CN112813056A - 采用丝状真菌菌株生产酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及采用属于丝状真菌家族的微生物菌株生产纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在至少一种碳基生长基质的存在下，在搅拌和曝气生物反应器中，在含水培养基中生长真菌的第一步骤，(b)在至少一种诱导性碳基基质的存在下，从第一步骤(a)中获得的含水培养基开始，生产酶以及诱导产生疏水蛋白的第二步骤，以及，在步骤(d)中，将步骤(b)中产生的疏水蛋白的至少一部分重新引入到生长步骤(a)中。

Description

采用丝状真菌菌株生产酶的方法
技术领域
本发明涉及采用丝状真菌生产纤维素酶的方法，该酶是例如用于生产“第二代”(2G)糖液的方法中的木质纤维素生物质的酶促水解所需的。这些糖液可用于经由化学或生物化学/发酵途径生产其他产物(例如，醇类，例如乙醇生物燃料，或者丁醇或其他分子，例如溶剂，例如丙酮和其他生物基分子等)。纤维素酶也可以用于其他工艺，特别是用于化学、造纸或纺织工业中。
以该实施的具体实例为例，开发经济上可行的生产第二代(2G)生物燃料的方法是众多研究的主题。这些生物燃料主要由木质基质，例如各种木材(硬木和软木，芒草或SRC，其是短轮伐期灌木丛的缩写)、农业副产物(麦秸、稻秸、玉米芯等)或产生自其他农业食品、造纸等行业的副产物生产。当与由甘蔗、玉米、小麦或甜菜生产的“第一代”生物燃料相比时，就农业用地的使用而言，第二代生物燃料与生存作物产生更少的竞争问题。
木质纤维素生物质的特征在于由三种主要级分组成的复杂结构：纤维素(35％-50％)，其是一种基本上由己糖组成的多糖；半纤维素(20％-30％)，其是一种基本上由戊糖组成的多糖；和木质素(15％-25％)，其是一种具有复杂结构和高分子量的聚合物，由通过醚键连接的芳族醇组成。这些不同的分子是植物壁的固有性质的原因并将它们自身组织成复杂的缠结体。在组成木质纤维素生物质的这三种基础聚合物中，纤维素和半纤维素是能够生产2G糖液的基础聚合物。
通常，将生物质转化为乙醇生物燃料的方法涉及若干个步骤：预处理使纤维素能与纤维素酶接触。酶促水解步骤将纤维素转化为糖，例如葡萄糖，其然后在发酵步骤的过程中通常使用酿酒酵母被转化为乙醇。最后，蒸馏步骤可以从发酵液(fermentation must)中分离并回收乙醇。
如上所述，应该注意的是，也可以选择在单体糖诸如葡萄糖、木糖等的生产中停止该方法以对它们原样（as such）进行改质，或者对它们进行不同的处理以获得其他生物基醇或分子。
背景技术
各种技术-经济研究表明，降低纤维素酶的成本是由木质纤维素原料生物生产乙醇方法中的关键点之一。目前，工业纤维素酶主要通过丝状真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)生产，因为其具有高分泌能力。
自二十世纪70年代以来，在将组成多糖水解成可发酵的糖之后，将木质纤维素材料转化为乙醇已经成为了众多研究的主题。例如，可以提及国家可再生能量实验室的参考研究(Process Design and Economics for Biochemical Conversion ofLignocellulosic Biomass to Ethanol，Humbird等人，NREL/TP-5100-57764，2011年5月)。
木质纤维素材料是基于纤维素的材料，即由超过90重量％的纤维素组成的材料，和/或是木质纤维素材料，即由纤维素、半纤维素（其是基本上由戊糖和己糖组成的多糖）以及木质素（其是基于酚类化合物的具有复杂结构和高分子量的大分子）组成的材料。
木材、秸秆和玉米芯是最常用的木质纤维素材料，但其他资源、专用林业作物、来自制醇、制糖和谷类植物的残余物、来自造纸工业的产物和残余物以及来自木质纤维素材料的转化的产物也是可用的。它们大多数由约35％-50％的纤维素、20％-30％的半纤维素和15％-25％的木质素组成。
将木质纤维素材料通过生物化学途径转化为乙醇的方法包括物理化学预处理步骤，然后是使用酶混合物(enzyme cocktail)进行酶促水解的步骤，将释放的糖进行乙醇发酵的步骤，以及纯化乙醇的步骤，所述乙醇发酵和酶促水解可以同时进行。
用于酶促水解的酶混合物是纤维素分解酶(也称为纤维素酶)和/或半纤维素分解酶的混合物。纤维素分解酶具有三种主要类型的活性：内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和纤维二糖酶，后者也称为β-葡萄糖苷酶。半纤维素分解酶特别具有木聚糖酶活性。
酶促水解是有效的并且在温和的条件下进行。但是，酶的成本仍然很高，其占将木质纤维素材料转化为乙醇的成本的20％-50％。因此，已进行了大量研究以降低这种成本：首先，通过选择高产微生物和通过改善生产所述酶的方法来优化酶的生产，随后通过优化预处理步骤、通过改善这些酶的比活性、并通过优化酶促水解步骤的实施来减少水解中酶的量。
大量研究都集中在理解酶混合物的作用和表达机制。其目的是通过修饰微生物分泌最适合于木质纤维素材料的水解的酶混合物。
