CN103725658B - 来源于兴安落叶松的植物发育相关蛋白LgUGPase及其编码基因和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种来源于兴安落叶松的植物发育相关蛋白LgUGPase及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物发育相关的由序列1衍生的蛋白质。导入LgUGPase基因能够促进细胞中可溶性糖的积累及纤维素等细胞壁成分的沉积，同时促进植物的营养生长。本发明对于培育性能良好的转基因植物，特别是提高抗逆性、增加营养生长水平、改善植物的纤维质量和提高纤维素含量有着重要的意义。

Description

来源于兴安落叶松的植物发育相关蛋白LgUGPase及其编码基因和应用
技术领域
本发明涉及一种来源于兴安落叶松的植物发育相关蛋白LgUGPase及其编码基因和应用。
背景技术
纤维素的分子式为“C6H10O5)n”，是由D-葡萄糖以β-1，4糖苷键组成的大分子多糖，分子量50000～2500000，相当于300～15000个葡萄糖基。纤维素是植物细胞壁的主要成分。全世界用于纺织造纸的纤维素每年达800万吨。此外，用分离纯化的纤维素做原料，可以制造人造丝、赛璐玢以及硝酸酯、醋酸酯等酯类衍生物和甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素钠等醚类衍生物，用于石油钻井、食品、陶瓷釉料、日化、合成洗涤、石墨制品、铅笔制造、电池、涂料、建筑建材、装饰、蚊香、烟草、造纸、橡胶、农业、胶粘剂、塑料、炸药、电工及科研器材等方面。
兴安落叶松是中国北方三大针叶树种之一，其木质较密，纹理清晰，有着较强的机械性能。另外，落叶松纤维细胞较长，并且非纤维细胞含量较低，所以兴安落叶松在建筑、装饰、造纸和化学纤维工业有着重要的经济价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种来源于兴安落叶松的植物发育相关蛋白LgUGPase及其编码基因和应用。
本发明提供的蛋白质，来源于兴安落叶松（Larixgmelinii），命名为LgUGPase蛋白，是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物发育相关的由序列1衍生的蛋白质。
为了使（a）中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6（通常为5个） RRRRR
Poly-His 2-10（通常为6个） HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述（b）中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
编码LgUGPase蛋白的基因（LgUGPase基因）也属于本发明的保护范围。
所述基因具体可为如下（1）或（2）或（3）或（4）的DNA分子：
（1）编码区如序列表的序列2所示的DNA分子；
（2）序列表的序列2所示的DNA分子；
（3）在严格条件下与（1）或（2）限定的DNA序列杂交且编码植物发育相关蛋白的DNA分子；
（4）与（1）或（2）限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码植物发育相关蛋白的DNA分子。
上述严格条件可为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65oC下杂交，然后用2×SSC、0.1%SDS和1×SSC、0.1%SDS各洗膜一次。
含有所述LgUGPase基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
可用现有的表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于进行鉴定及筛选，可对所述重组表达载体进行加工，如加入编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。所述重组载体具体可为将所述LgUGPase基因插入pBI101-35::Gus-Hm载体的多克隆位点得到的重组质粒。
本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将所述LgUGPase基因导入目的植物中，得到发育水平高于所述目的植物的转基因植物。所述目的植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为拟南芥，如Nossen生态型拟南芥。所述发育水平高可体现为营养生长水平高和/或可溶性糖含量高和/或纤维素含量高。所述营养生长为营养部位的生长，所述营养部位为茎和/或叶。所述发育水平高具体可体现为叶面积大和/或叶长度大和/或叶宽度大和/或节间距大和/或株高高和/或细胞壁厚度大。所述可溶性糖为葡萄糖和/或果糖和/或蔗糖。
