KR20020088663A

KR20020088663A - 과산화효소의 발현벡터, 이 발현벡터가 도입된 형질전환체및 이를 이용한 과산화효소의 대량생산방법

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Publication number: KR20020088663A
Application number: KR1020010027464A
Authority: KR
Inventors: 김태효; 박영훈; 정준기; 곽상수; 전문진
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2001-05-19
Filing date: 2001-05-19
Publication date: 2002-11-29
Also published as: KR100417806B1

Abstract

본 발명은 과산화효소의 대량 발현을 유도하는 신규한 발현벡터, 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체 및 상기 형질전환체를 이용하여 과산화효소를 대량으로 생산하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 GPD(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 프로모터 또는 GAL10(β-galactosidase 10) 프로모터를 사용하고 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae)의 알파-아밀라제 신호서열(α-amylase signal sequence) 및 과산화효소 유전자를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체 및 상기 형질전환체를 이용하여 과산화효소를 대량으로 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 발현벡터를 이용하면 과산화효소를 안정적으로 대량 얻을 수 있다.

Description

과산화효소의 발현벡터, 이 발현벡터가 도입된 형질전환체 및 이를 이용한 과산화효소의 대량생산방법{Novel expression vector producing peroxidase, transformants thereof and mass production method of peroxidase using it}

본 발명은 과산화효소의 대량 발현을 유도하는 신규한 발현벡터, 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체 및 상기 형질전환체를 이용하여 과산화효소를 대량으로 생산하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 GPD(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 프로모터 또는 GAL10(β-galactosidase 10) 프로모터를 사용하고 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae)의 알파-아밀라제 신호서열(α-amylase signal sequence) 및 과산화효소 유전자를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체 및 상기 형질전환체를 이용하여 과산화효소를 대량으로 생산하는 방법에 관한 것이다.

과산화효소(peroxidase)는 과산화수소 존재하에서 기질을 산화시키는 작용을 하는 효소로서 모든 생명체에 널리 존재하는 것으로 알려져 있으며, 이중에서도 식물에 대한 연구가 많이 이루어져 있다. 과산화효소는 효소반응이 민감하기 때문에 각종 임상시험용 시약, 화학분석용 시약 또는 유기화합물의 산화반응 등에 많이 사용되는 상업적으로 중요한 효소이며, 또한 각종 환경 스트레스에 대한 생체 방어기작에 관련되는 중요한 효소로서 주목되고 있다. 식물의 경우, 환경 스트레스에 의해 과산화효소 활성이 증가하는 것으로 알려져 있다. 특히, 본 발명에 이용한 고구마 유래 과산화효소는 고구마의 세포조직 배양을 통하여 대량생산하는 것으로 보고된 바 있다(대한민국 특허 제117516호; 한국생화학회지, 1994, 27, 32-137;Phytochemistry, 1995, 39, 981-984; 대한민국 특허 제176420호;Mol. Gen Genet., 1997, 255, 382-391). 과산화효소는 고구마를 비롯한 고등 식물체 내부에서 많은 수의 동위효소로 존재하며 그 이화학적 특성 및 기능에 있어서 많은 차이가 있다. 과산화효소는 출처와 기질에 따라 그 분류를 달리하는데 고구마 유래 과산화효소는 4종 이상인 것으로 알려져 있다(TRENDS in Biotechnology, 2001, 19, 73-80). 현재까지 고구마를 비롯한 서양겨자무 등의 식물에서 약 20여종의 과산화효소 동위효소의 유전자가 발견되었으며, 각각의 동위효소의 특성을 규명하려는 연구가 많이 이루어지고 있는 실정이다.

이렇게 과산화효소는 여러 식물체에 존재하는데 특히 서양겨자무(horseradish)의 주근이나 고구마(Ipomoea batatas)에 많이 함유되어 있으며, 현재 시약으로 이용되는 과산화효소는 서양겨자무에서 추출한 것이 대부분이다. 그러나 이와 같은 원료식물을 대량으로 재배하는 데에는 비옥한 넓은 토양이 필요하며, 또한 기후, 토양 및 수확시기 등 재배조건에 따라 이들의 수확량 및 품질이 크게 영향을 받기 때문에 고품질의 과산화효소를 안정하게 수득하기에는 어려움이 따른다.