里氏木霉是最广泛用于生产纤维素酶的微生物。在诱导性基质(例如纤维素)的存在下，野生型菌株具有分泌被认为是最适合于水解纤维素的酶复合物（enzymaticcomplex）的能力。酶复合物的酶具有三种主要类型的活性：内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和纤维二糖酶，并且具有对于水解木质纤维素材料必需的性质的其他蛋白质也由里氏木霉产生，例如木聚糖酶。诱导性基质的存在对于纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的表达是必需的。碳基基质的性质对酶复合物的组成有很大影响。木糖就正是这种情况，当木糖与碳基诱导性基质(例如纤维素或乳糖)组合时，可以显著地改善所述木聚糖酶的活性。已经详细研究了纤维素酶基因在各种碳源上的调控。它们在纤维素、纤维素的水解产物(例如纤维二糖)、或某些寡糖(例如乳糖或槐糖)的存在下被诱导(参见IImén等人，1997；Appl.Environ. Microbiol. 63. 1298/1306)。
常规的基因突变技术使得能够选择高产纤维素酶的里氏木霉菌株，例如菌株MCG77(Gallo-专利US 4275167)、MCG 80(Allen，A. L.和Andreotti，R. E.，Biotechnol.-Bioeng.1982，12，451-459 1982)、RUT C30(Montenecourt，B. S.和Eveleigh，D. E.，Appl.Environ. Microbiol. 1977，34，777-782)和CL847(Durand等人，1984，Proc. ColloqueSFM“Génétique des microorganismes industriels [Genetics of industrialmicroorganisms]”，Paris. H. Heslot编辑，第39-50页)。
为了扩展至工业规模的目的，通过里氏木霉生产纤维素酶的方法已经成为了实质性改善的主题。为了获得良好的酶生产率，必须提供用于里氏木霉生长的可快速同化碳源和允许纤维素酶表达并将其分泌到培养基中的诱导性基质。纤维素可以起这两个作用；然而，它在工业步骤中很难使用，并且已经提出采用可溶性碳源，例如葡萄糖、木糖或乳糖替代它，乳糖也起到诱导性基质的作用。其他可溶性糖，例如纤维二糖和槐糖已被描述为诱导性的，但它们在工业步骤的使用是相对昂贵的。还已发现，采用可溶性基质通过里氏木霉生产纤维素酶远不如通过“分批”方式在纤维素上获得的那些纤维素酶。这是由于在高浓度下可容易同化的糖的阻抑作用。通过限制培养基中的残留浓度并通过优化糖的量，以分批补料方式连续地进料可溶性碳基基质可以提高降解代谢产物抑制，从而可以获得更好的收率和更好的酶促生产率。
专利FR-B-2 555 603提出了一种方案，用于实现约35-40g/L的蛋白质浓度和约0.2g/L/h的生产率，该方案由两个步骤组成：以“分批”模式生长的第一步骤，其中必须为里氏木霉的生长提供可快速同化碳源，然后使用允许纤维素酶表达并将其分泌到培养基中的诱导性基质(例如乳糖)以“分批补料”模式生产的步骤。应用的最佳流量为35-45mg·g-1·h-1(每克生物质和每小时的诱导性基质的毫克数)。还可以提及专利EP-B-2 744 899，其提出了针对上述方案的改善，特别是通过选择具有特定的氧气体积传递系数kLa的生物反应器，结合在第一步骤中对碳基生长基质的浓度和在第二步骤中对限制碳源的流量水平二者的特定选择。
此外，丝状真菌里氏木霉以其严格的需氧性质而闻名：它对缺乏溶解氧的耐受性差。可以限定允许令人满意的培养的最低溶解氧浓度，该浓度通常为1-5 mg/L。
如Gabelle J.-C.、Jourdier E.、Licht R.B.、Ben Chaabane F.、Henaut I.、Morchain J.和Augier F.在2012年的文章"Impact of rheology on the mass transfercoefficient during the growth phase of Trichoderma reesei in stirredbioreactors" (Chemical Engineering Science 75 (2012) 408-417)中所详细描述的，为了在良好的氧合作用条件下进行培养，通常设计和运行所使用的反应器(也称为发酵罐)以能够在整个培养过程中进行足以达到上述最低溶解氧浓度的氧传递。现在，在包括真菌的生长步骤、然后是酶本身的生产步骤的整个酶生产方法过程中，遵循这一最低溶解氧浓度标准的最复杂的部分被证明是生长步骤的终点，因为该终点既是氧需求最大的时刻，又是发酵液粘度趋于最高的时刻。
现在，已知粘度对氧传递具有负面影响(Gabelle等人，2011 – Gabelle J. C.、Jourdier E.、Licht R. B.、Ben Chaabane F.、Henaut I.、Morchain J.和Augier F.(2012)，Impact of rheology on the mass transfer coefficient during the growthphase of Trichoderma reesei in stirred bioreactors，Chemical EngineeringScience 75，408-417)：生物质浓度增加得越多，待传递的氧流量就越趋于增加，但是由于粘度的增加导致这种传递更难实现，这可能导致必须调节操作条件。通过多个参数，例如气相中的氧分压、反应器中的压力、注入空气的流量、溶解氧的浓度和通过在发酵罐中进行机械搅拌(如果有的话)所消耗的功率来调节从气相传递到液相中的氧流量。
通常，出于经济原因，注入的气体是空气。此外，压力只能增加几巴，因为超过几巴，溶解的CO2浓度可能抑制培养。这两种作用杠杆直接影响酶生产的可行性，因为它们潜在地增加了实施该方法的设备的能耗或甚至投资成本。
