BR102020022469A2 - Processo para produzir enzimas com uma cepa pertencente a um fungo filamentoso - Google Patents

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Abstract

processo para produzir enzimas com uma cepa pertencente a um fungo filamentoso. a presente invenção refere-se a um processo para a produção de enzimas celulolíticas e/ou hemicelulolíticas com uma cepa de micro-organismo pertencente à família dos fungos filamentosos, o dito processo compreendendo as seguintes etapas: (a) uma primeira etapa de crescimento dos fungos em um meio de cultura aquoso, na presença de pelo menos um substrato de crescimento com base em carbono, em um biorreator agitado e aerado, (b) uma segunda etapa de produção de enzimas, começando com o meio de cultura aquoso obtido na primeira etapa (a), na presença de pelo menos um substrato com base em carbono indutivo que induz também à produção de hidrofobinas, e, em uma etapa (d), pelo menos uma parte das hidrofobinas produzidas na etapa (b) são reintroduzidas na etapa de crescimento (a).

Description

PROCESSO PARA PRODUZIR ENZIMAS COM UMA CEPA PERTENCENTE A UM FUNGO FILAMENTOSO
[0001] A invenção refere-se a um processo para a produção de celulases com um fungo filamentoso, necessário para a hidrólise enzimática de biomassa lignocelulósica usada, por exemplo, em processos para a produção de licores açucarados de "segunda geração" (2G). Estes licores açucarados podem ser usados para produzir outros produtos por meio de uma via química ou bioquímica/fermentação (por exemplo, álcoois, tais como biocombustíveis de etanol ou então butanol ou outras moléculas, por exemplo, solventes, tais como acetona e outras moléculas de base biológica, etc.). As celulases também podem ser usadas em outros processos, particularmente na indústria química, de papel ou têxtil.
[0002] O desenvolvimento de processos economicamente viáveis para a produção de biocombustíveis de segunda geração (2G), para pegar este exemplo particular de implementação, é o assunto de numerosos estudos. Estes biocombustíveis são particularmente produzidos a partir de substratos lenhosos, tais como várias madeiras (madeira dura e macia, miscanthus ou SRC, a qual é a abreviatura de Short-Rotation Coppice), subprodutos agrícolas (palha de trigo, palha de arroz, espigas de milho, etc.) ou subprodutos de outras indústrias agroalimentares, de papel, etc. Eles colocam menos problemas de competição com lavouras de subsistência pelo uso de terras agrícolas quando comparado com os biocombustíveis de "primeira geração" que são produzidos a partir da cana-de-açúcar, milho, trigo ou beterraba.
[0003] A biomassa lignocelulósica é caracterizada por uma estrutura complexa composta por três frações principais: celulose (35% a 50%), a qual é um polissacarídeo essencialmente constituído de hexoses; hemicelulose (20% a 30%), o qual é um polissacarídeo essencialmente constituído por pentoses; e lignina (15% a 25%), a qual é um polímero de estrutura complexa e de elevado peso molecular composto por álcoois aromáticos ligados por ligações de éter. Estas várias moléculas são responsáveis pelas propriedades intrínsecas da parede da planta e se organizam em um complexo emaranhado. Dentre os três polímeros base que compõem a biomassa lignocelulósica, a celulose e a hemicelulose são as que possibilitam a produção de licores açucarados 2G.
[0004] Convencionalmente, o processo de transformação da biomassa em biocombustível de etanol envolve várias etapas: O prétratamento torna a celulose acessível às enzimas celulase. A etapa de hidrólise enzimática permite a transformação da celulose em açúcares, tal como glicose que são, então, transformados em etanol durante a etapa de fermentação, geralmente com a levedura Saccharomyces cerevisiae. Por fim, a etapa de destilação permite separar e recuperar o etanol do mosto fermentado.
[0005] Deve ser observado, conforme mencionado acima, que também pode ser escolhido parar o processo na produção de açúcares monoméricos, tais como glicose, xilose, etc., a fim de atualizá-los como tal ou, então, processá-los de forma diferente a fim de obter outros álcoois ou moléculas de base biológica.
Estado da Técnica
[0006] Diversos estudos técnico-econômicos demonstram que a redução do custo das celulases é um dos pontos-chave nos processos de produção biológica de etanol a partir de matérias-primas lignocelulósicas. Atualmente, as celulases industriais são produzidas principalmente por um fungo filamentoso, Trichoderma reesei, em virtude de seu alto poder secretor
[0007] Desde a década de 1970, a transformação de materiais lignocelulósicos em etanol, após a hidrólise dos polissacarídeos constituintes em açúcares fermentáveis, tem sido objeto de numerosos estudos. Pode-se citar, por exemplo, os estudos de referência do National Renewable Energy Laboratory (Process Design and Economics for Biochemical Conversion of Lignocellulosic Biomass to Ethanol, Humbird et al., NREL/TP-5100-57764, maio de 2011).
[0008] Os materiais lignocelulósicos são materiais com base em celulose, isto é, materiais que consistem em mais de 90% em peso de celulose e/ou são materiais lignocelulósicos, isto é, materiais que consistem em celulose, hemiceluloses, os quais são polissacarídeos que consistem essencialmente em pentoses e hexoses, e também lignina, a qual é uma macromolécula de estrutura complexa e de elevado peso molecular com base em compostos fenólicos.
[0009] Madeira, palha e espigas de milho são os materiais lignocelulósicos mais comumente usados, mas outros recursos, plantações florestais dedicadas, resíduos de plantas produtoras de álcool, açúcar e cereais, produtos e resíduos da indústria de papel e produtos da transformação de materiais lignocelulósicos são utilizáveis. Eles são, em sua maioria, constituídos por cerca de 35% a 50% de celulose, 20% a 30% de hemicelulose e 15% a 25% de lignina.
[0010] O processo para a transformação bioquímica de materiais lignocelulósicos em etanol compreende uma etapa de pré-tratamento físico-químico, seguida de uma etapa de hidrólise enzimática usando um coquetel enzimático, uma etapa de fermentação etanólica dos açúcares liberados, a fermentação etanólica e a hidrólise enzimática sendo possivelmente conduzidas simultaneamente, e uma etapa de purificação do etanol.
[0011] O coquetel enzimático usado para a hidrólise enzimática é uma mistura de enzimas celulolíticas (também conhecidas como celulases) e/ou enzimas hemicelulolíticas. As enzimas celulolíticas têm três tipos principais de atividades: endoglucanases, exoglucanases e celobiases, sendo esta última também conhecida como β-glucosidases. Enzimas hemicelulolíticas têm, particularmente, atividades de xilanase.
