｉ 肉エキス ８ｇ Ｎ１！ＬＣｊ ５ｆｌ Ｎｌ！Ｌ２ＨＰＯ４２１ グルコース １０ＩＩ（別個にオートクレーブ処理
アガール ２０ｇ ｐＨ７，２ （３） 酵母−麦芽メジウム 酵母エキス ４１ 麦芽エキス １０ｇ グルコース ４１ アガール ２０＆ −７，６ （４） 細菌用オキノイドメジウム 肉エキス １０ｙ ペプトン １０＆ ＮａＣｊ ５ ｇ アが−ル ２１ ｐＨ７，２ （５）栄養肉汁（ＤｉｆＣＯ） ８ ＃アガール
２０＆ ｐ）１７．２ （６）細菌用最小培地〔ヒュツタ−（Ｈｕｔｔｅｒ）ほ
か、１９６６〕 Ｄ−グルコース ８ｙ 酒石酸ニアンモニウム ４ｙＮａ（Ｊ
５ＪＫ２ＨＰ０．
２ Ｊｉ１Ｍｇ８０４・７）１２０
１１ａ喝ｚ
Ｏ，２ｇＭｎ８０４・Ｈ２Ｏ０−０１１１ フエリオキサミンＢ Ｏ，０：ＩＩアガール
２０．９ −７．２ （７） りαストリジウム・パストウリアナム用メジ
ウム 肉エキス ３ｙ 酵母エキス ６Ｉ 麦芽エキス ６Ｉ ペプトン ２０Ｉ Ｄ−グルコース ５ｇ アスコルビン＃ｌ Ｏ，２ｇアガール
２０．９ −７．０ （８） ゾロビオニバクテリウム・アクネ用プリュー
アー（Ｂｒｅｗｅｒ）チオグリコレートメジウムチオグ
リコレートメジウム ４０．１１アガール
２０ＩＩ メ１７．２ 二ぎデルミノは耐容性に優れ、局所的に用いたＩ！１６
会、ｌＩｌ性作用は認められない。
主たる利点は、抵抗性変異株、スタフィロコッカス・エ
ビデルミゾイスＤ８Ｍ ５０９５が工ぎデルミノに抵抗
性で、それを産生ずることである。菌株ＮＯよりは、そ
れが産生ずる低分子抗生物質に対してこのような抵抗性
を示さない。
ビデルミゾイスＤ８Ｍ ５０９５が工ぎデルミノに抵抗
性で、それを産生ずることである。菌株ＮＯよりは、そ
れが産生ずる低分子抗生物質に対してこのような抵抗性
を示さない。
新規クローンＤＡＭ ３０９５は次のようにして得られ
た。
た。
適応は糊口を有する１００−のエルノンマイヤーフラス
コ中、１０−の栄養溶液（編心臓潅流液）で実施した。
コ中、１０−の栄養溶液（編心臓潅流液）で実施した。
出発培養液を０．５−０１２時間培養液で接種した。高
濃度のエビヂルミノを含むフラスコには、前回のよく生
育した培養液０．５−を樵として用いた。生育はｓ７ｓ
ｎｍｔｃおいて光学的に評価した。培養液中エビデルミ
ゾイスミン濃ｒＩＱ／ｖでもなお良好な生育を示した培
養液を食塩水で希釈し、工ぎデルミノ０．５ｗＩＩ／ｌ
ｌ１ｇを注いでしいたスライド上＆ＣＩｌ！！布した。
濃度のエビヂルミノを含むフラスコには、前回のよく生
育した培養液０．５−を樵として用いた。生育はｓ７ｓ
ｎｍｔｃおいて光学的に評価した。培養液中エビデルミ
ゾイスミン濃ｒＩＱ／ｖでもなお良好な生育を示した培
養液を食塩水で希釈し、工ぎデルミノ０．５ｗＩＩ／ｌ
ｌ１ｇを注いでしいたスライド上＆ＣＩｌ！！布した。
比較のために、文献公知の菌株ＮＯより１１５３６０１
２時間培養液を希釈しないでグレート上Ｋｌ！Ｅ布した
。６７℃に２４時間インキエベートしたのち、１０−６
に希釈した適応培養液に９４個のコロニーが観察された
。希釈しないで０．１５ｑ／ｍｌ富有グレート上に塗布
した対照菌株からは、４８時間インキュベートしたのち
も、生育は認められなかった。抵抗性コロニーを選択し