在具有众所周知的最大曝气和搅拌能力的给定发酵罐中，在生长结束时，设想不超过一定的生物质浓度。其原因是，一旦将曝气和搅拌推至其最大水平，一旦达到所需的最低溶解氧浓度，生物质浓度的任何增加会造成氧需求量的增加和导致溶解氧浓度降低的粘度的增加，这可能会损害总发酵收率。因此可见，发酵罐中将氧传递至液相的这种需求造成工业/经济上的约束，这影响了酶生产的总收率。
此外，来自专利申请EP-1 204 738的已知实践是对真菌菌株，特别是对木霉类型的真菌菌株，最特别是对其编码疏水蛋白的DNA序列进行基因修饰，以防止菌株分泌这些疏水蛋白，特别是HFBII，其被认为是造成泡沫形成的原因。但是，涉及基因修饰的任何解决方案实施起来费力，因为需要对每株目标菌株进行这些基因修饰。
发明内容
因此，本发明的目的是改善的生产酶的方法，其特别旨在克服上述缺点。本发明的目的尤其是改善所述方法的生产率，特别是在不增加/同时限制对反应器的操作条件或设计的任何附加约束的情况下，通过改善/增加将氧传递至使用所述方法的反应器中的液相来改善所述方法的生产率。
本发明的主题首先是采用属于丝状真菌家族的微生物菌株生产纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的方法，使得所述方法包括以下步骤(例如由以下步骤组成)：
(a)在至少一种碳基生长基质的存在下，在搅拌和曝气生物反应器中，在含水培养基中生长真菌，特别是以分批模式（batch phase）生长真菌的第一步骤，
(b)在至少一种诱导性碳基基质的存在下，由第一步骤(a)中获得的含水培养基开始，生产酶以及诱导产生疏水蛋白的第二步骤，
并且其中，在步骤(d)中，将步骤(b)中产生的疏水蛋白的至少一部分重新引入到生长步骤(a)中。
实际上，本发明人研究了在液相(培养基)和提供真菌生长和产生所需酶所需的氧的气相(氧气，或更通常为空气)之间的氧传递，这种传递涉及到多种物理参数。事实证明，对于氧传递而言，最大的重要性是气泡的尺寸。具体而言，气泡越小，注入的空气将产生更多的交换表面。实际上，主要由于这个原因，在发酵罐中经常使用搅拌装置，以减小气泡的尺寸，从而增加氧传递。两种现象控制着气-液反应器或发酵罐中的气泡尺寸：气泡破裂和气泡聚结。它们可以分别使气泡尺寸减小和增大，因此增加和减少传质。因此，本发明人认为，如果通过特定手段减少聚结现象，则可以增加传质，因此增加给定发酵罐中可达到的最大生物质浓度，同时保持溶解氧高于所需的最低值。
有许多分子可以部分地阻止含水培养基中气泡的聚结，例如表面活性剂，例如十二烷基硫酸钠(SDS)或牛血清白蛋白(BSA)。然而，这些分子具有在这些发酵培养基中产生大量泡沫的缺点，这在工艺的工业实施中是一个实际问题，并且它们还对起始材料的成本具有负面影响。
最后，本发明人已经观察到，真菌里氏木霉在生长步骤过程中，尤其是在生产步骤过程中，产生大量蛋白质。在这些蛋白质中，被称为疏水蛋白的分子家族被证明受到特别关注。具体而言，这些分子对气泡聚结有很大影响，因此对气泡的尺寸有很大影响，并且它们的存在显著提高了传递性能。然而，它们的缺点在于其主要在生产步骤过程中被分泌，而气-液传递首先是生长步骤而不是生产步骤中的主要现象。
因此，本发明通过在生产步骤结束时提取疏水蛋白以将其重新注入到生长步骤中来利用疏水蛋白的这种性质。将生产步骤中产生的疏水蛋白原样再循环到生长步骤中。该解决方案具有许多优点：疏水蛋白在生长步骤中发挥其限制聚结的作用，这最终可以降低与搅拌手段相关的成本(设备成本和能量成本)和/或对于给定的反应器体积/类型而言具有更高的真菌浓度。
还应指出，本发明在酶生产方法的实施中不会造成任何明显的复杂性，并且不会对微生物施加任何特定的基因修饰。
本发明提出了采用各种可能的分离类型从生产培养基中提取疏水蛋白的不同变体/不同实施方案。
优选地，根据本发明的方法包括在酶生产步骤(b)之后且在重新引入疏水蛋白的步骤(d)之前的至少一个分离出疏水蛋白，特别是液相形式的疏水蛋白的步骤(c)，对来自生产步骤(b)的培养基，特别是通过对所述培养基进行一次或多次连续过滤来实施所述步骤(c)。
根据第一变体，通过从生产步骤(b)的培养基中以液相形式直接分离疏水蛋白的至少一部分来实施分离出疏水蛋白的步骤(c)。因此，从发酵培养基中直接分离出疏水蛋白(例如通过过滤)，并且将真菌(在本文中可替代地称为细胞生物质)和酶一起截留，随后将它们组合用在木质纤维素生物质转化过程中：具体而言，在某些配置中，木质纤维素生物质的酶促水解可以通过与始于真菌和已产生的酶的混合物的发酵液接触来实施，而无需将真菌与酶分离。
根据第二变体，所述方法包括在生产步骤(b)之后且在重新引入疏水蛋白的步骤(d)之前的分离步骤(c)，所述分离步骤(c)包括一方面是真菌以及另一方面是培养基的剩余部分之间的第一分离子步骤(c1)，然后是一方面是疏水蛋白、特别是液相形式的疏水蛋白以及另一方面是酶之间的所述培养基的剩余部分的第二分离子步骤(c2)。因此，在该变体中设想首先例如通过过滤将真菌与培养基分离，这可以回收富含酶和疏水蛋白的滤液，然后将酶与疏水蛋白分离，这可以回收(如果通过过滤来实施这种分离)富含疏水蛋白(且贫酶)的滤液，该滤液将能够全部或部分用于生长步骤中，而如此分离的酶将能够用于木质纤维素生物质的酶促水解。
