NO141854B - Fremgangsmaate for fremstilling av 6-aminopenicillansyre ved enzymatisk spaltning av penicillin - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for frem-

stilling av 6-aminopenicillansyre ved enzymatisk spaltning av penicillin, og det særegne ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er at penicilliner med formel

hvori R står for fenoksymetyl, p-kresoksymetyl eller n-butoksy-

metyl, eller deres salter, spaltes ved hjelp av levende kul-

turer eller enzympreparater av mikroorganismen Bovista plumbea NRRL 3501 eller NRRL 3824.

Det er tidligere kjent å spalte penicilliner for utvinning

av 6-aminopenicillansyre på enzymatisk måte under anvendelse av penicillinamidase. I henhold til det østerrikske patent-

skrift nr. 231.610 kan mikroorganismer fra klassen schizomy-

ceter (arter av ordenen Actinomycetales), phycomyceter og ascomyceter fremstille penicillinamidase. Det tyske patent-

skrift nr. 1.111.778 omhandler nærmere bestemte bakteriearters penicillinamidaseproduksjon. Fra det østerrikske patentskrift nr. 233.738 er det endelig kjent at også en stamme fra klassen basidiomyceter, nemlig Pleurotus ostreatus hørende til ordenen Hymenomycetales, familien Polyporaceae, produserer penicillinamidase .

Den erkjennelse som ligger til grunn for den foreliggende oppfinnelse er at en ytterligere stamme fra klassen basidiomy-

ceter og en variant henholdsvis mutant derav produserer penicillinamidase i stor målestokk.

En kultur av denne organisme ble deponert ved Fermentations Division of the Northern Regional Research Laboratories, Preoria, Illinois, under nr. NRRL 3501. Under nummer NRRL 3824 ble også deponert en variant henholdsvis mutant av denne mikroorganisme.

Det ovennevnte resultat er særlig overraskende da forsøk

med flere hundre stammer av basidiomyceter forløp negativt og mikroorganismen Bovista plumbea som tilhører familien Lycoperdaceae, ordenen Castromycetales, systematisk henføres til et helt annet sted enn den fra det østerrikske patentskrift nr. 233.738 hittil eneste kjente penicillinamidase-produserende basidiomycet.

Mikroorganismen Bovista plumbea eller dens variant henholdsvis mutant kan ved den foreliggende fremgangsmåte anvendes som levende submers-kultur. Man kan imidlertid også anvende derfra fremstilte enzympreparater, f.eks. suspensjoner av drepte celler, mycel-tørrpulver, autolysater, ekstrakter, eller spesielt stabiliserte enzym- henholdsvis mycelpreparater av denne mikroorganisme for å omvandle penicilliner til 6-aminopenicillansyre. Da videre penicillinamidase utskilles i dyrkingsmediet under gjæringen er det endelig også mulig å spalte penicillin i dyrkingsløsningen, dvs. i dyrkingsfiltratet.

Fremgangsmåten gjennomføres f.eks. ved at Bovista plumbea dyrkes saprofytisk i en næringsløsning som inneholder assimi-lerbare karbon- og nitrogenkilder såvel som sporelementer som sikrer veksten og den optimale enzymdannelse. Alt etter størrelsen av det anvendte gjæringskar innsjaltes et eller flere vegetative fortrinn. Etter en bestemt forgjæringstid, vanlig etter avslutning av vekstfasen, tilsettes det penicillin som skal spaltes, idet man gjærer videre så lenge til en tilstrekkelig stor andel av substratet foreligger i form av 6-aminopenicillansyrc.

