CN116286419B - 一种分泌辣根过氧化物酶的酿酒酵母及其发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种分泌辣根过氧化物酶的酿酒酵母及其发酵方法，属于基因工程和发酵工程技术领域。本发明采用pGal1启动子调控HRP的表达，并配合二段式发酵使发酵120h的HRP产量达到1284U/L。进一步通过优化启动子核心区域，敲除GAL80提高pGal1及其衍生的杂合启动子(特征是具有CRMGal1区域)的表达活性，并结合对原始CYC1T终止子的替换，改善HRP表达与菌株生长的矛盾从而提高HRP产量，并通过对信号肽的pre‑α前肽区域进行替换并对pro‑α前肽区域或延长以提高HRP分泌途径的通畅程度，使构建的菌株在5‑L发酵罐上实现了13506U/L的HRP产量。
Description
技术领域
本发明涉及一种分泌辣根过氧化物酶的酿酒酵母及其发酵方法，属于基因工程和发酵工程技术领域。
背景技术
辣根过氧化物酶(HRP；EC编号，1.11.1.7)是一种糖蛋白，由一条44kDa的肽链和一个血红素辅基组成，属于第三类植物过氧化物酶。由于HRP具有广谱的氧化特性，已被用于医学诊断、生物催化、生物修复和癌症治疗领域。特别是近年来，HRP被开发为强大的食品添加剂，用于蛋白质或生物聚合物的交联以及食品的保鲜杀菌。除了这些应用，HRP有可能被用于生产生物相容性支架(水凝胶)用于医学应用和可食用的微尺度支架(明胶和胶原蛋白)用于细胞培养肉。因此，随着食品制造中的应用不断增加，也需要越来越多的食品级HRP。
目前，HRP可以通过从辣根或过表达HRP的转基因植物中提取获得。但这种方法不仅生产周期较长，作物的HRP含量低，同时所获得的HRP组分也非常复杂，需要进一步纯化，因而成本高昂。相比酿酒酵母直接胞外分泌，破碎植物进而提取HRP的加工过程也更加繁琐耗能，环境成本高。也有人尝试利用大肠杆菌进行HRP的重组生产，然而由于原核生物缺乏翻译后的修饰和折叠，只能从包涵体中获得的复性HRP活性和稳定性较低，产品性质与质量远低于酿酒酵母。在常见的微生物底盘中，酿酒酵母不仅没有内毒素，也没有溶原性病毒，繁殖速度快，能进行高密度培养。更重要的是其食品安全性，不仅仅早已被人类用于面包和酿酒工业数千年，在现代也经过GRAS认证为可以用于食品工业的安全宿主。因此，应用酿酒酵母表达系统来生产HRP是最佳的选择。
利用酿酒酵母高效分泌生产HRP需要解决三个方面的难题：第一，HRP的分泌表达与菌株生长存在矛盾。HRP在进行重组表达时，由于其较大的分子量、复杂的蛋白折叠和翻译后修饰，其合成成本较高，会与生长必需蛋白的合成争夺细胞资源，进而引起酿酒酵母的代谢负担和生长抑制。尤其在对数生长期时，细胞资源更多地投入细胞生长与分裂，负责进行蛋白分泌的相关蛋白占细胞资源的比例下调。此时高强度表达异源蛋白进入分泌通路，会导致分泌通路超负荷，引起内质网错误折叠蛋白增多、氧化还原失衡等问题，诱发内质网应激反应(UPR)等一系列基因表达的调控信号，使得细胞资源重新分配，不再专注于细胞的生长与分裂，优先处理错误折叠蛋白，以求重新恢复细胞内稳态。由于在生长与分裂方面投入的细胞资源减少，加上过量表达未能及时折叠的异源蛋白对分泌途径蛋白处理能力的占用以及对分泌途径稳态的破坏，细胞的比生长速率将受损。而这一现象在HRP的生产过程中尤为严重。
第二，由于细胞资源的有限性，异源蛋白的表达强度不是越强越好，需要精细调整。一方面，天然元件相互之间的表达强度差距较大，无法精细调整异源蛋白表达在细胞资源中的占比。另一方面，即使利用人工构建的具有连续强度的表达元件库进行最适异源蛋白表达水平的筛选，依旧需要大量的测试才能选择到最优强度的元件。针对调控型表达系统而言，通过修改序列提升整个系统开启状态下的表达强度时，其关闭状态时的严谨性也会受到影响，这进一步提升了诱导表达系统进行精细表达优化的复杂度，需要更多非理性的实验筛选才能确认最优的表达元件。从一个表达系统的组成来看，主要包括启动子，相应的转录调控因子以及终止子。启动子又进一步可以被划分为两部分：上游调控序列(CRM)和核心启动子序列(CPS)。前者主要决定整个系统的调控特性，即受什么转录调控因子或信号分子调控，调控效果是激活还是抑制，调控时机是组成型还是非组成型；后者则会影响整个表达系统的转录强度水平。转录调控因子对表达效果的影响则分为激活作用和抑制作用。终止子则主要通过影响转录本的稳定性进而影响整个表达系统的表达效果，其影响程度取决于启动子的转录强度。根据以上对调控型表达系统的理解，将有可能创制一种更理性的异源蛋白表达水平优化方式以求用更少的实验量获得目标异源蛋白的最适表达水平。