根据一个优选的实施方案，将疏水蛋白(根据上文特别提到的两个变体与培养基的剩余部分或与酶)分离的步骤(c)包括进行至少一次将所述疏水蛋白从存在其的液体培养基中超滤，从而以液相形式分离出所述滤液中的疏水蛋白。所述超滤优选采用具有3-30kDa、特别是5-15kDa的截留阈值的滤膜进行。具体而言，在本发明的上下文中，有关疏水蛋白，特别是分子HFBII的一个非常有利的特征是它们比酶(例如纤维素酶或半纤维素酶)小得多，约为7 kDa，而不是30-100kDa(特别对于纤维素酶)，这使得通过过滤/超滤分离这些分子是完全合适的，但是也可以使用任何其他已知的分离技术：膜因此过滤了截留物中所有尺寸大于疏水蛋白的组分，然后可以将疏水蛋白以液相形式分离并收集在滤液中。
优选地，根据第二变体，通过过滤，特别是用压滤机来实施真菌和培养基的剩余部分之间的分离子步骤(c1)，但是也可以使用任何其他已知的分离技术。
优选地，根据本发明的方法包括以下步骤、且优选地由以下步骤组成：生长步骤a)、生产步骤b)、分离步骤c)（以单个步骤进行或者特别地由子步骤c1和随后的子步骤c2组成）和将疏水蛋白重新引入到步骤a)中的步骤d)。
不管从培养基中分离疏水蛋白的方式如何，优选地，在分离步骤(c)之后分离出且在被重新引入到步骤(a)的培养基的步骤(d)之前的疏水蛋白为液相形式，其任选地被中间储存、任选地被中间稀释和/或浓缩。因此有利于它们的处理以及将它们引入到生长步骤(a)中，当所讨论的液相是通过对来自生产步骤(b)的培养基进行过滤而获得的含水相时更是如此：因此，该含水相是对来自步骤(a)的培养基的含水相的补充或甚至替代，这相当于将水从生产培养基再循环到生长培养基。
有利地，被重新引入到生长步骤(a)中的在生产步骤(b)中产生的疏水蛋白主要是，特别基本上是II型疏水蛋白。在疏水蛋白中，分子HFBII实际上是主要分子，其对气泡尺寸有很大影响。
生长步骤(a)和/或生产步骤(b)可以分批、分批补料或连续模式或以这些模式中的若干种模式依次进行。
在步骤(d)中，可以贯穿所述生长步骤(a)的全部或部分的持续时间以各种方式：连续地、单次地(在生长步骤(a)的开始或期间)或依次地将疏水蛋白重新引入到生长步骤(a)的培养基中。如上所述，可以设想例如通过设置缓冲罐来进行中间储存。
优选地，将在生产步骤(b)中产生的疏水蛋白以从步骤(b)的培养基中获得的含水相滤液的形式重新引入到生长步骤(a)中，生长步骤(a)的培养基中的水全部或部分来自所述滤液。
优选地，将疏水蛋白以在含水培养基中浓度为10-400mg/l、优选50-200mg/l的溶液形式重新引入到生长步骤(a)中。因此，当通过过滤从培养基中提取疏水蛋白时，它们已经在所获得的含水滤液中处于该浓度范围内并且处于合适的浓度，或者可以在将该滤液重新引入生长培养基之前对该滤液进行稀释或浓缩，从而达到此范围或达到此范围内的不同浓度值。
优选地，在第一生长步骤(a)期间，将所述碳基生长基质的浓度选择为15-100g/l，特别为15-60g/l或20-60g/l。
优选地，第二生产步骤(b)采用受限的、特别是30-140mg·g-1·h-1(即每克生物质和每小时30-140mg)、优选35-45mg·g-1·h-1的诱导性碳基基质料流进行，并且优选采用一种或多种碳基基质的浓度为200-700g/l的水溶液进行。所述一种或多种碳基基质的溶液包含至少一种诱导性碳基基质，其可以选自乳糖、槐糖、纤维素、纤维二糖、纤维素榨渣(cellulose marc)或其中至少两种的混合物。
有利地，所使用的菌株是里氏木霉菌株或通过选择性突变或基因重组修饰的里氏木霉菌株。尤其可以是上述的菌株CL847、RutC30、MCG77或MCG80。然而，无须赘述，并且与上述专利申请EP-1 204 738的教导相反，在本发明的上下文中设想的突变并非出于防止在所述菌株的生长期间形成疏水蛋白的完全相反的目的。
任选地，根据本发明的方法可以包括在步骤(a)和步骤(b)之间的中间步骤，该中间步骤是将从生长步骤(a)获得的培养基稀释的步骤。
另外，生长步骤(a)和生产步骤(b)可以在同一个生物反应器中或在两个不同的生物反应器中（将培养基从一个反应器转移到另一个反应器）进行。第一种情况更简单：仅使用一个反应器，无需转移培养基。第二种情况能够根据每个步骤的需要来精确地调整每个生物反应器的特性和设备。可以使用不同类型的生物反应器，例如包括鼓泡塔。
本发明的主题还在于通过上述方法获得的酶用于陆地或海洋纤维素/半纤维素生物质的酶促水解的用途。
本发明的主题还在于实施上述方法的生产装置，该装置可以包括用于生长步骤和生产步骤的单个生物反应器或两个不同的生物反应器，并且配备有能够分离生产步骤中产生的疏水蛋白的分离设备，特别是过滤设备，特别是例如超滤设备。
可直接将疏水蛋白从一个反应器重新引入到另一个反应器中，特别是当两个不同的反应器分别用于生长步骤和生产步骤时。
可以提供中间容器，在该中间容器中储存在生产步骤中取出的疏水蛋白，以随后将它们重新引入到生长步骤中(在同一个反应器或不同的反应器中)。
也可以提供中间溶液，一部分暂时储存在生产步骤中取出的疏水蛋白以供随后使用，一部分被直接重新引入到反应器中的生长步骤中。
下面将借助于非限制性实施例更详细地描述本发明。
附图说明
图1是根据本发明的第一变体的酶生产方法的方框图。
图2是根据本发明的第二变体的酶生产方法的方框图。
图3是在x轴上表示真菌(细胞生物质)浓度(单位为g/l)、在y轴上表示水的相应kLa(单位为h-1)(曲线C0)的曲线图，对于下文所述的实施例1和实施例2分别为曲线C1和C2。
具体实施方案
图1对应于根据本发明的酶生产方法的第一变体。限制聚结的分子是在碳基基质限制步骤期间产生的疏水蛋白。该方法包括：
-真菌生长步骤(a)；
-然后是生产步骤(b)；