재배 식물체로부터 과산화효소를 추출하는데 따르는 이와 같은 문제점을 해결하는 수단으로서, 식물조직세포의 배양 방법을 이용하여 배양세포로부터 과산화효소를 생산하는 방법이 있다. 그러나 과산화효소가 존재하는 것으로 보고된 땅콩, 서양겨자무, 토끼풀, 황벽나무, 파파야 등 식물에 이 방법을 적용한 결과, 배양세포로부터 생산되는 과산화효소의 양이 매우 적어서 실제적으로는 이용되지 못하고 있는 실정이다.

여러 종류의 단백질들, 특히 의약품으로 사용되는 단백질은 안정성이 널리 알려져 있는 사카로마이세스(Saccharomyces) 속을 포함한 효모를 사용하여 생산되어 왔고(Marten Seo, Chap, 7, Expression Systems and Processes for rDNA Products, ed, by Hatch et al., ACS Symp. Ser., 1991, 477), 목적 단백질을 발현 및 분비시키기 위하여 전사 촉진서열인 프로모터(promoter), 분비 신호 서열을 코딩하는 DNA, 목적 단백질의 구조 유전자 및 전사 종결자(transcription terminator)로 구성된 발현 분비 플라스미드 벡터를 사용해 왔다.

원하는 단백질을 대량으로 발현하기 위해서는 프로모터의 선택이 중요한데 이러한 플라스미드에 사용하기 위한 프로모터로는 PGK(Loison 등, 대한민국 특허공개 제88-7727호 및 제88-700234호:Bio/Technol,1998, 6, 72), GAPDH 교배인자 α(mating factor-α, MF α-1), PH05(Meyhack 등, 대한민국 특허공개 제86-381호 및 제87-6185호: Hershberger et al., Genetics and Molecular Biology of Industrial Microorganism, 1989, pp. 311-321) 및 포도당이 고갈된 배지에 갈락토스를 첨가함으로써 유도되는 GAL1 등의 GAL 프로모터 시리즈(Johnston, Microbiol, Rev., 1987, 51, 458-476)가 사용되고 있다. 그러나 PGK 또는 MF α-1 프로모터의 조절 하에서는 유전자가 구성적으로 발현되거나 또는 균체 증식기 말기에 발현되고, 소량의 단백질만이 생산되며, 나아가 그러한 프로모터를 포함하는 플라스미드의 안정성은 배양 도중에 저하되기 쉽다. PH05 프로모터는 배지 내의 인산염 농도가 낮을 때 유전자의 발현을 유도하지만, 재조합 효모의 발효 도중에 배지 내의 인산염 농도를 낮추는 것은 복잡하고 번거로운 공정이다. 이러한 이유 때문에 GAL(β-galactosidase) 시리즈 프로모터가 유전자 발현 조절용으로 많이 사용되어 지고 있다.

효모로부터 목적 단백질을 분비시키기 위해 현재 사용되고 있는 분비 신호 서열로는 인버타제 신호 서열(미합중국 특허제 5,010,003호), 산 포스파타제 신호 서열(미합중국 특허 제5,013,652호), 교배인자 α의 프리프로리더 서열(preproleader sequence; 미합중국 특허 제4,588,684호) 등이 있고, 이중 프리프로리더 서열이 많이 사용되어지고 있다.

상기에서처럼 상업적으로 중요한 효소인 과산화효소를 보다 효율적으로 대량 생산할 수 있는 동, 식물 또는 미생물 형질전환체의 개발이 요구되고 있는 실정이며, 이에, 서양겨자무 유래 과산화효소 유전자를 미생물(대장균 및 효모)에서 발현하거나 (Biochmeimal Society Transactions, 1992, 20, 111S), 고구마 유래 과산화효소를 고구마의 세포조직 배양을 통하여 대량 생산한 경우가 있지만(대한민국 특허 제117516호; 한국생화학회지, 1994, 27, 32-137; Phytochemistry, 1995, 39, 981-984; 대한민국 특허 제176420호;Mol. Gen Genet., 1997, 255, 382-391) 이 또한 대량 생산 공정상에서 효율적으로 이용되지는 못하고 있는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 상기의 조직 배양의 한계를 극복하기 위하여 유전공학 방법을 이용하여 과산화효소를 대량생산하는 방법을 개발하고자 노력하였으며, 이에 신규한 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체 및 상기 형질전환체를 이용하여 과산화효소를 대량으로 생산하는 방법을 제공함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 과산화효소의 대량 생산을 유도하는 신규한 발현벡터, 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체 및 상기 형질전환체를 이용한 과산화효소의 대량 생산방법을 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명의 GAL10 프로모터를 사용하고 알파-아밀라제 신호서열을 포함하는 새로운 발현벡터의 유전자 지도이고,

