BR112021003456A2

BR112021003456A2 - cepa mutante de trichoderma reesei e métodos para produzir uma proteína, para produzir celulase e para produzir açúcar

Info

Publication number: BR112021003456A2
Application number: BR112021003456-0A
Authority: BR
Inventors: Yusuke KAGAWA; Shingo Hiramatsu; Katsushige Yamada
Original assignee: Toray Industries, Inc.
Priority date: 2018-08-29
Filing date: 2019-08-28
Publication date: 2021-05-18
Also published as: EP3845631A1; JP7388195B2; CA3111169A1; WO2020045473A1; CN112639074A; US20210324437A1; EP3845631A4; US11732284B2; JPWO2020045473A1; AU2019331247A1

Abstract

cepa mutante de trichoderma reesei e métodos para produzir uma proteína, para produzir celulase e para produzir açúcar". a presente invenção fornece: uma cepa mutante de trichoderma reesei possuindo uma mutação pela qual a função de um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela seq id no: 2 é perdida ou diminuída; e um método para a produção em alto rendimento de uma proteína, compreendendo a cultura da cepa mutante.

Description

“CEPA MUTANTE DE TRICHODERMA REESEI E MÉTODOS PARA PRODUZIR UMA PROTEÍNA, PARA PRODUZIR CELULASE E PARA PRODUZIR AÇÚCAR” CAMPO DA INVENÇÃO

[01] A presente invenção refere-se a uma cepa mutante de Trichoderma reesei com uma capacidade de produção de proteína aumentada e a um método de produção de proteína usando a cepa mutante.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[02] O fungo Trichoderma reesei é conhecido por ter uma elevada capacidade de produção de proteínas, e diversos estudos foram feitos sobre a produção de proteínas utilizando o fungo filamentoso Trichoderma reesei. O Trichoderma reesei é especialmente excelente em termos de capacidade de produzir uma celulase, que é classificada como uma enzima sacarificante entre as proteínas. Por exemplo, a fim de aumentar ainda mais a quantidade de produção de celulase, a superexpressão ou a deleção de um fator que controla a produção de celulase é conduzida.

[03] A Literatura não Patentária 1 descreve que uma cepa mutante de Trichoderma reesei possuindo uma alta capacidade de produção de celulase foi adquirida pela redução da função de Cre1, que é um fator de transcrição que reprime a produção de celulase, entre os fatores do Trichoderma reesei que controlam a produção da celulase.

LISTA DE CITAÇÕES

LITERATURA NÃO PATENTÁRIA - Literatura Não Patentária 1: Juliano P, “Single nucleotide polymorphism analysis of a Trichoderma reesei hyper-cellulolytic mutant developed in Japan, Bioscience”, Biotechnology, and Biochemistry, Volume 77, 2013, edição 3, P534-543.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO PROBLEMA TÉCNICO

[04] Conforme descrito acima, foi identificado um fator de transcrição que é um dos fatores que controlam a produção de proteínas em Trichoderma reesei, mas este é considerado como sendo apenas uma parte do mecanismo de controle. Assim, um objetivo da presente invenção é obter uma cepa mutante de Trichoderma reesei possuindo uma capacidade de produção de proteína melhorada, fazendo uma busca por um novo fator que controla a produção de proteína no Trichoderma reesei e fornecer um método para a produção de proteína usando a cepa mutante de Trichoderma reesei.

SOLUÇÃO PARA O PROBLEMA

[05] Os presentes inventores consideraram que se um novo fator de controle que fosse desconhecido e capaz de provocar um aumento na produção de proteínas pudesse ser especificado, então a quantidade de proteínas a ser produzida pelo Trichoderma reesei poderia ser aumentada. Os inventores fizeram investigações diligentes e, como resultado, descobriram que uma melhora na capacidade de produção de proteínas pode ser alcançada cultivando uma cepa mutante de Trichoderma reesei na qual a função de um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 foi eliminada ou reduzida. A presente invenção foi realizada com base nesta descoberta.

[06] Especificamente, a presente invenção consiste nos seguintes itens de (1) a (6): (1) Uma cepa mutante de Trichoderma reesei, em que a cepa mutante possui uma mutação que elimina ou reduz a função de um polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2. (2) A cepa mutante de acordo com (1), na qual a mutação é uma mutação que deleta um domínio tipo Glicosiltransferase_GTP do polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2.

(3) A cepa mutante de acordo com (2), em que a mutação é uma mutação de códon de parada para um resíduo de ácido glutâmico no

1.523º resíduo a partir do lado N-terminal na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2.

(4) Um método para produzir uma proteína, cujo método inclui uma etapa de cultivo da cepa mutante de acordo com qualquer item de (1) a (3).

(5) Um método para produzir uma celulase, cujo método inclui uma etapa de cultivo da cepa mutante de acordo com qualquer item de (1) a (3).

(6) Um método para produzir um açúcar, cujo método inclui: - uma etapa de produção de uma celulase pelo método para produzir uma celulase de acordo com (5) ou (14); e - uma etapa de sacarificação de uma biomassa contendo celulose pelo uso da celulase obtida na etapa.

EFEITOS VANTAJOSOS DA INVENÇÃO

[07] A cepa de Trichoderma reesei mutante na qual a função de um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 foi eliminada ou reduzida tem uma capacidade de produção de proteína melhorada e é capaz de produzir uma proteína de maneira altamente eficaz quando comparada com a cepa parental na qual a mutação não foi introduzida. Além disso, especialmente no caso em que as proteínas produzidas são celulases, um efeito inesperado de que as celulases apresentam várias atividades específicas melhoradas também é obtido.

DESCRIÇÃO DE EXEMPLOS DE REALIZAÇÃO

[08] A presente invenção é caracterizada pelo fato de que é introduzida uma mutação em uma cepa parental de Trichoderma reesei, que é um micro-organismo que originalmente possui uma excelente capacidade de produção de proteínas, de modo a aumentar ainda mais a capacidade de produção de proteínas. Especificamente, a presente invenção refere-se a uma cepa mutante de Trichoderma reesei, cuja cepa é caracterizada por possuir uma mutação que elimina ou reduz a função de um polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2.

[09] A cepa parental de Trichoderma reesei a ser usada na presente invenção não está limitada as cepas selvagens e cepas mutantes que foram melhoradas de modo a terem uma maior capacidade de produção de proteínas, assim tais cepas também podem ser favoravelmente utilizadas como cepa parental. Por exemplo, uma cepa mutante com uma propriedade de produção de proteína melhorada obtida pela realização de um tratamento de mutação com um mutagênico, irradiação UV, etc. pode ser utilizada como a cepa parental. Exemplos específicos de cepas mutantes usadas como cepa parental incluem as seguintes cepas mutantes conhecidas pertencentes à espécie Trichoderma reesei: QM6a (NBRC31326), cepa QM9123 (ATCC24449), cepa QM9414 (NBRC31329), cepa PC-3-7 (ATCC66589), cepa QM9123 cepa (NBRC31327), cepa RutC-30 (ATCC56765), cepa CL-847 (Enzyme. Microbiol.