Man kan også gå frem på den måte at gjæringsprosessen av-brytes på det tidspunkt hvor mikroorganismen har nådd den høyeste enzymkonsentrasjon, soppmycelet,henholdsvis cellene i dyrkingsløsningen fraskilles og etter fornyet oppslemming av resten i en næringsfri løsning, f.eks. i vann, fysiologisk, koksaltløsning eller pufferløsning bringes de i intim kontakt med det substrat som skal spaltes. Dette skjer best ved rysting eller omrøring, idet spaltingsvirkningen for enzym-komplekset muliggjøres under aerobe betingelser. Konsentrasjonen av det anvendte penicillin, som også kan tilsettes kontinuerlig eller porsjonsvis under spaltingsprosessen, velges i avhengighet av aktiviteten for enzymet, fortrinns-vis slik at innvirkningsvarigheten bare utgjør noen timer, eller høyst to døgn. Ved full utnyttelse av enzymytelsen holdes på denne måte egenødeleggelsen av det anvendte penicillin og den dannede 6-aminopenicillansyre så lav som mulig. Den ved spaltingen i mediet foreliggende pH-verdi kan ligge

i det svakt sure til svakt alkaliske område. Temperaturen ligger i det for spalting av penicilliner vanlige område.

Det samme gjelder for valget av enzym- og substratkonsentra-sjoner, som er medbestemmende for spaltingsvarigheten.

Den ved hjelp av vanlige enzymatiske spaltemetoder fremstilte 6-aminopenicillansyre inneholder dog alltid forurensninger som blant annet består av penicilloylerte eggehvite-stoffer og som i mennesker og dyr kan fremkalle allergiske reaksjoner.

En foretrukket metode for spalting av penicilliner ved hjelp av Bovista plumbea består derfor i at det anvendes stabiliserte enzympreparater av Bovista plumbea.

Etter en første fremgangsmåtevariant overtrekkes penicillinamidaseholdig mycel av Bovista plumbea med en permeabel membran, f.eks. en polyakrylfilm. Derved erholdes et på

sin naturlige bærer stabilisert enzym som gjentatte ganger kan anvendes for spalting. Spaltingen skjer fordelaktig i en med belagt Bovista plumbea-mycel fylt kolonne som kontinuerlig tilføres penicillin-løsning. Spaltningstemperatur og substratkonsentrasjon tilsvarer dem som anvendes for en spalting i dyrkingsblandingen.

En ytterligere fremgangsmåte-variant består deri at penicillin-amidasen skilles fra sin naturlige bærer. For dette ekstra-heres enzymet fra Bovista plumbea-mycelet og bindes til en inert bærer som f.eks. kalsiumkarbonet, kiselgur, sjøsand,

etc. Enzym og bærer blandes for dette med hverandre, formes til et granulat og dette omgis med en permeabel membran, f.eks. en polyakrylfilm, for å beskytte enzymet. Spaltingen skjer med fordel i en med det således stabiliserte enzym fylt kolonne som kontinuerlig tilføres penicillinløsning.

Det etter de to fremgangsmåtetyper stabiliserte enzym kan naturligvis også anvendes for spalting etter en porsjonsvis metode, f.eks. i et gjæringskar.

Som bærermaterial så vel som for overtrekking kan det selv-følgelig også anvendes andre vanlige midler.

En særlig fordel ved spaltemetoden ved hjelp av stabiliserte enzympreparater er den meget ringe forurensning av den således fremstilte 6-aminopenicillansyre som derfor er fremragende egnet for fremstilling av halvsyntetiske penicilliner. En videre fordel vises derved at man i den ved ekstraksjon fra uspaltet restpenicillin og fra den ved spaltingen av substratet dannede spaltingsløsning direkte kan acylere den fra sidekjeden befridde 6-aminopenicillansyren til nye penicilliner, slik at en isolering og de dermed forbundne tap bortfaller.

Den ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen fremstilte 6-aminopenicillansyre utgjør et verdifullt utgangsprodukt og anvendes med særlig fordel for fremstilling av halvsyntetiske penicilliner.

