SU606554A3

SU606554A3 - Способ получени -галактозидазы

Info

Publication number: SU606554A3
Application number: SU752304401A
Authority: SU
Inventors: Нарита Сигееси; Наганиси Хиросуке; Йокуци Акиеси; Кагая Ициро
Original assignee: Хоккайдо Шугар Ко.,Лтд (Фирма)
Priority date: 1975-01-03
Filing date: 1975-12-30
Publication date: 1978-05-05
Also published as: FR2296689B1; YU314175A; DE2559218A1; JPS5191387A; JPS561072B2; DE2559218C2; US3957578A; FR2296689A1; IT1059868B; GB1497459A; BE837289A

Description

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ d. -ГАЛАКТОЗИДАЗЫ

кость, м сной экстракт, пептон, дрожжевой экстракт, нитраты и соли аммони . Используемые неорганические соли включают, например, хлористый натрий, хлористый кальций, сульфат магни , сульфат марганца, сульфат железа, фосфаты и карбонат кальци . При необходимости в среду ввод т витамины.

В. качестве индукторов дл эффективного продуцировани оС -галактозидазы в миделии используютс такие вещества как лактоза, рафиноза, мелибиоза и галактоза.

Способ осуществл ют следующим образом .

Питательную среду готов т следующего состава (%): лактоза - 1,5, глюкоза - 0,5, сульфат аммони - 0,6, кукурузна выт жка - 1,0,КН2РО - 0,4, Mg SQjjTHjO - 0,2, хлористый натрий 0 ,2, рН довод т до 5,S добавлением

гидроокиси натри , после чего ввод т 0,3% карбоната кальци .

Данную среду раздел ют на 5 частей по 200 мл кажда и стерилизуют. На стерилизованные порции среды инокулируют суспензии гпор штаммов Ab)i(Jia grriseoea (АТСС 20430) и Absidia о ео( van Ig nefiii (АТСС 20431) в количествах, каждое из которых дает 2x10 спор.

Затем микроорганизмы подвергают культивированию при встр хивании или аэробному культивированию при температуре около 30°С в течение от 40 до 70 час при регулировании рН в пределах 5-8.

В конце культивировани мицелий испытывают на активность сл, -галактозидазы и на инвертазную активность. В качестве контрольной расы используют штамм Afasidia 5874.

Результаты исследований приведейы

в табл.1.

Таблица

1,30 188900 1,453x10 О

1,29 31100 1,816x10 О

1,28 63100 493x10 104 Активность с. -галактозидазы определшот добавление 1 мл суспензии мицепи к смеси 0,5 мл 0,06М мелибиозы и 0,5 мл 0,1М фосфатного буферного раствора с рН 5,2 и выдерживают 2 часа при , после чего реакционную смесь нагревают на кип щей вод ной бане 5 мин дл инактивировани энзима и добавл ют 1 мл 1,8%-HoroBa{C5Hlj-8й,,О и 1 мл 2%-ного семигидрата сульфата цинка дл удалени протеина. Полученную смесь центрифугируют,, а поверхностный слой, свободный от протеинов, анализируют на содержание глюкозы глюкостатным методом. Учитыва , что количество глюкозы, освобожденной от мелибиозы, и концентраци энзима наход тс в пропорциональной взаимосв зи, соответствующей до 1000 микрограмм глюкозы, суспензию заранее разбавл ют так, что она по8 ,121 падает в пределы измерени , удовлетвор ющие этой взаимосв зи. Количество свободной глюкозы умножают на число разбавлений. Активность d. -галактозидазы , котора освобождает 1 микрограмм глюкозы, принимаетс за единицу. Активность инвертазы определ ют добавлением 1 мл суспензии мицели к смеси 0,5 мл 0,06М сахарозы и 0,5 мл 0,1М фосфатного буферного раствора при рН 6,0 при тех же услови х реакции, как и дл Х -галактозидазы. Далее реакционный раствор центрифугируют, удал ют протеины, а поверхностный слой анализируют на содержание инвертного сахара по методу Сомогии-Нельсона. Активность инвертазы, котора дает 1 микрограмм инвертного сахара, принимают за единицу. Вес сухого мицели определ ют сушкой при 105°С того количества его, которое выращивают в 100 мл культуральной среды с пойледующим взвешиванием . Данные табл.1 показывают, что активность сс -галактоэидазы, полученной по предлагаемому способу, выше, чем при использовании известного спо соба (контроль), при этом полностью отсутствует активность инвертазы. При культивировании штаммов по пр лагаемому способу к среде добавл ют органическую кислоту, например глико левую, лимонную, молочную, блочную, фумаровую, виннокаменную, нтарную, глутаровую, малоновую, малеиновую, пировиноградную или галактуроновую, в качестве вещества дл промотировани роста d. -галактозидазы, в количестве , составл ющем 0,2-1,0% в расчете на среду. Получаемый мицелий хран т в форме таблеток, которые упаковывают или добавл ют в реакционные емкости и со суды. . Мелассу пропускают через реакционную емкость при рН 4-6 и 30-60 с. Во врем контактировани мелассы с мицелием рафиноза, присутствующа в мелассе, гидролиэуетс в сахарозу и галактозу. Благодар тому, что в энзимах не содержито инвертаэа, энзиматический гидролиз происходит тольк на рафинозе и не протекает на саха-. розе. Пример 1. Среду следующего с тава, (%): лактоза - 0,5, глюкоза 0, сульфат аммони - 0,1, КН.РО, - 0,4 MgrSO -7H,20 - 0,2,(NN2)00 - 0,06, хло ристый натрий -.0,2, кукурузна жидкость - 1,2 довод т до рН 5,5 гидратем окиси аммони .