Technol., 10, 341-346 (1988)), cepa MCG77 (Biotechnol. Bioeng. Symp., 8, 89 (1978)), e cepa MCG80 (Biotechnol. Bioeng., 12, 451-459 (1982)). A cepa QM6a, cepa QM9414, e cepa QM9123 estão disponíveis pela NBRC (NITE Biological Resource Center), e a cepa PC-3-7 e cepa RUTC-30 estão disponíveis pela ATCC (American Type Culture Collection).

[10] O polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 é um polipeptídeo possuído pelo Trichoderma reesei e possui um comprimento total de 1.738 resíduos de aminoácidos, e no National Center for Biotechnology Information este polipeptídeo foi registrado como uma proteína da família de glicosiltransferases 41 parcial (EGR46476) que a cepa QM6a de Trichoderma reesei possui. A família de glicosiltransferases 41,

se dimeriza parcialmente para se tornar a família de glicosiltransferases 41 (The EMBO Journal, 27, 2080-2788 (2008)), e tem a função de que uma proteína recém–gerada logo após a tradução, durante a passagem pelo complexo de Golgi, sofre uma alteração de N-acetilgalactosamina (GalNAc) em um resíduo de serina ou treonina que é um resíduo de aminoácido (Biochemistry, Quarta Edição, 11, 280-281 (1995)). Exemplos específicos de genes que codificam o polipeptídeo consistindo da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 incluem a sequência de bases representada pela SEQ ID NO: 1.

[11] Exemplos de métodos para eliminar ou reduzir a função do polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 incluem um método para a introdução de uma mutação que causa uma deleção total da família de glicosiltransferase 41 parcial ou uma deleção parcial de uma família de glicosiltransferase 41 parcial. Exemplos específicos dos mesmos incluem um método em que uma mutação que altera a fase de leitura (mutação frameshift) ou uma mutação que altera o códon de parada (mutação de códon de parada) é introduzida em uma sequência do gene que codifica o polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2, por uma deleção, inserção, substituição, etc. de uma base.

[12] A frase “deleção de uma família de glicosiltransferase 41” significa uma perda total ou parcial do polipeptídeo, uma alteração de todo o polipeptídeo ou de parte do polipeptídeo em aminoácido(s) diferente(s), ou uma combinação destes. Mais especificamente, essa frase significa que a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 passa a ter uma identidade de sequência de 80% ou menos, em relação à sequência de aminoácidos da família de glicosiltransferase 41 parcial. A identidade de sequência é preferencialmente de 50% ou menos, mais preferencialmente de 20% ou menos, mais preferencialmente de 10% ou menos, mais preferencialmente de 5% ou menos, mais preferencialmente de 3% ou menos, mais preferencialmente de 1% ou menos, e mais preferencialmente de 0%.

[13] Os resultados da pesquisa CDD do National Center for Biotechnology Information revelam que os resíduos de aminoácidos do 1.338º ao

1.725º a partir do lado N-terminal são um domínio do tipo Glicosiltransferase_GTP. Na presente invenção, exemplos específicos do caso em que a função de um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 é eliminada ou reduzida por uma mutação, tal como deleção, substituição ou adição, que ocorreu em uma sequência de aminoácidos localizada na família de glicosiltransferase 41 parcial inclui uma mutação na sequência de bases representada pela SEQ ID NO: 1 que altera a citosina no 6.261º resíduo para adenina e, desse modo, inserindo um códon de parada. Esta mutação altera o resíduo de ácido glutâmico no 1.523º resíduo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 em um códon de parada fazendo com que a tradução termine. Uma vez que a tradução termina assim no meio do domínio tipo Glicosiltransferase_GTP, que desempenha principalmente a função da família de glicosiltransferase 41, a função original do polipeptídeo como uma proteína é eliminada.

[14] Além disso, a função do polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 pode ser reduzida pela introdução de uma mutação que reduz ou inibe a expressão do polipeptídeo. Especificamente, pode ser utilizada uma mutação introduzida na região promotora ou terminadora de um gene que codifica a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 para diminuir ou inibir a expressão do polipeptídeo. Em geral, as regiões promotoras e terminadoras correspondem a uma região de centenas de bases de comprimento antes e depois do gene que participa da transcrição. Exemplos específicos de sequências de bases que incluem um promotor e um terminador que participa na transcrição do polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ

ID NO: 2 incluem a sequência de bases representada pela SEQ ID NO: 1.

[15] Para a introdução de tais mutações no gene, pode ser feito o uso de métodos de mutação genética existentes, tal como um tratamento de mutação com um mutagênico conhecido por um versado na técnica ou por irradiação UV, etc., recombinação gênica, como a recombinação homóloga usando um marcador de seleção, e uma mutação por um transposon.

[16] Uma cepa mutante de Trichoderma reesei na qual a função do polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 foi eliminada pode ser adquirida pelo seguinte método.

[17] A cepa mutante na qual todas as funções do polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NOs: 2 foram eliminadas ou reduzidas pode ser adquirida submetendo esporos de Trichoderma reesei como uma cepa parental a um tratamento de mutação genética com nitrosoguanidina (NTG), ácido etilmetanossulfônico (EMS), UV, etc., e analisando os genes das cepas mutantes resultantes para coletar uma cepa mutante com a mutação por triagem.

[18] Uma vez que a cepa mutante da presente invenção tem uma capacidade de produção de proteína aumentada em comparação com a cepa parental na qual a mutação não foi introduzida, uma solução de cultura da cepa mutante da presente invenção tem uma concentração de proteína mais alta do que uma solução de cultura obtida pelo cultivo da cepa parental sem a mutação nas mesmas condições de cultivo. No caso em que a proteína é uma enzima, a enzima tem a atividade específica aumentada. A taxa crescente na concentração de proteína e a taxa crescente na atividade enzimática específica não são particularmente limitadas, desde que a concentração e a atividade específica tenham aumentado. Entretanto, é preferível que as taxas de aumento sejam de 20% ou mais.

[19] Além de uma mutação que elimina ou reduz a função do polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2, a cepa mutante da presente invenção pode ter uma mutação que melhora a quantidade de produção de proteína e/ou diminui a viscosidade da solução de cultura para inibir a diminuição do grau de saturação de oxigênio dissolvido na solução de cultura. Exemplos específicos dos mesmos incluem uma mutação genética que reduz a função do polipeptídeo representado por qualquer uma das SEQ ID NOs: 3, 5 e 7.