Særlige utførelsesformer for fremgangsmåten er nærmere illu-strert i de følgende eksempler:

EKSEMPEL 1

Mycelet fra en i 14 dogn ved 24°c dyrket stamkultur av Bovista plumbea (NRRL 3501) (næringssubstrat: Sabouraud-dextrose-agar fylt i 16 x 160 mm prøverør, 5 ml i hvert rør, og hensatt for stivning i skråstilling) overhelles 5 ml av den i det følgende anførte næringsløsning, rives opp'i et sterilt prøverør ved hjelp av en glass-stav og overføres i 20 ml av den i det følgende angitte sterile næringsløsning som er fylt i en smalhalset 100 ml Erlenmeyerkolbe.

Næringsløsning:

Etter påfylling av næringsløsningen tilsettes 0,6 % spermolje. Næringsløsningen steriliseres i 40 minutter ved 120°C i dampautoklav og rystes etter poding på et rotasjons-rysteverk med 40 ml slag og 200 omdreininger pr. minutt i 96 timer ved 24°C. Mycelet fra dette første submerstrinn er kuleformet og hele kulturen rives opp i et tilsvarende større glassrør ved hjelp av et godt innpasset glass-stempel under sterile betingelser til grøtaktig konsistens. 10 ml av denne findelte kultur anvendes for poding av det annet submerstrinn (500 ml vidhalset-Erlenmeyerkolbe fylt med 100 ml av den ovenfor beskrevne næringsløsning). Det rystes på et rotasjons-rysteverk med 40 ml slag og 260 omdreininger pr. minutt i 96 timer ved 24°C og kulturen homogeniseres så ved hjelp av en passende neddykkingsmikser under sterile betingelser ved 4000-4500 omdreininger pr. minutt i 30 sekunder. For dette formål innføres det i dampautoklav i 30 minutter ved 120°C steriliserte dispergeringshode på blanderen i det under sterile betingelser åpnede og vannrett holdte dyrkningskar. 10 ml homogenisert produkt fra dette annet submerstrinn anvendes for poding av dyrkingskaret for det tredje submerstrinn (500 ml vidhalset Erlenmeyerkolbe fylt med 100 ml av den ovenfor beskrevne næringsløsning).. Det. rystes og homogeniseres under de samme betingelser som i det annet submerstrinn, nemlig i 96 timer ved 24°C.

For spalting av penicillinet anvendes 500 ml Erlenmeyerkolber som hver er fylt med 45 ml av den ovenfor angitte sterile næringsløsning, idet hver kolbe podes med 10 ss av blandingen fra det i det foregående beskrevne tredje submerstrinn.

Etter 96 timers rysting på et rotasjonsrysteverk med 40 ml

slag, 260 omdreininger pr. minutt og 24°C tilsettes 30 000 enheter kalium-fenoksymetyl-penicillin i fast form pr. ml kolbeinnhold. Med 3-6 timers intervall uttas enkeltvis små delmengder for å bestemme restpenicillin, henholdsvis mengden av dannet 6-aminopenicillansyre. Etter ekstraksjon av penicillinet bestemmes forholdet mellom konsentrasjonen av substrat og konsentrasjon av spaltingsprodukt jodometrisk. Etter 8 timer er 94 % av det tilførte penicillin spaltet og foreligger som 6-aminopenicillansyre.

EKSEMPEL 2

Med det etter eksempel 1 erholdte podematerial podes submerskar av rustfritt stål som er utrustet med en innretning for omrøring og lufting og er fylt med 5 liter av den i eksempel 1 beskrevne næringsløsning. Etter 96 timers gjæring fraskilles det fremstilte mycel fra dyrkingsløsningen, vaskes og suspenderes i 2 liter 0,15 molar fosfatpuffer med en pH-verdi på 7,5, hvoretter man i alt tilsetter 100 000 E kalium-fenoksymetylpenicillin pr. ml dyrkingsblanding. Under spaltingen holdes pH-verdien automatisk på den opprinnelige verdi og etter 27 timers røring og lufting er 90 % av det tilsatte penicillin spaltet.

