CN103059108A - 一种枯草菌脂肽钠的纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物发酵领域，公开了一种枯草菌脂肽钠的纯化方法。本发明所述枯草菌脂肽钠的纯化方法为取枯草菌脂肽发酵液离心收集上清液，经膜过滤后收集截留液；缓慢加入碱溶液进行中和反应，反应液干燥后获得枯草菌肽钠成品。纯化后制得枯草菌脂肽钠成品纯度达到75%-80%。为了进一步提高枯草菌肽钠成品纯度，本发明所述纯化方法在膜过滤后采用离心去除枯草菌脂肽中混有的蛋白质等杂质，纯度达到80-85%，进一步，用酸调节离心上清液pH值，使枯草菌脂肽沉降下来，成品纯度达到85%-88%。本发明所述枯草菌脂肽钠的纯化方法制得枯草菌脂肽钠成品纯度可达75%-88%，可以作为化妆品添加剂广泛应用于化妆品领域。

Description

一种枯草菌脂肽钠的纯化方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵领域，具体的说是涉及一种枯草菌脂肽钠的纯化方法。

背景技术

表面活性剂(Surfactants)是指能显著降低溶剂表面张力和液-液界面张力，并具有一定结构、亲水亲油特性和特殊吸附性能的物质，包括化学表面活性剂和生物表面活性剂。化学表面活性剂大都是以石油为原料化学合成而来，在生产和使用过程中常常会带来严重的环境污染问题。生物表面活性剂(Biosurfactants)是由微生物所产生的一类具有表面活性的生物大分子物质，除了具有降低表面张力、稳定乳化液和增加泡沫等相同作用外，还具有一般化学合成表面活性剂所不具备的特性，如具有结构多样性，较低的毒性，较高的生物可降解性，良好的生物相容性，高的起泡性，对极端的温度、pH值和盐浓度有较高的选择性和专一性，可以由低廉的可再生原料生产得到等特点，因此在环保、石油开采、医药、食品加工等领域具有较大的应用研究价值。

枯草菌脂肽钠是枯草菌脂肽的钠盐，枯草菌脂肽译为Surfactin，是一种由枯草芽孢杆菌合成的环肽，多以钠盐形式应用。自1968年被Arima等人首次发现以来，Surfactin一直是表面活性最强、研究较多的生物表面活性剂之一，被广泛应用在食品工业、环境工业作为良好的生物相容性表面活性剂。除了具有较强的表面活性外，Surfactin还能增加憎水烃类的可生物降解性，在受烃类污染土壤和海洋的生物修复中发挥重要作用，它还能与部分重金属结合而移除受污染土壤和沉积物中的重金属，并具有一定的抗菌活性等。因此在环保、石油开采、高端化妆品、医药、食品加工等领域具有较大的应用研究价值。

Surfactin生产成本较高，是化学生物表面活性剂的3~10倍，其中产物的提取和下游的处理费用占生产费用的绝大部分，尤其是在预处理枯草菌脂肽钠发酵液时由于产品和菌体的特殊性导致发酵液粘度大，菌液分离成本高昂。因此，开发简单廉价的产物分离和提纯方法十分必要。

2000年，Randhir等提出通过泡沫回收分离Surfactin。2007年Huei-Li Chen等利用酸沉淀和PVDF树脂吸附对Surfactin进行提纯操作。2007年贡国鸿等人用高速离心机离心去除菌体，上清液酸化得Surfactin粗提物后进行溶剂抽提。2008年Huei-Li Chen等又利用硫酸铵对Surfactin进行混合盐析，再通过超滤和纳滤收集Surfactin。2008年Mohd Hafez Mohd Isa等利用超滤膜过滤收集Surfactin。但以上工艺均为实验室手段，若进行工业化生产则成本较高。因此开发一种适合于工业化生产的简单廉价的枯草菌脂肽钠纯化方法具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明目的是针对现有技术均为实验室手段，生产成本高的缺陷，提供一种简单廉价，适合于工业化生产的枯草菌脂肽钠的纯化方法。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种枯草菌脂肽钠的纯化方法，包括：