、メジウム２のグレート上にグリッドパターンに塗布し
た。径５■のフラグメンドナ取って産生り予備試験とマ
イクロコツカス・ルテウスＡＴＣ’０９６４１にぢする
活性試験を行ったのち、産生クローンを液体メジウム中
で試験した。
２時間培養液を希釈しないでグレート上Ｋｌ！Ｅ布した
。６７℃に２４時間インキエベートしたのち、１０−６
に希釈した適応培養液に９４個のコロニーが観察された
。希釈しないで０．１５ｑ／ｍｌ富有グレート上に塗布
した対照菌株からは、４８時間インキュベートしたのち
も、生育は認められなかった。抵抗性コロニーを選択し
、メジウム２のグレート上にグリッドパターンに塗布し
た。径５■のフラグメンドナ取って産生り予備試験とマ
イクロコツカス・ルテウスＡＴＣ’０９６４１にぢする
活性試験を行ったのち、産生クローンを液体メジウム中
で試験した。
抵抗性１株と文献公知菌株の比較：
＆）ｆレート拡散試験における最小阻止濃度：２棟の菌
株な言む試ｖｉｆレート上で得られた最小阻止濃度な第
４表に示す。
株な言む試ｖｉｆレート上で得られた最小阻止濃度な第
４表に示す。
果４表 ＮＯより１１５３６とＤＢＭ ５０９５のプレ
ＮＯより１１５３６ １０ｎｓＭ１０ｎ
５ ）１０００ｂ）生育および産生： 栄養浴液（６％肉エキス、２％麦芽エキス、０．６７％
水醸化カルシウム）中で２８１の菌株の生育と産生パタ
ーンを比較した（第１２図参照）。
ＮＯより１１５３６ １０ｎｓＭ１０ｎ
５ ）１０００ｂ）生育および産生： 栄養浴液（６％肉エキス、２％麦芽エキス、０．６７％
水醸化カルシウム）中で２８１の菌株の生育と産生パタ
ーンを比較した（第１２図参照）。
生育パターン：生菌数の測定
産生パターン＝ｆレート拡散試験におけるミクロコツカ
ス・ルテウスＡＴＯＣ！ ９３４１に対する活性 、抵抗性菌株によってより良好な産生が社められる。
ス・ルテウスＡＴＯＣ！ ９３４１に対する活性 、抵抗性菌株によってより良好な産生が社められる。
Ｃ）各種生育相における工ぎデルミノに対する感受性：
産生菌株の抗生物質による固有の阻害と、選ばれたクロ
ーンの抵抗性の試験をバイオホトメーター（自動循環装
置付のエペンドル７製ホトメーター］を用いて実施した
。
ーンの抵抗性の試験をバイオホトメーター（自動循環装
置付のエペンドル７製ホトメーター］を用いて実施した
。
これらの試験は、たとえば、久のように実施した。
〜 スタフィロコッカス・エビデルミゾイスＮｏより１１５
５６または選ばれた抵抗性菌株ｎｍ５１９５の１２時間
培養液０．５−のバッチを新鮮なメジウム上に接極した
。
〜 スタフィロコッカス・エビデルミゾイスＮｏより１１５
５６または選ばれた抵抗性菌株ｎｍ５１９５の１２時間
培養液０．５−のバッチを新鮮なメジウム上に接極した
。
これらの培養液を５７３ ｎｍの吸光度が０．０４３に
なるまで生育させ（層厚１１の皿）、ついでバイオホト
メーターのキューベット（Ｎ厚２ ｃｍ ）に７．５−
を加えた・ 細胞懸濁液の密度がバイオホトメーターの透過率９０優
になるように調整した。インキュベーションは最大通気
下に６７°Ｇで実施した。各生育相にエピデルミンを水
溶液として添加した。
なるまで生育させ（層厚１１の皿）、ついでバイオホト
