CN101864371A - 同源重组构建双gal4基因型工业酿酒酵母及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种同源重组构建双GAL4基因型工业酿酒酵母，保藏名称为：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S.C DG115，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2009年9月6日，保藏号：CGMCC NO.3262。本发明还同时公开了上述同源重组构建双GAL4基因型工业酿酒酵母的用途，作为宿主进行外源蛋白表达；该菌株能降低工业生产中酵母对半乳糖的消耗量。

Description

同源重组构建双GAL4基因型工业酿酒酵母及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及到基于同源重组技术同时敲除工业酵母染色体特定基因和插入特定基因后的重组酵母菌株，并涉及到应用此菌株作为宿主进行外源蛋白表达后的工业酶的表达产量。

背景技术

酿酒酵母GAL系统的半乳糖-葡萄糖调控是真核生物转录调控系统中研究的最为清楚的一种调控机制。GAL系统包括一系列的结构和调控基因，在酵母生长过程中这些基因在转录水平上通过碳源进行调控，一般被葡萄糖所抑制，被半乳糖所诱导。由于GAL基因表达可以被生长条件所控制，因此GAL基因对外源基因的表达具有很大的应用价值。利用GAL基因的诱导特点可以控制外源蛋白在酿酒酵母中的表达，并提高外源蛋白的表达水平。GAL1、GAL7和GAL10的启动子被大量用来指导外源蛋白在酿酒酵母中的表达。

GAL4是GAL基因诱导表达的主要正调控因子，但GAL4在酵母细胞中拷贝数很低。低拷贝数限制了依赖于GAL4的GAL基因的表达，成了利用GAL启动子表达外源基因的瓶颈。GAL4p表达量低的原因主要是因为其启动子较弱，比强启动子GAL1弱了大约90倍左右。通过基因技术增强酵母GAL4p的表达量从而提高GAL启动子控制下的外源基因的表达水平成了目前重组蛋白表达研究的热点之一。

为了提高GAL4p的表达，可将GAL4基因置于强启动子下方插入多拷贝载体后转化酵母。但由于在多拷贝载体上大量表达GAL4基因会打破其与GAL80p之间的平衡，造成与半乳糖无关的GAL80p的组成型表达并影响GAL启动子的转录，因此反而会导致外源蛋白表达量降低和酵母在半乳糖培养基中生长滞后。为了维持GAL4、GAL80和GAL3之间的平衡，一个能同时表达Gal3p-Gal80p-Gal4p的YEP载体pMEGA2-DURA3被构建，β-半乳糖苷酶作为报告基因。结果表明，pMEGA2-DURA3转化的酵母GAL4p表达量增加了15-20倍，β-半乳糖苷酶的表达量增加12倍，但GAL4的过量表达也引起了酿酒酵母细胞的水解和形态的改变。为了在提高GAL4p表达量的同时避免其过量带来的副作用，Schultz(1987)构建了一个染色体上整合了GAL4结构基因与GAL10启动子表达框的酿酒酵母菌株，并用含有GAL10启动子和外源基因的质粒转化酵母。GAL4蛋白在此重组酵母中得到大量表达，从而使得外源gp350基因的表达是非转化菌株的10倍。

从以上研究结果可知，为了最大限度的利用GAL4蛋白促进GAL基因转录的能力，必须增加GAL4蛋白的表达量，同时不影响酵母的生长和发酵性能。此外，尽管GAL启动子诱导下的外源蛋白能够达到较高的表达水平，然而，使用半乳糖做为GAL1启动子的诱导剂也存在缺陷。GAL1启动子的诱导需要半乳糖，而半乳糖在酵母生长过程中会被酵母同步消耗，造成诱导剂浓度下降，随之影响外源蛋白的表达。此外，一般情况下半乳糖被添加到培养基中的终浓度为2％-4％，与葡萄糖相比半乳糖价格较为昂贵，使得工业化大规模发酵中半乳糖浓度的维持需要较高的经济成本。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一株双GAL4基因型工业酿酒酵母菌株，在GAL4基因引入酵母染色体的同时敲除酵母的一个GAL1基因，从而构建获得GAL1基因部分缺失酵母菌株，该菌株能降低工业生产中酵母对半乳糖的消耗量，并通过GAL4基因的引入进一步提高该酵母对GAL启动子控制下的外源蛋白的表达产量。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种同源重组构建双GAL4基因型工业酿酒酵母，保藏名称为：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S.C DG115，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2009年9月6日，保藏号：CGMCC NO.3262。

