NO824247L - Omdanning av d-xylose til etanol ved hjelp av gjaersoppen pachysolen tannophilus - Google Patents

Description

Nærværende oppfinnelse vedrører en fermenteringsprosess til anvendelse ved fremstilling av etanol fra utskiftbar plantebiomasse. En stadig voksende interesse i utviklingen av slike:prosesser har sin årsak i den alminne;Irg"e utbredte betyd-ning som tillegges bruk av etanol som et alternativt flytende brennstoff.

Faststoff fra planter inneholder tre hovedkomponenter, nem-lig lignin, cellulose og hemicellulose. Ligninet er et poly-fenol-makromolekyl som binder sammen cellulosen samt gir stivhet til plantematerialet. Det kan ikke omdannes til alko-hol. Cellulosen er en homopolymer av glykose, som ved fra-separering fra ligninet utgjør en hydrolyserbar kilde bestående av fermenterbar heksose-sukker. Hemicellulose utgjør opp til 35% av plantenes faststoff, og hydrolyserer lett med fortynnet syre under milde betingelser til en sukker-blanding hvor D-xylose (en pentose) utgjør hovedproduktet. Mangelen på en effektiv fermenteringsprosess i forbindelse med bruk av D-xylose har imidlertid redusert, muligheten for praktisk utnyttelse av plantebiomasse som en kilde for fremstilling av petroleumssparende forbindelser.

Bakterier og sopp er tidligere kjent for sin evne til å omdanne pentoser til etanol, eller for i det minste å spille en viss rolle ved nevnte omdanning. En oversikt utarbeidet av S.L. Rosenberg under tittelen "Fermentation of Pentose Sugars to Ethanol and Other Neutral Products by Micro-organisms" , Enzyme Microbiol. Technol. 2. S... 185-193 (1980) viser f.eks. at Fusarium oxysporium i stillestående celle-suspensjoner vil fermentere D-xylose til omtrent ekvivalente mengder etanol, C02og eddiksyre. I voksende kulturer vil forholdet mellom etanol og CC^til acetat øke noe. Visse bakteriearter av Escherichia, Spirochaeta, Aeromonas, Bacillus og Aerobacter er også kjent å produsere etanol fra pentosesukker, men da med relativt lavt utbytte og vanligvis i forbindelse med 2,3-butandiol og forskjellige organiske syrer. G.C. Avgerinos et al. beskriver i "A Novel Single Step Microbial Conversion of Cellulosic Biomass to Ethanol", og som ble presentert ved the International Permentation Symposium, London, Ontario, Canada, i juli 1980, et forsøk på å omdanne halmstrå fra korn direkte til etanol ved hjelp av en blandingskultur av mutantstammene av Clostridium thermocellum og C. thermosaccharolyticum. Mens den sist-nevnte stammen viser seg å være affektiv med hensyn til å utnytte pentosanene som var produsert av C. thermocellum, så var det totale alkoholuthytte bare 50% av den teoretiske maksimale verdi.

Det har lenge vært kjent at gjærsopper har evnen til stø-kiometrisk å omdanne ...1 mol glykose til 2 mol hhv. etanol og CO.-,. Gjærsopp er også i stand til å assimilere; naturlige pentoser oksydativt, men de/, er ikke i stand til å fermentere dem til etanol slik de kan med glykose (Rosenberg, supra,, se avsnitt som overbrygger/sidene 187 og 188). Mange gjærsopper har i den senere tid blitt funnet å ha evnen til å fermentere D-xylose, en keptopentose. I forbindelse hermed har Wang et al (Biotechnol- Lett. 2(6): 279-284 (1980) vist gjennomførbarheten av å tilsette glykose-isomerase til et D-xylose-holdig medium, hvorved substratet omdannes in situ til den fermenterbare xylpseformen. Utbyttet av produsert etanol var lavt, d.v.s. bare 10% av det teoretiske utbyttet. Gong et al. (Appl. Environ, Microbiol. 41(2): 430-436 (februar 1981) har rapportert at de har økt utbyttet ved denne teknikk til å være større enn 80%, men det er mest trolig at denne enzym-understøttede omdanning i en kommersiell skala vil forbli uøkonomisk og ikke attraktiv.