-根据本发明，增加了通过超滤进行的分离步骤(c)，从而一方面可以获得富含真菌和由其产生的酶的截留物F + E，另一方面可以获得富含疏水蛋白的含水滤液(步骤(a)和步骤(b)的培养基都是含水的)。然后将该滤液重新注入到生长步骤(a)中。在重新注入之前，可以将该滤液稀释，或更常见的是将该滤液浓缩，并且也可以将该滤液暂时储存。
因此，在该变体中，直接从发酵培养基中过滤出疏水蛋白，并将真菌和酶一起截留。当使用该酶的下游工艺可以利用这些酶而无需事先将它们与真菌分离时，该变体是特别有利的：实施本发明仅需要一次分离。
图2对应于根据本发明的方法的第二变体。先是生长步骤(a)，然后是生产步骤(b)。在此设想根据本发明的两个依次的分离：第一分离(c1)，例如通过采用压滤机过滤，从而一方面可以分离富含真菌的截留物F，另一方面可以分离富含酶和疏水蛋白的滤液。接下来，通过超滤对该滤液进行分离(c2)，从而一方面可以回收富含酶的截留物，另一方面可以回收包含水且富含疏水蛋白的滤液，然后，与前面的变体一样，将该滤液重新注入到生长步骤(a)中。
因此，在此已将酶与培养基的剩余部分分离，当下游工艺使用这些纯的形式的酶或将其出售时，这是有利的。
特别地，在这两个变体中，但对于本发明的任何其他变体而言，在生产步骤(b)中存在分离。应当注意，该分离优选在步骤(b)结束时进行，并且该重新注入优选在步骤(a)开始时进行。但是，也可以通过除过滤以外的方法进行分离，并且也可以在整个步骤(b)中或仅在其部分的持续时间内进行分离。类似地，将疏水蛋白重新注入步骤(a)中也可以在步骤(a)的全部或部分的持续时间内逐步进行。
优选将疏水蛋白以含水液体的形式(它们通过过滤进行分离而直接以这种形式获得)重新引入。在调节液相中的浓度之后，该液相甚至可以完全替代用于生长步骤(a)的培养基的水。
实施例
在30L生物反应器中进行里氏木霉的两个对比生长：第一个采用常规培养基进行，第二个通过用由先前生产获得的富含疏水蛋白的滤液代替水来进行。通过采用截留阈值为10kDa的膜对培养基进行超滤过滤来获得该滤液；然后将其浓缩。
在两种情况下均进行流变学测量和kLa测量。在第一种情况下，可以看出粘度极大地影响了氧传递(如上述2012年Gabelle J.-C.的文章中所证明的)。在第二种情况下，尽管粘度高，但提供疏水蛋白对培养基的kLa具有正面影响，培养基的kLa变得等于或甚至高于在相同搅拌和曝气条件下获得的水的kLa。
根据以下文章中描述的方法使用流变学测量：Nicolas Hardy、Frédéric Augier、Alvin W. Nienow、Catherine Béal、Fadhel Ben Chaabane，Scale-up agitationcriteria for Trichoderma reesei fermentation: Chemical Engineering Science，Elsevier，2017，172，第158-168页(10.1016/j.ces.2017.06.034)。
通过上述文章中所述的已知气体平衡方法进行kLa的计算：Gabelle J.C. 、Jourdier E. 、Licht R.B. 、Ben Chaabane F. 、Henaut I. 、Morchain J. 、和Augier F.(2012) Impact of rheology on the mass transfer coefficient during the growthphase of Trichoderma reesei in stirred bioreactors，Chemical EngineeringScience 75，408-417。使用的反应器是30 L生物反应器。同一篇文章中描述了该反应器的构造。
实施例1(对比例-发明初步结果)
在上述机械搅拌的30L发酵罐中进行里氏木霉的生长，该发酵罐的工作容积为20L。矿质培养基具有以下组成：KOH 1.66g/L，85％H3PO4 2mL/L，(NH4)2SO4 2.8g/L，MgSO4•7H2O 0.6g/L，CaCl2 0.6g/L，MnSO4 3.2mg/L，ZnSO4•7H2O 2.8mg/L，CoCl2 104.0mg/L，FeSO4•7H2O 10mg/L，玉米浆1.2g/L，消泡剂0.5 mL/L(其将至少部分被微生物消耗)。自来水用于稀释培养基的各种组分并填充反应器，从而使最终体积达到20L。
将含有矿质培养基的发酵罐在120℃下灭菌20分钟，将碳基葡萄糖源在120℃下单独灭菌20分钟，然后在无菌条件下添加到生物反应器中，从而使最终浓度达到50g/L。将1L的里氏木霉CL847菌株的液体预培养基接种到发酵罐中。预培养基的矿质培养基与发酵罐的矿质培养基相同，除了添加了5g·L-1的邻苯二甲酸钾以缓冲培养基的pH值。使用浓度为30g·L-1的葡萄糖作为碳基基质在预培养基中进行真菌生长。接种物的生长持续2至3天，并在28℃下在振荡培养箱中进行。当残留葡萄糖浓度小于15g/L时，将其转移至发酵罐。
生长步骤在搅拌式30 L生物反应器中在27℃的温度和4.8的pH(用5.5M氨水来调节)下进行50小时。曝气为0.5vvm(体积/体积/分钟)，并且相对于液体培养基中的饱和情况，溶解氧的浓度百分数被调节至40％。发酵罐配备有搅拌器，该搅拌器包括两个带有斜直桨的叶轮，以1200 rpm的速度旋转。
定期取样以监测培养基的流变性和细胞生物质的浓度。由于培养基中没有不溶性组分，因此通过过滤和干燥至恒重所确定的干重代表真菌(也称为细胞生物质)的质量。生物反应器出口处的分析仪可以监测气体的O2和CO2组成。