步骤1：取枯草菌脂肽发酵液离心收集上清液，经膜过滤后收集截留液；

步骤2：缓慢加入碱溶液进行中和反应，反应液干燥后获得枯草菌肽钠成品。

进一步的，本发明所述纯化方法步骤1还包括在离心前对枯草菌脂肽发酵液进行预处理的步骤，所述预处理为将枯草菌脂肽发酵液稀释1-10倍，调pH值调至6.5-8.5。

作为优选，步骤1所述枯草菌脂肽钠发酵液离心的分离因数为5000-17000g。

作为优选，步骤1所述膜过滤的膜为陶瓷膜。

作为优选，步骤1所述膜过滤的膜温度为10-50℃。

作为优选，步骤2所述中和反应的温度为20-55℃。

作为优选，步骤2所述碱溶液为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠中的一种或几种的混合物。

作为优选，步骤1还包括离心除杂的步骤，所述离心除杂为取膜过滤所得截留液调pH至5.0-6.6，离心收集上清液。

作为优选，步骤1还包括酸化沉淀步骤，所述酸化沉淀为取离心除杂所得上清液加入酸溶液至pH值2.0-5.0，收集沉淀。

作为优选，所述酸化沉淀步骤中所述酸溶液为甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、盐酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、草酸、柠檬酸、延胡索酸、山梨酸中的一种或几种的混合物。

本发明所述枯草菌脂肽钠的纯化方法，首先利用离心去除枯草菌脂肽发酵液中的菌体，然后利用一定孔径的膜对离心所得上清液进行过滤处理，最后将膜截留液加入碱溶液进行中和反应，干燥获得枯草菌肽钠成品。高效液相色谱法检测纯化后制得枯草菌脂肽钠成品纯度达到75%-80%。为了进一步提高枯草菌肽钠成品纯度本发明所述枯草菌脂肽钠的纯化方法在膜过滤后采用离心去除枯草菌脂肽中混有的蛋白质等杂质，纯度达到80-85%，进一步，用酸调节离心上清液pH值至枯草菌脂肽等电点，使枯草菌脂肽沉降下来，使制得的枯草菌脂肽钠成品纯度达到85%-88%。本发明所述枯草菌脂肽钠的纯化方法制得枯草菌脂肽钠成品纯度可达75%-88%，可以作为化妆品添加剂广泛应用于化妆品领域。

具体实施方式

本发明实施例公开了一种枯草菌脂肽钠的纯化方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种枯草菌脂肽钠的纯化方法，包括：

步骤1：取枯草菌脂肽发酵液离心收集上清液，经膜过滤后收集截留液；

步骤2：缓慢加入碱溶液进行中和反应，反应液干燥后获得枯草菌肽钠成品。

目前枯草菌脂肽多采用发酵的方法制备得到，由于发酵液成分复杂，存在大量菌体，而菌体自溶会导致杂质增多，因此本发明所述纯化方法首先利用离心去除发酵液中的菌体，为提取和精制等后续工序创造有利条件。

枯草菌脂肽的等电点为2-5，在发酵液pH值接近枯草菌脂肽等电点时，部分枯草菌脂肽会沉淀析出从而与菌体混合，当离心去除菌体时，析出的枯草菌脂肽与菌体混合在一起被离心除掉，造成枯草菌脂肽的损失，降低枯草菌脂肽的收率。因此为了避免枯草菌脂肽会沉淀析出，保证枯草菌脂肽的收率，本发明所述纯化方法步骤1还包括在离心前对枯草菌脂肽发酵液进行预处理的步骤，所述预处理为将枯草菌脂肽发酵液稀释1-10倍，调pH值调至6.5-8.5。

离心就是利用离心机转子高速旋转产生的强大的离心力，加快液体中颗粒的沉降速度，把样品中不同沉降系数和浮力密度的物质分离开。衡量离心机分离性能的重要指标是分离因数，它表示被分离物料在转鼓内所受的离心力与其重力的比值，分离因数越大，通常分离也越迅速，分离效果越好。为了达到更好的去除菌体的效果，本发明所述纯化方法步骤1所述枯草菌脂肽钠发酵液离心的分离因数为5000g-17000g。