作为本发明的同源重组构建双GAL4基因型工业酿酒酵母的改进：染色体上的一个GAL1基因被敲除，同时在敲除位点处引入了一个GAL4基因拷贝。

本发明还同时提供上述同源重组构建双GAL4基因型工业酿酒酵母的用途，作为宿主进行外源蛋白表达。其表达量能提高3倍以上，对半乳糖的利用半衰期延长。

本发明通过GAL4基因的引入进一步提高酵母对GAL启动子控制下的外源蛋白的表达产量。

本发明的具体步骤如下：

1.扩增所需基因片段并克隆到载体中；

2.设计同源重组引物，以步骤1中的重组载体为模板进行PCR扩增，得到上下游与酵母GAL1基因有部分同源序列的包含GAL4基因和抗性表达盒的基因片段；

3.将步骤2中得到的基因片段转化酵母，用抗性作为筛选；

4.鉴定转化子。挑取转化子对其进行GAL1基因、GAL4基因和抗性表达盒的存在情况、引入位点进行分析；

5.诱导转化子丢失抗性表达盒，并检测丢失情况；

6.将带有GAL1启动子指导下的外源基因表达框架的多拷贝载体转入步骤5中丢失了抗性表达盒的转化子；

7.检测外源基因的表达量。

8.检测培养基中半乳糖的消耗量。

本发明中，涉及到的质粒为PMD18-T、YEPlac181、pUG6、PSH/ZEO。

本发明中，涉及到的菌株为工业酿酒酵母MS-1和大肠杆菌DH5α。

本发明中，同源序列碱基数为40～50bp。

本发明中，步骤3涉及的抗性筛选标记为G418筛选。

本发明中，步骤6中的外源基因可以为任意基因。

采用上述方法获得了高效表达外源蛋白的双GAL4基因型重组酵母S.C DG115(重组酿酒酵母CGMCC NO.3262)，此酵母对半乳糖的利用半衰期大大延长。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是GAL4+KanMX基因PCR扩增电泳图，250bp Marker。

图2是双GAL4基因酵母转化子的PCR鉴定，250bp Marker。

图3是β-1，3-1，4-葡聚糖酶表达的平板鉴定图。

图4是β-1，3-1，4-葡聚糖酶的酶活测定图。

图5是HPLC测定S.C DG115和MS-1在YPGL培养基中对半乳糖的消耗量对比图。

具体实施方式

下面通过S.C DG115高效表达β-1，3-1，4-葡聚糖酶的例子具体描述本发明重组菌株的构建和用途。

实施例1、重组菌株S.C DG115的构建：

1.基因扩增：分别以工业酿酒酵母MS-1基因组和质粒pUG6为模板扩增GAL4基因(SGD登陆号：YPL248C)和KanMX抗性表达盒。

2.载体构建：GAL4基因与PMD18-T载体相连后，得到质粒PMD18-TG4；用BamHI和KpnI分别双切PMD18-TG4和KanMX抗性表达盒，连接并转化大肠杆菌DH5α，最后得到质粒PMD18-TGK，大小为6.9kb左右。具体如下：

(1)DNA的酶切：

根据内切酶使用说明书上的建议，分别配制反应体系：

BamHI                     1μl

KpnI                      1μl

最适10×Buffer            2μl

DNA(PMD18-TG4和KanMX)     1μg

去离子水

                                     

加灭菌双蒸水至            20μl

最适反应温度酶切3-4小时，凝胶回收。

(2)片段的连接

按载体∶片断＝1∶8-1∶10的比例(体积比)配制反应体系，加1-1.5μl 10×T4 ligasebuffer、1μl T4 DNA ligase，加灭菌超纯水至体积为10μl-15μl。4℃连接过夜或16℃连接8小时后转4℃。

(3)大肠杆菌感受态细胞制备和转化

①试剂配制

TSS溶液：85％LB培养基，5％DMSO，10％PEG3350，5％50mM MgCl₂(pH6.5)，混合后0.22μm过滤除菌，4℃贮存一周后使用，半年内可用。上述％均是体积％。

②实验步骤

a.感受态细胞的制备：

(i)将-20℃甘油保存的E.coli DH5α划线接种于无抗LB固体培养基上，37℃培养过夜。

(ii)挑单菌落接种于5ml LB液体培养基，37℃振荡培养过夜；

(iii)取50μl(1％的接种量)接种于5ml LB液体培养基，37℃振荡培养2-3h至OD600为0.35-0.40；

(iv)将菌液分装于1.5ml灭菌离心管中，置冰上20min后4℃3200rpm离心10min；

(v)弃上清，加预冷的500μl TSS悬浮细胞，6500rpm离心5min；

(vi)弃上清，加预冷的100μl TSS悬浮细胞，即为感受态细胞；

b.转化：

(i)100μl感受态细胞中加入DNA连接产物(5-10μl)，轻轻混匀，置冰上30min；

(ii)在离心管中加入无抗生素的LB液体培养基1ml，混匀后37℃振荡培养1h；

(iii)离心，弃上清，用200μl灭菌水重悬菌体后涂布于含100μg/ml氨卞青霉素的LB固体培养基平板上，37℃培养12-16h后挑斑鉴定。

(4)质粒的提取

①取1-2ml过夜培养的LB液体培养基，12000g离心1min，弃尽上清。

②用250μl已加入RNAaseA的BufferS1悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小菌块。