[0012] A hidrólise enzimática é eficiente e realizada sob condições moderadas. Porém, o custo das enzimas continua muito elevado, representando de 20% a 50% do custo de transformação do material lignocelulósico em etanol. Como um resultado, inúmeros estudos têm sido realizados para reduzir este custo: primeiro, otimização da produção de enzimas por meio da seleção de micro-organismos hiperprodutivos e melhoria dos processos de produção das ditas enzimas, redução da quantidade de enzimas subsequentemente em hidrólise ao otimizar a etapa de pré-tratamento, melhorar a atividade específica destas enzimas e otimizar a implementação da etapa de hidrólise enzimática.
[0013] Numerosos estudos se concentraram na compreensão dos mecanismos de ação e expressão do coquetel enzimático. O objetivo é secretar o coquetel que é o mais adequado para a hidrólise dos materiais lignocelulósicos ao modificar os micro-organismos.
[0014] Trichoderma reesei é o micro-organismo mais amplamente utilizado para a produção de celulases. As cepas do tipo selvagem têm a capacidade de excretar, na presença de um substrato indutivo, por exemplo, celulose, o complexo enzimático considerado o mais adequado para a hidrólise da celulose. As enzimas do complexo enzimático contêm três tipos principais de atividades: endoglucanases, exoglucanases e celobiases e outras proteínas que possuem propriedades essenciais para a hidrólise de materiais lignocelulósicos também são produzidas pelo Trichoderma reesei, por exemplo, xilanases. A presença de um substrato indutivo é essencial para a expressão das enzimas celulolíticas e/ou hemicelulolíticas. A natureza do substrato com base em carbono tem forte influência sobre a composição do complexo enzimático. É o caso das xiloses as quais, quando combinadas com um substrato indutivo com base em carbono, tal como celulose ou lactose, permitem melhorar significativamente a atividade da dita xilanase. A regulação dos genes da celulase em várias fontes de carbono foi estudada em detalhes. Eles são induzidos na presença de celulose, de seus produtos de hidrólise, tal como celobiose, ou de determinados oligossacarídeos, tais como lactose ou soforose (cf. IImén et al., 1997; Appl. Environ. Microbiol. 63. 1298/1306).
[0015] As técnicas convencionais de mutação genética permitiram a seleção de cepas de Trichoderma reesei que hiperproduzem celulases, tais como as cepas MCG77 (Gallo – Patente US 4 275 167), MCG 80 (Allen, A.L. e Andreotti, R.E., Biotechnol.-Bioeng. 1982, 12, 451-459 1982), RUT C30 (Montenecourt, B.S. e Eveleigh, D.E., Appl. Environ. Microbiol. 1977, 34, 777-782) e CL847 (Durand et al., 1984, Proc. Colloque SFM "Génétique des microorganismes industriels [Genetics of Industrial Microorganisms] ". Paris. H. Heslot Ed., páginas 39-50).
[0016] O processo de produção de celulases por Trichoderma reesei tem sido objeto de melhorias substanciais para fins de extrapolação para a escala industrial. Para obter boas produtividades enzimáticas, é necessário fornecer uma fonte de carbono rapidamente assimilável para o crescimento de Trichoderma reesei e um substrato indutivo que permita a expressão das celulases e a secreção no meio de cultura. A celulose pode desempenhar estas duas funções; no entanto, é difícil de usar na fase industrial e tem sido proposto substituíla por fontes de carbono solúveis, tais como glicose, xilose ou lactose, a lactose também atuando como substrato indutivo. Outros açúcares solúveis, tais como celobiose e soforose, foram descritos como indutivos, mas são relativamente caros para uso na fase industrial. Descobriu-se também que as produções de celulases por Trichoderma reesei, com substratos solúveis, são muito inferiores àquelas obtidas com a celulose por "batelada". Isto se deve ao efeito repressor dos açúcares prontamente assimiláveis em alta concentração. A alimentação contínua em modo de batelada alimentada de substratos solúveis com base em carbono tem permitido aumentar a repressão catabólica ao limitar a concentração residual nas culturas e otimizar a quantidade de açúcares, possibilitando obter um melhor rendimento e melhor produtividade enzimática.
[0017] A patente FR-B-2 555 603 propõe um protocolo para chegar a uma concentração de proteína da ordem de 35 a 40 g/L com uma produtividade da ordem de 0,2 g/L/he que consiste em duas etapas: uma primeira etapa de crescimento no modo "em batelada", em que é necessário fornecer uma fonte de carbono rapidamente assimilável para o crescimento de Trichoderma reesei e, então, uma etapa de produção no modo de “batelada alimentada” usando um substrato indutivo (por exemplo: lactose) que permita a expressão das celulases e a secreção no meio de cultura. O fluxo ideal aplicado está entre 35 e 45 mg.g-1 .h-1 (miligramas de substrato indutivo por miligrama de biomassa e por hora). Também pode ser feita menção à patente EP-B-2 744 899, a qual propõe uma melhoria na mesma, particularmente ao selecionar um biorreator que tem um coeficiente particular de transferência volumétrica de oxigênio kLa, combinado com uma seleção particular tanto da concentração do substrato de crescimento com base em carbono na primeira etapa como um nível de fluxo que limita a fonte de carbono na segunda etapa.
[0018] Além disso, o fungo filamentoso Trichoderma reesei é conhecido por sua natureza estritamente aeróbia: ele tem pouca tolerância a uma falta de oxigênio dissolvido. É possível definir uma concentração mínima de oxigênio dissolvido que permita um cultivo satisfatório, esta concentração estando, em geral, entre 1 e 5 mg/L.
[0019] Conforme detalhado no artigo de 2012 de Gabelle J.-C., Jourdier E., Licht R.B., Ben Chaabane F., Henaut I., Morchain J. e Augier F. "Impact of rheology on the mass transfer coefficient during the growth phase of Trichoderma reesei in stirred bioreactors" (Chemical Engineering Science 75 (2012) 408-417), para realizar a cultura sob boas condições de oxigenação, o reator usado (também conhecido como fermentador) é geralmente projetado e operado de modo a ser capaz de realizar uma transferência de oxigênio suficiente para atingir a concentração mínima de oxigênio dissolvido supracitada ao longo da cultura. Agora, ao longo de todo o processo de produção da enzima, o qual compreende a etapa de crescimento dos fungos e, em seguida, a etapa de produção da enzima propriamente dita, a parte mais intrincada para respeitar este critério de concentração mínima de oxigênio dissolvido mostrou ser o final da etapa de crescimento, já que este é o momento em que a demanda de oxigênio é maior e o momento no qual a viscosidade da fermentação tende a ser maior.