第三，针对不同异源蛋白的分泌，由于异源蛋白性质的巨大差异，适用于酿酒酵母内源蛋白分泌的信号肽对于异源蛋白的分泌不一定是最优的。由于蛋白分泌途径的本质是货物蛋白与起转运加工作用蛋白之间的相互作用。针对不同的异源分泌蛋白，由于异源分泌蛋白、异源分泌蛋白自身的信号肽以及分泌途径的转运加工蛋白这三者之间的相互作用的不同，往往采用非理性的内源信号肽替换或信号肽随机突变去筛选最优信号肽以优化异源蛋白的分泌效果，工作量巨大的同时，获得正向结果的概率较低。但从信号肽的主要组成部分看可以被划分为两个区域，一部分是pre-peptide，主要决定异源蛋白从细胞质到内质网的易位，另一部分是pro-peptide，主要决定异源蛋白从内质网向高尔基体的转运。根据这一原理，将有可能创制一种更理性的信号肽优化策略以降低信号肽筛选的工作量，并提高正向结果的出现概率。
发明内容
本发明针对HRP分泌表达时会引起酿酒酵母生长抑制，进而导致HRP产量严重降低等问题，提供了一种HRP产量提高的重组酿酒酵母。
本发明提供了一种重组酿酒酵母，表达了SEQ ID NO.47所示的辣根过氧化物酶基因。
在一种实施方式中，所述重组酿酒酵母以pESC-URA为表达载体。
在一种实施方式中，所述辣根过氧化物酶基因连接至质粒pESC-URA的pGal1启动子(SEQ ID NO.3)和CYC1T终止子(SEQ ID NO.4)之间。
在一种实施方式中，所述辣根过氧化物酶基因通过SEQ ID NO.3所示的pGal1启动子或SEQ ID NO.16所示的杂合启动子pCGGal7-S调控所述辣根过氧化物酶基因的表达。
在一种实施方式中，所述重组酿酒酵母还敲除了GAL80基因；所述GAL80基因具有Gene ID:854954所示的核苷酸序列。
在一种实施方式中，所述重组酿酒酵母在酿酒酵母CEN.PK2-1C的基础上，敲除了GAL80基因，并应用SEQ ID表NO.42～46所示启动子表达了SEQ ID NO.47所示的辣根过氧化物酶基因。
在一种实施方式中，所述CYC1T终止子被替换为SEQ ID NO.18所示的RAD14T终止子，或SEQ ID NO.25所示的HOG1T终止子，或SEQ ID NO.19所示的SYN2T终止子、或SEQ IDNO.20所示的SYN9T终止子，或SEQ ID NO.21所示的SYN10T终止子。
在一种实施方式中，所述辣根过氧化物酶基因的N端融合α信号肽序列(SEQ IDNO.2)或SEQ ID NO.26～41任一所示的优化后的信号肽。
本发明还提供了提高酿酒酵母辣根过氧化物酶产量的方法，包括(1)～(5)中的至少一种改进：
(1)以SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.16所示的启动子调控所述辣根过氧化物酶基因的表达；
(2)敲除酿酒酵母基因组上的GAL80基因；
(3)应用α信号肽促进辣根过氧化物酶的分泌表达；
(4)将α信号肽的pro-α前肽区域(第20-89个氨基酸)进行删减或延长。
(5)将pre-α前肽区域(第1-19个氨基酸)替换为pre-Ost1前肽并对α信号肽的pro-α前肽区域(SEQ ID NO.50)进行删减或延长。
在一种实施方式中，所述方法还包括采用二段式发酵；所述二段式发酵是先采用10g/L以上的葡萄糖对启动子活性进行阻遏，再在发酵第6-48h时添加半乳糖激活启动子活性或在GAL80敲除菌的发酵过程中不额外添加半乳糖，启动子自行激活。
在一种实施方式中，所述二段式发酵是先在含20g/L蛋白胨、10g/L酵母膏、20g/L葡萄糖的培养基中发酵，再于发酵6-24h期间添加20g/L半乳糖。
在一种实施方式中，所述方法是将改进后的菌株先在含20g/L蛋白胨、10g/L酵母膏、40g/L葡萄糖的培养基中发酵，之后不再添加半乳糖。
本发明还提供了应用所述重组酿酒酵母发酵生产辣根过氧化物酶的方法。
有益效果：
1、本发明采用pGal1启动子调控HRP的表达，并采用二段式发酵使发酵120h的HRP产量达到1284U/L。
2、本发明通过将pGal1启动子的核心启动子区域替换为pTEF1、pTDH3和pGal7启动子的不同长度核心区域，对HRP在阻遏或诱导条件下的表达强度分布进行粗调。其中将pGal1的核心启动子区域替换为pGal7的核心启动子cpGal7-S所获得的杂合启动子pCGGal7-S初步改善HRP表达与菌株生长的矛盾，从而提高HRP产量至1570U/L。