[20] O polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 3 é um polipeptídeo possuído pelo Trichoderma reesei, e foi registrado no National Center for Biotechnology Information como uma proteína prevista EGR50654 cuja cepa QM6a de Trichoderma reesei possui. O polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 3 é um polipeptídeo cuja função é desconhecida, mas a Conserved Domain Architecture Retrieval Tool of National Center for Biotechnology Information divulga que do resíduo de aminoácidos 95º ao 277º da extremidade N-terminal há o “Domínio médio do fator de iniciação eucariótico 4G” (doravante referido como “domínio MIF4G”) e do resíduo de aminoácido 380º ao 485º do lado N-terminal há o domínio MA-3. Os dois domínios, MIF4G e MA-3, são conhecidos por terem a função de ligação aos DNAs ou RNAs (Biochem. 44, 12265-12272 (2005); Mol. Cell. Biol. 1, 147-156 (2007)).

Presume-se a partir dessas divulgações que o polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 3 tenha pelo menos a função de ligação a um DNA e/ou RNA.

[21] Exemplos específicos de genes que codificam o polipeptídeo consistindo da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 3 incluem a sequência de bases representada pela SEQ ID NO: 4. Exemplos de mutações genéticas que reduzem a função de EGR50654 incluem uma deleção total do Domínio MIF4G e/ou domínio MA-3 possuído por

EGR50654, uma deleção parcial do domínio MIF4G e/ou domínio MA-3 e uma mutação do gene que altera a relação de configuração entre o domínio MIF4G e o domínio MA-3. Além disso, a função do polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 3 pode ser reduzida também pela introdução de uma mutação que reduz ou inibe a expressão do polipeptídeo. Exemplos específicos da deleção da função do polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 3 incluem uma mutação na sequência de bases representada pela SEQ ID NO: 4 que deleta qualquer uma das bases de 1.039ª a 1.044ª.

[22] O polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 5 é um polipeptídeo possuído pelo Trichoderma reesei, e foi registrado no National Center for Biotechnology Information como uma proteína prevista EGR44419 cuja cepa QM6a de Trichoderma reesei possui. O polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 5 é um polipeptídeo cuja função é desconhecida, mas a ferramenta Conserved Domain Architecture Retrieval Tool of National Center for Biotechnology Information divulga que os resíduos de aminoácidos 26º ao 499º do lado N-terminal tem um domínio transportador de açúcar (e outro).

Presume-se partir desta divulgação que o polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 5 pelo menos participa do transporte de açúcar entre o interior e o exterior dos corpos do fungo.

[23] Exemplos específicos de genes que codificam o polipeptídeo consistindo da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 5 incluem a sequência de bases representada pela SEQ ID NO: 6.

Exemplos de mutações genéticas que reduzem a função de EGR44419 incluem uma deleção total do domínio transportador de açúcar (e outro) possuído por EGR44419, uma deleção parcial do domínio transportador de açúcar (e outro) e uma mutação genética que altera a relação de configuração do domínio transportador de açúcar (e outro). Além disso, a função do polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 5 pode ser reduzida também pela introdução de uma mutação que reduz ou inibe a expressão do polipeptídeo. Exemplos específicos da deleção da função do polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 5 incluem uma mutação na sequência de bases representada pela SEQ ID NO: 6 que insere 11 bases na posição 1.415ª.

[24] O polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 7 é um polipeptídeo possuído pelo Trichoderma reesei, e foi registrado no National Center for Biotechnology Information como EGR48910 como uma subunidade grande beta-adaptina possuída pela cepa QM6a de Trichoderma reesei. O polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 7 é uma das proteínas que constituem proteínas adaptadoras, que se ligam à clatrina, que é amplamente conservada em eucariotos, e que constituem vesículas que participam do transporte dentro e fora das células e dentro e fora dos corpos de fungos (Proc.

Natl. Acad. Sci. USA., 101, 14108-14113 (2004)).

[25] Exemplos específicos de genes que codificam o polipeptídeo consistindo da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 7 incluem a sequência de bases representada pela SEQ ID NO: 8.

Exemplos de mutações genéticas para EGR48910 incluem uma mutação na sequência de bases representada pela SEQ ID NO: 8 que transforma a citosina na base 1.080 em adenina.

[26] A presente invenção refere-se ainda a um método para produzir uma proteína incluindo uma etapa de cultivo da cepa mutante.

[27] A composição do meio de cultura a ser utilizado na etapa de cultivo da cepa mutante da presente invenção não é particularmente limitada, desde que seja uma composição de meio de cultura onde o Trichoderma reesei possa produzir uma proteína, e uma composição de meio de cultura conhecida para micro-organismos do gênero Trichoderma pode ser utilizada. Como fonte de nitrogênio, pode-se utilizar, por exemplo, polipeptona, caldo, CSL ou torta de soja. Um indutor para a produção de proteína pode ser adicionado ao meio de cultura.

[28] No caso da produção de uma celulase pela presente invenção, a cepa mutante pode ser cultivada em um meio de cultura contendo um ou mais indutores selecionados a partir do grupo que consiste em lactose, celulose e xilano. Celulose ou xilano pode ser adicionado pela adição de uma biomassa contendo celulose ou xilano como um indutor. Os exemplos específicos da biomassa contendo celulose ou xilano incluem não vegetais, tais como plantas de semente, pteridófitas, briófitas, algas, e planta aquáticas, mas também resíduos de materiais de construção. As plantas com sementes são classificadas em gimnospermas e angiospermas, e ambas podem ser utilizadas de maneira favorável. As angiospermas são ainda classificadas em monocotiledôneas e dicotiledôneas. Exemplos específicos das monocotiledôneas incluem bagaço, swichgrass (Panicum virgatum), capim-elefante (Pennisetum purpureum), Erianthus, palha de milho, sabugo de milho, palha de arroz, e palha de trigo, e exemplos específicos preferidos de dicotiledôneas incluem polpa de beterraba, e eucalipto, carvalho, e vidoeiro branco.

[29] A biomassa contendo celulose ou xilano pode ser uma biomassa pré-tratada. Os métodos para o pré-tratamento não estão particularmente limitados, mas podem ser utilizados métodos conhecidos como, por exemplo, tratamento com ácido, tratamento com ácido sulfúrico, tratamento com ácido sulfúrico diluído, tratamento alcalino, tratamento hidrotérmico, tratamento subcrítico, tratamento de moagem fina e tratamento com vapor. A polpa pode ser usada como biomassa contendo celulose ou xilano, que foi submetida a tal pré-tratamento.

[30] Os métodos de cultivo não são particularmente limitados.