[0020] Agora, sabe-se que a viscosidade tem um impacto negativo sobre a transferência de oxigênio (Gabelle et al., 2011 - Gabelle J.C., Jourdier E., Licht R.B., Ben Chaabane F., Henaut I., Morchain J. e Augier F. (2012) Impact of rheology on the mass transfer coefficient during the growth phase of Trichoderma reesei in stirred bioreactors. Chemical Engineering Science 75, 408-417): quanto mais a concentração de biomassa aumenta, mais o fluxo de oxigênio a ser transferido tende a aumentar, porém, mais difícil será esta transferência em virtude de tal aumento de viscosidade, o que pode tornar necessário adaptar as condições de operação. O fluxo de oxigênio transferido de uma fase gasosa para um líquido é condicionado por vários parâmetros, tais como a pressão parcial de oxigênio na fase gasosa, a pressão no reator, a vazão de ar injetado, a concentração de oxigênio dissolvido e a energia dissipada por agitação mecânica, se houver, no fermentador.
[0021] Em geral, o gás injetado é o ar, por questões econômicas. Além disso, a pressão só pode ser aumentada em alguns bar uma vez que, além disso, a concentração de CO2 dissolvido pode inibir a cultura. Estas duas alavancas de ação têm impacto direto sobre a viabilidade de produção da enzima, visto que aumentam potencialmente o consumo de energia, ou mesmo os investimentos, para as instalações que realizam este processo.
[0022] Em um determinado fermentador que tem capacidades máximas de aeração e agitação bem conhecidas, não é previsível exceder uma determinada concentração de biomassa ao final do crescimento. A razão para isto é que, uma vez que a aeração e agitação tenham sido levadas ao seu nível máximo, visto que a concentração mínima necessária de oxigênio dissolvido tenha sido alcançada, qualquer aumento na concentração de biomassa induziria tanto a um aumento na demanda de oxigênio quanto um aumento da viscosidade, levando a uma diminuição da concentração de oxigênio dissolvido, o que pode prejudicar o rendimento geral da fermentação. Vê-se, portanto, que a necessidade desta transferência de oxigênio para a fase líquida no fermentador cria restrições industriais/econômicas que têm um impacto sobre o rendimento geral de produção da enzima.
[0023] Além disso, é prática conhecida a partir do pedido de patente EP-1 204 738 modificar geneticamente cepas fúngicas, particularmente do tipo Trichoderma e, mais particularmente, as sequências de DNA das mesmas que codificam hidrofobinas, a fim de evitar que as cepas secretem estas hidrofobinas, especialmente HFBIIs que são consideradas responsáveis pela formação de espuma. Porém, qualquer solução que envolva modificações genéticas é trabalhosa de implementar, uma vez que requer que tais modificações genéticas sejam realizadas em cada uma das cepas de interesse.
[0024] O objetivo da invenção é, assim, um processo aprimorado para a produção de enzimas o qual se destina particularmente a superar as desvantagens supracitadas. O objetivo da invenção é, particularmente, melhorar a produtividade do processo, principalmente ao melhorar/aumentar a transferência de oxigênio para a fase líquida do reator usando-o sem adicionar/ao mesmo tempo que limita qualquer restrição adicional sobre as condições de operação ou a concepção do reator.
[0025] O objetivo da invenção é, primeiramente, um processo para a produção de enzimas celulolíticas e/ou hemicelulolíticas com uma cepa de micro-organismo pertencente à família dos fungos filamentosos, de modo que o dito processo compreenda (por exemplo, consista em) as seguintes etapas:
  • (a) uma primeira etapa de crescimento dos fungos em um meio de cultura aquoso, na presença de pelo menos um substrato de crescimento com base em carbono, em um biorreator agitado e aerado, particularmente em fase em batelada,
  • (b) uma segunda etapa de produção de enzimas, começando com o meio de cultura aquoso obtido na primeira etapa (a), na presença de pelo menos um substrato com base em carbono indutivo que induz também à produção de hidrofobinas,
e em que, em uma etapa (d), pelo menos uma parte das hidrofobinas produzidas na etapa (b) é reintroduzida na etapa de crescimento (a).
[0026] Os inventores, na verdade, estudaram a transferência de oxigênio entre uma fase líquida (o meio de cultura) e uma fase gasosa (oxigênio ou, de maneira mais geral, ar) ao fornecer o oxigênio necessário para que os fungos cresçam e produzam as enzimas desejadas, esta transferência envolvendo muitos parâmetros físicos. Descobriu-se que uma magnitude de grande importância na transferência de oxigênio é o tamanho das bolhas. Especificamente, quanto menores as bolhas, mais superfície de troca o ar injetado gerará. Na verdade, é principalmente por esta razão que um dispositivo de agitação é frequentemente usado em fermentadores para reduzir o tamanho da bolha e, assim, aumentar a transferência de oxigênio. Dois fenômenos governam o tamanho da bolha em um reator gás-líquido ou fermentador: a ruptura das bolhas e sua coalescência. Eles permitem, respectivamente, reduzir e aumentar o tamanho da bolha e, assim, aumentar e reduzir a transferência de massa. Assim, os inventores consideraram que se, através de um meio particular, o fenômeno de coalescência fosse reduzido, isto tornaria possível aumentar a transferência de massa e, portanto, a concentração máxima de biomassa alcançável em um determinado fermentador, ao mesmo tempo em que mantém o oxigênio dissolvido acima do valor mínimo exigido.
[0027] Há muitas moléculas que podem bloquear parcialmente a coalescência de bolhas em meio aquoso, tais como tensoativos, por exemplo, Dodecil Sulfato de Sódio (SDS) ou Albumina de Soro Bovino (BSA). Estas moléculas, no entanto, têm o inconveniente de gerar espuma substancial nestes meios de fermentação, o que é um problema real na implementação industrial do processo, e também têm um impacto negativo em termos dos custos com materiais de partida.
[0028] Por fim, os inventores observaram que o fungo Trichoderma reesei produz numerosas proteínas durante a etapa de crescimento e, principalmente, durante a etapa de produção. Dentre estas proteínas, a família de moléculas conhecidas como hidrofobinas se mostrou de interesse particular. Especificamente, estas moléculas têm um impacto considerável sobre a coalescência e, portanto, o tamanho das bolhas, e sua presença aumenta substancialmente o desempenho de transferência. No entanto, elas apresentam a desvantagem de serem secretadas predominantemente durante a etapa de produção, enquanto que a transferência gás-líquido é um fenômeno substancial, sobretudo na etapa de crescimento e não na etapa de produção.