EKSEMPEL 3

40 g penicillinamidaseholdig ved behandling med aceton tørket Bovista plumbea-mycel (NRRL 3501) tilsettes 30 ml polyakryl-drasjeringslakk ("Eudragit" retard-s) og forarbeides til en plastisk masse under avdamping av løsningsmidlet og langvarig knaing. Før fullstendig herding trykkes massen gjennom en nylonsikt med en lys-maskevidde på 750 mikrometer. Det erholdes et formstabilt mycel som har tilstrekkelig mekanisk styrke for en ensartet kolonnefylling. 35 g av dette belagte, formede mycel oppslemmes i 500 ml fosfatpuffer etter Sørensen (pH 7,5) og fylles i en glasskolonne (2,5 x 50 cm) som er forsynt med en tempereringskappe. Den fylte kolonne med en fyllhøyde på omtrent 33 cm og et volum på omtrent 162 ml vaskes ved romtemperatur med fosfatpuffer etter Sørensen (pH 7,5) med en volumhastighet på 0,5 i 4 til 5 timer. For spalting tilføres en løsning med omtrent 40 000 E kalium-fenoksymetylpenicillin pr. ml i fosfatpuffer (pH 7,5) som pr. liter inneholder 40 g Na2HP04 . 12 H2<3 og 2,5 g KH2P04 til den ved 28°C tempererte kolonne på kontinuerlig måte ved hjelp av en pumpe. Volumhastigheten utgjør 0,3 til 0,35. De ved kontinuerlig drift erholdte resultater er anført i den følgende tabell 1.

Den høye spalteytelse er ennå i behold etter 20 døgns kontinuerlig drift. Fra de nesten fargeløse spaltningsløsninger kan 6-aminopenicillansyren isoleres i ren form ved hjelp av vanlige metoder.

EKSEMPEL 4

2,5 ml av en høykonsentrert enzymekstrakt fra 23 g med aceton torket Bovista plumbea-mycel (NRRL 3501) blandes med 4,5 g "Filtercel" (kiselgel). Adsorbatet vaskes tre ganger med hver gang 50 ml kold aceton, torkes, tilsettes 9 ml poly-akryl-drasjeringslakk ("Eudragit" retard-s), forarbeides til en plastisk masse og trykkes gjennom en nylonsikt med en lys-maskevidde på 500 mikrometer. Det stivnede granulat oppslemmes i fosfatpuffer etter Sørensen (pH 7,5) og fylles i en glasskolonne (1,0 x 30 cm) forsynt med en tempereringskappe. Fyllhoyden utgjor 25 cm. Etter kort vasking med fosfatpuffer ved pH 7,5 innhelles en losning med ca. 20 000

E kalium-fenoksymetylpenicillin pr. ml i fosfatpuffer pH 7,5, som pr. liter inneholdt 40 g Na„HPO.-12 Ho0 og 2,5 g KHoP0j med en volumhastighet på 0,2. Samtidig tempereres kolonnen ved 28°C. Resultatene av spaltningsforsøket frem-går av følgende tabell 2.

Den erholdte spaltningsløsning er fargeløs og den derfra isolerte 6-aminopenicillansyre har et spaltningspunkt på 206-208°C (ukorr.) og har aktivitet 2740 E/mg (jod).

EKSEMPEL 5

Ved hjelp av den i eksempel 1 beskrevne fremgangsmåte frem-stilles fra en stamkultur av Bovista plumbea NRRL 3824, som er en variant henholdsvis en mutant av Bovista plumbea NRRL 3501, en liter submerskultur. Med det således erholdte inokulat podes et submerskar av rustfritt stål som er forsynt med en innretning for omrøring og lufting og fylles med 5 liter av den"i eksempel 1 beskrevne næringsløsning. Etter 72 timers gjæringstid fraskilles det dannede mycel fra dyrkingsløsningen, vaskes og suspenderes i 3,5 liter 0,15 molar fosfatpuffer med en pH-verdi på 7,5, hvoretter det tilsettes 60 000 E kalium-fenoksymetylpenicillin pr. ml dyrkingsblanding. Under spaltingen holdes pH-verdien automatisk på 7,5. Etter 10 timers røring og lufting er 92 % av det tilsatte penicillin spaltet.