メーターのキューベット（Ｎ厚２ ｃｍ ）に７．５−
を加えた・ 細胞懸濁液の密度がバイオホトメーターの透過率９０優
になるように調整した。インキュベーションは最大通気
下に６７°Ｇで実施した。各生育相にエピデルミンを水
溶液として添加した。
論ずれの菌株も、対数期の初期と中期に、各種＠度の工
ぎデルミノをｆｆ＆加した。結果を第１３図および第１
４図に示す。
ぎデルミノをｆｆ＆加した。結果を第１３図および第１
４図に示す。
これまでに試験した濃度では、抵抗性菌株には爵菌は認
められなかった。
められなかった。
本発明の抗生物質エピデルミンは、それが単離された培
養液と同様、殺菌効果を示し、細胞を溶解させる。
養液と同様、殺菌効果を示し、細胞を溶解させる。
その殺ｌ活性とグラム陽性細菌に対する広いスペクトル
の活性から、本発明のポリペゾチド抗生物質エピデルミ
ンは、グラム陽性ａｌｉＫよって生じる感染症の治療に
とくに有用である。工ぎデルミノは、湿疹、膿伽疹、蜂
巣炎およびとくに福倫のよ５な皮膚感染症の治療に有用
である。プロピオニバクテリウム・アクネズの一部の重
要な菌株に対する著しく毘い有効性は、すでに第２表お
よび第３表に示した。エピデルミンはヒトの皮膚に生棲
する微生物によって正常に産生されるものということが
でき、他の慣用の抗生物質に比べ、皮膚の保ｌＩＫより
効果的である。
の活性から、本発明のポリペゾチド抗生物質エピデルミ
ンは、グラム陽性ａｌｉＫよって生じる感染症の治療に
とくに有用である。工ぎデルミノは、湿疹、膿伽疹、蜂
巣炎およびとくに福倫のよ５な皮膚感染症の治療に有用
である。プロピオニバクテリウム・アクネズの一部の重
要な菌株に対する著しく毘い有効性は、すでに第２表お
よび第３表に示した。エピデルミンはヒトの皮膚に生棲
する微生物によって正常に産生されるものということが
でき、他の慣用の抗生物質に比べ、皮膚の保ｌＩＫより
効果的である。
本発明の抗生物質を慣用の賦形剤および担体とともに含
有する医゛薬組成物は、経口的に、′非経口的に、経腸
的にまたは局所的に適用できる。これらの組成物は、と
く九局所用剤型の場合、浴液剤、乳化剤、デル、ローシ
ョン、軟膏、クリームまたは粉末とし℃提供される。
。
有する医゛薬組成物は、経口的に、′非経口的に、経腸
的にまたは局所的に適用できる。これらの組成物は、と
く九局所用剤型の場合、浴液剤、乳化剤、デル、ローシ
ョン、軟膏、クリームまたは粉末とし℃提供される。
。
以下の実施例はこれらの医薬用剤型の一造方法を例示す
るもの℃ある。
るもの℃ある。
例２
１００Ｉ中言址：
工ぎデルミノ １．Ｏｙエタノール（
９４，５容１％） ５６．０ｇ１．２−プ５ピ
レングリコール ４０．０ ｇ脱イオン
水 ３．０ｇ製法： 二ぜデルミノをエタノール、１．２−ｆＨピレングリコ
ールおよび水の混合物に溶解し、この溶液を無菌的にろ
過する。
９４，５容１％） ５６．０ｇ１．２−プ５ピ
レングリコール ４０．０ ｇ脱イオン
水 ３．０ｇ製法： 二ぜデルミノをエタノール、１．２−ｆＨピレングリコ
ールおよび水の混合物に溶解し、この溶液を無菌的にろ
過する。
例６
１００ｇ中の含量
工ｔデルミノ １．００ 、？１．２