[0029] A presente invenção explorou, assim, esta propriedade das hidrofobinas extraindo-as ao final da fase de produção para reinjetá-las na fase de crescimento. As hidrofobinas produzidas na fase de produção são, por assim dizer, recicladas para a fase de crescimento. Esta solução tem muitas vantagens: as hidrofobinas desempenham seu papel de limitar a coalescência na fase de crescimento, o que acaba por permitir reduzir os custos associados ao meio de agitação (custo do equipamento e custo da energia) e/ou ter uma maior concentração de fungos para um determinado volume/tipo de reator.
[0030] Deve ser destacado também que a invenção não dá origem a nenhuma complicação significativa na implementação do processo de produção da enzima e não obriga a quaisquer modificações genéticas específicas nos micro-organismos.
[0031] A invenção propõe diferentes variantes/diferentes modalidades para a extração das hidrofobinas do meio de produção, com vários tipos de separação possíveis.
[0032] De preferência, o processo de acordo com a invenção compreende, após a etapa de produção da enzima (b) e antes da etapa (d) de reintrodução das hidrofobinas, pelo menos uma etapa (c) de separação das hidrofobinas, particularmente na fase líquida, a qual é realizada no meio de cultura da etapa de produção (b), particularmente por meio de uma ou mais filtrações sucessivas do dito meio de cultura.
[0033] De acordo com uma primeira variante, a etapa (c) de separação das hidrofobinas é realizada por meio da separação direta de pelo menos uma parte das hidrofobinas em fase líquida do meio de cultura da etapa de produção (b). As hidrofobinas são, portanto, separadas diretamente (por exemplo, através de filtração) do meio de cultura de fermentação, e os fungos (alternativamente denominados como biomassa celular no presente texto) e as enzimas são deixados juntos para seu uso subsequente combinado em um processo de conversão de biomassa lignocelulósica: especificamente, sob determinadas configurações, a hidrólise enzimática da biomassa lignocelulósica pode ser realizada colocando em contato com um mosto de fermentação proveniente da mistura de fungos e enzimas que foi produzida sem a necessidade de separar os fungos das enzimas.
[0034] De acordo com uma segunda variante, o processo compreende, após a etapa de produção (b) e antes da etapa (d) de reintrodução das hidrofobinas, uma etapa de separação (c) que compreende uma primeira subetapa (c1) de separação, por um lado, entre os fungos e, por outro lado, o restante do meio de cultura e, então, uma segunda subetapa (c2) de separação do dito restante do meio de cultura, por um lado, entre as hidrofobinas, particularmente na fase líquida, e, por outro lado, as enzimas. Pretende-se, assim, nesta variante, separar primeiro os fungos do meio de cultura, por exemplo, através de filtração, o que permite recuperar um filtrado rico em enzimas e em hidrofobinas, e depois separar as enzimas das hidrofobinas, o que o torna possível recuperar, se esta separação for realizada através de filtração, um filtrado rico em hidrofobinas (e pobre em enzimas) que poderá ser usado, total ou parcialmente, na etapa de crescimento, enquanto que as enzimas assim isoladas poderão ser usadas para a hidrólise enzimática de biomassa lignocelulósica.
[0035] De acordo com uma modalidade preferida, a etapa (c) de separação das hidrofobinas (seja do restante do meio de cultura ou das enzimas de acordo com as duas variantes supracitadas) compreende pelo menos uma ultrafiltração das hidrofobinas do meio líquido no qual elas estão presentes para isolar as hidrofobinas do filtrado em fase líquida. Esta ultrafiltração é, de preferência, realizada com uma membrana de filtração que tem um limite de corte entre 3 e 30 kDa, particularmente entre 5 e 15 kDa. Especificamente, uma característica muito vantajosa no contexto da presente invenção em relação às hidrofobinas, e particularmente à molécula HFBII, é que elas são muito menores do que enzimas, tais como celulases ou hemicelulases, cerca de 7 kDa em oposição a 30 a 100 kDa, particularmente para celulases, o que torna a separação destas moléculas através de filtração/ultrafiltração inteiramente adequada, embora qualquer outra técnica de separação conhecida também possa ser usada: deste modo, as membranas filtram no retentado todos os componentes com um tamanho maior do que as hidrofobinas as quais podem, então, ser isoladas e coletadas do filtrado em fase líquida.
[0036] De preferência, a subetapa (c1) de separação entre os fungos e o restante do meio de reação de acordo com a segunda variante é realizada através de filtração, particularmente com um filtroprensa, embora também possa ser usada qualquer outra técnica de separação conhecida.
[0037] De preferência, o processo de acordo com a invenção compreende, e de preferência consiste, nas etapas a) de crescimento, b) de produção, c) de separação, seja em uma única etapa ou, em particular, consistindo na subetapa c1 e, em seguida, a subetapa c2 e d) de reintrodução das hidrofobinas na etapa a).
[0038] Independentemente da maneira pela qual as hidrofobinas são separadas do meio de cultura, de preferência, as hidrofobinas isoladas após a separação (c) e antes da reintrodução (d) no meio de cultura da etapa (a) estão em fase líquida, com armazenamento intermediário opcional, e diluição e/ou concentração intermediária opcional. Seu manuseio e sua introdução na etapa de crescimento (a) são assim facilitados, ainda mais quando a fase líquida em questão é uma fase aquosa obtida a partir de filtração do meio de cultura da etapa de produção (b): esta fase aquosa é, assim, um complemento ou mesmo uma substituição da fase aquosa do meio de cultura da etapa (a), a qual equivale a reciclagem da água do meio de produção para o meio de crescimento.
[0039] Vantajosamente, as hidrofobinas produzidas na etapa de produção (b) que são reintroduzidas na etapa de crescimento (a) são predominantemente, particularmente de forma essencial, hidrofobinas de tipo II. Dentre as hidrofobinas, a molécula de HFBII é, na verdade, uma molécula predominante que tem um forte impacto sobre o tamanho da bolha.
[0040] A etapa de crescimento (a) e/ou a etapa de produção (b) podem ser realizadas no modo em batelada, descontínuo ou modo contínuo ou vários destes modos sucessivamente.
[0041] Na etapa (d), as hidrofobinas podem ser reintroduzidas no meio de cultura da etapa de crescimento (a) através de diversas formas: continuamente, em uma única porção (no início ou durante a etapa de crescimento (a)) ou sequencialmente ao longo de toda ou parte da duração da dita etapa de crescimento (a). Conforme mencionado acima, o armazenamento intermediário pode ser considerado, por exemplo, ao fornecer um tanque de armazenamento.
[0042] De preferência, as hidrofobinas produzidas na etapa de produção (b) são reintroduzidas na etapa de crescimento (a) na forma de um filtrado em fase aquosa obtido a partir do meio de cultura da etapa (b), a água do meio de cultura da etapa de crescimento (a) proveniente total ou parcialmente do dito filtrado.