本发明还保护所述LgUGPase蛋白作为UGPase酶的应用。
本发明还保护所述LgUGPase蛋白在制备UGPase酶中的应用。
本发明发现，导入LgUGPase基因能够促进细胞中可溶性糖的积累及纤维素等细胞壁成分的沉积，同时LgUGPase基因对于植物的营养生长，特别是高生长具有促进作用。由于细胞壁的加厚及体内可溶性糖含量的增加预示着该基因对于提高植物抗逆性具有积极作用。本发明对于培育性能良好的转基因植物，特别是提高抗逆性、增加营养生长水平、改善植物的纤维质量和提高纤维素含量有着重要的意义。
附图说明
图1为重组质粒pBI101-LgUGPase的元件示意图；35Sp，CaMV35S启动子；NOSp，胭脂碱合酶启动子；NOSt，胭脂碱合酶终止子；NTPII,卡那霉素抗性基因；BR，右侧；BL，左侧；黑色短线表示探针位置。
图2为southernblot鉴定结果。
图3为PCR鉴定结果。
图4为植株表型鉴定结果。
图5为细胞形态鉴定结果。
图6为UGPase酶活鉴定结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置五次重复实验，结果取平均值。
基于大量的序列分析、基因克隆和功能验证，本发明的发明人从兴安落叶松（Larixgmelinii）中发现了一个新蛋白，将其命名为LgUGPase蛋白，如序列表的序列1所示（由480个氨基酸残基组成）。将编码LgUGPase蛋白的基因命名为LgUGPase基因，其开放阅读框如序列表的序列2所示（1443bp）。
pBI101-35::Gus-Hm载体是由pIG121-Hm（NCBIACCESSIONNO.AB489142）改造而成。提及pBI101-35::Gus-Hm载体的参考文献为：LinXF,MinamisawaN,TakechiK,ZhangWB,SatoH,TakioS,TsukayaH,TakanoH(2008)IsolationandcharacterizationoftheLarixgmeliniiANGUSTIFOLIA(LgAN)gene.Planta228:601-608。
农杆菌菌株LBA4404：参考文献：BevanM.BinaryAgrobacteriumvectorsforplanttransformation.[J].NucleicAcidsResearch,1984,12(22):8711-8721.。
Nossen生态型拟南芥(又称野生型植株，用WT表示)：参考文献：Garcia,M.,Myouga,F.,Takechi,K.,Sato,H.,Nabeshima,K.,Nagata,N.,Takio,S.,Shinozaki,K.,Takano,H.(2008)AnArabidopsishomologofthebacterialpeptidoglycansynthesisenzymeMurEhasanessentialroleinchloroplastdevelopment.ThePlantJournal,53,924-934.。
实施例1、转基因植物的获得
一、重组表达载体的构建
1、提取兴安落叶松的实生苗的总RNA并反转录为cDNA。
2、以步骤1提取的cDNA为模板，采用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
F1：5’-TATCTAGAATGGCTGCAGCACCAGCAGTTGC-3’；
R1：5’-GCGGATCCCTAGTTCACAATATCATCAGGACTGC-3’。
3、用限制性内切酶XbaI和BamHI双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶XbaI和BamHI双酶切pBI101-35::Gus-Hm载体，回收约12kb的载体骨架。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pBI101-LgUGPase。根据测序结果，对重组质粒pBI101-LgUGPase进行结构描述如下：在pBI101-35::Gus-Hm载体的XbaI和BamHI酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的双链DNA分子。重组质粒pBI101-LgUGPase的元件示意图见图1。
二、转基因植物的获得
1、将重组质粒pBI101-LgUGPase导入农杆菌菌株LBA4404，得到重组农杆菌。
2、用含5g/100mL蔗糖和0.02g/100mLSilwetL-77的水溶液悬浮步骤1得到的重组农杆菌，得到OD600nm约为0.7的菌液。
3、取在光照培养箱（22℃，16小时光照/8小时黑暗）中生长约1个月的Nossen生态型拟南芥植株，剪去果荚和已开的花，然后将花盆倒置，使其花蕾浸泡在步骤2得到的菌液中约30秒；然后将花盆斜置于黑暗潮湿的环境下过夜；然后将花盆正置，继续在相同条件下培养，直至种子成熟，收取种子（T0代种子）。