도 2는 본 발명의 GAL10 또는 GPD 프로모터와 알파-아밀라제 신호서열을 포함하는 발현벡터에 외래 유전자의 cDNA를 클로닝하여 삽입하였을 때 프로모터, 신호서열, 외래 유전자, 전자 종결 암호에 대한 부분을 자세히 나타낸 구성도이고,

A: PGAL10 : GAL10 프로모터(0.52kb),

B: PGPD: GPD(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 프로모터(1.25kb)

도 3은 본 발명의 GAL10 프로모터를 이용하여 고구마 유래 과산화효소인 swpa1 유전자를 사카로마이세스 세레비지에에서 발현 분비할 수 있는 pGAL-POD1의 유전자 지도이고 (A), (B)는 pGAL-POD1을 각각의 제한효소들에 의해 37 ℃에서 3시간 동안 반응하여 분석한 결과 사진이고,

레인 1, 6 : Lambda DNA/EcoR1+HindⅢmarker,

레인 2 :Sal1으로 처리, 레인 3 :Nco1으로 처리

레인 4 :BamH1과Nco1으로 처리, 레인 5 :EcoR1과Nco1으로 처리

레인 7 : 제한효소로 처리하지 않은 정상 pGPD-POD1.

도 4는 본 발명의 GPD 프로모터를 이용하여 고구마 유래 과산화효소인 swpa1 유전자를 사카로마이세스 세레비지에에서 발현 분비할 수 있는 pGPD-POD1의 유전자 지도이고 (A), (B)는 pGPD-POD1을 각각의 제한효소들에 의해 37℃에서 3시간 동안 반응하여 분석한 결과 사진이고,

레인 1 : 슈퍼코일된(supercoiled) pGAL-POD1,

레인 2 : 슈퍼코일된 pYGAP-CT1, 레인 3 : 슈퍼코일된 pGPD-POD1

레인 4, 13 : Lambda DNA/EcoR1+HindⅢmarker

레인 5 :Nco1으로 처리, 레인 6 :Xba1으로 처리

레인 7 :EcoR1과Xba1으로 처리, 레인 8 :Sal1으로 처리

레인 9 :EcoR1과Sal1으로 처리, 레인 10 :EcoR1으로 처리

레인 11 :BamH1으로 처리, 레인 12 :EcoR1과BamH1으로 처리

레인 14 : pYGAP-CT1을EcoR1과BamH1으로 처리

레인 15 : pGAL-POD1을EcoR1과BamH1으로 처리

도 5는 본 발명의 형질전환 사카로마이세스 세레비지에 효모균주의 배양액으로부터 재조합 과산화효소의 배지내 생산정도 여부를 네이티브(native)-PAGE로 분석한 결과 사진이다.

A : GAL-POD1, B : GPD-POD1

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 GAL10 또는 GPD 프로모터, 알파-아밀라제 신호서열 및 과산화효소 유전자를 포함하는 발현벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 형질전환체를 배양하여 단백질을 대량으로 생산하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 GAL10 또는 GPD 프로모터, 알파-아밀라제 신호서열 및 과산화효소유전자를 포함한 발현벡터를 제공한다.

본 발명의 발현벡터는 프로모터로 강력한 당분해 프로모터인 GPD(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 프로모터 또는 GAL10(β-galactosidase 10) 프로모터를 사용하고, 알파-아밀라제 신호서열(α-amylase signal sequence)과 GAL7 전사종결암호를 포함하는 신규한 발현벡터를 제작한다. 구체적으로 본 발명자들은 GAL10 프로모터를 갖고 있고, 세포내에서 발현벡터를 포함한 플라스미드의 안정적 유지를 위하여 GAL7(β-galactosidase 7) 유전자 유래의 전사종결암호를 포함하는 YEGα-HIR525에 재조합 단백질을 세포 외부로 배지로 분비시키기 위한 분비 시그널로서 아스퍼질러스 오리제(A. oryzae)의 알파-아밀라제 신호서열을 도입함으로써 GAL10 프로모터에 의해 단백질이 발현되는 발현벡터를 제조하였다. 본 발명에서는 바람직한 실시예로서 외래유전자로 고구마 유래 과산화효소 유전자를 사용한 경우를 예시하였다(실시예 1 참조)