[0043] De preferência, as hidrofobinas são reintroduzidas na etapa de crescimento (a) em solução em um meio aquoso em uma concentração entre 10 e 400 mg/l, de preferência entre 50 e 200 mg/l. Assim, quando elas são extraídas do meio de cultura através de filtração, elas já estão nesta faixa de concentração no filtrado aquoso obtido e em uma concentração adequada, ou este filtrado pode, antes de reintrodução no meio de crescimento, ser diluído ou concentrado para atingir esta faixa ou atingir um valor de concentração diferente dentro desta faixa.
[0044] De preferência, durante a primeira etapa de crescimento (a), a concentração de substrato de crescimento com base em carbono é escolhida entre 15 e 100 g/l, particularmente entre 15 ou 20 e 60 g/l.
[0045] De preferência, a segunda etapa de produção (b) é realizada com uma corrente limitante de substrato indutivo com base em carbono, particularmente entre 30 e 140 mg.g-1 .h-1 (isto é, entre 30 e 140 mg por grama de biomassa e por hora), de preferência entre 35 e 45 mg.g-1 .h-1 e, de preferência, com uma solução aquosa de substrato(s) com base em carbono em uma concentração entre 200 e 700 g/l. Esta solução de substrato(s) com base em carbono compreende pelo menos um substrato indutivo com base em carbono, o qual pode ser escolhido a partir de lactose, soforose, celulose, celobiose, um bagaço de celulose ou uma mistura de pelo menos dois dos mesmos.
[0046] Vantajosamente, a cepa usada é uma cepa de Trichoderma reesei ou de Trichoderma reesei modificada por meio de mutação seletiva ou recombinação genética. Ela pode ser particularmente a cepa CL847, RutC30, MCG77 ou MCG80 supracitada. No entanto, nem é preciso dizer, e ao contrário dos ensinamentos do pedido de patente EP-1 204 738 supracitado, as mutações previstas no contexto da invenção não têm a finalidade, muito pelo contrário, de evitar a formação de hidrofobinas durante o crescimento da dita cepa.
[0047] Opcionalmente, o processo de acordo com a invenção pode compreender uma etapa intermediária entre a etapa (a) e a etapa (b), esta etapa intermediária sendo uma etapa de diluição do meio de cultura obtido na etapa de crescimento (a).
[0048] Além disso, a etapa de crescimento (a) e a etapa de produção (b) podem ser realizadas no mesmo biorreator ou em dois biorreatores diferentes, com transferência do meio de reação de um reator para o outro. O primeiro caso é o mais simples: com apenas um reator, a necessidade de transferir o meio de reação é evitada. O segundo caso permite uma adaptação precisa das características e equipamentos de cada um dos biorreatores em função das necessidades de cada uma das etapas. Podem ser usados diferentes tipos de biorreatores, por exemplo, incluindo colunas de bolha.
[0049] Um assunto da invenção é também o uso das enzimas obtidas através do processo descrito acima para a hidrólise enzimática da biomassa celulósica/hemicelulósica terrestre ou marinha.
[0050] Um assunto da invenção é também a instalação de produção que implementa o processo descrito acima, o qual pode compreender um único biorreator para as etapas de crescimento e produção, ou dois biorreatores diferentes, e que está equipado com meios de separação, particularmente meios de filtração, capazes de isolar as hidrofobinas produzidas na fase de produção, particularmente como meios de ultrafiltração.
[0051] As hidrofobinas podem ser reintroduzidas diretamente de um reator para outro, particularmente quando dois reatores diferentes são usados para cada uma das etapas de crescimento e produção.
[0052] Pode ser fornecido um recipiente intermediário no qual as hidrofobinas retiradas na fase de produção são armazenadas, para reintroduzi-las posteriormente na fase de crescimento (no mesmo reator ou em um reator diferente).
[0053] Uma solução intermediária também pode ser fornecida, em parte com armazenamento temporário das hidrofobinas retiradas na fase de produção para uso subsequente e em parte com reintrodução direta na fase de crescimento em um reator.
[0054] A invenção será descrita abaixo em maiores detalhes com o auxílio de exemplos de implementação não limitativos.
Lista de Figuras Figura 1
[0055] A Figura 1 é um diagrama de blocos de um processo de produção de enzima de acordo com uma primeira variante da invenção.
Figura 2
[0056] A Figura 2 é um diagrama de blocos de um processo de produção de enzima de acordo com uma segunda variante da invenção.
Figura 3
[0057] A Figura 3 é um gráfico que representa, no eixo x, a concentração de fungos (biomassa celular) em g/l e, no eixo y, o kLa correspondente em h-1 para água (curva C0) e para o Exemplo 1 e o Exemplo 2 descritos abaixo (curvas C1 e C2, respectivamente).
Descrição das Modalidades
[0058] A Figura 1 corresponde à primeira variante do processo de produção de enzima de acordo com a invenção. As moléculas limitadoras de coalescência são hidrofobinas produzidas durante a fase de limitação do substrato com base em carbono. O processo envolve:
  • - uma etapa (a) de cultivo dos fungos
  • - e, então, uma etapa de crescimento (b)
  • - de acordo com a invenção, acrescenta-se uma etapa (c) de separação através de ultrafiltração que permite a obtenção, por um lado, de um retentado F + E rico em fungos e em enzimas produzidas pelos mesmos e, por outro lado, um filtrado que contém água (o meio de cultura das etapas (a) e (b) é aquoso) enriquecido em hidrofobinas. Este filtrado é, então, reinjetado na etapa de crescimento (a). Antes da reinjeção, ele pode ser diluído ou, mais frequentemente, concentrado, podendo também ser temporariamente armazenado.
[0059] Nesta variante, as hidrofobinas são filtradas diretamente do meio de fermentação e os fungos e enzimas são mantidos juntos. Esta variante é particularmente vantajosa quando o processo a jusante usando as enzimas pode explorar estas enzimas sem separação prévia dos fungos: apenas uma separação é necessária para realizar a invenção.
[0060] A Figura 2 corresponde a uma segunda variante do processo de acordo com a invenção. A etapa de crescimento (a) e, em seguida, a etapa de produção (b) são encontradas. Duas separações sucessivas de acordo com a invenção são previstas aqui: primeiro uma separação (c1), por exemplo, através de filtração com um filtro-prensa, permitindo separar, por um lado, um retentado F rico em fungos e, por outro lado, um filtrado enriquecido em enzimas e hidrofobinas. Em seguida, este filtrado é submetido a uma separação (c2) através de ultrafiltração que permite recuperar, por um lado, um retentado enriquecido em enzimas e, por outro lado, um filtrado constituído por água e enriquecido em hidrofobinas, este filtrado sendo posteriormente reinjetado, conforme na variante anterior, na etapa de crescimento (a).