−ブ５ピレングリコｉル ７．０
０ｇアルキルジメチバンジルアン モニウムクロリド（ペノヂルコンム■） ０．
１５．Ｖンルピタンモノパルミテート （スパン４０＠）０・４０．９ ンルビマクロプールパルミテート （ツイーン４０＠） １
．２０ 、ｉｌ’デシルオレエート （セチオールＶ■） ２・４０
．？セチルおよびステアリル アルコール混合物（ラネツテ０■） １．６
Ｃｌセチルパルミテート ０．
８０．？脱イオン水 全１１００．＠と
でる製法： 上記普のアルキルジメチルペンジルアンモニウムクロリ
ド、ソルビタンモノツヤルミテート、ンルビマクロイー
ルバルミテート、デシルオレエート、セチルおよびステ
アリルアルコールならびにセチルパルミテートを水７５
−中に攪拌下に混合し、ついでエビヂルミノの１．２−
７’ｌ：Ｉビレフグ１ノコール浴液のろ過液とｌｊ！４
Ｉ！ｌＫの水を攪拌に加え、均一にする・ 例４ ｒル １００１中含量 工ぎデルミノ １・Ｏｙラウリルアル
コ−Ｗ）ポリエチレン グリコールエーテル（ブリッジ！１５の） １
．０１１１．２−プ１ピレングリコール
５．０ｇアクリル４１１ポリマー （カルボボール９３４■） １．
２ ＃ｐ−ヒドキシ安息香酸メチル １
．６ｇｐ−ヒドロキシ安息香酸プロぎル ０．
４ｇ香料 適量 水酸化ナトリウム溶液 ＰＨ６，５になるま
で脱イオン水 全量１００ｇとする製
Ｓ： 特定量の賦形剤を水７５−中に攪拌下に加える。
−ブ５ピレングリコｉル ７．０
０ｇアルキルジメチバンジルアン モニウムクロリド（ペノヂルコンム■） ０．
１５．Ｖンルピタンモノパルミテート （スパン４０＠）０・４０．９ ンルビマクロプールパルミテート （ツイーン４０＠） １
．２０ 、ｉｌ’デシルオレエート （セチオールＶ■） ２・４０
．？セチルおよびステアリル アルコール混合物（ラネツテ０■） １．６
Ｃｌセチルパルミテート ０．
８０．？脱イオン水 全１１００．＠と
でる製法： 上記普のアルキルジメチルペンジルアンモニウムクロリ
ド、ソルビタンモノツヤルミテート、ンルビマクロイー
ルバルミテート、デシルオレエート、セチルおよびステ
アリルアルコールならびにセチルパルミテートを水７５
−中に攪拌下に混合し、ついでエビヂルミノの１．２−
７’ｌ：Ｉビレフグ１ノコール浴液のろ過液とｌｊ！４
Ｉ！ｌＫの水を攪拌に加え、均一にする・ 例４ ｒル １００１中含量 工ぎデルミノ １・Ｏｙラウリルアル
コ−Ｗ）ポリエチレン グリコールエーテル（ブリッジ！１５の） １
．０１１１．２−プ１ピレングリコール
５．０ｇアクリル４１１ポリマー （カルボボール９３４■） １．
２ ＃ｐ−ヒドキシ安息香酸メチル １
．６ｇｐ−ヒドロキシ安息香酸プロぎル ０．
４ｇ香料 適量 水酸化ナトリウム溶液 ＰＨ６，５になるま
で脱イオン水 全量１００ｇとする製
Ｓ： 特定量の賦形剤を水７５−中に攪拌下に加える。
エピデルミン＆１．２−デａｇレンゲリコールと残部の
水の混合物にＩｌ！屏し、この溶液な再び攪拌下に加え
る。得られたｒルをもう一度ホモジナイズする。
水の混合物にＩｌ！屏し、この溶液な再び攪拌下に加え
る。得られたｒルをもう一度ホモジナイズする。
第１図は二ぎデルミノの酸完全加水分解物の７２ノ酸ク