Por exemplo, a cepa mutante pode ser cultivada por cultura líquida na qual é usado um tubo de centrífuga, balão, frasco/balão fermentador, tanque ou semelhantes ou cultura sólida em que uma placa ou semelhante é utilizado. É preferido cultivar o Trichoderma reesei sob condições aeróbicas, e dentre tais métodos de cultivo é especialmente preferida a realização de cultura submersa realizada em um jarro/recipiente fermentador ou tanque enquanto a aeração ou agitação é realizada. A taxa de fluxo de ar é preferencialmente de cerca de 0,1-2,0 vvm, mais preferencialmente de 0,3 a 1,5 vvm, e de modo especialmente preferido a taxa de fluxo de ar é de cerca de 0,5 a 1,0 vvm. A temperatura da cultura é preferencialmente de cerca de 25-35ºC, mais preferencialmente 25-31ºC. A condição de pH durante o cultivo são preferencialmente pH 3,0-7,0, mais preferencialmente pH 4,0-6,0. Quanto ao tempo de cultivo, o cultivo é realizado em condições capazes de produção de proteína, até que a proteína se acumule em quantidade recuperável. O período de cultivo é geralmente de 24-288 horas, preferencialmente 24-240 horas, mais preferencialmente 36-240 horas, ainda mais preferencialmente 36-192 horas.

[31] Embora a proteína a ser produzida na presente invenção não seja particularmente limitada, as proteínas secretadas a partir dos corpos de fungos podem ser produzidas de forma eficiente. Dentre as proteínas, as preferidas são as enzimas. São mais preferidas enzimas sacarificantes, como celulases, amilases, invertases, quitinases e pectinases. As celulases são ainda mais preferidas.

[32] As celulases que podem ser produzidas na presente invenção incluem várias hidrolases, que incluem enzimas com atividade de decomposição contra xilano, celulose e hemicelulose. Exemplos específicos destas enzimas incluem celobiohidrolase (EC 3.2.1.91), que produz celobiose por hidrólise de cadeias de celulose, endoglucanase (EC 3.2.1.4), que hidrolisa cadeias de celulose de porções centrais das mesmas, β-glucosidase (EC

3.2.1.21), que hidrolisa celo-oligossacarídeo e celobiose, xilanase (EC 3.2.1.8), que se caracteriza por atuar na hemicelulose e, em particular, no xilano, e β-xilosidase (EC 3.2.1.37), que hidrolisa o xilo-oligossacarídeo.

[33] O aprimoramento na capacidade de produção de proteína ou na atividade específica da celulase da cepa mutante de Trichoderma reesei da presente invenção em comparação com a cepa parental é verificado comparando as soluções de cultura obtidas pelo cultivo da cepa mutante e da cepa parental nas mesmas condições em concentração de proteína ou em uma ou mais atividades específicas selecionadas a partir do grupo que consiste em atividade específica da β-glucosidase, atividade específica da β-xilosidase e atividade específica da celobiohidrolase, sendo a concentração de proteína e as atividades específicas determinadas pelos métodos a seguir descritos.

[34] A concentração de proteína é determinada da seguinte maneira. As soluções de cultura da cepa mutante e da cepa parental são centrifugadas a 15.000 x g por 10 minutos para obter um sobrenadante. O sobrenadante obtido é diluído e 5 μL do sobrenadante diluído são adicionados a 250 μL do reagente do ensaio de proteína Quick Start Bradford (fabricado pela Bio-Rad Laboratories, Inc.). A mistura é deixada em repouso em temperatura ambiente por 15 minutos e, em seguida, é realizada a leitura da absorbância a 595 nm. A concentração da proteína contida na solução de enzima sacarificante é calculada com base em uma curva de calibração obtida usando soluções de albumina de soro bovino como soluções de referência.

[35] A atividade específica da β-glucosidase é determinada pelo seguinte método. Primeiro, para o sobrenadante da solução de cultura, 10 μL de uma diluição de enzima são adicionados a 90 μL de tampão acetato a 50 mM contendo 1 mM de p-nitrofenil-β-glucopiranosídeo (produzido pela Sigma-Aldrich, Japão), e a mistura é deixada reagir a 30ºC por 10 minutos. Em seguida, 10 µL de carbonato de sódio 2 M são adicionados e bem misturados para interromper a reação, e o aumento na absorbância a 405 nm é medido.

Finalmente, a liberação de 1 μmol de p-nitrofenol por minuto é definida como 1 U de atividade para calcular a atividade específica.

[36] A atividade específica da β-xilosidase é determinada pelo seguinte método. Primeiro, para o sobrenadante da solução de cultura, 10 μL de uma diluição de enzima são adicionados a 90 μL de tampão acetato a 50 mM contendo 1 mM de p-nitrofenil-β-xilopiranosídeo (produzido pela Sigma-Aldrich, Japão), e a mistura é deixada reagir a 30ºC por 30 minutos. Em seguida, 10 µL de carbonato de sódio 2 M são adicionados e bem misturados para interromper a reação, e o aumento na absorbância a 405 nm é medido. Finalmente, a liberação de 1 μmol de p-nitrofenol por minuto é definida como 1 U de atividade para calcular a atividade específica.

[37] A atividade específica da celobiohidrolase é determinada pelo seguinte método. Primeiro, para o sobrenadante da solução de cultura, 10 μL de uma diluição de enzima são adicionados a 90 μL de tampão acetato a 50 mM contendo 1 mM de p-nitrofenil-β-lactopiranosídeo (produzido pela Sigma-Aldrich, Japão), e a mistura é deixada reagir a 30ºC por 60 minutos. Em seguida, 10 µL de carbonato de sódio 2 M são adicionados e bem misturados para interromper a reação, e o aumento na absorbância a 405 nm é medido.

[38] Os métodos para recuperar uma proteína contida na solução de cultura onde a cepa mutante foi cultivada não são particularmente limitados, mas a proteína pode ser recuperada removendo os corpos de fungos a partir da solução de cultura. Exemplos de métodos para remover os corpos de fungos incluem centrifugação, separação por membrana e filtro-prensa.

[39] Além disso, no caso em que a solução de cultura na qual o fungo mutante foi cultivado é usada como uma solução de proteína sem remover os corpos de fungos da solução, a solução de cultura é preferencialmente tratada de modo que a cepa mutante de Trichoderma reesei não possa crescer nela. Exemplos de métodos de tratamento para prevenir o crescimento dos fungos incluem tratamento com calor, tratamento químico, tratamento ácido/alcalino, e tratamento com UV.

[40] No caso em que a proteína é uma enzima, a solução de cultura a partir da qual os corpos dos fungos foram removidos ou quand o a solução foi tratada de modo que os corpos dos fungos não possam crescer como mencionado acima, pode ser usada diretamente como uma solução de enzima.

[41] No caso em que a proteína alvo a ser produzida é uma celulase, esta celulase pode ser usada para sacarificar biomassa contendo celulose para produzir um açúcar. A celulase obtida pelo cultivo da cepa mutante é alta, especialmente na atividade específica de β-glucosidase em comparação com a celulase obtida pelo cultivo da cepa parental na qual a mutação não foi introduzida, e pode, portanto, decompor eficientemente a biomassa contendo celulose para obter uma solução de açúcar com alta concentração de glicose.

Assim, uma quantidade maior de açúcar pode ser obtida.

[42] Como biomassa contendo celulose para ser usadas na presente invenção, pode-se utilizar a mesma biomassa como a biomassa que contém celulose descrita acima como um indutor, ou uma biomassa pré-tratada.