3、本发明还通过敲除基因GAL80提高pGal1及其衍生的杂合启动子(特征是具有CRMGal1区域)的表达活性，使所有启动子控制下的HRP产量都呈现出飞跃式提升。敲除基因GAL80后，启动子pGal1和杂合启动子pCGTDH3-S、pCGTDH3-S和pCGGal7-S控制下的HRP产量均达到了2256U/L以上。其中，最优实验组pCGGal7-S启动子结合基因GAL80的敲除使HRP产量达到了3789U/L。
4、本发明采用RAD14T、HOG1T、DIT1T、SYN2T、SYN9T、SYN10T和SYN25T终止子替换原始CYC1T终止子，对HRP在阻遏或诱导条件下的表达强度分布进行细调。除了DIT1T和SYN25T终止子对HRP生产造成了负向效果，其余终止子控制下的HRP产量均达到了3908U/L以上。最优终止子RAD14T结合pCGGal7-S启动子和基因GAL80的敲除进一步改善HRP表达与菌株生长的矛盾从而提高HRP产量至5092U/L。
5、对pre-α前肽区域进行替换并对pro-α前肽区域或延长以提高HRP分泌途径的通畅程度减少HRP分泌堵塞对菌株生长的影响，提高HRP产量。其中，信号肽α(Δ30-43)、Ost1(Δ57-70)、Ost1(Δ55-70)、α(Δ55-70)、Ost1(Δ30-43)和Ost1(Δ44-70)控制下的HRP产量均达到了5000U/L以上，最优信号肽Ost1(Δ44-70)的HRP产量达到8551U/L。
6、针对采用pCGGal7-S杂合启动子、RAD14T终止子、Ost1(Δ44-70)信号肽进行HRP分泌表达的GAL80基因敲除菌株进行5-L发酵罐的放大实验，实现了13506U/L的HRP产量。
附图说明
图1诱导表达实验组Gal1/Gal7-20 g/L Glucose+20g/L Galactose和组成表达实验组TEF1/TDH3-40 g/L Glucose和Gal1/Gal7-40 g/L Glucose随发酵时间的菌株生长情况(图1A，相对于同发酵条件下对照组Control的OD600％)和HRP产量(图1B，发酵上清中HRP的酶活，U/L)
图2采用不同杂合启动子与pGal1启动子控制HRP表达结合野生型CEN.PK2-1C菌株(图2A和图2B)或是GAL80敲除菌(图2C和图2D)中进行HRP的发酵生产，在发酵结束时(96h)的HRP产量(图2A和图2C，发酵上清中HRP的酶活，U/L)与发酵第18h的OD600(图2B和图2D)。
图3采用不同终止子控制HRP表达结合pCGGal7-S启动子和GAL80敲除菌进行HRP的发酵生产，在发酵结束时(96h)的HRP产量(图3A，发酵上清中HRP的酶活，U/L)与发酵第18h的OD600(图3B)。
图4为采用不同信号肽控制HRP分泌结合pCGGal7-S启动子、GAL80敲除菌和RAD14T终止子进行HRP的发酵生产，在发酵结束时(96h)的HRP产量(发酵上清中HRP的酶活，U/L)与葡萄糖耗尽后第24h的OD600(按照HRP产量升序排序)。
图5为5-L发酵罐中进行HRP生产最优菌株SIP-Ost1(Δ44-70)的分批发酵生产的HRP产量(发酵上清中HRP的酶活，U/L)、菌株生长(OD600)、葡萄糖浓度和乙醇浓度数据。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
HRP活性的测定：在室温下将10μL适当稀释的培养上清液与190μL测定溶液(50mM乙酸乙酸钠缓冲液、1mM ABTS、1mM H2O2，pH 4.5)在酶标板中混合，在酶标仪中测定412nm的吸光度值。412nm处吸光度值随时间的斜率用于计算每单位体积样品的HRP活性。一个单位被定义为在上述测定条件下，一分钟内氧化1μmol ABTS所需的酶量。
葡萄糖、乙醇、菌体生长情况的测定：葡萄糖和乙醇的浓度由M-100生物传感器分析仪进行检测。菌液浓度测定：吸取样品菌液，用蒸馏水稀释一定倍数，以蒸馏水作为空白对照，采用分光光度计于1cm光程测定600nm的吸光度值后再乘回稀释倍数。
实施例1调控型表达系统结合二阶段发酵解除HRP分泌表达对酿酒酵母的生长抑制
将成熟HRP C1A的氨基酸序列(SEQ ID NO.1)按照酿酒酵母密码子偏好性进行密码子优化后得到SEQ ID NO.47所示的片段，于N端融合α信号肽序列(SEQ ID NO.2)后进行基因合成，获得DNA片段α-HRP(SEQ ID NO.48)。将DNA片段α-HRP应用Gibson Assembly组装至质粒pESC-URA的pGal1启动子(SEQ ID NO.3)和CYC1T终止子(SEQ ID NO.4)之间构建质粒pESC-pGal1-α-HRP-CYC1T。