Man har nå overraskende oppdaget en art gjærsopp som fermenterer D-xylose uten tilsetning av enzymer, og som kan anvendes ved fremgangsmåten for omdanning av plantebiomasse til etanol. Den aktuelle gjærsoppen er Pachysolen tannophilus og er meget egnet for fermentering av xyloseholdige stoffer som stammer fra hydrolysen av lignocelluloseholdige plantematerialer.

Ifølge denne oppdagelse er det et formål med nærværende oppfinnelse å fremskaffe en ny fremgangsmåte for direkte fermentering av D-xylose i xyloseholdige stoffer til etanol.

Det er også et formål med oppfinnelsen å fremskaffe en effektiv og økonomisk fremgangsmåte som kan anvendes ved produksjon av et alternativt flytende brennstoff fra plantebiomasse-materiale.

Et annet formål med oppfinnelsen er å fremskaffe en fremgangsmåte, hvorved man kan foreta en xylosefermentering under betingelser som hemmer konkurrenrende organismer samt bireaksjoner.

Øvrige formål og fordeler med nærværende oppfinnelse vil fremgå av den etterfølgende beskrivelse.

Gjærsoppen Pachysolen tannophilus som anvendes ifølge oppfinnelsen er ofte omtalt under det synonyme navnet Pa. pelliculatus og Hansemula tannophilus. Stammetypen CBS 4044 (NRRL Y-2460) ble opprinnelig isolert fra konsentrert gar-vevæske og har fått sin betgnelse av Boidin og Adzet i.1975. En fullstendig taksonomisk beskrivelse er som følger: Vekst på maltekstrakt-agar: Etter 3 dager ved 25°C er cellene sfæriske til ellipseformede (1,5-5,0) x (2.0-7.0) ^um,

og cellene har vanligvis en eller to knapper. Veksten er mukøs til fettaktig samt brun-hvit.

Dalmau plate-kultur på morfologi-agar: Etter 7 dager ved 25^C oppviste veksten under dekkglasset enkel udifferen-siert ps eudphy fe samt tilfeldige og meget forgrenede tråder. Den aerobiske vekst er brun-hvit, glinsende, mukøs, litt konveks i forhold til hele randkanten og lukter svagt etter estere.

Dannelse av ascussporer: Ascus dannes når en vegetativ celle produserer et kraftig rør, vanligvis ved den ene enden. Avhengig av kultur-mediet og antagelig også andre faktorer kan rørene være ganske korte eller opp til 60<y>um lange, og de kan være rette eller bøyd. Enden på røret forstørres under dannelse av ascus, og følgelig kan røret betraktes som en ascusspore. Asci inneholder opp til fire hemisfæriske ascusporer som har et smalt fremspring ved basis. Ascus-veggen sprettes opp hvorved sporene frigjøres. Når dette har funnet sted vil man se at ascusen er dannet innenfor et V-formet hakk ved enden til ascussporen. Ascussporeveggene viser seg å bli meget tykke samt meget bøybare. Dette karakteristiske trekk med meget bøybare ascussporer, som i enden oppebærer asci, gjør Pachysolen lett identifiserbar i et lysmikroskop selv ved moderat forstørrelse.

Asci kan være konjugert eller ukonjugert avhengig av den un-dersøkte stammen. Stammetypen NRRL-24 60 danner ukonjugert asci mens NRRL Y-2461, Y-2462 og Y-2463 har konjugerte asci. På alle kulturer ble det dannet sporer på YM-agar ved 25°C etter ca. 1 uke. Enkel-spore isolert fra NTTL-2460 gav.spore-holdige kolonier, og følgelig viser arten seg å være homo-thallisk (Wickerham, 1970).

Sporene ble observert på YM, Gorodkowa ogrmaltekstrakt-agar-media.

I tillegg til det ovenfor nevnte fermenterbare substrat■er det uventet funnet at Pa. tannophilus har den unike evne blant gjærsoppene til også å frementere D-xylose. Alle kjente stammer derav inkludert NRRL Y-2460, Y-2461, Y-2462, Y-2463 og Y-6704 deler dette karakteristiske trekk og er.derfor aktuelle for anvendelse i den beskrevne fremgangsmåte uten begrensninger.