6,2

1,37

5,4 6., 4 6,5 6.-4 5,9 5,7 5,4 5,8

0,08

О

37200

84300

J09000

155400

226700

250900

257000

1,99x10

,29 В ферментер емкостью 20 л помещают 15 л среды и 800 частей на 1 млн.ко- , .колина, добавленного в качестве пеногас щего агента, и стерилизуют 30 мин под давлением 1,2 кг/кв.см. Среду затем охлаждают и в нее инокулируют сус пензию спор, полученную культивированием Atsidia var -tcrnefni (АТСС 20431) в картофельно-глгокозной агаровой среде при 27, в течение 10 дней, в количесЬгве, дающем 1x10 спор/куб.см среды. Культивирование осуществл ют при 30°С 18 час при аэрации со скоростью 1/4 объем/объем/ /мин и при перемешивании со скоростью 250 об/мин. Полученный мицелий используют в качестве посевного, материала. Среду следующего состава (%): лактоза - 1,5, сульфат аммрнп - 0,6, кукурузна жидкость - 1,0,КН2РО.-о,4 , семигидрат сульфата магни - 0,2, хлористый .натрий - 0,2, довод т до рН 5,5 ,и 15 л срец петлещают в ферментер объемом .20.in и с 1280 частей на 1 млн. коколина добавленного в качестве пеаогас щего агента, и .стерилизуют 30 .мин .под давлением -1,2 кг/кв. см. На данной сро е инокулируют 500 мл указанного посевного матед иала и культивируют при при аэрации со скоростью 1/4 объем/объ /мин и при перемешиваний со скоростью 350 . Культивирование прекращают при достижении содержани сахара в среде 0,1% (по количеству глюкозы по методу Сомогии )., культивирование в течение 44 час, Отнетиение между временем культивировани и количеством Л.-галактозидазы приведено в табл.2. Анализ культурального бульона обнаруживает полное отсутствие инвертазы. Таблица 2

П р и м е р 2„ Atisid-ia gpisaoEa АТСС 20430 культивируют в среде и услови х , как в примере 1, Зависимость Анализ культурального бульона показывает

Примерз, К каждой из двенад-цати порций основной средда состава (% глюкоза - 0,5, сульфат аммони « 0,6j кукурузна жилкость- 1,0,КНаРО -О 4, MgSO 7Н2О - 0,2, хлористый натрий 0 ,2, CaCOj- 0,3, добавл ют сакар из двенадцати различных сахароз табЛр4 в количестве, соответствующем 1,5%, : Среду готов т вначале растворением компонентов в у сазанном составе, исключа Са.СО J доведением смеси до ,рН 5,5 и последующим введением карбо-ната кальци .

Порции среды по 200 мл по -.объему распредел ют в колбы Сакагучи

s-isr-ivJiy Браманем культивировани и количеством образовавшейс сС -галактозидазы приведена в табл.З.