以酿酒酵母CEN.PK2-1C基因组为模板，分别扩增得到pTEF1启动子(SEQ IDNO.5)、pTDH3启动子(SEQ ID NO.6)和pGal7启动子(SEQ ID NO.7)片段，应用GibsonAssembly分别替换质粒pESC-pGal1-α-HRP-CYC1T的pGal1启动子，分别获得质粒
pESC-pTEF1-α-HRP-CYC1T、pESC-pTDH3-α-HRP-CYC1T和pESC-pGal7-α-HRP-CYC1T。将质粒pESC-URA、pESC-pGal1-α-HRP-CYC1T、pESC-pTEF1-α-HRP-CYC1T、pESC-pTDH3-α-HRP-CYC1T和pESC-pGal7-α-HRP-CYC1T分别转化至酿酒酵母CEN.PK2-1C构建重组菌，构建的重组菌分别命名为Control、Gal1、TEF1、TDH3和Gal7。经菌落PCR和测序验证后，获得正确阳性克隆菌株进行摇瓶水平发酵验证，检测工程菌生长和HRP分泌效果。摇瓶水平发酵验证的过程为：所有菌株均挑取单菌落接种至分别添加了40mg/L亮氨酸、组氨酸和色氨酸的5mL YNB培养基中(6.7g/L YNB培养基粉末+20g/L的葡萄糖)，于50mL无菌离心管中30℃,220rpm培养18h作为种子。接着将改种子接种1mL至49mL YPD中(20g/L蛋白胨+10g/L酵母膏+40g/L葡萄糖)，于250mL摇瓶中30℃,220rpm发酵114h。
针对不同的启动子采用含有不同碳源的培养基进行实验：
(a)采用40g/L半乳糖替换YPD培养基中的40g/L葡萄糖对启动子活性进行组成式诱导；
(b)先采用20g/L葡萄糖替换YPD培养基中的40g/L葡萄糖对启动子活性进行阻遏，再在发酵第18h时添加20g/L半乳糖激活启动子活性；
(c)采用最初始版本的含有40g/L葡萄糖的YPD培养基进行发酵。
针对Control菌株分别采用a、b、c三种条件进行发酵作对照组，针对TEF1和TDH3菌株采用条件c进行发酵，针对Gal1和Gal7菌株分别采用条件a和b进行发酵。将TEF1、TDH3、Gal1和Gal7菌株各条件实验组的OD除以对应条件下对照组的OD，则可以看出各实验组生长削弱的情况，得到图1A。图1B为TEF1、TDH3、Gal1和Gal7菌株各条件实验组的HRP生产效果。可以发现在保证碳源总量不变的情况下，先采用20g/L葡萄糖阻遏后采用20g/L半乳糖诱导的二段式发酵，结合调控型启动子pGal1和pGal7的菌株Gal1和Gal7(即红色和浅红色折线)，其生长情况快速达到了对照组的95％，其余实验组生长均受严重抑制。采用二段式表达结合调控型启动子的两个菌株中Gal1菌株HRP产量最高，达到了1284U/L，是采用TEF1菌株的98倍。
实施例2pGal1启动子的核心启动子区域筛选初步优化HRP在阻遏和诱导条件下的表达强度分布
保留HRP生产效果更好的pGal1启动子(SEQ ID NO.3)的CRM Gal1区域(SEQ IDNO.8)用于后续的表达水平精细优化。
以酿酒酵母CEN.PK2-1C基因组为模板，分别扩增出启动子pTEF1、pTDH3和pGal7中不同长度的核心启动子pcTEF1-S(SEQ ID NO.9)、pcTEF1-L(SEQ ID NO.10)、pcTDH3-S(SEQID NO.11)、pcTDH3-L(SEQ ID NO.12)、pcGal7-S(SEQ ID NO.13)和pcGal7-L(SEQ IDNO.14)。通过Gibson Assembly将质粒pESC-pGal1-α-HRP-CYC1T上的pGal1核心启动子cGal1(SEQ ID NO.15)分别替换为上述6个核心启动子，分别获得包含杂合启动子pCGTEF1-S(SEQ ID NO.42)的质粒pESC-pCGTEF1-S-α-HRP-CYC1T、包含杂合启动子pCGTEF1-L(SEQID NO.43)的质粒pESC-pCGTEF1-L-α-HRP-CYC1T、包含杂合启动子pCGTDH3-S(SEQ IDNO.44)的质粒pESC-pCGTDH3-S-α-HRP-CYC1T、包含杂合启动子pCGTDH3-L(SEQ ID NO.45)的质粒pESC-pCGTDH3-L-α-HRP-CYC1T、包含杂合启动子pCGGal7-S(SEQ ID NO.16)的质粒pESC-pCGGal7-S-α-HRP-CYC1T和包含杂合启动子pCGGal7-L(SEQ ID NO.46)的质粒pESC-pCGGal7-L-α-HRP-CYC1T。