气体平衡使得可以连续地计算O2消耗速率rO2和kLa：
这在拟稳态下给出：
rO2 = Q入口*％O2入口－Q出口*％O2出口
rCO2 = Q出口*％CO2出口- Q入口*％CO2入口
其中：
Q入口：入口处的空气流量，以mol/h表示
Q出口：出口处的空气流量，以mol/h表示
％O2入口：入口处的O2mol％
％O2出口：出口处的O2mol％
％CO2入口：入口处的CO2mol％
％CO2出口：出口处的CO2mol％。
rO2用于通过在拟稳态下液相和气相上的两种O2物料平衡的组合来计算培养基kLa：
kLa(t)= rO2 /(O2* -O2L)
其中：
O2 *：饱和时的O2浓度
O2L：液体中的氧浓度
根据亨利定律，与包含气体的气氛处于平衡时，溶液中的该气体的最大浓度与该气体在该点时的分压成正比。
因此，对于O2的情况而言：
O2 *(mol/m3) = 1.25 pO (巴)
其中：
pO：O2的分压。
应当注意，O2的分压等于气体中O2的摩尔分数与压力的乘积。因此，工业发酵罐中的O2*在反应器底部处最大(压力最大和入口处21％的O2百分数)，在顶部最小(顶部空间压力和出口处的气体中的O2百分数)。它是针对实验的每个时刻进行计算的，因为由于微生物消耗O2，所以出口气体的O2组成降低。在实验室反应器的情况下，反应器顶部和底部之间的压力差可忽略不计。液体中的氧浓度通过pO2探头测量来计算，该测量给出了相对于饱和的O2的百分数。
因此，在真菌的生长过程中，可以在不同的时刻测量细胞生物质的浓度(X)、剪切为10s-1时发酵培养基的粘度(µa)和以h-1表示的气液传递系数kLa。
将kLa测量值与在相同空气流量和相同搅拌速度下在水中取得的测量值进行对比。下表1给出了在根据现有技术的发酵过程中获得的传递系数的结果。
表1
Figure 632565DEST_PATH_IMAGE001
然后在25℃、pH为4下实施生产步骤，乳糖浓度为220g/L，相当于每克生物质和每小时45mg的特定分批补料乳糖流量。
实施例2(根据本发明)
在相同条件下进行实验，但是用由先前的纤维素酶生产实验获得的溶液代替水，对该溶液，通过具有Wide Pore C5柱(150×2.1mm；5µm)和UV检测的HPLC(高效液相色谱)测定HFBII疏水蛋白的浓度为100 mg/L(仅对HFBII进行了测定，使用的疏水蛋白还可以包含少量其他类型的疏水蛋白)。在该实验结束时进行过滤，以将真菌与纤维素酶分离，并使用孔隙率为10kDa的膜进行超滤(推荐的膜为Alfa Laval公司出售的UFX 10 pHt膜)。应遵守供应商关于该产品的使用信息（压力、温度等条件)。对于该产品而言，在该超滤过程中优选温度不超过30℃，20-25℃为优选的温度范围。
在超滤之后，渗透物含有疏水蛋白。平均渗透物样品的分析可以测定样品。所获得的流量为20l/h/m2膜。超滤可以浓缩纤维素酶，并在滤液中回收含有疏水蛋白的培养基。然后通过HPLC再次测量疏水蛋白浓度，其接近100mg/L。该溶液被用作30L生物反应器中的稀释水。应当指出的是，添加了额外的水，因此使实验开始时(时间T0)的疏水蛋白浓度稀释了25％。
操作条件与实施例1相同。
在生长步骤之后，也在与实施例1相同的操作条件下进行生产步骤。
在真菌的生长过程中测量粘度和传递系数。所得结果列于表2，如前述表1中那样，表2示出了细胞生物质的浓度(X)、剪切为10s-1时发酵培养基的粘度(µa)和以h-1表示的气-液传递系数kLa。
表2
Figure 487388DEST_PATH_IMAGE002
在图3的曲线图上示出了根据两个实施例1和2获得的性能的对比：应当注意，根据本发明获得的传递系数kLa(对于对比例1而言为曲线C1，对于根据本发明的实施例2而言为曲线C2)至少是根据现有技术的传递系数的两倍。根据生物质浓度，在相同的曝气和搅拌条件下，传递系数有时低于并有时高于在水中测得的传递系数(曲线C0)。
这些实施例表明，本发明极大地促进了氧传递。可以多种方式利用此优点，尤其是：
-降低生物反应器中的搅拌速度，以达到目标传递系数，同时消耗更少的能量，
-出于相同的原因，降低生物反应器中的空气流量，
-用更多的细胞生物质进行培养，同时保持高于溶解氧的最低目标浓度，这可以提高生物反应器(也称为发酵罐)的生产率。
还证实了在生产步骤结束时所评估的两个实施例的酶生产性能对于两个实施例相同或几乎相同：因此获得这些优点不以工艺的性能或生产收率为代价。
由于传递系数kLa与每单位体积的功耗(P/V，用W/m3表示)成正比，因此在0.4-0.5kW/m3的每单位体积的功率(P/V)范围内(根据上述2012年Gabelle等人的文章)，将kLa提高到至少2倍，可以节省75％-85％的每单位体积的功耗，这在工业规模上是巨大的节省。
此外应当注意，尽管实施例1和2使用特定的碳源用于生长和生产，但是本发明自然也适用于其他碳源，例如可溶性糖，例如乳糖、葡萄糖或木糖。碳基生长基质可以选自乳糖、葡萄糖、木糖、在来自纤维素基生物质的酶促水解产物的单体糖的乙醇发酵后获得的残余物、和/或由纤维素基生物质的预处理获得的水溶性戊糖的粗提取物。诱导性碳基基质优选选自乳糖、纤维二糖、槐糖、在来自纤维素基生物质的酶促水解产物的单体糖的乙醇发酵后获得的残余物、和/或由纤维素基生物质的预处理获得的水溶性戊糖的粗提取物。因此，这种类型的残余物/提取物也可以用作总碳源，即用于微生物生长和用于表达体系的诱导。该碳源可以更特别地被基因增强菌株、特别是重组菌株使用。
类似地，本发明也在不同于实施例中明确提及的那些操作条件的操作条件下适用。因此，用于生长步骤和生产步骤的pH和温度可以如下：