离心机的种类繁多，作为优选，本发明所述离心机为卧式离心机、三足式离心机、袋式离心机、管式离心机、碟式离心机中的一种。

本发明所述纯化方法在离心去除菌体后，利用分子易于聚合的特性，借助一定孔径的膜对离心所得上清液进行过滤处理。

膜过滤是一种与膜孔径大小相关的筛分过程，以膜两侧的压力差为驱动力，以膜为过滤介质，在一定的压力下，当原液流过膜表面时，膜表面密布的许多细小的微孔只允许水及小分子物质通过而成为透过液，而原液中体积大于膜表面微孔径的物质则被截留在膜的进液侧，成为截留液，因而实现对原液的分离纯化的目的。

膜孔径的选择对膜过滤的分离纯化效果具有重要影响。为了达到去除枯草菌脂肽中的小分子杂质及色素的目的，本发明所述纯化方法步骤1所述膜过滤的膜为陶瓷膜。

进一步的，本发明所述陶瓷复合膜的孔径优选为10nm-800nm。更优选为20nm-100nm

陶瓷膜性能的发挥与温度高低有直接的关系，因此，为了膜过滤的效果，本发明所述纯化方法步骤1所述膜过滤的膜温度优选为10-50℃。

本发明所述纯化方法步骤2将膜截留液加入碱溶液进行中和反应，制得枯草菌肽钠，干燥可获得枯草菌肽钠成品。其中所述中和反应是指加入碱溶液反应至中性，即反应至pH6.5-8.5。

其中，作为优选，所述中和反应的温度为20-55℃。

作为优选，步骤2所述碱溶液为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠中的一种或几种的混合物。

干燥泛指从湿物料中除去水分或其他湿分的各种操作。如在日常生活中将潮湿物料置于阳光下曝晒以除去水分，工业上用硅胶、石灰、浓硫酸等除去空气、工业气体或有机液体中的水分。在化工生产中，干燥通常指用热空气、烟道气以及红外线等加热湿固体物料，使其中所含的水分或溶剂汽化而除去，是一种属于热质传递过程的单元操作。干燥的目的是使物料便于贮存、运输和使用，或满足进一步加工的需要。根据热量的供应方式，有多种干燥类型：①对流干燥：使热空气或烟道气与湿物料直接接触，依靠对流传热向物料供热，水汽则由气流带走。对流干燥在生产中应用最广，它包括气流干燥、喷雾干燥、流化干燥、回转圆筒干燥和厢式干燥等；②传导干燥：湿物料与加热壁面直接接触，热量靠热传导由壁面传给湿物料，水汽靠抽气装置排出。它包括滚筒干燥、冷冻干燥、真空耙式干燥等；③辐射干燥：热量以辐射传热方式投射到湿物料表面，被吸收后转化为热能，水汽靠抽气装置排出，如红外线干燥；④介电加热干燥：将湿物料置于高频电场内，依靠电能加热而使水分汽化，包括高频干燥、微波干燥。

其中，作为优选，本发明所述纯化方法步骤2所述干燥为喷雾干燥。

本发明采用高效液相色谱法检测本发明所述经离心去除菌体、膜过滤处理、中和成盐的步骤纯化获得的枯草菌肽钠成品，纯度可达75%-80%。

发酵制备枯草菌脂肽的发酵液成分复杂，除了存在大量菌体外，还含有未被微生物完全利用的蛋白质等。为了进一步提高枯草菌肽钠成品纯度，本发明所述纯化方法步骤1还包括离心除杂的步骤，以去除枯草菌脂肽中混有的蛋白质等杂质。

作为优选，所述离心除杂为取膜过滤所得截留液调pH至5.0-6.6，离心收集上清液。利用目标产品枯草菌脂肽与蛋白质等杂质等电点不同，蛋白质等杂质在溶液pH达到其等电点时会发生自然沉降的原理，将膜截留液pH调至5.0-6.6，将目标产品枯草菌脂肽与蛋白质等杂质分离，离心除去蛋白质等杂质。

其中，所述膜截留液pH优选为4.0-6.5。

为了达到更好的去除蛋白质等杂质的效果，减轻后续精制工序的压力，本发明所述纯化方法步骤1所述离心除杂步骤中所述离心的分离因数优选为5000g-17000g。

本发明采用高效液相色谱法检测本发明所述经离心去除菌体、膜过滤处理、离心除杂、中和成盐的步骤纯化获得的枯草菌肽钠成品，纯度可达80-85%。

进一步的，本发明所述纯化方法步骤1还包括酸化沉淀步骤。利用等电点沉淀法，用酸调节离心上清液pH值至枯草菌脂肽等电点，使枯草菌脂肽沉降下来。

作为优选，所述酸化沉淀为取离心除杂所得上清液加入酸溶液至pH值2.0-5.0，收集沉淀。更优选为3.0-4.0。

其中，所述酸化沉淀步骤中所述酸溶液为甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、盐酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、草酸、柠檬酸、延胡索酸、山梨酸中的一种或几种的混合物。