将以上质粒分别转化酿酒酵母CEN.PK2-1C中构建重组菌，经菌落PCR和测序验证后，分别获得菌株cTEF1-S、cTEF1-L、cTDH3-S、cTDH3-L、cGal7-S和cGal7-L。进行摇瓶水平发酵验证，检测工程菌生长和HRP分泌效果。摇瓶水平发酵验证的过程为：所有菌株均挑取单菌落接种至分别添加了40mg/L亮氨酸、组氨酸和色氨酸的5mL YNB培养基中(6.7g/L YNB培养基粉末+20g/L的葡萄糖)，于50mL无菌离心管中30℃,220rpm培养18h作为种子。接着将改种子接种1mL至49mL YPD中(20g/L蛋白胨+10g/L酵母膏+40g/L葡萄糖)，于250mL摇瓶中30℃,220rpm发酵96h(根据实施例1可知发酵96h左右HRP产量最高)。
所有菌株均在两种条件下进行实验：
(a)先采用20g/L葡萄糖替换YPD培养基中的40g/L葡萄糖对启动子活性进行阻遏，再在发酵第18h时添加20g/L半乳糖激活启动子活性；
(b)采用最初始版本的含有40g/L葡萄糖的YPD培养基进行发酵。
通过图1A菌株的生长情况可以发现，HRP的表达对对数生长期菌体的生长抑制更明显。同时第18h时，添加40g/L葡萄糖的实验组葡萄糖已耗尽不再对启动子进行阻遏，且对添加20g/L葡萄糖+20g/L半乳糖的实验组而言，第18h开始添加半乳糖激活启动子活性，因此前18h的OD600数据更能反映各杂合启动子在阻遏状态下的泄露情况。发酵结果如图2A和2B所示，使用不同杂合启动子控制HRP表达的菌株表现出了不同程度的泄露水平与HRP生产能力。其中，包含pCGGal7-S杂合启动子(SEQ ID NO.16)的菌株cGal7-S，不仅在不添加半乳糖诱导的情况下具有更低的HRP泄露活性(图2A)，其对数生长期期间的生长性能也更加卓越(图2B)，在半乳糖诱导条件下的HRP产量也是最高的，达到1570U/L，是pGal1启动子所对应的Gal1菌株HRP产量的1.22倍。
实施例3GAL80基因敲除提高带有CRM Gal1区域的启动子的表达活性
GAL80基因所表达出的GAL80p抑制性转录调控因子会抑制能够与CRM Gal1区域结合的GAL4p转录激活因子的活性。因此，在采用启动子pGal1和上述各种杂合启动子的基础上，敲除抑制性转录调控因子GAL80p的基因GAL80(Gene ID:854954)，以完全释放源自pGal1启动子的CRM Gal1区域的激活活性。同时，这一改造还能摆脱HRP表达激活对半乳糖的需求，只需要葡萄糖的阻遏消失就能激活HRP表达。改造具体步骤为：以酿酒酵母CEN.PK2-1C基因组为模板，扩增得到GAL80基因(Gene ID:854954)序列上下游各500bp的片段，应用融合PCR将上游片段和下游片段连接构建敲除框，通过CRISPR/Cas9技术敲除框替换至酿酒酵母CEN.PK2-1C基因组的GAL80基因(Gene ID:854954)位点获得GAL80基因敲除菌。将质粒pESC-pGal1-α-HRP-CYC1T、pESC-pCGTEF1-S-α-HRP-CYC1T、pESC-pCGTEF1-L
-α-HRP-CYC1T、pESC-pCGTDH3-S-α-HRP-CYC1T、pESC-pCGTDH3-L-α-HRP-CYC1T、pESC-pCGGal7-S-α-HRP-CYC1T和pESC-pCGGal7-L-α-HRP-CYC1T转化至GAL80基因敲除菌，经菌落PCR和测序验证后，分别获得菌株Gal1-80、cTEF1-S-80、cTEF1-L-80、cTDH3-S-80、cTDH3-L-80、cGal7-S-80和cGal7-L-80。采用与实施例2相同的方法与条件，分别在40g/L葡萄糖或20g/L葡萄糖+20g/L半乳糖的条件下进行摇瓶水平发酵验证，检测工程菌生长情况和HRP分泌效果。发酵结果如图2C和2D所示。比较图2B与2D，可以发现无论在野生型CEN.PK2-1C中还是在GAL80敲除菌株中，含有各个启动子的菌株的生长情况几乎没有变化，说明GAL80基因的敲除并没有导致启动子的泄露增加，而所有启动子控制下的HRP产量飞跃式提升。尤其是包含杂合启动子pCGGal7-S的GAL80敲除菌株cGal7-S-80，其HRP产量达到了3789U/L，是cGal7-S菌株(pCGGal7-S启动子+CEN.PK2-1C菌株)HRP产量的2.41倍，Gal1-80菌株(pGal1启动子+GAL80敲除菌株)HRP产量的1.68倍，Gal1菌株(pGal1启动子+CEN.PK2-1C菌株)HRP产量的2.41倍，TEF1菌株(pTEF1启动子+CEN.PK2-1C菌株)HRP产量的291倍。