ロマトグラムである（ニンヒドリン発色、λ＝ ５７
Ｑ ｎｍ） 第２図はエピデルミンの酸完全加水分解物のＮ−ペンタ
フルオロプ１２ぎオニル−アミノａｌｎ−ゾａビルエス
テルの０ｈｉｒｌ！Ｌ！１ｉ１−Ｖａｌ上ガスクロマト
グラムである（温度プログラム、３分間、８５℃の等温
、ついで１分間４℃ずつ２００°Ｃまで上昇、キヤ・リ
アーガス： Ｈｓ 、 ０．９２パール）第３図：エピ
デルミン水溶液の紫外部スペクトル、ｐＨ３（Ｃ！＝０
．１５ｑ／ｍｌ ）第４図：エピデルミンの赤外吸収スペクトル、Ｋ］３
ｒ錠 ＠５図：エビヂルミミノ１ト皿スペクトルｔ２Ｄ■／
（１，５ｗｔ Ｄマージメチルホルムアミド、４００．
１６Ｍ１ｌｌ ） 第６図；工ぎデルミノの１３０−ＮＲスペクトル（４０
■１０．５ｍ、上”Ｏ、”Ｈ−ジメチル゛ホルムアｉ「
、１００．６ＭＨｚ、 ４５３６０パルス）Ｉｔ ７８
： ｘ ｖ！ テｓ、ミ７ （１） μＢＯｎ（ｌａ
ｐａｋ Ｃ１＠ ＨＰＬＯクロマトグラム（３００Ｘ３
．９鵡、移動箱：Ａ＝ニアセトニトリル ０．０１ Ｍ
ＫＨ２ｐｏ、、１０／９０：Ｂ＝ニアセトニトリル
０．０１ 、Ｍ ＫＨ２ＰＯ，，７０／３０．６０分で
１０％Ｂ→１００僑Ｂ直線勾配、流速２−７分） ｗ、８幽；フラグメントＰ２の”Ｃ−ＮＲスペクトル（
１２η１０．５ｍ、五″０ 、２Ｈ−ジメチルホルムア
ミｒ、１００．６ ＭＨｚ 、 ５８３００パルス）第
９図：エピデルミンの単離 第１０図：生菌数（実線）とミクロコツカス・ルテウス
に対する活性（点線）のメジウムによる比較 ム 編心臓潅流液 Ｑ３％肉エキス−２暢麦芽エキス−０，２５％（ＪＯＯ
３ ・ ３憾肉エキス−２％麦芽エキス−０，３７％０ａ（
ＯＨ）２ 第１１図：１０１スケールでの発酵過程・ −曲線 ム 生菌数 ○ ストレプトコッカス・パイロジエンズＡＴＯＣ！８
６６８に対する活性 第１２図：文献公知の菌株と抵抗性クローンＤＳＭ３０
９５の生菌数（実線）およびミクロコツカス・ルテウス
ＡＴＯＯ９３４１に対する活性（点１Ｍ）Ｑ 文献公知
の菌株 ム 抵抗性クローン 第１３図：各種生育相におけるスタフィロコッカス・エ
ビ？ルミディスＮＣより１１５３６へのエピデルミンの
添加 曲線１；正常な生育パターン 曲線２；対数期の初期にエピデルミン１０μｇ／ｍｌを
添加、溶菌を生じている 曲線３；対数期の中期にエピデルミン１０μｇ／ｍｌを
添加、同様Ｋｌ菌を生じてい る曲線４：対数期の中期に工Ｃデルミノ２．５μｇ／ｍ
ｌを添加、生育遅延 第１４図：抵抗性クローンＤＳＭ ３０９５の各檀生育
相におけるエピデルミンの添加 油＃１：正常な生育パターン、Ｎｏより１１５３６のＩ
Ｉｍ＠−に同じ 曲ＩＩｊＩ２；対数期の初期にエピデルミン１２０μＶ
−を添加、生育にわずかな遅延のみ曲線６：対数期の中
期に３６０μｇ／ｍｌのエピデルミン添加、生育にわず
かな遅延なみるのみ第１５図：Ｈｌの完全加水分解物の
Ｎ−ペンタフルオａ ｆａ ヒオニルアミ／ｒＩＩＮ−
７’口ぎルエステルの（１！ｈｉｒａｇｉｌ−Ｖａｌ上
ガスクロマトグラム（温度プログラム；６分間８０°Ｃ
に等温保持、りｈで１分間４℃で２００℃に上昇させる
、キャリヤーガス：Ｈ２）
ロマトグラムである（ニンヒドリン発色、λ＝ ５７