EKSEMPEL 6

Den ved fraskilling av det etter eksempel 5 erholdte mycel erholdte dyrkingslosning tilsettes porsjonsvis 60 000 E kalium-fenoksymetylpenicillin pr. ml'dyrkingsbuljorg. pH-verdien under spaltningen holdes automatisk på pH 7,5. Etter 8 timer foreligger 85 % av det opprinnelige penicillin som 6-aniinopenicillansyre.

EKSEMPEL 7

En submers-beholder av rustfritt V4A-stål, som er forsynt

med en innretning for roring og lufting og er fylt med 5

liter av den i eksempel 1 beskrevne næringsløsning, podes med 0,5 liter av en submers-kultur av Bovista plumbea NRRL

3501 - fremstilt som beskrevet i eksempel 1. Etter 96 timers gjæring filtreres dyrkingsblandingen og dyrkingsfiltratet innstilles forsiktig til pH 6 med 20 % svovelsyre. Til 3

liter filtrat tilsettes nå 30 gram av en kiselsyreaerogel og det omrores i 40 minutter ved romtemperatur og sentrifu-geres. Den frasentrifugerte gel, som har absorbert spalt-enzymet, vaskes 3 ganger med hver gang en liter fosfatpuffer (pH 7,5) etter Sørensen, suspenderes i 1,5 liter destillert vann og tilsettes 45 g kalium-fenoksymetylpenicillin. Den enzymatiske spalting av substratet skjer ved 28°C under omrøring og tilsetning av konsentrert ammoniakk for å holde pH-verdicr. på omtrent 7,5. Etter 6 timers spdtningstid er omtrent 8-4 av det opprinnelige penicillin spaltet.

EKSEMPEL 8

Ved samme fremqanqsmåtc som i eksempel 1 kommer man ved anvendelse av andre i den foregående beskrivelse nevnte penicilliner istedet for kalium-fenoksymetylpenicillin frem til foigende resultater:

For påvisning av den uventede gunstige spalt-enzymdannende

evne av soppstammen Bovista plumbea NRRL 3501 er denne sammen-lignet med den klassifiseringsmessig meget nærstående stamme Bovista nigrescens CBS 128, 50. Av "Kleine Kryptogamenflora", Bind Ilb, "Die Rohrlinge-, Slatter, und Bauchpilze" av M. Moser, sidene 5, 6, 7, 287-291, spesielt sidene 287-291,

kan man se stillingen for slekten Bovista innenfor familien Lycoperdeceae og på side 291 de systematiske kjennetegn av Bovista plumbea og Bovista nigrescens.

Ved de gjennomførte dyrkningsarbeider viste seg Bovista nigrescens fra begynnelsen av forskjellig fra Bovista plumbea ved en meget langsom og sparsom vekst. Mens det for Bovista plumbea var tilstrekkelig med en 7 til 10 dagers dyrking på Sebouraud-dextrose-agar ("Difco"), måtte Bovista nigrescens

CBS 128, 50 dyrkes over 3 passasjer før det var tilstede tilstrekkelig utgangsmaterial for submerskulturer hvis penicillin-amidaseaktivitet, det vil si spaltenzymaktivitet, skulle prøves. Den submerse dyrking skjedde som beskrevet i eksempel 1 i den foreliggende beskrivelse, og det ble herved for de to soppstammer oppnådd de i den etterfølgende tabell 3 angitte resultater. Bestemmelse av spaltningsaktiviteten for enzymet ble gjennomført under anvendelse av den i det følgende beskrevne kontrollmetode. Fra de i den siste spalte i tabell 3 sammenfattede resultater kan det sees at det består en vesens-forskjell i dannelsesevnen for penicillinamidase for de to i seg selv meget nær beslektede soppstammer.