进一步的，所述酸化沉淀还包括水洗沉淀步骤，以更好的除去沉降下来的枯草菌脂肽中混有的杂质。

本发明采用高效液相色谱法检测本发明所述经离心去除菌体、膜过滤处理、离心除杂、酸化沉淀、中和成盐的步骤纯化获得的枯草菌肽钠成品，纯度可达85-88%。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种枯草菌脂肽钠的纯化方法进行详细说明。

其中高效液相色谱测定枯草菌脂肽钠成品纯度的方法如下：

色谱条件：色谱柱：5μm C18柱，200×4.6mm；流动相：80%乙腈+20%3.8mM三氟乙酸（TFA），经0.22μm有机滤膜过滤，超声波脱气20min；流速：1.0mL/min；柱温：27℃；进样量：20μL；紫外检测波长：205nm。

样品处理：准确称取枯草菌脂肽钠标准品10mg，用5mL流动相配制成2mg/mL的标准液母液，吸取1mL母液用二倍梯度法稀释为1mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL、0.125mg/mL的标准液，于冰箱冷冻保存备用。

准确称取50.0mg(精确至0.0001g)制得枯草菌脂肽钠待测样品至50mL容量瓶中，加入流动相配制成1mg/mL样品溶液，超声提取20分钟，静置30分钟，经0.22μm有机微孔滤膜过滤后，收集滤液待液相检测。

测定：将枯草菌脂肽钠标准液按照浓度由低到高进样，检测结果经岛津LC Solution工作站处理得出标准曲线，详细处理操作见《高效液相色谱法操作规程》。在上述色谱条件下，根据保留时间定性，外标峰面积定量。根据标准品高效液相色谱图6-30分钟之间的峰面积之和为枯草菌脂肽钠的峰面积。

待测样品中枯草菌脂肽钠响应值应在标准曲线线性范围内，超出浓度线性范围则应稀释后再进样分析。

结果计算：分析结果经岛津LC Solution工作站处理得出待测样品纯度，工作站积分处理操作见《高效液相色谱法操作规程》。

实施例1：本发明所述枯草菌脂肽钠的纯化

取枯草菌脂肽发酵液5000g离心20min，收集离心所得上清液，经50nm、膜温为10℃的陶瓷复合膜过滤，收集膜过滤截留液，在20℃加入氢氧化钠溶液进行中和反应，反应液经喷雾干燥后即得枯草菌脂肽钠成品。高效液相色谱法测定制得的枯草菌脂肽钠成品纯度为76%。

实施例2：本发明所述枯草菌脂肽钠的纯化

取枯草菌脂肽发酵液17000g离心10min，收集离心所得上清液，经20nm、膜温为50℃的陶瓷复合膜过滤，收集膜过滤截留液，在50℃加入氢氧化钾溶液进行中和反应，反应液经喷雾干燥后即得枯草菌脂肽钠成品。高效液相色谱法测定制得的枯草菌脂肽钠成品纯度为78%。

实施例3：本发明所述枯草菌脂肽钠的纯化

取枯草菌脂肽发酵液稀释10倍，调pH值调至7.0-8.5，10000g离心10min，收集离心所得上清液，经50nm、膜温为20℃的陶瓷复合膜过滤，收集膜过滤截留液，在30℃加入碳酸氢钠溶液进行中和反应，反应液经喷雾干燥后即得枯草菌脂肽钠成品。高效液相色谱法测定制得的枯草菌脂肽钠成品纯度为79%。

实施例4：本发明所述枯草菌脂肽钠的纯化

取枯草菌脂肽发酵液稀释5倍，调pH值调至6.5-7.5，12000g离心15min，收集离心所得上清液，经50nm、膜温为30℃的陶瓷复合膜过滤，收集膜过滤截留液，在40℃加入氢氧化钠溶液进行中和反应，反应液经喷雾干燥后即得枯草菌脂肽钠成品。高效液相色谱法测定制得的枯草菌脂肽钠成品纯度为80%。