实施例4终止子筛选精细优化HRP在阻遏和诱导条件下的表达强度分布
为了进一步提高HRP的产量，在采用pGal1衍生出的杂合启动子pCGGal7-S和GAL80敲除的基础上，将CYC1T终止子替换为不同强度的其他终止子对HRP在阻遏和诱导条件下的表达强度分布进行精细优化。。以酿酒酵母CEN.PK2-1C基因组为模板扩增或通过基因合成，得到不同强度的终止子HOG1T终止子(SEQ ID NO.25)、DIT1T终止子(SEQ ID NO.17)、RAD14T终止子(SEQ ID NO.18)、SYN2T终止子(SEQ ID NO.19)、SYN9T终止子(SEQ IDNO.20)、SYN10T终止子(SEQ ID NO.21)、SYN25T终止子(SEQ ID NO.22)，应用GibsonAssembly替换质粒pESC-pCGGal7-S-α-HRP-CYC1T中的CYC1T终止子(SEQ ID NO.3)分别得到质粒pESC-pCGGal7-S-α-HRP-HOG1T、pESC-pCGGal7-S-α-HRP-DIT1T、pESC-pCGGal7-S-α-HRP-RAD14T、pESC-pCGGal7-S-α-HRP-SYN2T、pESC-pCGGal7-S-α-HRP-SYN9T、pESC-pCGGal7-S-α-HRP-SYN10T、pESC-pCGGal7-S-α-HRP-SYN25T。将以上质粒分别转化至实施例3构建的GAL80基因敲除菌，经菌落PCR和测序验证后，分别获得菌株HOG1、DIT1、RAD14、SYN2、SYN9、SYN10和SYN25。采用与实施例2相同的方法与条件，分别在40g/L葡萄糖或20g/L葡萄糖+20g/L半乳糖的条件下进行摇瓶水平发酵验证，检测工程菌生长情况和HRP分泌效果。发酵结果如图3所示，由于DIT1T终止子是一种极强的终止子，导致菌株DIT1在对数生长期出现过强的HRP表达泄露，进而引起生长性能的剧烈下降。而对于弱终止子RAD14T而言，由于进一步增强了整个表达系统的严谨性，使得菌株RAD14的生长性能仅次于采用失活终止子SYN25T的菌株SYN25。最终RAD14菌株(pCGGal7-S启动子+GAL80敲除菌+RAD14T终止子)的HRP产量达到了5092U/L，相比菌株cGal7-S-80(pCGGal7-S启动子+GAL80敲除菌)提升了1.34倍，是cGal7-S菌株(pCGGal7-S启动子+CEN.PK2-1C菌株)HRP产量的3.24倍，Gal1-80菌株(pGal1启动子+GAL80敲除菌株)HRP产量的2.26倍，Gal1菌株(pGal1启动子+CEN.PK2-1C菌株)HRP产量的3.96倍，TEF1菌株(pTEF1启动子+CEN.PK2-1C菌株)HRP产量的392倍。
实施例5pre-peptide和pro-peptide的组合优化
以酿酒酵母CEN.PK2-1C基因组为模板，扩增得到前肽pre-Ost1(氨基酸序列SEQID NO.23，CEN.PK2-1C基因组上的核苷酸序列SEQ ID NO.49)，应用Gibson Assembly替换质粒pESC-pCGGal7-S-α-HRP-RAD14T中α信号肽的pre-α前肽区域(α信号肽第1-19个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.24所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.51所示)得到质粒pESC-pCGGal7-S-Ost1-HRP-RAD14T。