Kontrollmetode ved isolering av penicillinamidase.

Kontrollen foregår ved en kinetisk bestemmelse av enzymaktiviteten. En internasjonel enzymenhet E er den aktivitet som under standardbetingelser omsetter 1 mikromol K-penicillinl' pr. minutt. Den her anførte enzymenhet er den aktivitet som ved 32°C og pH 7,5 under substratmetting spalter 1 mikromol K-penicillin V i løpet av 1 time. Ved den enzymatiske hydro-lyse frigis fenoksyeddiksyre og det er derfor nødvendig at man holder pH på 7,5 ved tilsetning av NaOH. Dette alkali-forbruk pr. tidsenhet er således et mål for enzymaktiviteten.

Gjennomforing av aktivitetsbestemmelsen.

For prøven anvendes ca. 200 - 800 enheter tilført i form av mycel, homogenisat, enzymløsning eller sluttprodukt for hver test. I en glassbeholder som rommer 50 ml og som styres til 32°C ved hjelp av en termostat, og som videre er forsynt med pH-elektrode, termometer og doseringsinnretning for 0,5 n NaOH og som er anbrakt over en magnetrøreinnretning, innføres f.eks. 10 ml overliggende klaret mycelhomogenisat. Dertil kommer 5 ml 0,01 m K-fosfatpuffer med pH 7,5 og 10 ml destillert vann. Om nødvendig innstilles pH méd 1 n NaOH til pH 7,5

og reaksjonen settes i gang ved tilsetning av 2 ml 50 % van-dig K-penicillin V-losning. Skulle det forekomme en for-skyvning av pil kan denne korrigeres med tilsetning av 1 n NaOH henholdsvis 1 n H?SO^. Så snart en pH på 7,5 er nådd begynnes titreringen med en pH-stat. Forbruket av 0,5 n NaOH noteres hvert 5 minutt. Reaksjonen skal forløpe under omrøring ved 32°C over 30 minutter.

Beregning av enzymaktivit et, grafisk metode.

Det registrerte forbruk av 0,5 n NaOH oppfores i forhold til tiden (5 minutters perioder) på et mm-papir. Det trekkes en rett linje: for utligning som skal løpe gjennom null-

punktet for koordinatene. Hvis dette ikke kan gjøres parallel-forskyves den rette linje til den loper gjennom nullpunktet. Man oppnår fra de korrigerte rette linjer det faktiske forbruk i mikroliter av 0,5 n NaOH etter 30 minutters reaksjons-tid. Denne verdi tilsvarer det totale antall enheter (E) inneholdt i tilførselen. Som et eksempel ble det tilsatt 10 ml enzymekstrakt og for dette forbrukt 800 mikroliter 0,5 n NaOH i løpet av 30 minutter. Aktiviteten utgjor dermed 800 E/10 ml eller 80 E/ml enzymløsning.

Det er således ved gjennomførte dyrkingsforsøk påvist at Bovista plumbea (NRRL 3501) har en uventet gunstig evne til

å danne penicillinamidase i forhold til den klassifikasjons-messig meget nær beslektede stamme Bovista nigrescens (CBS 128,50).

I det følgende inneholdes morfologiske beskrivelser av stammene NRRL 3501 og NRRL 3824.

Morfologisk beskrivelse avGastromyces Bovista plumbea, stamme NRRL 3501 I. Soppen gror rikelig på Sabouraud-dekstrose-agar (Difco Laboratories, Detroit, Michigan) og dens kolonier oppnår en gjennomsnittlig diameter på 22 mm i løpet av 10 døgn ved 24°C.

Farge av oversiden av koloniene: I midten melkehvit, svakt hvit i kantområdene.

Farge av undersiden av koloniene: Svakt flø tefarget, i midten gul.

Farge av substratet: Ingen endring i farge.