[43] As condições para a reação de sacarificação não são particularmente limitadas. A temperatura da reação de sacarificação está preferencialmente no intervalo entre 25-60ºC, mais preferencialmente no intervalo entre 30 a 55ºC. O tempo de reação de sacarificação está preferencialmente no intervalo entre 2 horas à 200 horas. O pH na reação de sacarificação está preferencialmente no intervalo 3,0-7,0, mais preferencialmente no intervalo 4,0-6,0. No caso de celulases derivadas do gênero Trichoderma, o pH ótimo para a reação é pH 5,0. Além disso, uma vez que o pH muda durante a hidrólise, é preferível adicionar um tampão à solução de reação ou conduzir a reação enquanto mantém o pH constante usando um ácido ou um álcali.

[44] No caso em que a enzima é separada e recuperada da solução sacarificada, pode-se usar um método em que a solução sacarificada é filtrada com uma membrana de ultrafiltração ou dispositivo semelhante para recuperar a enzima no lado de não permeação. De acordo com a necessidade, uma etapa para a remoção de matéria sólida da solução sacarificada pode ser realizada antes da filtração. A enzima recuperada pode ser novamente utilizada para uma reação de sacarificação.

EXEMPLOS

[45] A presente invenção é descrita de forma específica a seguir, com referência aos Exemplos.

EXEMPLO DE REFERÊNCIA 1

CONDIÇÕES PARA MEDIÇÃO DE CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNA

[46] O reagente utilizado para medir a concentração de proteína foi o Quick Start Bradford (produzido pela Bio-Rad Laboratories, Inc.).

[47] Condições de medição - Temperatura de medição: temperatura ambiente - Reagente de medição da concentração de proteína: 250 μL - Solução de cultura de fungo filamentoso: 5 μL - Tempo de reação: 5 min - Absorbância: 595 nm - Padrão : BSA

EXEMPLO DE REFERÊNCIA 2

CONDIÇÕES PARA DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ESPECÍFICA DE CELULASES

[48] (Condições para a determinação da atividade específica de β-glucosidase) - Substrato: p-nitrofenil-β-glucopiranosídeo (produzido pela Sigma-Aldrich Japão) - Solução de reação: 90 μL de tampão acetato a 50 mM contendo p-nitrofenil-β-glucopiranosídeo 1 mM.

- Diluição da enzima: 10 μL - Temperatura de reação: 30ºC - Tempo de reação: 10 min - Bloqueador da reação: 10 μL de carbonato de sódio 2M - Absorbância: 405 nm

[49] (Condições para a determinação da atividade específica de β-Xilosidase) - Substrato: p-nitrofenil-β-xilopiranosídeo (produzido pela Sigma-Aldrich Japão) - Solução de reação: 90 μL de tampão acetato a 50 mM contendo p-nitrofenil-β-xilopiranosídeo 1 mM.

[50] (Condições para a determinação da atividade específica de celobiohidrolase) - Substrato: p-nitrofenil-β-lactopiranosídeo (produzido pela Sigma-Aldrich Japão)

- Solução de reação: 90 μL de tampão acetato a 50 mM contendo p-nitrofenil-β-lactopiranosídeo 1 mM.

- Diluição da enzima: 10 μL - Temperatura de reação: 30ºC - Tempo de reação: 10 min - Bloqueador da reação: 10 μL de carbonato de sódio 2M - Absorbância: 405 nm EXEMPLO DE REFERÊNCIA 3

TESTE DE SACARIFICAÇÃO DE BIOMASSA CONTENDO CELULOSE

[51] Como biomassa contendo celulose, utilizou-se o Arbocel (marca registrada) B800 (produzido pela J. Rettenmaier & Sohne) ou um bagaço em pó com um diâmetro médio de partícula de 100 μm. Como solução enzimática, utilizou-se um filtrado obtido pela coleta de uma porção de 1 mL de uma solução de cultura de Trichoderma reesei ou de cepa mutante de Trichoderma reesei, centrifugando a solução de cultura coletada, recuperando um sobrenadante a partir do qual os corpos dos fungos foram removidos, e filtrando o sobrenadante utilizando um filtro de 0,22 μm.

[52] (Reação de sacarificação)

[53] 100 μL de um tampão de acetato de sódio 1M foram usados como tampão para a reação de sacarificação; 2 μL de solução de eritromicina 50 g/L foram usados para prevenir a propagação de vários germes; e 0,1 g de Arbocel (marca registrada) B800 (produzido pela J. Rettenmaier & Sohne) ou bagaço em pó com um diâmetro médio de partícula de 100 µm como material a ser sacarificado. Como para as soluções de enzimas, uma solução de enzima obtida por cultivo em balão usando Arbocel (marca registrada) B800 foi utilizada em uma quantidade de 450 μL no caso de sacarificação de Arbocel (marca registrada) B800 ou em uma quantidade de 400 μL no caso de sacarificação do bagaço em pó. Uma solução de enzima obtida por cultivo em balão usando lactose foi introduzida em uma proveta medidora na quantidade de 350 μL no caso da sacarificação de Arbocel (marca registrada) B800 ou na quantidade de 400 μL no caso da sacarificação de bagaço em pó, e a solução de enzima na proveta foi diluída com água esterilizada para um total de 1 mL. A diluição foi então introduzida em um tubo de 2 mL. Uma reação de sacarificação foi conduzida sob condições de temperatura de 50ºC por 24 horas e então a mistura de sacarificação foi centrifugada. O sobrenadante resultante foi recuperado como uma solução sacarificada e a reação enzimática foi encerrada pela adição de solução de NaOH a 1N em uma quantidade de um décimo da quantidade da solução sacarificada recuperada. A concentração de glicose na solução sacarificada após o término da reação foi determinada pela UPLC mostrada abaixo.

[54] (Determinação da concentração de glicose)

[55] A glicose foi analisada quantitativamente nas seguintes condições, usando o sistema ACQUITY UPLC (Waters). A análise quantitativa foi realizada com base em uma curva de calibração desenhada com soluções padrão de glicose.

[56] Coluna: Coluna ACQUITY UPLC BEH Amide 1,7 μm 2.1 x 100 mm

[57] Método de separação: HILIC

[58] Fase móvel: Fase móvel A: 80% de acetonitrila, solução aquosa de TEA a 0,2% , e fase móvel B: 30% de acetonitrila, uma solução aquosa de TEA a 0,2%, de acordo com o seguinte gradiente. O gradiente era um gradiente linear atingindo a proporção de mistura correspondente ao tempo abaixo.