4、取T0代种子，表面消毒后均匀铺于含50mg/L卡那霉素的1/2MS培养基平板，4℃春化2天，然后移至光照培养箱（22℃，16小时光照/8小时黑暗）培养约2周，用镊子小心将长出绿色真叶的阳性幼苗转移到花盆中，培养至种子成熟（22℃，16小时光照/8小时黑暗），分株收取种子（T1代种子）。
5、取T1代种子，表面消毒后均匀铺于含50mg/L卡那霉素的1/2MS培养基平板，4℃春化2天，然后移至光照培养箱（22℃，16小时光照/8小时黑暗）培养约2周，用镊子小心将长出绿色真叶的阳性幼苗转移到花盆中，培养至种子成熟（22℃，16小时光照/8小时黑暗），分株收取种子（T2代种子）。
6、取T2代种子，表面消毒后均匀铺于含50mg/L卡那霉素的1/2MS培养基平板，4℃春化2天，然后移至光照培养箱（22℃，16小时光照/8小时黑暗）培养约2周，用镊子小心将长出绿色真叶的阳性幼苗转移到花盆中，培养至种子成熟（22℃，16小时光照/8小时黑暗），分株收取种子（T3代种子）。
T0代种子长成的植株即为T1代植株，T1代种子长成的植株即为T2代植株，T2代种子长成的植株即为T3代植株。对于某株系来说，如果其T3代植株在步骤6的抗性筛选中均显示为阳性，则其T2代为纯合的转基因植株，该植株及其自交后代为纯合的转基因株系。
三、分子鉴定
随机取四个纯合的转基因株系（株系1、株系2、株系3和株系4）的T2代植株和Nossen生态型拟南芥植株进行如下分子鉴定：提取植株叶片的基因组DNA，用限制性内切酶XbaI酶切后采用NPTII基因片段（以重组质粒pBI101-LgUGPase为模板，采用NPTII-F和NPTII-R组成的引物对扩增得到；NPTII-F5'-TTGTCACTGAAGCGGGAAGG-3'和NPTII-R5'-CGGCGATACCGTAAAGCAC-3'）作为探针进行southernblot鉴定。结果见图2。结果表明，LgUGPase基因以单拷贝的形式插入到各转基因株系的基因组中。
取四个纯合的转基因株系（株系1、株系2、株系3和株系4）的T3代植株和Nossen生态型拟南芥植株进行如下分子鉴定：提取植株叶片的总RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板，采用F2(5'-CTCCTGGACAAGCTTGTTGTGCT-3')和R2(5'-GTTTTGGGAGTGACCTCCATGCA-3')组成的引物对检测LgUGPase基因的相对表达量（以Actin基因为内参基因，用于检测内参基因的表达量的引物如下：Atactin2-F：5'-CTGGATTCTGGTGATGGTGTGTCT-3'；Atactin2-R：5'-GAACCACCGATCCAGACACTGTAC-3'）。结果见图3。结果表明，在Nossen生态型拟南芥中没有LgUGPase基因表达，但在四个转基因株系中均具有LgUGPase基因的表达。
三、转空载体植株的获得
用pBI101-35::Gus-Hm载体代替重组质粒pBI101-LgUGPase，其它同步骤二，得到转空载体植株，作为转基因植株的对照。
实施例2、转基因植物的鉴定
取四个纯合的转基因株系（株系1、株系2、株系3和株系4）的T2代种子、转空载体植株的T2代种子和Nossen生态型拟南芥的种子，进行如下操作：将种子播种于MS培养基并正常培养，播种14天后将植株移栽至营养土。
一、营养生长指标检测
培养过程中，植株的表型照片见图4。播种3天后植株的照片见图4a，播种7天后植株的照片见图4b，播种10天后植株的照片见图4c，播种14天后植株的照片见图4d，（图4a-图4d中，直线以上为Nossen生态型拟南芥，直线以下自左至右依次为株系1、株系2、株系3和株系4）；播种3周后植株的照片见图4e（Nossen生态型拟南芥）和图4f（株系1），播种4周后植株的照片见图4g（Nossen生态型拟南芥）和图4h（株系1），播种5周后植株的照片见图4i（左为株系1，右为Nossen生态型拟南芥）。结果表明，与Nossen生态型拟南芥相比各个转基因株系表现出更快的生长速率，各个转基因株系的生长速率基本相同，转空载体植株与Nossen生态型拟南芥的生长速率基本相同。
对于播种40天后的植株，测量的第五叶片的叶面积、叶长和叶宽，测量分枝数、节间距和株高，结果见表2。结果表明，与Nossen生态型拟南芥相比各个转基因株系的营养生长均显著增加，各个转基因株系的营养生长基本相同，转空载体植株与Nossen生态型拟南芥的营养生长基本相同。
表2拟南芥的形态学指标（每个株系5个植株，取平均值）
a表示α=0.05与对照组有显著差异。
对于播种40天后的植株，观察第五叶片叶脉和茎的薄壁细胞（用FAA固定，用石蜡包埋，做超薄切片后进行显微观察），见图5。图5中，j、k、n、o为Nossen生态型拟南芥，l、m、p、q为株系1，j、l、k、m为叶脉的薄壁细胞，n、p、o、q为茎的薄壁细胞，k为j的局部放大图，m为l的局部放大图，o为n的局部放大图，q为p的局部放大图。结果表明，与Nossen生态型拟南芥相比各个转基因株系的薄壁细胞的细胞壁明显加厚，各个转基因株系的细胞壁厚度基本相同，转空载体植株与Nossen生态型拟南芥的细胞壁厚度基本相同。结果表明，LgUGPase基因对纤维素等细胞壁成分的积累起着关键作用。