본 발명자들은 또한 GAL10 프로모터 대신에 GPD 프로모터를 사용하는 새로운 발현벡터를 만들기 위해 효모용 플라스미드 pYGAP-CT-1(8.0 kb)과 외래 유전자가 클로닝된 상기 GAL10 프로모터를 사용하는 발현벡터를 동일한 제한효소로 처리한 후 GPD 프로모터 단편(1.25 kb)을 GAL10 프로모터 위치에 클로닝하여 GPD 프로모터를 사용하는 발현벡터를 제조하였다. 본 발명에서는 바람직한 실시예로서 외래 유전자로 고구마 유래 과산화효소 유전자를 사용한 경우를 예시하였다.

또한, 본 발명은 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다. 본 발명자들은 고구마 유래 과산화효소 재조합 유전자를 포함하고 본발명의 발현벡터 pGAL-POP1 또는 pGPD-POD1으로 형질전환된 효모 형질전환체를 제조하고 각각 2001년 4월 12일부로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 0992BP; KCTC 0993BP).

아울러, 본 발명은 상기 형질전환체를 이용하여 과산화효소를 대량으로 생산하는 방법을 제공한다

본 발명의 새로운 발현벡터를 이용하여 원하는 단백질을 분비 생산하기 위한 방법은,

1) 상기 발현벡터에 외래 유전자를 삽입하는 단계;

2) 단계 1의 발현벡터를 효모에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및

3) 단계 2의 형질전환체로부터 특정 단백질을 분비 생산하는 단계로 구성된다.

상기에서 단계 1은 새로운 발현벡터에 외래 유전자를 삽입하기 위하여 알파-아밀라제 신호서열과 GAL7 전사종결암호 사이에 원하는 특정 유전자의 cDNA를 클로닝하여 삽입시키고 이를 아가로스 젤 전기영동(agarose gel electrophoresis)을 통하여 확인함으로써 GAL10 또는 GPD를 프로모터로 사용하여 재조합 단백질을 분비 생산할 수 있는 발현벡터를 제조한다.

상기 단계 1에서 만들어진 외래 유전자가 삽입된 발현벡터를 전기적 충격 방법등의 통상적인 방법으로 효모에 형질전환하여 형질전환체를 제조한다. 상기 형질전환체를 한천배지에 도말하여 배양하여 여기서 나타난 단일집락들은 진탕 배양하면 원하는 특정 유전자가 발현되어 배양액으로 분비된다. 이 배양액을 원심분리하여 균체를 제거하고 회수한 배양상등액에 아세톤을 동일용적만큼 첨가하여 혼합한 후 이를 다시 원심분리하여 분비 단백질을 농축하여 이를 네이티브-폴리아크릴아마이드 전기영동을 실시하여 원하는 단백질의 분비를 확인한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> pGAL-POD1 발현벡터의 제조

<1-1> pGAL-1 셔틀벡터의 제조

본 발명자들은 GAL10 프로모터를 사용하고, 여기에 세포막 외부로의 분비를 유도하기 위한 신호서열로서열번호 1또는서열번호 2로 기재되는 아스퍼질러스 오리제의 알파-아밀라제 신호서열을 포함하는 효모용 셔틀벡터를 하기의 방법으로 제조하였다.