[59] Condição de iniciação: (A 99,90%, B 0,10%), 2 minutos após o início: (A 96,70%, B 3,30%), 3,5 minutos após o início: (A 95,00%, B 5,00%), 3,55 minutos após o início: (A 99,90%, B 0,10%), 6 minutos após o início: (A

99,90%, B 0,10%)

[60] Método de detecção: ELSD (detector evaporativo de espalhamento de luz)

[61] Velocidade de fluxo: 0,3 mL/minuto

[62] Temperatura: 55ºC EXEMPLO 1

PREPARAÇÃO DA CEPA MUTANTE DE TRICHODERMA REESEI NA QUAL A FUNÇÃO DO

POLIPEPTÍDEO QUE CONSISTE NA SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS REPRESENTADA PELA SEQ ID NO: 2 FOI ELIMINADA

[63] (Método De Preparação Da Cepa Mutante)

[64] Uma cepa mutante de Trichoderma reesei na qual a função do polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 foi eliminada foi preparada da seguinte maneira. Um gene representado pela SEQ ID NO: 1 que codifica o polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 é destruído pela substituição do gene por acetamida como marcador de seleção e pelo gene da acetamidase (AmdS) (gene amdS) capaz de decompor acetamida como um gene marcador de seleção. Um fragmento de DNA consistindo na sequência do gene representado pela SEQ ID NO: 9 é preparado a fim de eliminar a função do polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2, e a cepa Trichoderma reesei QM9414 é transformada com o fragmento de DNA, preparando assim a cepa mutante de Trichoderma reesei na qual a função do polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 foi eliminada. Por este método, é obtida uma cepa mutante de Trichoderma reesei em que a sequência de bases representada pela SEQ ID NO: 1 foi deletada. Para permitir que um fragmento de DNA que consiste na sequência de base representada pela SEQ ID NO: 1 seja introduzido a montante e a jusante de uma sequência de DNA contendo amdS, um plasmídeo para introdução de mutação foi preparado de modo a adicionar uma porção homóloga à sequência do gene da cepa de Trichoderma reesei, QM9414.

[65] Especificamente, a PCR é conduzida utilizando o DNA genômico extraído de maneira usual a partir da cepa QM9414 de Trichoderma reesei e oligos DNAs representados pelas SEQ ID NOs: 10 e 11, e o fragmento amplificado resultante é tratado com enzimas de restrição AfiII e NotI para se obter um fragmento de DNA, que foi usado como fragmento a montante. Além disso, a PCR é conduzida usando oligos DNA representados pelas SEQ ID NOs: 12 e 13, e o fragmento amplificado resultante é tratado com enzimas de restrição MluI e SphI para se obter um fragmento de DNA para uso como fragmento de DNA a jusante. Os fragmentos de DNA a montante e a jusante são introduzidos em um plasmídeo no qual amdS foi inserido pelo uso das enzimas de restrição AfIII e NotI e as enzimas de restrição MluI e SphI , respectivamente, para a construção de um plasmídeo para a introdução de mutações. O plasmídeo para a introdução da mutação é tratado com as enzimas de restrição AflII e SphI, e a cepa QM9414 de Trichoderma reesei foi transformada com o fragmento de DNA obtido que é exibido pela SEQ ID NO: 9. As manipulações envolvendo a técnica de biologia molecular são realizadas como descrito em Molecular cloning, laboratory manual, 1, 2, 3 (1989). Além disso, a transformação é realizada usando uma técnica padrão, ou seja, um método de PEG de protoplasto e, especificamente, é realizada como descrito em Gene, 61, 165-176 (1987).

[66] (Preparação E Avaliação Da Cepa Mutante)

[67] A cepa mutante de Trichoderma reesei adquirida pelo método descrito acima foi usada como cepa mutante I de Trichoderma reesei no seguinte teste de produção de proteína e experimentos para determinar a concentração de proteína e atividade específica da celulase.

EXEMPLO 2

TESTE DE PRODUÇÃO DE PROTEÍNA USANDO A CEPA MUTANTE DE TRICHODERMA REESEI

[68] (Pré-cultura)

[69] Após os esporos da cepa mutante de Trichoderma reesei preparada no Exemplo 1 serem diluídos com solução salina fisiológica para uma densidade de 1,0 × 107/mL, 2,5 mL da solução de esporos diluída são inoculadas em 250 mL do meio de pré-cultivo mostrado na Tabela 1 que foram colocados em um balão com saliências/reentrâncias no fundo (baffled) de 1 L, e incubados em um agitador nas condições de 28ºC e 120 rpm durante 72 horas. A cepa QM9414 de Trichoderma reesei é usada como controle para conduzir os mesmos experimentos mostrados abaixo.

TABELA 1 Glicose 20 g Solução de Mandel* 5x 200 mL Solução de tartarato de amônio** 10x 100 mL Efluente de milho (milhocina) 50 g Trace element solution*** 1 mL Tween 80 0,5 mL PE-M 1 mL (para 1 L) * A solução de Mandel 5x tem a seguinte composição.

7 g/L (NH4)2SO4 10 g/L KH2PO4 2 g/L CaCl2·2H2O 1,5 g/L MgSO4·7H2O ** A solução de tartarato de amônio 10x contém 92 g/L de tartarato de amônio.

*** A solução de elementos vestigiais (traço) tem a seguinte composição.

0,3 g/L H3BO3

1,3 g/L (NH4)6Mo7O24·4H2O 5 g/L FeCl3·6H2O 2 g/L CuSO4·5H2O 0,4 g/L MnCl2·4H2O 10 g/L ZnCl2

[70] (Cultura Principal)

[71] Arbocel B800 (produzido pela J. Rettenmaier & Sohne) é adicionado ao meio de cultura principal mostrado na Tabela 2, e uma investigação em cultura submersa é conduzida usando um balão fermentador de 5 L (produzido pela ABLE & Biott Co., Ltd.).

[72] As soluções de pré-cultivo da cepa QM9414 de Trichoderma reesei e cepa mutante I de Trichoderma reesei preparadas no Exemplo 1 são inoculadas em uma quantidade de 200 mL em 2,5 L de meio de cultura principal ao qual o Arbocel B800 foi adicionado.

[73] Após a inoculação de cada meio de pré-cultura no meio de cultura principal, a cultura submersa é conduzida sob as condições de cultivo de 28ºC, 700 rpm, e uma taxa de fluxo de ar de 100 mL/min, enquanto o pH era regulado em 5,0.

TABELA 2 Arbocel B800 (produzido pela J. Rettenmaier & Sohne) 100 g Solução de Mandel* 5x 200 mL Efluente de milho (milhocina) 25 g Solução de elementos vestigiais (traço)*** 1 mL Tween 80 0,5 mL PE-M 1 mL (para 1 L) * O mesmo que na Tabela 1.

*** O mesmo que na Tabela 1.

[74] (Coleção de Soluções de Cultura)

[75] Em120 horas após o inicio do cultivo, uma porção de 20 mL de cada solução de cultura é coletada. Uma parte da solução de cultura coletada é centrifugada nas condições de 15.000 × g e 4 ºC por 10 minutos para a obtenção de um sobrenadante. O sobrenadante é filtrado com um filtro de 0,22 μm e o filtrado é usado como solução de celulase nos experimentos a seguir.