Substratet som er egnet for etanol-produksjon ifølge nærværende fremgangsmåte omfatter alle xyloseholdige stoffer under forutsetning av at det øvrige bestanddeler deri ikke i vesentlig grad forstyrrer fermenteringsprosessen. Av spesiell interesse er naturligvis lignocelluloseholdige nedbrytnings-produkter, og da spesielt hydrolysat av hemicellulose, eller av hemicelluloseholdige råstoffer som trær, gress samt vel-kjente vekstrester fra høsting i landbruket. Det er under-forstått at den naturlig forekommende form for pentosesukker i disse materialer i alt vesentlig er D-xylose, som i sin helhet direkte påvirkes av gjærsoppen. Tigjengelig glykose vil også bli fermentert.

Fermenteringen utføres i et vandig medium under betingelser som sikrer opprettholdelse av cellenes levedyktighet og for å avstedkomme omdanning av xylose til etanol. Selv om det hele vil foregå under ikke-vekstbetingelser, så vil alko-holproduksjonenc;:'generelt kunneøkes hvis organismene til-lates å utvikle seg. Mediet bør derfor inneholde en egnet nitrogenkilde. Mineraltilsetninger og andre næringsstoffer kan også tilsettes i den utstrekning en fagmann vurderer dette ønskelig. Av praktiske hensyn, og da spesielt med hen blikk på gjenvinning, bør den totale fermenterbare sukkerkon-sentrasjonen holdes på et nivå som er tilstrekkelig til å

gi i det minste 15 g/l etanol i sluttløsningen. Den øvre grense for fermenterbar sukkerkonsentrasjon er den som av-stedkommer vesentlig tilbakegang av utbyttet ved etanolproduksjon, d.v.s. forholdet mellom produsert etanol per enhet gjærsoppceller. For de ovenfor nevnte stammer vil xylose-nivåene som tilfredsstiller disse kriterier ligge innenfor området på ca. 50 g/l til ca. 250 g/l, hvorved området 50-150 g/l foretrekkes. Når etanolkonsentrasjonen overstiger ca. 19 g/l i mediet så begynner denne også å hemme produksjonshastigheten.

Mens oskygen ikke er viktig for fermenteringen, så økes celleveksten og den samtidige etanolproduks jonen markant når mediet blir tilført oksygen ved lufting. Under betingelser med hurtig vekst er det beregnede oksygenbehov pr. gram cellemasse ca. 9,2 mol C^/time.

Veksthastighet, cellekonsentrasjon og etanolproduksjon blir samtlige begunstiget av lav ph i miljøet .. For utførelse av fermentering er pH under drift ca. 2 til 7. Imidlertid er etanolutbytte ved et pH i området mellom 2,5 - 5,5 mer enn to ganger så stort enn det som oppnås ved pH på over 5,5, hvilket indikerer at ved høyere pH vil xylose gå i en annen metabolisk retning enn den som fører til etanoldannelse. De beste resultater oppnås ved en pH-verdi på ca. 2,5. Fenomenet er noe uventet med tanke på tidligere publikasjoner om at pentoseforbruket i gjærsopper vanligvis er mest effektiv i alkalisk miljø sammenlignet med surt miljø. På grunn av at cellefunksjonene til de fleste organismer hemmes når pH er lavt, så er Pa. tannophilus i stand til fremgangsrikt å konkurrere mot uønskede kulturforurensninger. Det er derfor ikke nødvendig å sterilisere substratet og andre bestanddeler av kulturmediet.

Dyrkningsteinperaturene i området 28-35°C foretrekkes, hvorved 32°C er omtrent den optimale temperatur for celievekst-hastigheten, produksjonshastigheten av etanol samt det totale etanolutbyttet. Fermenteringen vil i virkeligheten foregå ved en temperatur på 15°C eller lavere, men da ved hastigheter og et utbytte som er lavt.