-pH为3.5-4.4；
-温度为20-35℃。
在此方法期间应用的vvm(表示为每体积培养基和每分钟的空气体积的曝气度)为0.3-1.5min-1，并且rpm(搅拌速度)必须能够将液体培养基中相对于饱和的溶解氧的浓度百分数调节至20％-60％的O2。优选选择0.3-0.5min-1的曝气度和可以将溶解氧的浓度百分数调节至30％-40％的O2的搅拌。
根据选择用于生产生物质的碳基基质的性质，将其在灭菌之前引入发酵罐，或将其单独灭菌并在灭菌之后引入发酵罐。碳基基质的浓度为200-700g/L，这取决于所用碳基基质(特别是关于形成这些碳基基质的一部分的诱导性基质)的溶解度。

Claims (15)

1.采用属于丝状真菌家族的微生物菌株生产纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在至少一种碳基生长基质的存在下，在搅拌和曝气生物反应器中，在含水培养基中生长真菌，特别是以分批模式生长真菌的第一步骤，
(b)在至少一种诱导性碳基基质的存在下，由第一步骤(a)中获得的含水培养基开始，生产酶以及诱导产生疏水蛋白的第二步骤，
其特征在于，在步骤(d)中，将步骤(b)中产生的疏水蛋白的至少一部分重新引入到生长步骤(a)中。
2.根据前一权利要求的方法，其特征在于，所述方法包括在酶生产步骤(b)之后且在重新引入疏水蛋白的步骤(d)之前的至少一个分离出疏水蛋白，特别是液相形式的疏水蛋白的步骤(c)，对来自生产步骤(b)的培养基，特别是通过对所述培养基进行一次或多次连续过滤来实施所述步骤(c)。
3.根据前一权利要求的方法，其特征在于，通过从生产步骤(b)的培养基中以液相形式直接分离疏水蛋白的至少一部分来实施分离出疏水蛋白的步骤(c)。
4.根据权利要求2的方法，其特征在于，所述方法包括在生产步骤(b)之后且在重新引入疏水蛋白的步骤(d)之前的分离步骤(c)，所述分离步骤(c)包括一方面是真菌以及另一方面是培养基的剩余部分之间的第一分离子步骤(c1)，然后是一方面是疏水蛋白、特别是液相形式的疏水蛋白以及另一方面是酶之间的所述培养基的剩余部分的第二分离子步骤(c2)。
5.根据权利要求2-4之一的方法，其特征在于，所述分离步骤(c)包括进行至少一次将所述疏水蛋白从存在其的液体培养基中超滤，从而以液相形式分离出所述滤液中的疏水蛋白，所述超滤特别采用具有3-30kDa、特别是5-15kDa的截留阈值的滤膜进行。
6.根据权利要求4的方法，其特征在于，通过过滤，特别是采用压滤机来实施真菌和培养基的剩余部分之间的分离子步骤(c1)。
7.根据权利要求2-6之一的方法，其特征在于，在分离步骤(c)之后分离出且重新引入到步骤(a)的培养基中的步骤(d)之前的疏水蛋白为液相形式，其任选地被中间储存、稀释和/或浓缩。
8.根据前述权利要求之一的方法，其特征在于，在生产步骤(b)中产生且被重新引入到生长步骤(a)中的疏水蛋白主要是，特别基本上是II型疏水蛋白。
9.根据前述权利要求之一的方法，其特征在于，所述生长步骤(a)和/或所述生产步骤(b)以分批、分批补料或连续模式或以这些模式中的若干种模式依次进行。
10.根据前述权利要求之一的方法，其特征在于，在步骤(d)中，贯穿所述生长步骤(a)的持续时间，将疏水蛋白连续地、单次地或依次地重新引入到生长步骤(a)的培养基中。
11.根据前述权利要求之一的方法，其特征在于，将在生产步骤(b)中产生的疏水蛋白以从步骤(b)的培养基获得的含水相滤液的形式重新引入到生长步骤(a)中，生长步骤(a)的培养基中的水全部或部分来自所述滤液。
12.根据前述权利要求之一的方法，其特征在于，将疏水蛋白以在含水培养基中浓度为10-400mg/l、优选50-200mg/l的溶液形式重新引入到生长步骤(a)中。
13.根据前述权利要求之一的方法，其特征在于，在所述生长步骤(a)期间，所述碳基生长基质的浓度为15-100g/l，并且所述生产步骤(b)采用受限的、特别是30-140mg·g-1·h-1、优选35-45mg·g-1·h-1的诱导性碳基基质料流进行，并且优选使用一种或多种碳基基质的浓度为200-700g/l的水溶液进行。
14.根据前述权利要求之一的方法，其特征在于，所使用的微生物菌株是里氏木霉菌株或通过选择性突变或基因重组修饰的里氏木霉菌株。
15.通过根据前述权利要求之一的方法获得的酶用于陆地或海洋纤维素/半纤维素生物质的酶促水解的用途。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101287839A (zh) * 2005-03-24 2008-10-15 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 对有价值化合物进行微生物生产的方法
CN103890171A (zh) * 2011-08-19 2014-06-25 Ifp新能源公司 使用适用于具有低容积传氧系数KLa的发酵罐的丝状真菌用于生产纤维素酶的方法
CN106190874A (zh) * 2015-05-06 2016-12-07 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种强化丝状真菌蛋白质生产的方法
US9982229B2 (en) * 2013-12-19 2018-05-29 Danisco Us Inc. Use of hydrophobins to increase gas transfer in aerobic fermentation processes