[0061] As enzimas foram, assim, separadas aqui do restante do meio de cultura, o que é vantajoso quando o processo a jusante usa estas enzimas na forma pura ou para comercializá-las.
[0062] Nestas duas variantes, particularmente, mas para qualquer outra variante da invenção, há uma separação na etapa de produção (b). Deve ser observado que esta separação ocorre preferencialmente ao final da etapa (b) e que esta reinjeção ocorre preferencialmente no início da etapa (a). No entanto, também é possível realizar a separação por meio de métodos diferentes de filtração e também é possível que a separação seja realizada ao longo da etapa (b) ou ao longo de apenas uma parte de sua duração. Da mesma forma, a reinjeção das hidrofobinas na etapa (a) também pode ocorrer gradualmente ao longo de toda ou parte da duração da etapa (a).
[0063] As hidrofobinas são, de preferência, reintroduzidas na forma líquida aquosa (são obtidas diretamente nesta forma, realizando as separações através de filtração). Após o ajuste da concentração na fase líquida, esta fase líquida pode até mesmo substituir totalmente a água usada para o meio de cultura da etapa de crescimento (a).
Exemplos de Implementação
[0064] Foram realizados dois crescimentos comparativos de Trichoderma reesei em um biorreator de 30 L: o primeiro é realizado com meio de cultura convencional e o segundo é realizado substituindo a água por um filtrado rico em hidrofobinas obtido a partir de uma produção anterior. Este filtrado foi obtido ao filtrar o meio de cultura através de ultrafiltração com membranas que têm um limite de corte de 10 kDa; ele foi, então, concentrado.
[0065] Medições reológicas e medições de kLa são realizadas em ambos os casos. No primeiro caso, descobriu-se que a viscosidade afeta muito a transferência de oxigênio (conforme demonstrado no artigo de 2012 citado acima de Gabelle J.-C.). No segundo caso, apesar da alta viscosidade, o fornecimento de hidrofobinas tem um impacto positivo sobre o kLa do meio, o qual se torna equivalente ou até superior àquele da água, obtido sob as mesmas condições de agitação e aeração.
[0066] A medição de reologia é usada de acordo com o método descrito no seguinte artigo: Nicolas Hardy, Frédéric Augier, Alvin W. Nienow, Catherine Béal, Fadhel Ben Chaabane. Scale-up agitation criteria for Trichoderma reesei fermentation: Chemical Engineering Science, Elsevier, 2017, 172, páginas 158- 168(10.1016/j.ces.2017.06.034).
[0067] O cálculo do kLa é realizado através do método conhecido de equilíbrio de gás descrito no artigo supracitado: Gabelle J.C., Jourdier E., Licht R.B., Ben Chaabane F., Henaut I., Morchain J. e Augier F. (2012) Impact of rheology on the mass transfer coefficient during the growth phase of Trichoderma reesei in stirred bioreactors. Chemical Engineering Science 75, 408-417. O reator usado é um biorreator de 30 L. Sua configuração é descrita no mesmo artigo.
Exemplo 1 (Exemplo Comparativo - Invenção Preliminar)
[0068] O crescimento de Trichoderma reesei é realizado no fermentador de 30 L agitado mecanicamente supracitado com um volume de trabalho de 20 L. O meio mineral tem a seguinte composição: KOH 1,66 g/L, 85 % H3PO4 2 mL/L, (NH4)2SO4 2,8 g/L, MgSO4·7 H2O 0,6 g/L, CaCl2 0,6 g/L, MnSO4 3,2 mg/L, ZnSO4·7 H2O 2,8 mg/L, CoCl2 104,0 mg/L, FeSO4·7 H2O 10 mg/L, milhocina 1,2 g/L, antiespumante 0,5 mL/L (que será pelo menos parcialmente consumido pelo microorganismo). A água da rede pública é usada para diluir os vários componentes do meio e encher o reator de forma a obter um volume final de 20 L.
[0069] O fermentador que contém o meio mineral é esterilizado a 120°C durante 20 minutos, a fonte de glicose com base em carbono é esterilizada separadamente a 120 °C durante 20 minutos e depois adicionada sob condições estéreis ao biorreator de modo a obter uma concentração final de 50 g/L. O fermentador é semeado com uma précultura líquida de 1L da cepa de Trichoderma reesei CL847. O meio mineral da pré-cultura é idêntico àquele do fermentador, exceto quanto a adição de ftalato de potássio a 5 g.L-1 para tamponar o pH do meio. O crescimento do fungo em pré-cultivo é realizado usando glicose como substrato com base em carbono na concentração de 30 g.L-1 . O crescimento do inóculo dura 2 a 3 dias e é realizado a 28°C em uma incubadora com agitação. A transferência para o fermentador é realizada quando a concentração de glicose residual é menor do que 15 g/L.
[0070] A etapa de crescimento é realizada durante 50 horas no biorreator agitado de 30 L em uma temperatura de 27°C e um pH de 4,8 (ajustado com amônia aquosa a 5,5 M). A aeração é de 0,5 vvm (volume/volume/minuto) e a porcentagem de concentração de oxigênio dissolvido em relação a saturação no meio líquido é ajustada para 40%. O fermentador está equipado com um agitador que contém dois propulsores com pás retas inclinadas que giram em uma velocidade de 1200 rpm.
[0071] Amostras são coletadas regularmente para monitorar a reologia do meio e a concentração de biomassa celular. Uma vez que não existem componentes insolúveis no meio de cultura, o peso seco, determinado através de filtração e secagem em um peso constante, representa a massa fúngica, também conhecida como biomassa celular. Um analisador na saída do biorreator permite monitorar a composição de O2 e CO2 do gás.
[0072] Os equilíbrios de gás permitem calcular continuamente a taxa de consumo de O2, rO2 e o kLa:
[0073] Isto dá, no estado pseudo-estacionário:
rO2= Qentrada*%O2entrada - Qsaída*%O2saída
rCO2 = Qsaída*%CO2saída - Qentrada*%CO2entrada
com:
Qentrada: vazão de ar na entrada mol/h
Qsaída: vazão de ar na saída mol/h
% O2entrada: % molar de O2 na entrada
% O2saída: % molar de O2 na saída
% CO2entrada: % molar de CO2 na entrada
% CO2saída: % molar de CO2 na saída
[0074] O rO2 é usado para calcular o kLa da cultura por meio da combinação dos dois equilíbrios de material de O2 na fase líquida e na fase gasosa no estado pseudo-estacionário:
kLa(t)= rO2/(O2*-O2L)
com:
O2*: concentração de O2 na saturação
O2L: concentração de oxigênio no líquido
[0075] De acordo com a lei de Henry, a concentração máxima de um gás em solução, em equilíbrio com uma atmosfera que contém tal gás, é proporcional à pressão parcial deste gás neste ponto.
