SU578335A1 - Способ получени лейцил-глицил-глицин-аминопептидазы - Google Patents

Description

1

Изобретение относитс  к области технической микробиологии и может быть иснользовано дл  получени  ферментных препаратов, в частности пептидаз из микробиологического сырь .

Известен способ пол}чени  лейцил-глицилглицин-аминопептидазы , предусматриваюндий осаждение белков из ферментного сырь , полученного из грибов рода Aspergillus, обессоливание белковой фракции, фракционирование белков кол-оночной хроматографией на сефадексе, диализ пептидазной фракции с выделением целевого продукта и его лиофилизацию в фосфатном буфере.

Однако используемые в известном способе в качестве ферментного сырь  штаммы Aspergillus oryzae и aspergillus paraziticus продуцируют токсины, от которых не удаетс  освободитьс  на последующих этапах очистки.

Цель изобретени  - получение фермента, свободного от токсичных примесей, и повышение его стабильности.

Дл  этого осаждение белков из ферментного сырь , полученного из грибов рода Aspeigillus , провод т в присутствии ионов кобальта , перед диализом осуществл ют инактивацию протеиназы, а лиофилизацию провод т при рН 7,8-8,0. При этом протеиназу инактивируют нагревом в течение 10-15 мин до 62°С с последующим охлаждением до 20°С.

Сущность предлагаемого способа заключаетс  в обработке ферментного сырь  из щтамма Aspergilius, осаждении белков сульфатом аммони , обессоливании белкового осадка, фракционировании белков колоночной хроматографией на сефадексе, диализе пептидазной фракции с выделением целевого продукта и его лиофилизации в фосфатном буфере. Концентрированный препарат поверхностной

культуры Aspergillus flavus раствор ют в воде с добавлением 0,001-0,0001 М раствора хлористого кобальта, осаждают низкомолекул рные белковые примеси этанолом. В полученной после дробного осаждени  и центрифугировани  ферментной фракции инактивирзют протеиназу нагревом в течение 10- 15 мин, обеспечива  перепад температур от 62 до 20°С, а очищенную лейцил-глицил-глицин-аминопеитидазу лиофилизуют из кобальтсодержащего раствора при рН 7,8-8,0.

При.мер. 100 г концентрированного препарата поверхностной культуры Aspergillus flavus - флавизина, полученного Украинским научно-исследовательским институтом

пищевой пpOJMЫщлeннocти, обрабатывают семикратным объемом воды, содерйсащей ионы Со+2, в течение 2 час дл  извлечени  низкомолекул рных веществ и других примесей. Смесь центрифугируют в течение 40 мин при

3000 об/мин. Полученный раствор, содержащий пигменты, примеси углеводородов, протеазы и пептидазы, охлаждают до 2°С и прибавл ют этиловый спирт до конечной концентрации 50% при температуре - 8°С. Выдерживают систему в течение 20 мин, а затем центрифугируют на холоде.

Полученный белковый осадок, содержащий протеазы и нептидаэы с примесью углеводов и пигмента, раствор ют в двойном количестве по отношению к исходной навеске флавизина дистиллированной воды, содержащей ионы . Нерастворившуюс  часть удал ют центрифугированием.

К надосадочной жидкости, содержащей протеазы и пептидазы, прибавл ют сухой сульфат аммони  до 40% от полного насыщени  и выдерживают в течение 15-18 час при комнатной температуре. Белок, вынавщий в осадок, отдел ют центрифугированием, а в полученном растворе провод т повторное насыщение сульфатом аммони  до 80% от полного насыщени . Через 6-8 час смесь центрифугируют, а осадок, содержащий протеины и нептидазы, раствор ют в половинном объеме дистиллированной воды, содержащей ионы Со+2. От сульфата аммони  освобождаютс  диализом против 0,0067 М фосфатного буфера при рН 7,8-8,0.

Дл  инактивации нротешшзы полученный диализат подогревают до 62°С в течение 10 мин и сразу же охлаждают на вод ной бане до 20°С. Денатурированный белок, содержащий пептидазы, удал ют центрифугированием , а пептидазную фракцию очищают на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой при линейном градиенте 0,1-0,7 М NaCl в 0,02 М фосфатном буфере при рН 7,8-8,0.

Активную фракцию, полученную после обессоливаии  диализом, хроматографируют на сефадексе Г-100 в фосфатном буфере и лиофилизуют из кобальтсодержащего раствора при рН 7,8-8,0.

Расчет активности ЛГГ-аминопептидазы провод т по формуле:

Активность лейцил-глицил-глицин-аминоцептидазы

а-1000.103.100

;: Д-

b-c-t-x%

где а - количество очищенной аминокислоты (в перерасчете но оптической плотности), 7;

1000 - перевод j в мг; Ю -перерасчет до целого числа; b - молекул рный вес расщепленного пептида;

с - навеска фермента, 7; t - врем  инкубации, мин;

100,,,

- -перерасчет на 1 мг чистого белка;

Х96

х% содержание чистого белка в препарате .

Способ позвол ет получить высокоочищенный препарат лейцил-глицил-глицин-аминопептидазы , гомогенный при электрофорезе в

полиакриламидном геле, а также при исследовании его методом экзимэлектрофореза.

Предлагаемый способ позвол ет получить препарат ЛГГ-аминопептидазы с активностью , составл ющей 24% по сравнению с

активностью концентрированной поверхностной культуры Aspergillus flavus, со степенью очистки в 237 раз и свободный от токсических примесей. Полученный лиофилизированный ферментиый препарат полностью сохран ет исходную активность в течение года при хранении его при 4°С.

Claims (2)

1.Способ получени  лейцил-глицил-глицин-а .минопептидазы, предусматривающий осаждение белков из ферментного сырь , полученного из грибов рода Aspergillus, обессолнвание белковой фракции, фракционирование белков колоночной хроматографией на сефадексе, диализ пептидазной фракции с выделением целевого продукта и его лиофилизацию в фосфатном буфере, отличающийс  тем, что, с целью получени  фермента , свободного от токсичных примесей, и повышени  стабильности фермента, осаждение белков из ферментного сырь , полученного из грибов рода Aspergillus, провод т в присутствии ионов кобальта, перед диализом осуществл ют инактивацию протеиназы, а лиофилизацию провод т при рН 7,8-8,0.

2.Способ по п. 1, отличающийс  тем, что протеиназу инактивируют нагревом в течение 10-15 мин до 62°С с последующим охлаждением до 20°С.