Struktur av overflaten av koloniene, svakt opphøyet i midten, ullaktig hvit, med variabel diameter og uregelmessig form. Derfra radialt utstrålende løse hyfer.

Kantområder av koloniene: Uregelmessige og sterkt frynset.

Mikroskopisk bilde: Hyfer med en diameter på 1,6 til 3,3 mikrometer med boyledannelser og uten vegetative sporer. II. Soppen vokser på Czapek-oppløsnings-agar (Difco Laboratories, Detroit, Michigan) i store kolonier men meget tynt. Mycelet er makroskopisk synlig bare i gjennomfallende lys. Koloniene oppnår en gjennomsnittlig diameter på 48 mm i løpet av 10 døgn ved 24°C.

Farge av oversiden av koloniene: I midten svakt hvitt, eller glassaktig.

Farge av undersiden av koloniene: Glassaktig.

Farge av substratet: Ingen endring i farge.

Struktur av overflaten av koloniene: Fra inokuleringspunktet utsendes 4-7 brede og løse, ofte forgrenede hyfer. Den største del av mycelet er i substratet og bare noen få hyfer vokser på overflaten.

Kantområder av koloniene: Meget frynset.

Mikroskopisk bilde: Hyfer med en diameter på 2,5 - 3,2 mikrometer med bøyledannelser, uten dannelse av vegetative sporer. III. Soppen vokser dårlig på ølgjær-autolysat-dekstrose-agar.

Sammensetning av medium:

1,0 g N som filtrert ølgjær-autolysat

50,0 g dekstrose

1,0 g KH2P04

0,5 g MgS04 . 7H20

0, 5 g Ca (N03) 2

0,1 g NaCl

0,05 FeS04 . 7H20

20,0 g Bacto agar (Difco)

til 100 ml med vannledningsvann: pH = 6,0.

Koloniene når en gjennomsnittlig diameter på 6 mm i løpet av 10 døgns inkubasjon ved 24°C.

Farge av oversiden av koloniene: Svakt hvit, i midten mer intens.

Farge av substratet: Ingen endring i farge.

Struktur av overflate av koloniene: Opphøyet i midten, konisk hvit topp med en diameter på 1 til 2 mm, idet resten av koloniene er fløyelslignende til svakt ullaktige, uten dannelse av hyfe-f ormas joner.

Kantområder av koloniene: Svakt frynset, skarpt avgrenset mot medium.

Mikroskopisk bilde: Hyfer med en diameter på 2,2 til 3,2 mikrometer med bøyledannelser uten dannelse av vegetative sporer. IV. Soppen vokser dårlig på malt-agar (Difco) og koloniene oppnår en gjennomsnittlig diameter på 8 mm i løpet av 10 døgn ved 24°C.

Farge av overside og underside av koloniene: Svakt hvit. Farge av substratet: Ingen endring i farge. Struktur av overflaten av koloniene: Opphøyet i midten; nedsynking mot kantområdene; overflaten ullaktig, med radialt utstrålende løse hyfer som er sterkt forgrenet.

Kantområder av kolonien: Meget frynset og uregelmessig.

Mikroskopisk bilde: Hyfer med en diameter på 1,8 til 3,8 mikrometer med bøyledannelser, uten dannelse av vegetative sporer.

Morfologisk beskrivelse av Gastromyses Bovista plumbea, stamme NRRL 3824

På Sabouraud-desktrose-agar (Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA) vokser soppen rikelig og dens kolonier oppnår en gjennomsnittlig diameter på 34 mm i løpet av 10 døgns inkubasjonstid ved 24°C.

Farge av oversiden av koloniene: Trådaktig, hvit.

Farge av undersiden av koloniene: Svakt fløtefarget, i midten gulaktig.

Farge av substratet: Ingen endring i farge.

Struktur av overflaten av koloniene: Mycelet hevet opp til

2 til 4 mm med synking ned til kantområdet; ullaktige flokker, mer kompakt i sentrum, derfra radialt utstrålende løse hyfer.