О

о

25800

60400

76500

112000

162900

186.300

4

194600

1 Зй

1,497x10

ODfcei4OM 1 п и стерилизуют 30 гдан под давлением 1,2 кг/кв.см. Затем инокулируют суспензии спор Abaidia gr-laeoga АТСС 204 и А1э sidid §чч5еайа vaf -Ig-n е hf АТСС 20431 в количестваКс дающих 1x10 спор/куб,см среды. Культивируют при 30°С 60 час на возвратно-поступательном вибраторе при амплитуде 7 см со скоростью 136 об/мин.

Результаты приведены в табл ,4„ Анас , ЛИЗ показывает полное отсутствие инвертазв во всех гуаицели х, на которых исиольэую-тс 1.2 ..ра.з.пк нык Сахаров. . Т а б л .и ц. а 4 полное отсутствие инвертазы. ТаблицаЗ Из табл.4 видно, что индуцирующие вещества, которые ранее использовали дл получени оС -галактоэидазы при культивировании известных штаммов, эффективны и в культуре микроорганизмов по предлагаемому изобретению, а эффект лактозы вл етс наиболее высоким . П р и м е р 4. Основную среду соетава {%): лактоза - 1,5, глюкоза - 0 сульфат аммони - 0,6, кукурузна жид кость - 1,0,КН2Р04-0,4, семигидрат ма ни - 0,2, хлористый натрий - 0,2, смешивают с 0,6% лимонной кислоты, вз той в качестве вещества, промотирующего образование oL-гaлaктoз дaзы затем рН довод т до 5,0 гидратом оки си аммони и к смеси добавл ют 0,2% карбоната кальци . Порции среды по 200 мл кажда распредел ют в колбы

Продолжение таблицы 4 Сакагучи объемом 1 л и стерилизуют 30 мин под давлением 1,2 кг/кв.см. На среде инокулируют суспензии спор Absfdib g-r-i eoea (АТСС 20430) и Afesidior. gr-iseoea var -ig-nehu (АТСС 20431) в количествах, дающих 1x10 спор/куб.см среды, и далее культивируют при в течение 60 час на возвратно-поступательном вибраторе с. амплитудой 7 см при 136 об/мин. . Дл сравнени штаммы культивируют в. среде, идентичной по составу вышеуказанной среде, но без добавки лимонной кислоты. Контрольное культивирование провод т в тех же услови х, бульоны анализируют на активность о.-галактозидазы . Данные исследований приведены в табл.5.

Absicfia

не добав- 1,280 gfriseota л етс

(АТСС 20430)1 добавл етс

Atstdia gn-fie- не добавotoi var ignellii л етс

(ЙТСС 20431):до&вфл 1 ,260 496200 3,938x10 етс

Из табл.5 видно, что добавка лимонной кислоты увеличивает активнсх;ть

d -галактозилазы примерно в2,2 раза и не допускает получени активной инвертазы .

Приме р 5. К каждой на 11 пор- зо дий основной ере№1 примера 4 добавл ют одну из 11 различных органических кислот , укаэанн)1х в табл. 6 и 7, в колиГалактуронова

Контроль

(без добавки

органической

кислоты)

Т а

лица 5

177200 1,384x10

4

385400 ,3,059x10 230900 1,790x10

О

igcTBe, соответствующем 0,6%, и штамv Ma idict gTMseofd ctr ig-neiiii Afasfdibt g-rifeoEa

(АТСС

14 31Г

ATCC 204j«4 культивируют в тех же .услови х, как - Сг1римере 4.

Данные исследЬв ий актив|1ости d- -гйлактозидазы приведены в табл.5, и б соответственно дл штаммов АТСС 431 и ЛТСС 430,

Таблица б

4,214x10

3,730x10

3,487x10

Зу150х1о

2,619x10

2,388х10

2,293x10

2,266x10

2,014x10

2,322x10

1,350 371200 2,749x10

1,290 г30900 1,790х10

1,280 177200 1,384x10

0,02

Данные табл. 6 и 7 показывают, что все органические кислоты обладают эффективностью в промотировании роста

d -галактозидазы так же, как лимонна кислота,

Примерб. К порции основной среды примера 4 добавл ют независимо лимонную, молочную и гликолевую кисЛимонна

Таблица

2,989x10

2,851x10

2,768x10

2,436x10

2,145x10

1,841x10

1,758x10

1,564х1о

4

1,795x10

2,237x10

лоты-в различных количествах, соответствующих 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, и 1,0%. При тех же услови х Absiaia gr-iseoea vof igfriet i (ATGC 20431) и gfiuecitci (ATCC 20430) подвергают культивированию .