<1-1-1> 플라스미드 제조

GAL10 프로모터와 GAL7 전사종결암호를 포함하고 GAL1-GAL10 양방향 프로모터의 GAL1 방향 프로모터로부터의 전사를 억제하기 위하여 GAL1 프로모터 부위의 TATA 박스를 제거한 YEGα-HIR525를 효모용 출발 플라스미드로 선택하고 YEGα-HIR525의 분비 시그널인 교배인자 α의 프리프로 리더(pre-pro leader)와 히루딘 유전자를 인식하는 제한효소EcoR1및Sal1에 의해 제거하였다. 상기 플라스미드 pYEGα-HIR525(6.5 kb)를 함유하는 대장균 균주를 100 ㎍/㎖의 앰피실린 함유 LB(Luria-Bertani) 액체 배지(트립톤 1%, 효모추출물 0.5%, 소금 1%) 50 ㎖에 접종하고, 37℃에서 150 rpm 으로 12 - 16시간 동안 진탕 배양하였다. 상기 배양액을 12,000 g에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 회수한 다음, 키아젠 플라즈미드 맥시 키트(QIAGEN^RPlasmid Maxi Kit, QIAGEN사, 독일)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 행함으로써 GAL10 프로모터와 GAL7 전사종결암호를 가지는 pYEGα-HIR525를 확보하였다.

<1-1-2> 분비 신호서열의 제조

고구마 유래 과산화효소의 효모세포막 외부로의 분비를 위하여서열번호 1또는서열번호 2로 기재되는 아스퍼질러스 오리제의 알파-아밀라제 신호서열은 화학 합성하였다. 즉, 알파-아밀라제 신호서열 염기서열의 양 말단에 제한효소EcoR1과Sal1의 인식부위를 갖도록 각각 74 bp 크기의 단일 사슬의 올리고뉴클리오티드(oligonucleotide)들을 TaKaRa사(일본)에 의뢰하여 화학합성하였고, 상기 단일사슬의 올리고뉴클리오티드로부터 이중사슬의 올리고뉴클리오티드 어댑터(adapter)를 제조하기 위하여 어닐링(annealing) 반응을 실시하였다. 어닐링 반응은 두 개의 단일사슬 올리고뉴클리오티드들의 혼합 농도를 5.6 pmol/㎕로 동일하게 하고, 90℃ 항온조에서 5분 동안 열처리한 후, 실온까지 냉각하여 실시하였다. 상기 어닐링 반응 산물에 제한효소EcoR1과Sal1을 동시 처리하여 가수분해하고 TAE 완충액을 사용한 후 0.8% 아가로스 젤 전기영동을 통하여 DNA 절편을 분리하였고, 상기 DNA 절편을 퀴엑스-2 추출 킷트(QIAEX Ⅱ extraction kit, QIAGEN사, 독일)를 사용하여 재추출함으로써 74 bp 크기의 어댑터 절편을 회수하였다.

<1-1-3> pGAL-1 벡터의 제조

상기 실시예 <1-1-1> 과정을 통하여 준비한 플라스미드 pYEGα-HIR525 5㎍을 제한효소EcoR1과Sal1으로 동시에 처리하여 가수분해한 후 TAE 완충액을 사용한 0.8% 아가로스 젤 전기영동을 통하여 DNA 절편을 분리하였다. 다음으로, 상기 DNA 절편을 퀴엑스-2 추출킷트를 사용하여 재추출함으로써 6.1 kb 크기의 DNA 절편을 회수하였다. 상기의 과정을 통하여 제한효소EcoR1과Sal1의 인식부위를 갖도록 준비한 GAL10 프로모터와 GAL7 전사종결암호를 가지는 6.1 kb 크기의 DNA 절편에 상기의 실시예 <1-1-2> 과정에서 회수한 74 bp 크기의 DNA 절편을 클로닝하였다. 구체적으로, GAL10 프로모터와 GAL7 전사종결암호를 포함하는 6.1 kb 크기의 DNA 절편과 효모세포막 외부로의 분비를 위한 아스퍼질러스 오리제의 알파-아밀라제 신호서열을 인식하는 74 bp 크기의 어댑터 절편을 각각 제한효소EcoR1과Sal1으로 동시처리하여 절단한 후 전기영동을 실시하였다. 젤로부터 회수한 6.1 kb 크기의DNA 절편 0.5 ㎍과 74 bp 크기의 어댑터 절편 5.6 pmol/㎕을 혼합한 후 1 U의 T4 DNA 리가제(ligase)를 첨가하여 4℃에서 24시간 동안 반응시켰고, 대장균 DH5α 균주에 하나한의 열충격 방법(Hanahan,In DNA cloning, 1983, Vol. 1, 109-135)으로 형질전환하였다.