Ved en typisk satsvis fermentering blir et surgjort vekstme-dium, som inneholder denønskede konsentrasjon av xylose-holdig substans, inokulert med predyrket Pa. tannophilus, for derved, å gi en første gjærsopp-densitet på ca. 0,01 g/l. pH-verdien og temperaturen reguleres til forutbetsemte verdier innenfor de ovenfor nevnte områder, og kulturen blir kontinuerlig luftet og rørt under hele inkubasjonsperioden. Avhengig av begynnelseskonsentrasjonen og inkubasjonsbeting-elsene vil xylose-substratet vanlegvis være uttømt i løpet av ca. 3 til 10 dager, hvoretter fermenteringen stoppes.

Det etanolrike mediet blir deretter utvunnet og kan behandles ved destillasjon eller på annen kjent måte for utvinning av etanol eller den ønskede etanolholdige fraksjonen.

Andelen xylose som er assimilert av Pa. tannophylos under celleveksten er liten (ca. 10%) sammenlignet med det som er fermentert. Selv om de forskjellige sider ved fermenteringsprosessen ikke er kjent, så er det åpenbart fra følgende lig-ning at det teoretiske etanol-utbytte kan bli så høyt som 0,51 g/l av forbrukt glykose.

Under de her beskrevne betingelser har man erholdt så høyt utbytte som 0,34 g/g

Følgende eksempler skal ytterligere illustrere oppfinnelsen, som derved imdilertid ikke må begrenses av eksemplene.

Ekesmepl 1

Fremstilling av media samt prekulturer.

Følgende løsninger ble fremstilt:

Løsning A - spormineraler

Løsning B Løsning C 1 liter av kulturmediet ble fremstilt ved først å sammenblan-de 10 ml løsning A, 10 ml løsning B, 100 ml løsning C og 10 g gjærsoppekstrakt for dannelse av et volum på 120 ml. Etter sentrifugering for fjerning av eventuell presipitat ble blandingen behandlet i autoklav. pH-verdien til den avkjølte sterile løsningen ble deretter justert til 4,5 med ca. 1 ml 2N HC1 med den hensikt på nytt å oppløse eventult presipitat som er dannet under steriliseringen. D-xylose (50g) ble oppløst i tilstrekkelig destillert vann for dannelse av 880 ml løsning som deretter ble behandlet i autoklav og sam-menblandet med mineralløsningen.

En kultur av Pa. tannophilus, stamme NRRL Y-2 46 0, som var gjort lyofil ble fremskaffet fra Agricultural Research Culture Collection (NRRL) in Peoria, IL.Forråds-kulturer

som er fremstilt fra den lyofile væske ble holdt på skrå-agar ved 32°C. Skrå-mediet inneholdt 3,0 g/l gjærsoppekstrakt, 3,0 g/l maltekstrakt, 5,0 g/l pepton, 10,0 g/l dextrose og 20,0 g/l agar.

Inokulåsjoner ble foretatt ved å overføre organismer med trådsløyfe fra forrådskulturene til 48 timers skrå-substrat og deretter til 125 ml Erlenmeyer-flasker som inneholdt 50 ml av det xyloseholdige kulturmediet (50 g/l xylose, initial pH = 4,5). Disse prekulturer ble ristet ved 28° Q 150 omdreininger pr. minutt i 4 8 timer før bruk.

Eksempel 2- 7

400 milliliters prøver av kulturmediene (50 g/l xylose, initial pH = 4,5) , som er fremstilt i eksempel 1 og plassert i 500 ml Erlenmeyer-flasker, ble innokulert med en tilstrekkelig mengde av gjærsopp-prekulturen for å resultere i en initial-gjærsoppdensitet på 0,01 g/l. Flaskene ble lukket med bomullspropper som var overtrukket med gassbind for å tillate effektiv oksygenoverføring, og ble rystet ved 200 omdreininger pr. minutt i ca. 160 timer i en "Nev/ Brunswick Aquatherm" vannbad-ryster. Prøver på mindre enn 4 ml ble periodisk tatt for analyse. De maskimale hastigheter for cellevekst, xylose-forbruk og etanolproduksjon pr. celleenhet samt'.1 det totale etanolutbytte ble bestemt som funksjon av temperaturen. Resultatene vises i nedenstående tabell I.