Результаты исследований соответственно приведены в табл. 8 и 9.

Таблица 8

о о о о о

О О О О

О

Продолжение табл. 8

Из данных таблиц 8 и 9 видно, что количество любой из органических кислот , добавленных дл промотировани продуцировани (А, -галактозйдазы, находитс в пределах от 0,2 До 1,0% и что количество d. -галактозидазы постепенно уменьшаетс по мере увеличени органической кислоты за пределами 1,0%.

Пример. Свекловичную мелассу разбавл ют водой до 30°(по Бриксу) и рН довод т до 5,2 добавлением серной кислоты. 200 г полученного раствора , содержащего 5,8 г рафинозы, мицели микроорганизма по данному изобретению , имеющего сухой вес 0,971 г и 17540000 единиц оС -галактозидазы, согласно примеру 1, подвергают реакции при в течение 2 час 30 мин при встр хивании.

Затем мицелий отдел ют фильтрованием и промывают водой, фильтрат и .промывные воды объедин ют ,и определенный объем данной смеси анализируют с помощью бумажной хроматографии на остаточное содержание рафинозы и на уведанные табл.10 показывают, что ак- тивность оС -галактозидазы, содержащейс в мицелии плесени, по предлагаемому изобретению снижаетс только на 16% даже после ее семиразового использовани дл обработки свекловичной мелассы, и d. -галактозидазу после такой обработки можно использойать дл разложени рафинозы.

П р и м е р 9. Свекловичную мелассу разбавл ют до 50°(по Бриксу) и рН довод т до 5,2 добавлением серной кислоты . 200 г данного раствора, содержащего 9,8 г рафинозы, мицелий плесени (имеющий сухой вес 1,619 г и активность cL -галактозидазы 29400000 единиц ) , полученный в примере 1, дают возможность реагировать при в течение 2 час 30 мин. В конце реакции раствор анализируют на степень разложени рафинозы и на увеличение содержани сахарозы.

личенное содержание сахарозы. Более точно образец про вл етс в растворителе , состо щем из 6 частей н-бутанола , 4 частей пиридина и 3 частей воды. Зоны рафинозы и сахарозы отде л ют , промывают водой и анализируют с помощью цистеин-карбазольного процесса .

Установлено, что 81% первоначального содержани рафинозы разлагаетс , а содержание сахарозц увеличиваетс на 3,19 г,

Пр и м ер 8. 200 г свекловичной мелассы 30° (по Бриксу), приготовленной как в примере 7, с мицелием, имеющим активность -галактозидазы I7640000i единиц, дают возможность реагировать так же, как в примере 7. После реакции мицелий промывают водой добавл ют к новой порции разбавленной мелассы и выдерживают дл реакции. Таким образом мицелий используют повторно семь раз, полученные растворы анализируют на остаточное содержание рафинозы и на увеличение содержани сахарозы.

Данные исследований приведены в табл.10. ..

. Т а б л и ц а 10

При этом устанавливают, что разлагаетс 60,4% рафинозы, ,а прирост сахарозы составл ет 3,99 г.

Предлагаемый способ получени оС -галактозидазы по сравнению с известным решением той же задачи обеспечивает повышение выхода фермента, имеющего высокую активность, при использовании новых микроорганизмов из рода Abs-idicf , а именно Absidia g-1 «.еоеа АТСС 20430 и Abbidfot g-piseofioi var igfnetiii АТСС 20431.

Claims

Формула изобретени

Способ получени сХ. -галактозидазы путем культивировани микроорганизмов рода А t S 3 ia на питательной среде, о т л и, ч а ю щ и и с тем, что, с Целью повышени выхода фермента, из микроорганизмов рода Absif ic ис; .:i9.60655420

. ;г„рс.Пй йуЛнлЛь лг. .„„-:°r pS i:.°iTrT,i; fr ,seota «ogan,.),, ,t Hirahora ,o.r „ел„ ,. „„ Лвз1284,кл.195-11, АТСС 20431.. 1974.