상기 플라스미드는 선택표식 유전자로서 앰피실린(ampicillin) 저항성 유전자를 포함하므로, 100 ㎍/㎖ 농도의 앰피실린을 첨가한 LB(Luria-Bertani) 갈락토오스(galactos 2%) 한천배지에서 약 15시간 동안 배양하여 본 발명의 플라스니드가 올바르게 형질전환된 대장균을 분리하였다. 배양 후 나타난 단일군락(colony)들을 취하여 100 ㎍/㎖ 농도의 앰피실린을 포함한 LB 갈락토오스 액체배지에 접종한 후 37℃에서 약 15시간 동안 진탕배양하였고 플라스미드 신속분리법(Holmes et al., Analytical Biochemistry, 1981, 114, 193-197)에 따라 플라스미드들을 분리한 후, 제한효소 처리와 0.8% 아가로오스 젤 전기영동으로 플라스미드들을 선별하였으며, 여러 제한효소들에 의한 제한분석(restriction analysis)을 통하여 GAL10 프로모터와 알파-아밀라제 신호서열을 포함하는 플라스미드를 분리하여 "pGAL-1"이라 명명하였다(도 1).

<1-2> 고구마 유래 과산화효소 swpa1 유전자의 증폭

고구마 유래 과산화효소 swpa1 유전자를 함유하는 대장균을 배양하여 swpa1 유전자 함유 플라스미드를 얻었고, 중합효소 연쇄반응으로 swpa1 유전자의 양방향 말단에 단일한 제한효소Sal1인식부위를 갖도록 증폭하였다. 구체적으로, swpa1유전자 서열의 5' 말단에 단일한 제한효소Sal1인식부위를 갖는서열번호 3으로 기재되는 프라이머와 swpa1 유전자 서열의 3' 말단에 단일한 제한효소Sal1인식부위를 갖는서열번호 4로 기재되는 프라이머를 Takara사에 의뢰하여 화학 합성하였으며, 자동화 열 순환장치(automated thermal cycler, PCR system 9700/PE Applied Biosystems, USA)를 이용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하였다. 중합효소 연쇄반응은 내열성 중합 효소인 Taq DNA 중합효소(polymerase)를 포함하는 PCR-마스터(master) 혼합액(Boehringer Mannheim GmbH사, 독일) 25 ㎕, 주형(template) DNA 1 ㎕,서열번호 3과서열번호 4로 기재되는 프라이머 각각 2.5 ㎕(250 pmol) 및 PCR-증류수 혼합액(Boehringer Mannheim GmbH사) 19 ㎕를 혼합한 50 ㎕ 부피의 용액에 대하여 실시하였다. 광유(mineral oil, Sigma Chemical Co.)로 반응액 상부를 도말하고 95℃에서 5분간 가열하여 단백질 가수분해 효소를 불활성화 시킨 후, 자동화 열 순환장치를 이용하여 중합효소 연쇄반응(94℃ 1분, 50℃ 1분, 72℃ 1분)을 30회 반복 실시하였으며, 72℃에서 7분간 더 지속시킨 후 반응을 종료하였다. 중합효소 연쇄반응의 산물은 TAE 완충액을 사용한 0.8 % 아가로스 젤 전기영동을 통하여 DNA 절편을 분리한 후 퀴엑스-2 추출 킷트를 사용하여 0.92 kb 크기의 재조합 cDNA 절편을 회수하였다.

<1-3> pGAL-POD1 발현벡터의 제조

상기 실시예 <1-1>의 pGAL-1 벡터에 고구마 유래 과산화효소 swpa1 유전자의 재조합 cDNA(0.92 kb)를 발현벡터에 삽입하기 위해 하기와 같이 클로닝하였다.

상기 실시예 <1-2>에서 회수한 고구마 유래 과산화효소 swpa1 유전자의 재조합 cDNA 절편(0.92 kb)과 pGAL-1(6.1 kb) 벡터는 각각 제한효소Sal1을 처리하여 가수분해한 후, 0.8% 아가로스 젤 전기영동으로 DNA 단편들을 분리하고 퀴엑스-2 추출킷트를 사용하여 각각의 DNA 절편들을 회수하였다.

상기에서 회수한 pGAL-1 DNA 절편과 swpa1 유전자의 재조합 cDNA 절편을 적정 농도로 혼합하고 1U의 T4 DNA 리가제(ligase)를 첨가한 후 4℃에서 24시간 반응시킨 후, 전기적 충격에 의한 형질전환 방법으로서 대장균 XL1-blue 균주를 이용하여 일렉트로포레이션법(Dower et al.,Nucleic Acids Research, 1988, 16, 6127-6145)으로 형질전환하였다.