Ekesempel 8

I den hensikt å få bekreftet at den erholdte etanol var et produkt fra xylose-omdanningen, ble samme prosedyre som i eksempel 4 utført ved 25°C bortsett fra at xylose ble sløy-fet i mediet. Det xylosefrie mediet resulterte i at ingen etanol ble produsert, og det tillot en vekst av gjærsopp- bestanden ■ til en sluttdensitet på bare 4% av den som ble opp-nådd i eksempel 4, hvor xylose var nærværende i en initial-konsentrasjon på 50 g/l.

Eksemplene 9- 13

Effekten av initial- xylose- konsentrasjonen

Fremgangsmåten fra eksemplene 2-7 ble gjentatt bortsett fra at temperaturen ble holdt konstant ved 25°C (som i eksempel 4), og initial-xylose-konsentrasjonen ble vair ert: Initialhastig-heten for cellevekst, maksimale hastigheter for xylose-forbruk samt etanolproduksjon pr. celleenhet, samt det totale etanolutbytte ble bestemt som en funksjon av initial-xylose-konsentras jonen. Resultatene vises i nedenstående tabell II.

Ekesemplene 14- 17

Effekten av pH

Fremgangsmåten fra eksemplene 2-7 ble gjentatt med temperaturen holdt ved 25°C som i eksempel 4, med unntakelse for at fermenteringene ble utført satsvis med 10 liter kulturmedium, og pH ble regulert innenfor området - 0,05 pH-enheter ved forskjellige forutbestemte verdier ved automatisk tilsetning av IN NaOH. Beluftningshastigheten ble regulert til 0, 7o l/min. og omrøringshastighten til 200 omdreininger pr. minutt i eksempel 14 og 15, og 100 omdreininger pr. minutt i eksemplene 16 og 17. Fermenteringene i eksemplene 14 og 15 ble avsluttet etter 146 timer og fermenteringene ifølge eksemplene 16 og 17 etter 138 timer. De maskimale hastigheter

for cellevekst, xylose-forbruk samt etanolproduksjon pr. celleenhet såvel som det totale etanolutbytte ble bestemt som en funksjon av pH. Resultatene vises i nedenstående tabell III:

Eksemplene 18- 22

Etter å ha avgjort at Pa. tannophilus NRRL Y-2460 vil fermentere xylose til etanol, så ble de gjenværende stammer som er deponert i the Agricultural Research Culture Collection og- '. såc undersøkt med hensyn til krakateristiske trekk ved hjelp av en standard-vurderingsprosedyre. Hver stamme ble testet på et kontrollmedium (ikke karbonkilde), et glykosemedium og et xylosemedium. Et forråds-basismedium ble fremstilt av

4,5 g pulversiert gjærsoppekstrakt, 7,5 g pepton, 1000 ml destillert vann og tilstrekkelig bromtymol-blått for å gi en tilstrekkelig sterk grønn farge. 2 milliliter av dette medium ble plassert i 150 x 12 mm Durham-rør, som er utstyrt med innlegg som måler 50 x 6 mm, og hvoretter det tilsettes destillert vann for kontroll eller 1 ml sterilisert 6%-ig vandig løsning av enten glykose eller xylose. Fermenterings-medium ble deretter innokulert med 0,1 ml cellesuspensjon

som var fremstilt ved å suspendere veksten av en 48 timer skråagar_av maltekstrakt-gj ærsoppekstrakt i 4,5 ml sterilisert destillert vann. Kulturene ble innkubert ved 28°C i 61

dager. Rørene ble periodisk rystet og visuelt inspektert med henblikk på forekomst av gass i innleggene som en indikator på fermenteringsgraden. Basert på tidligere studier av stammen Y-2460 ble gassen antatt å være CG^. Resultatene vises i nedenstående tabell IV. Alle kontroller under for-søket ga negative resultater med hensyn til gass.