二、UGPase酶活测定
对于播种40天后的植株，取第五叶片进行测定。方法参见文献：CiereszkoI,JohanssonH,HurryV,KleczkowskiLA(2001)Phosphatestatusaffectsthegeneexpression,proteincontentandenzymaticactivityofUDP-glucosepyrophosphorylaseinwild-typeandphomutantsofArabidopsis.Planta212:598-605。结果见图6（每个株系5个植株，取平均值）。结果表明，与Nossen生态型拟南芥相比各个转基因株系的UGPase酶活明显增高，各个转基因株系的UGPase酶活基本相同，转空载体植株与Nossen生态型拟南芥的UGPase酶活基本相同。
三、可溶性糖含量测定
对于播种40天后的植株，取第五叶片进行测定。方法参见文献：SekinS(1978)Enzymaticdeterminationofglucose,fructoseandsucroseintobacco.TobaccoSci23:75-77。结果见表3（每个株系5个植株，取平均值）。结果表明，与Nossen生态型拟南芥相比各个转基因株系的葡萄糖、果糖、蔗糖和可溶性糖含量都有显著增加，转空载体植株与Nossen生态型拟南芥的葡萄糖、果糖、蔗糖和可溶性糖含量基本相同。结果表明，LgUGPase基因对植株可溶性糖含量积累有一定促进作用。
表3拟南芥的可溶性糖含量
a表示α=0.05与对照组有显著差异,b表示α=0.10与对照组有显著差异。
四、纤维素含量的测定
对于播种40天后的植株，取茎进行测定。
木质素含量测定方法：HuntleySK,EllisD,GilbertM,ChappleC,MansfieldSD(2003)SignificantincreasesinpulpingefficiencyinC4H–F5H-transformedpoplars;improvedchemicalsavingsandreducedenvironmentaltoxins.JAgricFoodChem51:6178-6183。
半纤维素含量测定方法：C,A,RichterA,HochG(2010)Quantificationandmonosaccharidecompositionofhemicellulosesfromdifferentplantfunctionaltypes.PlantPhysiolBiochem48:1-8。
纤维素含量测定方法：UpdegraffDM(1969)Semi-microdeterminationofcelluloseinbiologicalmaterials.AnalBiochem32:420-424。
结果见表4。结果表明，与Nossen生态型拟南芥相比各个转基因株系的纤维素含量有显著增加，转空载体植株与Nossen生态型拟南芥的纤维素含量基本相同。结果表明，LgUGPase基因对纤维素的积累有一定的促进作用。
表4拟南芥的纤维素含量（每个株系5个植株，取平均值）
木质素(%) 纤维素(%) 半纤维素(%)
WT 28.60±2.30 17.95±2.11 1.06±0.23
株系1 27.80±4.24 22.37±2.13a 1.18±0.67
株系2 27.63±1.96 21.05±1.61a 1.34±0.65
株系3 28.11±2.25 24.24±1.46a 1.04±0.23
株系4 27.34±1.16 25.29±3.21a 1.02±0.21
a表示α=0.10与对照组有显著差异。

Claims (8)

1.一种蛋白质，是由SEQIDNo.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为SEQIDNo.2中所示的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的表达盒、重组载体或重组菌。
5.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述基因导入目的植物中，得到发育水平高于所述目的植物的转基因植物；所述发育水平高体现为营养生长水平高和/或可溶性糖含量高和/或纤维素含量高。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。
7.权利要求1所述蛋白质作为UGPase酶的应用。
8.权利要求1所述蛋白质在制备UGPase酶中的应用。
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