상기 실시예 <1-1-3>에서와 동일한 방법으로 플라스미드들을 선별하였으며, 여러 제한효소들에 의한 제한분석을 통하여 본 발명의 발현벡터를 분리하고, 이를 "pGAL-POD1"이라 명명하였다(도 3).

<실시예 2> pGPD-POD1 발현벡터의 제조

<2-1> GPD 프로모터의 회수

GAL10 프로모터 대신에 GPD 프로모터(1.25 kb)를 도입하기 위해 효모 플라스미드 pYGAP-CT1(8.0 kb)을 함유하는 대장균으로부터 실시예 <1-1-1>과 동일한 방법으로 플라스미드를 얻고 제한효소BamH1과EcoR1을 동시 처리하여 가수분해한 후, 0.8% 아가로스 젤 전기영동으로 DNA 단편들을 분리하고 퀴엑스-2 추출 킷트를 사용하여 GPD 프로모터 DNA 절편들을 회수하였다.

<2-2> pGPD-POD1 발현벡터의 제조

실시예 <1-3>에서 얻은 GAL10 프로모터, 알파-아밀라제 신호서열, 고구마 유래 과산화효소 swpa1 유전자의 재조합 cDNA 및 GAL7 전자종결암호를 포함하는 플라스미드 pGAL-POD1에서 GAL10 프로모터 대신에 GPD 프로모터를 포함하도록 하기와 같이 클로닝하였다.

먼저, 실시예 <1-3>에서 제조한 GAL10 프로모터를 포함하는 플라스미드 pGAL-POD1을 제한효소BamH1과EcoR1을 동시 처리하여 가수분해하여 GAL10 프로모터만 제거한 후, 실시예 <1-3>과 동일한 방법에 따라 0.8% 아가로스 젤 전기영동으로 DNA 절편을 분리하고, 퀴엑스-2 추출 킷트를 사용하여 DNA 절편(6.5kb)을 회수하였다.

상기에서 회수한, GAL10 프로모터는 제거되고 알파-아밀라제 신호서열, 고구마 유래 과산화효소 swpa1 cDNA, GAL7 전사종결암호를 포함하는 DNA(6.5kb) 약 1㎍을 취하여, 상기 실시예 <2-1>에서 회수한 GPD 프로모터 DNA 절편이 포함된 용액에 적정 농도로 혼합하고 실시예 <1-1-3>과 동일한 방법으로 클로닝하여 플라스미드들을 선별하였으며, 여러 제한효소들을 사용한 제한분석을 통하여 본 발명의 발현벡터를 분리하고 이를 "pGPD-POD1"라 명명하였다(도 4).

<실시예 3> 효모 형질전환체의 제조

본 발명자들은 YPD(yeast extract 10.0 g/ℓ, peptone 20.0 g/ℓ, glucose20.0 g/ℓ) 배지에서 30℃에서 1일간 배양한 단백분해효소가 결핍된 돌연변이 효모균주인 사카로마이세스 세레비시에 2805(Mat a prep4::HIS prb1-δ can1 his3δ ura3-52) 균주를 전기적 충격에 의한 형질전환 방법(Evelyne Delorme,Applied and Environmental Microbiology, 1989, 55, 2242-2246)을 이용하였다. 효모균주의 종균(5%)은 YPD 배지에 접종하고 상기와 동일조건에서 배양하여 균농도(600 ㎚) 1.0일 때 균체를 회수하고 냉증류수로 세척한 다음 차가운 1 M 솔비톨 용액으로 세척하고 현탁하여 감응세포로 사용하였다. 상기 실시예 1과 실시예 2에서 준비한 고구마 유래 과산화효소 swpa1 재조합 유전자를 포함하는 발현벡터 pGAL-POD1과 pGPD-POD1 각각의 유전자 100 ng을 취하여 0.2 cm 큐빗에 넣고 감응세포 40 ㎕와 혼합한 후 25 ㎌, 2.0 kV/cm, 200 Ω의 조건에서 약 3초동안 전기적 충격을 가했으며, 1 M 솔비톨을 함유하는 YNBDCas 고체배지에서 형질전환체를 생성하였다.