进一步地，以质粒pESC-pCGGal7-S-α-HRP-RAD14T和pESC-pCGGal7-S-Ost1-HRP-RAD14T为模板，通过PCR对,α信号肽的pro-α前肽区域(SEQ IDNO.50，α信号肽第20-89个氨基酸)进行删减或延长，使得质粒pESC-pCGGal7-S-α-HRP-RAD14T和pESC-pCGGal7-S-Ost1-HRP-RAD14T中的信号肽分别改变为信号肽Ost1(1x57-60)(SEQ ID NO.26)、信号肽Ost1(Δ57-70)(SEQ ID NO.27)、信号肽Ost1(Δ55-70)(SEQ IDNO.28)、信号肽Ost1(Δ30-43)(SEQ ID NO.29)、信号肽Ost1(Δ44-70)(SEQ ID NO.30)、信号肽Ost1(Δ57-60)(SEQ ID NO.31)、信号肽Ost1(Δ79-83)(SEQ ID NO.32)、信号肽Ost1(Δ27-29)(SEQ ID NO.33)、信号肽α(Δ27-29)(SEQ ID NO.34)、信号肽α(Δ79-83)(SEQID NO.35)、信号肽α(Δ57-60)(SEQ ID NO.36)、信号肽α(1x57-60)(SEQ ID NO.37)、信号肽α(Δ44-70)(SEQ ID NO.38)、信号肽α(Δ57-70)(SEQ ID NO.39)、信号肽α(Δ30-43)(SEQ ID NO.40)和信号肽α(Δ55-70)(SEQ ID NO.41)(信号肽名称的括号前为所使用的pre-peptide为pre-α或pre-Ost1，括号中的数字范围表示为pro-α前肽区域删减或延长的氨基酸范围，以完整α信号肽的氨基酸序列计数)。将以上以pESC-pCGGal7-S-α-HRP-RAD14T和pESC-pCGGal7-S-Ost1-HRP-RAD14T质粒为模板进行信号肽改造后的质粒pESC-pCGGal7-S-Ost1(1x57-60)-HRP-RAD14T、pESC-pCGGal7-S-Ost1Ost1(Δ57-70)-HRP-RAD14T、pESC-pCGGal7-S-Ost1(Δ55-70)-HRP-RAD14T、pESC-pCGGal7-S-Ost1(Δ30-43)-HRP-RAD14T、pESC-pCGGal7-S-Ost1(Δ44-70)-HRP-RAD14T、pESC-pCGGal7-S-Ost1(Δ57-60)-HRP-RAD14T、pESC-pCGGal7-S-Ost1(Δ79-83)-HRP-RAD14T、pESC-pCGGal7-S-Ost1(Δ27-29)-HRP-RAD14T、pESC-pCGGal7-S-α(Δ27-29)-HRP-RAD14T、pESC-pCGGal7-S-α(Δ79-83)-HRP-RAD14T、pESC-pCGGal7-S-α(Δ57-60)-HRP-RAD14T、pESC-pCGGal7-S-α(1x57-60)-HRP-RAD14T、pESC-pCGGal7-S-α(Δ44-70)-HRP-RAD14T、pESC-pCGGal7-S-α(Δ57-70)-HRP-RAD14T、pESC-pCGGal7-S-α(Δ30-43)-HRP-RAD14T和pESC-pCGGal7-S-α(Δ55-70)-HRP-RAD14T分别转化至实施例3构建的GAL80基因敲除菌，经菌落PCR和测序验证后，分别获得正确阳性克隆菌株SIP-Ost1(1x57-60)、SIP-Ost1(Δ57-70)、SIP-Ost1(Δ55-70)、SIP-Ost1(Δ30-43)、SIP-Ost1(Δ44-70)、SIP-Ost1(Δ57-60)、SIP-Ost1(Δ79-83)、SIP-Ost1(Δ27-29)、SIP-α(Δ27-29)、SIP-α(Δ79-83)、SIP-α(Δ57-60)、SIP-α(1x57-60)、SIP-α(Δ44-70)、SIP-α(Δ57-70)、SIP-α(Δ30-43)和SIP-α(Δ55-70)。采用与实施例2相同的方法与条件，但仅在40g/L葡萄糖条件下进行摇瓶水平发酵验证，检测工程菌生长情况(比较的是葡萄糖消耗完不再阻遏启动子活性，开启表达24h时的OD600)和HRP分泌效果。结果如图4所示，随着HRP分泌能力的提高，菌株生长能力也得到恢复。更好的信号肽促使HRP更好地分泌，从而减轻了对菌株的生长抑制进而改善HRP的生产。菌株SIP-α(Δ30-43)、SIP-Ost1(Δ57-70)、SIP-Ost1(Δ57-60)、SIP-Ost1(Δ55-70)、SIP-Ost1(Δ30-43)和SIP-Ost1(Δ44-70)均相比于α信号肽获得了正向效果。其中，菌株SIP-Ost1(Δ44-70)(pCGGal7-S启动子+GAL80敲除菌+RAD14T终止子+Ost1(Δ44-70)信号肽)的HRP产量最高达到了8551U/L，是菌株RAD14(pCGGal7-S启动子+GAL80敲除菌+RAD14T终止子)HRP产量的1.68倍，是TEF1菌株(pTEF1启动子+CEN.PK2-1C菌株)HRP产量的658倍。