实施例5：本发明所述枯草菌脂肽钠的纯化

取枯草菌脂肽发酵液稀释6倍，调pH值调至6.5-7.0，8000g离心20min，收集离心所得上清液，经50nm、膜温为50℃的陶瓷复合膜过滤，收集膜过滤截留液，调pH至5.0-6.5，10000g离心10min，收集上清液在20℃加入氢氧化钾溶液进行中和反应，反应液经喷雾干燥后即得枯草菌脂肽钠成品。高效液相色谱法测定制得的枯草菌脂肽钠成品纯度为82%。

实施例6：本发明所述枯草菌脂肽钠的纯化

取枯草菌脂肽发酵液稀释10倍，调pH值调至7.0-8.0，5000g离心30min，收集离心所得上清液，经20nm、膜温为40℃的陶瓷复合膜过滤，收集膜过滤截留液，调pH至5.0-6.0，10000g离心10min，收集上清液，在50℃加入碳酸氢钠溶液进行中和反应，反应液经喷雾干燥后即得枯草菌脂肽钠成品。高效液相色谱法测定制得的枯草菌脂肽钠成品纯度为85%。

实施例7：本发明所述枯草菌脂肽钠的纯化

取枯草菌脂肽发酵液稀释10倍，调pH值调至7.0-7.5，5000g离心30min，收集离心所得上清液，经20nm、膜温为30℃的陶瓷复合膜过滤，收集膜过滤截留液，调pH至5.0-6.0，10000g离心10min，收集上清液，加入盐酸至pH值3.0-4.0，收集沉淀，在20℃加入氢氧化钠溶液进行中和反应，反应液经喷雾干燥后即得枯草菌脂肽钠成品。高效液相色谱法测定制得的枯草菌脂肽钠成品纯度为88%。

实施例8：本发明所述枯草菌脂肽钠的纯化

取枯草菌脂肽发酵液稀释5倍，调pH值调至6.5-7.5，12000g离心10min，收集离心所得上清液，经50nm、膜温为20℃的陶瓷复合膜过滤，收集膜过滤截留液，调pH至5.0-6.0，10000g离心10min，收集上清液，加入甲酸至pH值3.0-5.0，收集沉淀，在25℃加入氢氧化钾溶液进行中和反应，反应液经喷雾干燥后即得枯草菌脂肽钠成品。高效液相色谱法测定制得的枯草菌脂肽钠成品纯度为86%。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种枯草菌脂肽钠的纯化方法，其特征在于，包括：

步骤1：取枯草菌脂肽发酵液离心收集上清液，经膜过滤后收集截留液；

步骤2：缓慢加入碱溶液进行中和反应，反应液干燥后获得枯草菌肽钠成品。

2.根据权利要求1所述纯化方法，其特征在于，步骤1还包括在离心前对枯草菌脂肽发酵液进行预处理的步骤，所述预处理为将枯草菌脂肽发酵液稀释1-10倍，调pH值调至6.0-8.5。

3.根据权利要求1或2所述纯化方法，其特征在于，步骤1所述枯草菌脂肽钠发酵液离心的分离因数为5000-17000g。

4.根据权利要求1或2所述纯化方法，其特征在于，步骤1所述膜过滤的膜为陶瓷膜。

5.根据权利要求1或2所述纯化方法，其特征在于，步骤1所述膜过滤的膜温度为10-50℃。

6.根据权利要求1或2所述纯化方法，其特征在于，步骤2所述中和反应的温度为20-55℃。

7.根据权利要求1或2所述纯化方法，其特征在于，步骤2所述碱溶液为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠中的一种或几种的混合物。

8.根据权利要求1或2所述纯化方法，其特征在于，步骤1还包括离心除杂的步骤，所述离心除杂为取膜过滤所得截留液调pH至5.0-6.6，离心收集上清液。

9.根据权利要求8所述纯化方法，其特征在于，步骤1还包括酸化沉淀步骤，所述酸化沉淀为取离心除杂所得上清液加入酸溶液至pH值2.0-5.0，收集沉淀。

10.根据权利要求9所述纯化方法，其特征在于，所述酸化沉淀步骤中所述酸溶液为甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、盐酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、草酸、柠檬酸、延胡索酸、山梨酸中的一种或几种的混合物。