Ｑ ｎｍ） 第２図はエピデルミンの酸完全加水分解物のＮ−ペンタ
フルオロプ１２ぎオニル−アミノａｌｎ−ゾａビルエス
テルの０ｈｉｒｌ！Ｌ！１ｉ１−Ｖａｌ上ガスクロマト
グラムである（温度プログラム、３分間、８５℃の等温
、ついで１分間４℃ずつ２００°Ｃまで上昇、キヤ・リ
アーガス： Ｈｓ 、 ０．９２パール）第３図：エピ
デルミン水溶液の紫外部スペクトル、ｐＨ３（Ｃ！＝０
．１５ｑ／ｍｌ ）第４図：エピデルミンの赤外吸収スペクトル、Ｋ］３
ｒ錠 ＠５図：エビヂルミミノ１ト皿スペクトルｔ２Ｄ■／
（１，５ｗｔ Ｄマージメチルホルムアミド、４００．
１６Ｍ１ｌｌ ） 第６図；工ぎデルミノの１３０−ＮＲスペクトル（４０
■１０．５ｍ、上”Ｏ、”Ｈ−ジメチル゛ホルムアｉ「
、１００．６ＭＨｚ、 ４５３６０パルス）Ｉｔ ７８
： ｘ ｖ！ テｓ、ミ７ （１） μＢＯｎ（ｌａ
ｐａｋ Ｃ１＠ ＨＰＬＯクロマトグラム（３００Ｘ３
．９鵡、移動箱：Ａ＝ニアセトニトリル ０．０１ Ｍ
ＫＨ２ｐｏ、、１０／９０：Ｂ＝ニアセトニトリル
０．０１ 、Ｍ ＫＨ２ＰＯ，，７０／３０．６０分で
１０％Ｂ→１００僑Ｂ直線勾配、流速２−７分） ｗ、８幽；フラグメントＰ２の”Ｃ−ＮＲスペクトル（
１２η１０．５ｍ、五″０ 、２Ｈ−ジメチルホルムア
ミｒ、１００．６ ＭＨｚ 、 ５８３００パルス）第
９図：エピデルミンの単離 第１０図：生菌数（実線）とミクロコツカス・ルテウス
に対する活性（点線）のメジウムによる比較 ム 編心臓潅流液 Ｑ３％肉エキス−２暢麦芽エキス−０，２５％（ＪＯＯ
３ ・ ３憾肉エキス−２％麦芽エキス−０，３７％０ａ（
ＯＨ）２ 第１１図：１０１スケールでの発酵過程・ −曲線 ム 生菌数 ○ ストレプトコッカス・パイロジエンズＡＴＯＣ！８
６６８に対する活性 第１２図：文献公知の菌株と抵抗性クローンＤＳＭ３０
９５の生菌数（実線）およびミクロコツカス・ルテウス
ＡＴＯＯ９３４１に対する活性（点１Ｍ）Ｑ 文献公知
の菌株 ム 抵抗性クローン 第１３図：各種生育相におけるスタフィロコッカス・エ
ビ？ルミディスＮＣより１１５３６へのエピデルミンの
添加 曲線１；正常な生育パターン 曲線２；対数期の初期にエピデルミン１０μｇ／ｍｌを
添加、溶菌を生じている 曲線３；対数期の中期にエピデルミン１０μｇ／ｍｌを
添加、同様Ｋｌ菌を生じてい る曲線４：対数期の中期に工Ｃデルミノ２．５μｇ／ｍ
ｌを添加、生育遅延 第１４図：抵抗性クローンＤＳＭ ３０９５の各檀生育
相におけるエピデルミンの添加 油＃１：正常な生育パターン、Ｎｏより１１５３６のＩ
Ｉｍ＠−に同じ 曲ＩＩｊＩ２；対数期の初期にエピデルミン１２０μＶ
−を添加、生育にわずかな遅延のみ曲線６：対数期の中
期に３６０μｇ／ｍｌのエピデルミン添加、生育にわず
かな遅延なみるのみ第１５図：Ｈｌの完全加水分解物の
Ｎ−ペンタフルオａ ｆａ ヒオニルアミ／ｒＩＩＮ−
７’口ぎルエステルの（１！ｈｉｒａｇｉｌ−Ｖａｌ上
ガスクロマトグラム（温度プログラム；６分間８０°Ｃ
に等温保持、りｈで１分間４℃で２００℃に上昇させる
、キャリヤーガス：Ｈ２）
Claims (6)
- （１）アミノ酸組成がＡｓｎ（１）、Ｐｒｏ（１）、Ｇ
ｌｙ（２）、Ａｌａ（２）、Ｉｌｅ（２）、Ｐｈｅ（２