实施例6重组菌在5-L发酵罐发酵产HRP
将重组菌SIP-Ost1(Δ44-70)的保藏管划线于分别添加了终浓度为40mg/L亮氨酸、组氨酸和色氨酸的YNB平板后，30℃培养48h。挑取单菌落接种至分别添加了终浓度40mg/L亮氨酸、组氨酸和色氨酸的YNB液体培养基中(一级种子培养基)，于30℃，220rpm培养18-20h。随后，按照百分之10％的接种量转接至含有40g/L葡萄糖的YPD培养基(二级种子培养基),于30℃，220rpm培养12-14h。按照12％的接种量将二级种子接种至5L发酵罐中的2.2L含有40g/L葡萄糖的YPD培养基(发酵培养基)，在3vvm，30℃条件下发酵120h。发酵过程中，通过50％的NH4OH将pH值控制在5.5，通过调整200-800rpm的搅拌将溶解氧(DO)保持在30％。检测菌体生长、发酵上清HRP活性、残糖和乙醇浓度，发酵结果如图5所示。可以发现最高HRP产量达到了13506U/L，相比摇瓶水平提高了1.58倍，是TEF1菌株(pTEF1启动子+CEN.PK2-1C菌株)HRP产量的1040倍。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (4)
1.一种重组酿酒酵母，其特征在于，在酿酒酵母CEN.PK2-1C的基础上，敲除了GAL80基因，并通过SEQ ID NO.3所示的pGal1启动子或SEQ ID NO.16所示的杂合启动子pCGGal7-S调控SEQ ID NO.47所示辣根过氧化物酶基因的表达；所述GAL80基因的核苷酸序列如GeneID: 854954所示；所述辣根过氧化物酶基因连接至质粒并位于所述启动子和CYC1T终止子之间；所述CYC1T终止子被替换为SEQ ID NO.18所示的RAD14T终止子，或SEQ ID NO.25所示的HOG1T终止子，或SEQ ID NO.19所示的SYN2T终止子、或SEQ ID NO.20所示的SYN9T终止子，或SEQ ID NO.21所示的SYN10T终止子；所述辣根过氧化物酶的N端融合SEQ ID NO.2所示的α信号肽序列或SEQ ID NO.27~31、SEQ ID NO.40~41任一所示的信号肽。
2.一种重组酿酒酵母，其特征在于，所述重组酿酒酵母在酿酒酵母CEN.PK2-1C的基础上，敲除了GAL80基因，并应用SEQ ID NO.44或SEQ ID NO.45所示启动子表达了SEQ IDNO.47所示的辣根过氧化物酶基因；所述GAL80基因的核苷酸序列如Gene ID: 854954所示；所述辣根过氧化物酶基因连接至质粒，位于所述启动子和CYC1T终止子之间；所述CYC1T终止子被替换为SEQ ID NO.18所示的RAD14T终止子，或SEQ ID NO.25所示的HOG1T终止子，或SEQ ID NO.19所示的SYN2T终止子、或SEQ ID NO.20所示的SYN9T终止子，或SEQ ID NO.21所示的SYN10T终止子；所述辣根过氧化物酶的N端融合SEQ ID NO.2所示的α信号肽序列或SEQ ID NO.27~31、SEQ ID NO.40~41任一所示的信号肽。
3.一种提高酿酒酵母辣根过氧化物酶产量的方法，其特征在于，对酿酒酵母出发菌株进行了（1）~（3）中的至少一种改进，所述酿酒酵母出发菌株为酿酒酵母CEN.PK2-1C：
（1）以SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.16所示的启动子调控SEQ ID NO.47所示辣根过氧化物酶基因的表达；并采用二段式发酵；所述二段式发酵是先采用10 g/L以上的葡萄糖对启动子活性进行阻遏，再在发酵第6-48h时添加半乳糖激活启动子活性；
（2）敲除酿酒酵母基因组上的GAL80基因；以SEQ ID NO.16所示的启动子调控辣根过氧化物酶的表达；所述GAL80基因的核苷酸序列如Gene ID: 854954所示；编码所述辣根过氧化物酶的基因序列如SEQ ID NO.47所示；
（3）应用SEQ ID NO.27~31、SEQ ID NO.40~41任一所示的信号肽实现辣根过氧化物酶的分泌表达；编码所述辣根过氧化物酶的基因序列如SEQ ID NO.47所示。
4.应用权利要求1或2所述重组酿酒酵母发酵生产辣根过氧化物酶的方法。
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