[0076] Isto dá, portanto, para o caso de O2:
O2* (mol/m3) = 1,25 pO (bar)
com:
pO: pressão parcial de O2
[0077] Deve ser observado que a pressão parcial de O2 é igual ao produto da fração molar do O2 no gás e da pressão. O O2* em um fermentador industrial é, portanto, máximo na parte inferior do reator (pressão máxima e porcentagem de O2 na entrada de 21%) e mínimo na parte superior (pressão do headspace e porcentagem de O2 no gás na saída). Ele é calculado a cada momento do experimento, uma vez que a composição de O2 do gás que sai diminui em virtude do consumo de O2 pelo micro-organismo. No caso de um reator de laboratório, a diferença de pressão entre a parte superior e a parte inferior do reator é desprezível. A concentração de oxigênio no líquido é calculada por meio de medição com uma sonda de pO2, a qual fornece uma porcentagem de O2 em relação a saturação.
[0078] Assim, durante o crescimento do fungo, foi possível medir, em diferentes momentos, a concentração de biomassa celular (X), a viscosidade (µa) do meio de fermentação em um cisalhamento de 10 s-1 e o coeficiente de transferência de gás-líquido kLa em h-1 .
[0079] As medições de kLa são comparadas com uma medição feita na água, na mesma vazão de ar e na mesma velocidade de agitação. A Tabela 1 abaixo apresenta os resultados para os coeficientes de transferência obtidos durante a fermentação de acordo com ao estado da técnica.
Figure img0001
Figure img0002
[0080] A fase de produção foi, então, realizada em um pH de 4 a 25°C, com uma concentração de lactose de 220 g/L, correspondendo a uma vazão específica de lactose em batelada alimentada de 45 mg por grama de biomassa e por hora.
Exemplo 2 (de acordo com a invenção)
[0081] Um experimento é realizado sob as mesmas condições, mas substituindo a água por uma solução obtida a partir de um experimento anterior de produção de celulase em que uma concentração de 100 mg/L de hidrofobinas HFBII (apenas as HFBIIs foram ensaiadas, é possível que as hidrofobinas usadas também compreendam outros tipos de hidrofobinas, em quantidade menor) foi determinada por meio de HPLC (cromatografia líquida de alto desempenho) com uma coluna Wide Pore C5 (150 x 2,1 mm; 5 µm) e detecção de UV. A filtração foi realizada ao final deste experimento para separar o fungo das celulases, e ultrafiltração com membranas que têm uma porosidade de 10 kDa (as membranas recomendadas são membranas UFX 10 pHt vendidas pela empresa Alfa Laval). As informações do fornecedor devem ser respeitadas para seu uso (condições de pressão, temperatura, etc.). Para o produto, é preferível não exceder 30°C durante esta ultrafiltração, com 20 a 25°C sendo uma faixa de temperatura preferida.
[0082] Após ultrafiltração, os permeados contêm as hidrofobinas. A análise da amostra média do permeado torna possível analisar a amostra. As vazões obtidas são de 20 l/h/m² de membrana. A ultrafiltração permite ser possível concentrar as celulases e recuperar no filtrado um meio que contém hidrofobinas. A concentração de hidrofobinas foi, então, medida novamente por meio de HPLC e está próxima de 100 mg/L. É esta solução que foi usada como água de diluição no biorreator de 30 L. Deve ser observado que foi adicionada água extra, deste modo, diluindo a concentração de hidrofobina no início (tempo T0) do experimento em 25 %.
[0083] As condições de operação são as mesmas do Exemplo 1.
[0084] A fase de produção também é conduzida, após a fase de crescimento, sob as mesmas condições operacionais do Exemplo 1.
[0085] A viscosidade e o coeficiente de transferência são medidos durante o crescimento do fungo. Os resultados obtidos são apresentados na Tabela 2, a qual indica a concentração de biomassa celular (X), a viscosidade do meio de fermentação em um cisalhamento de 10 s-1 (µa) e um coeficiente de transferência gás-líquido kLa em h-1 conforme na Tabela 1 anterior.
Figure img0003
[0086] Uma comparação do desempenho obtido de acordo com os dois Exemplos 1 e 2 é mostrada no gráfico da Figura 3: deve ser observado que os coeficientes de transferência kLa obtidos de acordo com a invenção (curva C1 para o Exemplo Comparativo 1, curva C2 para o Exemplo 2 de acordo com a invenção) são pelo menos duas vezes maiores do que de acordo com o estado da técnica. Dependendo da concentração de biomassa, o coeficiente de transferência algumas vezes é menor e algumas vezes é maior do que aquele medido na água (curva C0) sob as mesmas condições de aeração e agitação.
[0087] Estes exemplos mostram que a transferência de oxigênio é grandemente facilitada pela invenção. Esta vantagem pode ser explorada de várias maneiras, principalmente:
  • - para diminuir a velocidade de agitação no biorreator para atingir o coeficiente de transferência alvo, ao mesmo tempo em que consome menos energia,
  • - para diminuir a vazão de ar no biorreator pelas mesmas razões,
  • - realizar o cultivo com mais biomassa celular, ao mesmo tempo em que permanece acima de uma concentração mínima de oxigênio dissolvido, o que permite aumentar a produtividade dos biorreatores (também conhecidos como fermentadores).
[0088] Descobriu-se também que o desempenho de produção de enzima dos dois exemplos, avaliados ao final da fase de produção, é o mesmo ou praticamente o mesmo para os dois exemplos: estas vantagens não são, portanto, obtidas às custas do desempenho ou do rendimento de produção do processo.
[0089] Uma vez que o coeficiente de transferência kLa é proporcional à potência dissipada por unidade de volume (P/V, expressa em W/m3 ), dentro de uma faixa de potência por unidade de volume P/V entre 0,4 e 0,5 kW/m3 (de acordo com o dito artigo de Gabelle et al. de 2012), o aumento do kLa em um fator de pelo menos 2 permite economizar entre 75 % e 85 % da potência dissipada por unidade de volume, o que é uma enorme economia em escala industrial.