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4275167A (en) 1980-06-18 1981-06-23 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Preferential degradation of lignin in gramineous materials
FR2555603B1 (fr) 1983-11-29 1986-10-03 Inst Francais Du Petrole Procede de production d'enzymes cellulolytiques
FI108863B (fi) 1999-08-20 2002-04-15 Valtion Teknillinen Parannettu biotekninen tuotantomenetelmä
CA2700685A1 (en) * 2007-09-27 2009-04-02 Mascoma Corporation Progressive fermentation of lignocellulosic biomass
DK2464446T3 (en) * 2009-08-10 2015-03-30 Danisco Us Inc CROSS-FLOW MEMBRANE FILTRATION BASED PROTEIN RECOVERY PROCEDURE
FR2957935B1 (fr) * 2010-03-26 2016-05-06 Inst Francais Du Petrole Procede de production de cellulases base sur la regulation de l'oscillation de la pression en oxygene dissous dans le milieu de culture
DE102010063942B4 (de) * 2010-12-22 2015-03-26 Technische Universität Dresden Verfahren und Verwendung von Hydrophobinen zur Herabsetzung der Oberflächenspannung in Zellkulturen
US20120252066A1 (en) * 2011-03-29 2012-10-04 Heng Meng H Methods of foam control
CA2832975A1 (en) * 2011-04-15 2012-10-18 Danisco Us Inc. Methods of purifying hydrophobin
FR3049957B1 (fr) * 2016-04-08 2020-09-25 Ifp Energies Now Procede de production de cellulases avec du marc lignocellulosique pretraite

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101287839A (zh) * 2005-03-24 2008-10-15 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 对有价值化合物进行微生物生产的方法
CN103890171A (zh) * 2011-08-19 2014-06-25 Ifp新能源公司 使用适用于具有低容积传氧系数KLa的发酵罐的丝状真菌用于生产纤维素酶的方法
US9982229B2 (en) * 2013-12-19 2018-05-29 Danisco Us Inc. Use of hydrophobins to increase gas transfer in aerobic fermentation processes
CN106190874A (zh) * 2015-05-06 2016-12-07 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种强化丝状真菌蛋白质生产的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SENTA HEISS-BLANQUET等: "Effect of pretreatment and enzymatic hydrolysis of wheat straw on cell wall composition, hydrophobicity and cellulase adsorption", vol. 102, no. 10, pages 5938 - 5946, XP028407856, DOI: 10.1016/j.biortech.2011.03.011 *
张介驰等: "金针菇蛋白的研究与应用", vol. 2011, 黑龙江大学出版社, pages: 30 *
高云雨等: "里氏木霉绿色荧光蛋白表达载体的构建及功能鉴定", vol. 21, no. 04, pages 28 - 33 *
黄俊辉等: "纤维素酶酶解法提高海藻脂质抽提率的研究", vol. 2017, no. 03, pages 102 - 34 *

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