상기에서 제조한 pGAL-POD1 및 pGPD-POD1 벡터로 형질전환된 효모 형질전환체를 각각 2001년 4월 12일부로 한국생명공학연구원 유전자 은행에 기탁하였다(수탁번호; KCTC 0992BP; KCTC 0993BP).

<실험예 1> 고구마 유래 과산화효소 swpa1 재조합 유전자의 발현 및 분비

본 발명자들은 효모 형질전환체에서 swpa1 재조합 유전자의 발현을 확인하기 위하여, 먼저 pGAL-POD1 함유 형질전환체는 YNBCas- 갈락토스 한천배지에 pGPD-POD1 함유 형질전환체는 YNBDCas 한천배지에 각각 도말하여 30℃에서 배양하였다. 나타난 단일 집락들은 각각 YNBDCas 또는 YNBCas- 갈락토스 액체배지에 접종하고30℃, 150 rpm에서 60시간 동안 진탕 배양하였다. 배양액은 10,000 g로 10분간 원심분리하여 균체를 제거하였고, 피로갈올(pyrogallol)을 색소원으로 사용하여 420 ㎚에서의 흡광도를 측정하는 시그마(Sigma)사의 표준방법을 따라 남은 상등액내의 과산화효소 역가를 측정하였다.

그 결과, pGAL-POD1과 pGPD-POD1 각각을 함유하는 형질전환체 모두에서 과산화효소 활성을 나타내었으며, 역가는 GAL-POD1 효모균주의 경우 7.6 unit/㎖, GPD-POD1 효모균주의 경우 19.6 unit/㎖을 나타내었다.

배양시간에 따른 과산화효소의 발현 분비를 확인하기 위하여, 일정량의 배양액을 10,000 g에서 10분간 원심분리하여 균체를 제거하고 회수한 배양상등액에 시약급 아세톤을 동일 용적만큼 첨가하여 혼합한 후 0℃에서 1시간 동안 방치하였다. 상기 배양액을 15,000 g에서 30분 동안 원심분리하여 분비 단백질을 농축하였으며, 8% 아크릴 아마이드를 사용하여 가브리엘의 방법(Gabriell,In Methods in Enzymology, 1971, 22, 578-604)에 따라 Native-폴리아크릴아마이드 전기영동을 실시하였다. 소량의 피로갈올(pyrogallol)과 과산화수소 희석액을 사용하여 젤을 염색한 후 고구마 유래 과산화효소 단백질의 효모균주에서의 발현 및 분비를 확인한 결과, 단일한 활성밴드가 나타남으로써 본 발명의 재조합 유전자가 효모세포 외부로 분비됨을 확인하였다(도 5).

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 새로운 발현벡터를 이용하면 유용한 특정 과산화효소의 대량 발현 및 분비를 유도할 수 있을 뿐만 아니라 과산화효소를 안정적으로 대량 생산할 수 있다.

Claims

GPD(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 프로모터 또는 GAL10(β-galactosidase 10) 프로모터, 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus. oryzae)의 알파-아밀라제 신호서열(α-amylase signal sequence) 및 과산화효소 유전자를 포함하는 발현벡터.
제 1항에 있어서, 알파-아밀라제 신호서열은서열번호 1과서열번호 2로 기재되는 것을 특징으로 하는 발현벡터.
제 1항에 있어서, 프로모터는 GAL10 프로모터이고, 과산화효소 유전자는 고구마 유래 과산화효소 swpa1인 것을 특징으로 하는 발현벡터 pGAL-POD1.
제 1항에 있어서, 프로모터는 GPD 프로모터이고, 과산화효소 유전자는 고구마 유래 과산화효소 swpa1인 것을 특징으로 하는 발현벡터 pGPD-POD1.
제 1항의 발현벡터가 도입된 형질전환체.
제 5항에 있어서, 발현벡터 pGAL-POD1으로 형질전환된 사카로마이세스 세레비시에 2805(수탁번호; KCTC 0992BP).
제 5항에 있어서, 발현벡터 pGPD-POD1으로 형질전환된 사카로마이세스 세레비시에 2805(수탁번호; KCTC 0993BP).
제 5항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 형질전환체를 배양하고 이어서 과산화효소는 분리하는 것을 특징으로 하는 과산화효소의 대량 생산방법.