[76] (Determinação da Concentração de proteína)

[77] A concentração de proteína de cada uma das soluções de cultura que foram coletadas em 10 horas após o início do cultivo é determinada nas condições mostradas no Exemplo de Referência 1. Como resultado, a solução de cultura obtida pelo cultivo da cepa mutante de Trichoderma reesei na qual a função do polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 foi eliminada tem uma concentração de proteína mais alta do que a solução de cultura obtida pelo cultivo a cepa QM9414 de Trichoderma reesei.

[78] (Determinação das Atividades Enzimáticas)

[79] As soluções de cultura coletadas 120 horas após o início do cultivo são examinadas quanto as atividades específicas da celulase, ou seja, as atividades específicas de β-glucosidase, β-xilosidase e celobiohidrolase, nas condições mostradas no Exemplo de Referência 2. Na determinação da atividade específica, um aumento na absorbância a 405 nm é medido, e a liberação de 1 μmol do substrato por minuto é definida como 1 U de atividade para calcular a atividade específica. Como resultado, a solução de cultura obtida pelo cultivo da cepa mutante de Trichoderma reesei na qual a função do polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 foi eliminada é maior nas três atividades específicas em comparação com a solução de cultura obtida pelo cultivo da cepa QM9414 de Trichoderma reesei.

[80] (Cultivo em balão)

[81] Os esporos da cepa mutante I de Trichoderma reesei preparada no Exemplo 1 foram diluídos com solução salina fisiológica para 1,0 × 107/mL, e 0,1 mL da diluição de esporos resultante foi inoculado em 10 mL do meio de cultura em balão contendo Arbocel (marca registrada) B800 (produzido pela J. Rettenmaier & Sohne) ou lactose mostrada na Tabela 3, que havia sido colocado em um balão baffled de 50 mL. Esta diluição de esporos foi incubada em um agitador sob as condições de 28ºC e 120 rpm por 120 horas.

[82] Além disso, a cepa QM9414 de Trichoderma reesei, que era a cepa original (parental) na qual foi introduzida a mutação da cepa mutante I, foi submetida a 120 horas de incubação pelo método mostrado acima, como um controle para a cepa mutante.

TABELA 3 Arbocel B800 (produzido pela J. Rettenmaier & Sohne) 20 g ou Lactose (produzida pela Kanto Chemical Co., Inc.) 20 g Solução de Mandel* 5x 200 mL Solução de tartarato de amônio** 10x 100 mL Efluente de milho (milhocina) 50 g Solução de elementos vestigiais (traço)*** 1 mL Tween 80 0,5 mL PE-M 1 mL (para 1 L) * O mesmo que na Tabela 1.

** O mesmo que na Tabela 1.

*** O mesmo que na Tabela 1.

[83] (Coleta de Soluções de Cultura)

[84] Em 120 horas após o inicio do cultivo, uma porção de 1 mL de cada solução de cultura foi coletada. A solução de cultura foi centrifugada nas condições de 15.000 × g e 4ºC por 10 minutos para obter um sobrenadante. O sobrenadante foi filtrado com um filtro de 0,22 μm e o filtrado foi usado nos experimentos seguintes.

[85] (Determinação da Concentração de proteína)

[86] No balão de cultivo com Arbocel (marca registrada) B800, nos casos em que a concentração de proteína na solução de cultivo obtida pelo cultivo da cepa QM9414 de Trichoderma reesei foi considerada como 1, o valor relativo da concentração de proteína na solução de cultivo da cepa mutante I de Trichoderma reesei foi de 1,2. Assim, foi verificado que a cepa mutante tinha uma capacidade de produção de proteína maior do que a cepa original.

[87] Também no cultivo utilizando lactose, no caso em que a concentração de proteína na solução de cultivo obtida pelo cultivo da cepa QM9414 de Trichoderma reesei foi considerada como 1, o valor relativo da concentração de proteína na solução de cultivo da cepa mutante I de Trichoderma reesei foi de 1,3. Assim, foi verificado que a cepa mutante tinha uma capacidade de produção de proteína maior do que a cepa original.

[88] (Determinação de várias atividades específicas da celulase)

[89] No cultivo usando Arbocel (marca registrada) B800, nos casos em que várias atividades específicas de celulase da solução de cultura obtida pelo cultivo da cepa QM9414 de Trichoderma reesei foram consideradas como 1, os valores relativos das diferentes atividades específicas de celulase na solução de cultura obtida pelo cultivo da cepa mutante I de Trichoderma reesei foram: uma atividade específica de β-glucosidase de 1,1, uma atividade específica de β-xilosidase de 1,5 e uma atividade específica de celobiohidrolase de 1,8. Assim, verificou-se que a cepa mutante teve o efeito inesperado de trazer melhorias em diversas atividades específicas da celulase.

[90] Também no cultivo usando lactose, nos casos em que várias atividades específicas de celulase da solução de cultura obtida pelo cultivo da cepa QM9414 de Trichoderma reesei foram consideradas como 1, os valores relativos das diferentes atividades específicas de celulase na solução de cultura obtida pelo cultivo da cepa mutante I de Trichoderma reesei foram: uma atividade específica de β-glucosidase de 1,8, uma atividade específica de β-xilosidase de 1,4 e uma atividade específica de celobiohidrolase de 1,6. Assim, verificou-se que a cepa mutante teve o efeito inesperado de trazer melhorias em diversas atividades específicas da celulase.

[91] (Teste da Reação de sacarificação)

[92] De acordo com a técnica descrita no Exemplo de Referência 3, uma solução de cultura coletada 120 horas após o início do cultivo em balão da cepa mutante I de Trichoderma reesei foi usada como celulases para conduzir um teste de reação de sacarificação de biomassa contendo celulose.

Arbocel® B800 ou bagaço em pó foi utilizado como a biomassa contendo celulose.

[93] Como resultado, na reação de sacarificação para sacarificar Arbocel (marca registrada) B800, nos casos em que a concentração de glicose na solução sacarificada obtida com as celulases obtidas com a cepa QM9414 de Trichoderma reesei pelo cultivo com Arbocel (marca registrada) B800 foi considerado como 1, o valor relativo da concentração de glicose na solução sacarificada obtida usando as celulases obtidas com a cepa mutante I de Trichoderma reesei foi de 1,7. O valor relativo da concentração de glicose na solução sacarificada obtido usando as celulases obtidas pelo cultivo em balão da cepa mutante usando lactose também foi de 1,7.

[94] Na reação de sacarificação para sacarificar bagaço em pó, nos casos em que a concentração de glicose na solução sacarificada obtida com as celulases obtidas com a cepa QM9414 de Trichoderma reesei pelo cultivo com Arbocel (marca registrada) B800 foi considerado como 1, o valor relativo da concentração de glicose na solução sacarificada obtida usando as celulases obtidas com a cepa mutante I de Trichoderma reesei foi de 1,5. O valor relativo da concentração de glicose na solução sacarificada obtido usando as celulases obtidas pelo cultivo em balão da cepa mutante usando lactose também foi de 1,5.