[0090] Além disso, deve ser observado que, embora os Exemplos 1 e 2 usem fontes de carbono específicas para o crescimento e para a produção, a invenção se aplica naturalmente a outras fontes de carbono, tais como açúcares solúveis, por exemplo, lactose, glicose ou xilose. O substrato de crescimento com base em carbono pode ser escolhido a partir de lactose, glicose, xilose, resíduos obtidos após fermentação etanólica de açúcares monoméricos a partir dos hidrolisados enzimáticos de biomassa com base em celulose, e/ou um extrato bruto de pentoses solúveis em água obtidas a partir do pré-tratamento de uma biomassa com base em celulose. O substrato indutivo com base em carbono é, de preferência, escolhido a partir de lactose, celobiose, soforose, resíduos obtidos após a fermentação etanólica de açúcares monoméricos a partir dos hidrolisados enzimáticos de biomassa com base em celulose e/ou um extrato bruto de pentoses solúveis em água obtidas a partir do pré-tratamento de uma biomassa com base em celulose. Este tipo de resíduo/extrato também pode ser usado como fonte de carbono total, isto é, tanto para o crescimento do micro-organismo quanto para a indução do sistema de expressão. Esta fonte de carbono pode ser usada, mais particularmente, por cepas geneticamente melhoradas e principalmente cepas recombinantes.
[0091] Da mesma forma, a invenção também se aplica em condições operacionais diferentes daquelas expressamente previstas nos exemplos. Assim, o pH e a temperatura, para a etapa de crescimento e a etapa de produção, podem ser os seguintes:
  • - pH entre 3,5 e 4,4;
  • - temperatura entre 20 e 35°C.
[0092] O vvm (grau de aeração expresso em volume de ar por volume de meio de reação e por minuto) aplicado durante o processo está entre 0,3 e 1,5 min-1 e a rpm (velocidade de agitação) deve permitir regular a porcentagem de concentração de oxigênio dissolvido em relação a saturação no meio líquido entre 20% e 60% de O2. De preferência, é escolhida uma aeração de 0,3 a 0,5 min-1 e uma agitação que permitam regular a percentagem de concentração de oxigênio dissolvido entre 30% e 40% de O2.
[0093] Dependendo de sua natureza, o substrato com base em carbono escolhido para a produção da biomassa é introduzido no fermentador antes de esterilização ou é esterilizado separadamente e introduzido no fermentador após esterilização. A concentração de substrato com base em carbono está entre 200 e 700 g/L, dependendo do grau de solubilidade dos substratos com base em carbono usados (particularmente em relação ao substrato indutivo que faz parte destes substratos com base em carbono).

Claims (15)

  1. Processo para produção de enzimas celulolíticas e/ou hemicelulolíticas com uma cepa de micro-organismo pertencente à família dos fungos filamentosos, o dito processo compreendendo as seguintes etapas:
    • (a) uma primeira etapa de crescimento dos fungos em um meio de cultura aquoso, na presença de pelo menos um substrato de crescimento com base em carbono, em um biorreator agitado e aerado, particularmente em fase em batelada,
    • (b) uma segunda etapa de produção de enzimas, começando com o meio de cultura aquoso obtido na primeira etapa (a), na presença de pelo menos um substrato com base em carbono indutivo que induz também à produção de hidrofobinas,
    caracterizado pelo fato de que, em uma etapa (d), pelo menos uma parte das hidrofobinas produzidas na etapa (b) ser reintroduzida na etapa de crescimento (a).
  2. Processo, de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que o dito processo compreende, após a etapa de produção da enzima (b) e antes da etapa (d) de reintrodução das hidrofobinas, pelo menos uma etapa (c) de separação das hidrofobinas, particularmente em fase líquida, a qual é realizada no meio de cultura a partir da etapa de produção (b), particularmente por meio de uma ou mais filtrações sucessivas do dito meio de cultura.
  3. Processo, de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado por a etapa (c) de separação das hidrofobinas é realizada por meio de separação direta de pelo menos uma parte das hidrofobinas em fase líquida do meio de cultura da etapa de produção (b).
  4. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que compreende, após a etapa de produção (b) e antes da etapa (d) de reintrodução das hidrofobinas, uma etapa de separação (c) que compreende uma primeira subetapa (c1) de separação, por um lado, entre os fungos e, por outro lado, o restante do meio de cultura e, então, uma segunda subetapa (c2) de separação do dito restante do meio de cultura, por um lado, entre as hidrofobinas, particularmente em fase líquida e, por outro lado, as enzimas.
  5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, caracterizado pelo fato de que a etapa de separação (c) compreende pelo menos uma ultrafiltração das hidrofobinas do meio líquido no qual elas estão presentes de modo a isolar as hidrofobinas do filtrado na fase líquida, a dita ultrafiltração sendo particularmente realizada com uma membrana de filtração que tem um limite de corte entre 3 e 30 kDa, particularmente entre 5 e 15 kDa.
  6. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a subetapa (c1) de separação entre os fungos e o restante do meio de reação é realizada por meio de filtração, particularmente com um filtro-prensa.
  7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 6, caracterizado pelo fato de que as hidrofobinas isoladas após separação (c) e antes de reintrodução (d) no meio de cultura da etapa (a) estão em fase líquida, com opcional armazenamento intermediário, diluição e/ou concentração.
  8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que as hidrofobinas produzidas na etapa de produção (b) que são reintroduzidas na etapa de crescimento (a) são predominantemente, particularmente de forma essencial, hidrofobinas de tipo II.
  9. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a etapa de crescimento (a) e/ou a etapa de produção (b) são realizadas no modo em batelada, descontínuo ou contínuo, ou em vários destes modos sucessivamente.
  10. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que, na etapa (d), as hidrofobinas são reintroduzidas no meio de cultura da etapa de crescimento (a) continuamente, em uma única porção ou sequencialmente ao longo da duração da dita etapa de crescimento (a).
  11. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que hidrofobinas produzidas na etapa de produção (b) são reintroduzidas na etapa de crescimento (a) na forma de um filtrado em fase aquosa obtido a partir do meio de cultura da etapa (b), a água do meio de cultura da etapa de produção (a) proveniente total ou parcialmente do dito filtrado.
  12. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que as hidrofobinas são reintroduzidas na etapa de crescimento (a) em solução em meio aquoso em uma concentração entre 10 e 400 mg/l, de preferência entre 50 e 200 mg/l.
  13. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que, durante a etapa de crescimento (a), a concentração de substrato de crescimento com base em carbono está entre 15 e 100 g/l e em que a etapa de produção (b) é realizada com uma corrente limitante de substrato indutivo com base em carbono, particularmente entre 30 e 140 mg.g-1.h-1 e, de preferência entre 35 e 45 mg.g-1 .h-1 e, de preferência, com uma solução aquosa de substrato(s) com base em carbono em uma concentração entre 200 e 700 g/l.
  14. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a cepa de microorganismo usada é uma cepa de Trichoderma reesei ou Trichoderma reesei modificado por meio de mutação seletiva ou recombinação genética.
  15. Uso de enzimas obtidas através do processo como definido em qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que é para a hidrólise enzimática de biomassa celulósica/hemicelulósica terrestre ou marinha.
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