Kantområder av koloniene: Meget uregelmessig og sterkt

frynset. Mikroskopisk bilde: Hyfer med en diameter på 2,0

til 3,3 mikrometer, med bøyledannelser, uten vegetative sporer. II. Soppen vokser på Czapek-oppløsnings-agar (Difco Laboratories Detroit, USA) i store men meget tynne kolonier. Koloniene når en gjennomsnittlig diameter på 77 mm i løpet av 10 døgn ved 24°C. Mycelet er makroskopisk synlig bare i gjennomfallende lys.

Farge av oversiden av koloniene: I midten svakt hvit, ellers glassaktig.

Farge av substratet under koloniene: Uendret.

Struktur av overflaten: Fra inokulasjonspunktet løper det

ut 5 til 10 (oftest 7) brede og løse, ofte forgrenede hyfer.

Den største del av mycelet er i substratet, idet bare et fåtall hyfer gror på overflaten som stiger opp til 2 mm høyde. Kantområder av koloniene: Meget uregelmessige og sterkt

frynset.

Mikroskopisk bilde: Hyfer med en diameter på 1,5 til 3,0 mikromett uten bøyledannelser, uten vegetativ sporedannelse. III. Soppen vokser meget godt på ølgjær-autolysat glykose-agar.

Sammensetning av medium:

1,0 g N som filtrert ølgjør-autolysat

50,0 g dekstrose

1,0 g KG2P04

0,5 g MgS04 . 7H20

0,5 g Ca(NOj)2

0,1 g NaCl

0,05 g FeS04 . 7H20

20,0 g Bacto agar (Difco)

til 1000 ml med vannledningsvann; pH = 6,0.

Ved 24°C oppnår koloniene en gjennomsnittlig diameter på

53 mm i løpet av 10 døgns inkubasjon.

Farge av oversiden av koloniene: Hvit, i midten svakt gulaktig.

Farge av undersiden av koloniene: Gulaktig brun, kanter hvite.

Farge av substratet: Ingen endring av farge.

Struktur av overflaten av koloniene: Mycel opphøyet til 4 mm

i midten, ullaktige flokker, synking ned til kantområdet,

ingen tydelig dannelse av hyfer.

Kantområder av koloniene: Ganske regelmessig rund, tydelig avgrenset mot medium.

Mikroskopisk bilde: Hyfer med diametere på 2,2 til 2,4 mikrometer, med bøyledannelser, uten dannelser av vegetative sporer. IV. Soppen vokser meget forskjellig på malt-agar (Difco). Etter 10 døgns inkubasjon ved 24°C varierer diameteren av koloniene fra 10 til 80 mm som ekstreme tilfeller.

Gjennomsnittlig diameter er 3 9 mm.

Farge av overside og underside av koloniene: Svakt hvite.

Farge av substratet under koloniene: Uendret.

Struktur av overflaten av koloniene: Et tydelig inokulerings-punkt, deretter er et område på 5 til 10 mm bredde mindre ut-vokst, idet resten av koloniene har et løst, lett flokkaktig mycel opptil 3 mm høyde; ingen tydelig dannelse av hyfer.

Kantområder av koloniene: Uregelmessige og frynset.

Mikroskopisk bilde: Hyfer med en diameter på 1,7 til 5,0 mikrometer med bøyledannelser, uten vegetative sporer.

Stammen NRRL 3824 er ennå bedre enn stammen NRRL 3501 med hensyn til vekst-egenskaper (omtrent 10 % bedre) og kan ellers skjelnes fra Bovista nigrescens på samme måte.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av 6-aminopenicillansyre ved enzymatisk spaltning av penicillin, karakterisert ved at penicilliner med formel

   hvori R står for fenoksymetyl, p-kresoksymetyl eller n-butoksy-metyl, eller deres salter, spaltes ved hjelp av levende kul-turer eller enzympreparater av mikroorganismen Bovista plumbea NRRL 3501 eller NRRL 3824.