[95] Foi determinado a partir desses resultados que as celulases produzidas pela cepa mutante I de Trichoderma reesei eram superiores em atividade enzimática em relação às celulases produzidas pela cepa parental e, portanto, tinham uma excelente capacidade de produzir glicose a partir de biomassa contendo celulose.

EXEMPLO 3

PREPARAÇÃO DA CEPA MUTANTE DE TRICHODERMA REESEI NA QUAL A FUNÇÃO DO

POLIPEPTÍDEO QUE CONSISTE NA SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS REPRESENTADA PELA SEQ ID NO: 2 FOI ELIMINADA (2)

[96] Uma cepa QM9414-A, que foi uma cepa obtida por cultura de passagem da cepa QM9414 de Trichoderma reesei foi submetida a um tratamento de mutação genética para adquirir uma cepa QM9414-C como uma cepa mutante. O tratamento da mutação genética foi conduzido da seguinte maneira. Os esporos da cepa QM9414-A foram inoculados no meio de pré-cultivo mostrado na Tabela 1 de forma que 1,0 × 10 5 esporos foram inoculados por mL de meio de pré-cultivo. 15 mL do meio de pré-cultivo foram incubados por meio dia e depois centrifugados para recuperar os esporos. Os esporos recuperados foram suspensos em um tampão Tris-maleato (pH 6,0) de modo a resultar em uma solução de esporos de 10 mL e foi adicionado 0,5 mL de uma solução NTG obtida por dissolução com um tampão Tris-maleato (pH 6,0) de modo a resultar em uma concentração de 1,0 g/L. A mistura resultante foi mantida a 28 ºC por 100 minutos para realizar o tratamento de mutação genética.

Os esporos que foram submetidos ao tratamento de mutação genética foram recuperados por centrifugação, posteriormente lavados com um tampão Tris-maleato (pH 6,0) três vezes e, finalmente, suspensos como esporos tratados com mutação genética em 10 mL de um tampão Tris-maleato (pH 6.0).

Os esporos tratados com mutação genética foram adicionados a um meio de ágar preparado pela adição de celulose cristalina. O tamanho dos halos, que circundavam as colônias e indicavam regiões onde a celulose cristalina havia sido decomposta pelas celulases, foi usado como um índice para selecionar uma cepa QM9414-C que havia formado um grande halo.

[97] A cepa QM9414-C foi analisada geneticamente e, como resultado, verificou-se que a citosina no resíduo 6.261º da sequência de bases representada pela SEQ ID NO: 1 havia sido alterada para adenina. Esta mutação altera o resíduo de ácido glutâmico no resíduo 1.523 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 em um códon de parada e causa a deleção de um domínio do tipo Glicosiltransferase_GTP do polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2.

EXEMPLO 4

TESTE DE PRODUÇÃO DE PROTEÍNA UTILIZANDO A CEPA MUTANTE DE TRICHODERMA

REESEI NA QUAL A FUNÇÃO DO POLIPEPTÍDEO QUE CONSISTE NA SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS REPRESENTADA PELA SEQ ID NO: 2 FOI ELIMINADA

[98] (Determinação da concentração de proteínas e várias atividades de celulase específicas)

[99] A cepa QM9414-C adquirida no Exemplo 3, que era uma cepa mutante de Trichoderma reesei na qual a função do polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 havia sido eliminada, foi cultivada da mesma maneira que no exemplo 2, e a solução de cultura coletada em 120 horas após o início do cultivo foi examinada quanto a concentração de proteína e atividades de celulase específica sob as condições indicadas nos Exemplos de referência 1 e 2. A cepa QM 9414-A que era a cepa parental da cepa QM9414-C foi utilizada como controle.

[100] Os resultados deste teste são exibidos na Tabela 4. A solução de cultura da cepa QM9414-C teve um valor relativo de concentração de proteína 2,6 vezes maior que o da solução de cultura da cepa QM9414-A. Além disso, as várias atividades específicas da solução de cultura da cepa QM9414-C, em termos de valor relativo em relação àquelas para a cepa QM9414-A, foram: 3,1 vezes para a β-glucosidase, 1,5 vezes para a β-xilosidase, e 2.0 vezes para a celobiohidrolase.

TABELA 4 Cepa Cepa QM9414-A QM9414-C Valor relativo da concentração de proteína 1,0 2,6 Valor relativo da atividade específica de β-glucosidase 1,0 3,1 Valor relativo da atividade específica de β-xilosidase 1,0 1,5 Valor relativo da atividade específica de celobiohidrolase 1,0 2,0

[101] (Teste da Reação de sacarificação)

[102] De acordo com a técnica descrita no Exemplo de Referência 3, uma solução de cultura coletada 120 horas após o início do cultivo da cepa QM9414-C de Trichoderma reesei foi usada como celulases para conduzir um teste de reação de sacarificação de biomassa contendo celulose. Arbocel (marca registrada) B800 ou bagaço em pó foi utilizado como a biomassa contendo celulose.

[103] Como resultado, nos casos em que a concentração de glicose na solução sacarificado obtida utilizando as celulases obtidas com a cepa QM9414-A de Trichoderma reesei foi considerada como 1, o valor relativo da concentração de glicose na solução sacarificada obtida utilizando as celulases obtidas da cepa QM9414-C de Trichoderma reesei foi de 1,1 na sacarificação de Arbocel (marca registrada) B800 e de 1,2 na sacarificação do bagaço em pó.

[104] Foi determinado a partir desses resultados que as celulases produzidas pela cepa QM9414-C de Trichoderma reesei eram superiores na atividade enzimática em relação às celulases produzidas pela cepa parental e, portanto, tinham uma excelente capacidade de produzir glicose a partir de biomassa contendo celulose.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. CEPA MUTANTE DE TRICHODERMA REESEI, caracterizada por possuir uma mutação que elimina ou reduz a função de um polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2.

2. CEPA MUTANTE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela mutação ser uma mutação que deleta um domínio tipo Glicosiltransferase_GTP do polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2.

3. CEPA MUTANTE, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pela mutação ser uma mutação de códon de parada para um resíduo de ácido glutâmico no 1.523º resíduo a partir do lado N-terminal na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2.

4. MÉTODO PARA PRODUZIR UMA PROTEÍNA, caracterizado por incluir uma etapa de cultivo da cepa mutante de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3.

5. MÉTODO PARA PRODUZIR UMA CELULASE, caracterizado por incluir uma etapa de cultivo da cepa mutante de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3.

6. MÉTODO PARA PRODUZIR UM AÇÚCAR, caracterizado por compreender: - uma etapa de produção de uma celulase pelo método para produzir uma celulase de acordo com a reivindicação 5; e - uma etapa de sacarificação de uma biomassa contendo celulose pelo uso da celulase obtida na etapa.