Eksempel 23

Et kulturmedium ble fremstilt, og som inneholdt følgende kom-ponenter :

Vann,xylose og salt-aminosyre-blanding ble blandet og sterilisert. Etter at blandingen ble avkjølt til romtemperatur ble vitamin-mineral-blandingen tilsatt, og mediet ble plassert i en 10 liter fermenteringsbeholder. Mediet ble deretter inokulert med Pa. tannophilus Y-2460 ved tilsetning av 1 1 av en 48 timer gammel gjærsopp-malt-prekultur som inneholdt 3 g/l gjærsoppekstrakt, 3 g/l maltekstrakt, 10 g/l dekstrose og 5 g/l pepton. Kulturen ble innkubert ved 28°C

i 14 dager og ble undersøkt regelmessig med hensyn til xylose, etanol og pH. Resultatene vises i nedenstående tabell V. Minskningen i etanolinnhold etter 6.e dagen skyldes for-dampning fra mediet og muligens assimilasjon foretatt av gjærsopp-ceIlene.

Eksemplene 24- 33

Virkningen av Pa. tannophilus pg dens kompatibilitet i blandet kultur ble bekreftet ved hjelp av følgende forsøk. En serie på tre kulturmedia ble fremstilt ifølge eksempel 1,

men med den forandring at karbonkilden ble variert. Et medium inneholdt 50 g/l D-xylose, et. annet inneholdt 5.0;g/l dekstrose og det tredje inneholdt en blanding av 50 g/l D-xylose og 50 g/l dekstrose. Det ble tilberedt tre flasker hver av de nevnte sukker-media og 4 flasker med det blandede mediet. FLaskene ble hver inokulert med enten Pa. tannophilus NRRL Y-2460 eller Saccharomyces uvarum NRRL-1347 eller en blanding derav ved hjelp av sløyfe fra skråkulturer som var in-kubert ved 32°C 2 dager og deretter fått. stå ved romtemperatur inntil videre bruk. De inokulerte flasker ble rystet med hastighet på .100 omdreininger pr. minutt ved konstant temperatur på 28°C i 4 dager, hvoretter etanolinnholdet ble bestemt. Resultatene fremgår av nedenstående tabell VI.

De ovenstående ekesmpler skal kun tjene til å illustrere oppfinnelsen, og det er åpenbart for fagmannen at det vil være mange muligheter for modifikasjoner og variasjoner innenfor oppfinnelsens ramme.

Claims (11)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av etanol fra et xyloseholdig materiale, karakterisert ved at det foretas a) inokulering av et medium, som inneholder nevnte materialer, med gjærsoppen Pachysolen tannophilus; b) fermentering av nevnte materiale i nevnte inokulerte medium under betingelser som er gunstige for cellenes levedyktighet og for omdanning av xylose til etanol av gjærsoppen, hvorved mediet anrikes på etanol og c) utvinning av det etanol-anrikede mediet fra fermenteringstrinnet b).

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den anvendte gjærsoppen Pachysolen tannophilus er en stamme som er utvalgt fra en gruppe bestående av NRRL-2460, NRRL 2461, NRRL Y-2462, NRRL Y-2463 og NRRL Y-6704.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det anvendte xyloseholdige materiale er et lignocelluloseholdig spaltningsprodukt.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det anvendte xyloseholdige materiale er et hemicellulosehydrolysat.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at mediet fra fremgangsmåtetrinn a) også inneholder glykose og at fermenteringsbetingelsene ved fremgangsmåtetrinn b) også er gunstige for fermentering av ovenfor nevnte glykose til etanol.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at fermenteringsbetingelsene ved fremgangsmåten b) også er gunstige for cellevekst.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at mediet blir oksygenert, at pH reguleres innenfor området ca. 2 til 7, og at temperaturen holdes i området fra ca. 10 til ca. 35°C.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved atpH reguleres ved ca. 2,5 og at temperaturen holdes på ca. 32°C.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at før inokuleringen i fremgangsmåte trinn a) så forekommer xylose i nevnte medium ved en konsentrasjon på mindre enn 150 g/l.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at nevnte konsentrasjon er ca. 50 g/l.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at fremgangsmåten ytterligere består av Sn arbeidsoperasjon med å isolere vandig etanol fra det ut-vunnede etanol-anrikede mediet.