）、Ｌｙｓ（２）、Ｌａｎ（２）、β−Ｍｅ−Ｌａｎ（
１）、Ｄｈｂ（１）、Ｔｙｒ（１）、Ｓ−（２−アミノ
ビニル）−Ｄ−システイン（１）；一次構造は▲数式、
化学式、表等があります▼ で表され；各チオエーテルアミノ酸のＮ末端に近い半分
はＤコンフイギユレーシヨンであることを特徴とするエ
ピデルミンとして知られる抗生物質活性ポリペプチド - （２）以下の付加的パラメーター： （ｉ）外観；無色粉末 （ｉｉ）溶解性；水／氷酢酸またはメタノール／氷酢酸
の混合物にきわめて易溶、低級アルコールに可溶、クロ
ロホルム、アセトン、ジエチルエーテル、石油エーテル
に不溶 （ｉｉｉ）シリカゲル板上の発色反応：ニンヒドリン、
塩素／ＴＤＭ〔ＴＤＭ＝４，４′−ビス−（ジメチルア
ミノ）ジフエニルメタン〕、オルシン／硫酸、アニスア
ルデヒド／硫酸。紫外光２５４ｎｍにおける水噴霧での
非分解検出 （ｉｖ）薄層クロマトグラフイー〔既製のシリカゲル板
６０Ｆ＿２＿５＿４（メルク）を使用〕、システムＡ；
クロロホルム／メタノール／１７％アンモニア（２／２
／１）、Ｒ＿Ｆ＝０．７３、システムＢ；クロロホルム
／メタノール／１７％アンモニア（７０／３５／１０）
Ｒ＿Ｆ＝０．３０、システムＣ；ｎ−ブタノール／氷酢
酸／水（４／１／１）、Ｒ＿Ｆ＝０．０５ （ｖ）ＨＰＬＣ；第７図参照 （ｖｉ）安定性；ｐＨ２〜７において安定。ただしそれ
以上高いｐＨでは活性の急激な低下が起こる（ｖｉｉ）
分子量；２１６０付近（陰イオンなしで）（ｖｉｉｉ）
紫外部吸収スペクトル；水溶液、２６７ｎｍに長波長側
極大（第３図） （ｉｘ）赤外部吸収スペクトル；サンプルの臭化カリウ
ム錠のＩＲスペクトル（第４図） （ｘ）核磁器共鳴スペクトル；＾１Ｈ−ＮＭＲスペクト
ル（第５図）、＾１＾３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（第６図
）によつて特徴づけられる特許請求の範囲第１項記載の
エピデルミン - （３）スタフイロコツカス・エピデルミデイス（Ｓｔａ
ｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）Ｄ
ＳＭ ３０９５を、肉汁のような窒素源２〜４％、炭素
源として糖または糖アルコール１〜３％ならびにアルカ
リ土類金属の炭酸塩０．２５〜１％および／または水酸
化塩０．２５〜０．５％を含む混合栄養溶液中、３４〜
３７℃で好気的に生育させ；細胞および無機塩を除去し
たのち生成した活性物質を単離するために、培養液を、
ｐＨ８においてｎ−ブタノールで抽出し、ブタノール抽
出液を蒸発させ、残留物をメタノールに溶解し、エーテ
ル沈殿によつてこの溶液から脂質夾雑物を除去するか、
あるいは、培養液をアクリレートまたはポリスチレンを
ベースとしたポリマーで処理し、この樹脂をメタノール
／濃塩酸（９９：１）で処理して吸着したエピデルミン
を放出させ、この溶液をアンモニアで中和して真空中で
濃縮乾固し；かくして得られた単離物質をゲルクロマト
グラフイー〔セフアデツクスＬＨ−２０、メタノール／
酢酸（９５：５）〕に付して他の低分子量ペプチド、ア
ミノ酸および塩を除去し；ついでクレーグ（Ｃｒａｉｇ
）による多重向流分配に付し、最初の液−液分配はｎ−
ブタノール／酢酸エチル／０．１Ｎ酢酸（３：１：３）
のシステムを用いて行い（エピデルミンはベースライン
上に残る）、第二の分配は２−ブタノール／０．０５Ｎ
酢酸アンモニウム（１：１）中性システムを用い、この
溶出液から凍結乾燥によつて純粋なエピデルミンを無色
の粉末として単離することを特徴とする特許請求の範囲
第１項および第２項に記載の抗生物質エピデルミンの製
造、単離および精製方法 - （４）窒素源として、２〜４重量％の肉汁、全２０種の
アミノ酸の混合物（アミノ酸濃度２ｇ／ｌ）、または２
〜４％のカサミノ酸（トリプトフアンの存在下）；炭素
源として１〜３重量％の麦芽エキス、マルトース、ガラ
クトース、ラクトース、マニトール、グルコース、グリ
セロール、またはラクトースとマルトースもしくはガラ
クトースとマルトースの配合物；および０．２５〜１重
量％の炭酸カルシウムまたは０．２５〜０．５重量％の
水酸化カルシウムを発酵メジウムに導入し、さらに所望
によりビオチン、ニコチン酸、チアミン、ピリドキシン
塩酸塩およびパントテン酸カルシウムのようなビタミン
を加え、発酵前にｐＨ値を６．０〜７．０に調整し、製
造過程は連続サンプリングでモニターする特許請求の範
囲第３項記載の方法 - （５）特許請求の範囲第３項記載の方法で得られたエピ
デルミン - （６）エピデルミン抵抗性の新規なエピデルミン産生株
、スタフイロコツカス・エピデルミデイス（ｓｔａｐｈ
ｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）ＤＳＭ
３０９５（７）以下の特徴： （ｉ）グラム染色；陽性 （ｉｉ）細胞サイズ；直径０．５〜０．８μｍ（ｉｉｉ
）コロニーのサイズ：直径約１ｍｍ（ｉｖ）コロニーの
外観：平坦、光沢あり、中央がわずかに盛り上る （ｖ）コロニーの色：灰色がかつた白色 （ｖｉ）培養中の細胞：通常、単独または２個の群をな
す。大きなクランプをなすことは稀 （ｖｉｉ）溶血：血液スライド上に培養液を広げると強
い溶血を示す （ｖｉｉｉ）無気的生育：無気的条件下にもこの株は生
育する （ｉｘ）ライソゾーム感受性：２ｍｇ／ｍｌまではライ
ソゾームに対し細胞は抵抗する （ｘ）ライソスタフイン感受性：２０μｇ／ｍｌでもラ
イソスタフインに対し細胞は感受性を示す（ｘｉ）エピ
デルミン抵抗性：１ｍｇ／ｍｌまで認められる （ｘｉｉ）その他の抵抗性：液体培養においてこの株は
ストレプトマイシン（１ｍｇ／ｍｌまで）、スペクチノ
マイシン（０．５ｍｇ／ｍｌまで）に対し著しい抵抗性
を示す （ｘｉｉｉ）食塩含量の増大：食塩含量１５重量％まで
はなお良好な生育を示す （ｘｉｖ）コロニーまたは塗布した培養液を粘着性を示
す を有するスタフイロコツカス・エピデルミデイス（Ｓｔ
ａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）
ＤＳＭ ３０９５（８）特許請求の範囲第１項および第
２項のいずれかに記載のエピデルミンを、慣用の担体お
よび／または賦形剤とともに含有する抗菌性医薬組成物
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