③加入250μl BufferS2，温和并充分地上下翻转混合4-6次均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮溶液。此步骤不宜超过5min。

④加入350μl BufferS3，温和并充分地上下翻转混合6-8次，12000g离心10min。

⑤吸取以上步骤的离心上清液并转移到DNA制备管(置于2ml离心管中)，12000g离心1min，弃滤液。

⑥将制备管置回离心管，加500μl BufferW1，12000g离心1min，弃滤液。

⑦将制备管置回离心管，加700μl BufferW2，12000g离心1min，弃滤液。重复此步骤。

⑧将带有制备管的离心管在离心机中12000g空转1分钟；

⑨取出制备管，置于新的1.5ml离心管中，室温下晾干数分钟直至酒精完全挥发；

⑩在DNA制备膜正中央加50μl洗脱液，室温静置1min，12000g离心1min。所得质粒PMD18-TGK，大小为6.9kb左右，-20℃保存。

3.以质粒PMD18-TGK为模板，设计引物GAL4-S2/KanMX-AS1扩增GAL4+KanMX框架，所得PCR产物两端分别带有与GAL1基因同源序列47bp，产物大小为4357bp(图1)，引物序列如下：

上游引物GAL4-S2：(SEQ ID NO：1)

GTTAATATACCTCTATACTTTAACGTCAAGGAGAAAAAACTATAATGAAGCTACTG

TCTTCTATCGA

下游引物KanMX-AS1：(SEQ ID NO：2)

GAAAAAAATGAGAAGTTGTTCTGAACAAAGTAAAAAAAAGAAGTATACCCACTAG

TGGATCTGATATC

高保真酶扩增基因片段的PCR反应体系和条件如下：

HSTaq                          0.5μl

5×PCR Buffer(Mg²⁺Plus)        10μl

dNTP Mixture(各2.5mM)        4μl

模板                         1-10ng

引物1                        1μl

引物2                        1μl

加灭菌超纯水至               50μl

PCR反应条件：

94℃变性5min；

72℃延伸7min

乙醇沉淀PCR产物，溶于5μl无菌水中。

4.将同源片段电击入MS-1酵母感受态细胞内，在含200μg/ml G418的YPD平板上筛选转化子。

酵母感受态细胞制备：

a)从YEPD平板上挑取单个酵母菌落，接种于5ml YEPD培养基中，30℃、200rpm振荡培养过夜。

b)取100μl菌液接种于含10ml YEPD培养基的三角瓶中，30℃、200rpm振荡培养8-10h至OD₆₀₀1.3-1.5。

c)分装菌液到灭菌的2ml离心管中，冰上放置15min。

d)5500rpm 4℃离心5min收集细胞。去离子水洗涤1-2次。

e)弃上清，每管用320μl灭菌超纯水重悬，加40μl 10×TE以及40μl 10×LiAc，混匀，30℃85rpm振荡45min；加20μl DTT至终浓度为25mM，30℃85rpm振荡15min。5500rpm 4℃离心5min收集细胞。

f)用1ml预冷过的灭菌超纯水重悬细胞沉淀，5500rpm 4℃离心5min收集细胞。

g)重复步骤f两次。

h)1ml预冷过的1M D-山梨醇重悬细胞沉淀，5500rpm 4℃离心5min。

i)100μl预冷过的1M D-山梨醇重悬细胞沉淀，轻轻旋转混匀，置于冰上。

酵母电转化

a)取40μl酵母感受态菌，与5μl重组质粒(步骤3中PCR扩增得到的同源片段，大小为4357bp)混合，移入0.2cm电转化杯，冰浴5min。

b)擦干水滴，置电转仪上，电击转化。条件为：电压1.5kV；电容25μF；电阻200Ω；时间5msec。

c)立即加入1ml冰浴的YEPD培养基，将混合物转到1.5ml EP管中。

d)30℃振荡2h，其间每隔30min轻轻颠倒混匀一次。

e)5500rpm室温离心5min，弃上清，用灭菌超纯水洗涤一次。

f)5500rpm室温离心5min，用200μl灭菌超纯水悬浮细胞。

g)菌液涂布于含G418(200μg/ml)或Zeocin(150μg/ml)的YPD培养板，30℃倒置培养培养2-3天左右。

5.鉴定转化子。

将YPD平板上长出的大菌落复点于YPD/G418平板上，30℃培养3天后使用引物V1/K3对长出的200个单菌落进行PCR鉴定。V1位于GAL1基因上游346bp处，K3位于GAL4基因内部608bp处，V1/K3引物可以鉴定GAL4基因是否已经被正确重组到酵母染色体GAL1基因位点上。V1/K3扩增得到的PCR产物大小为954bp(图2)。引物序列如下：

V1：GCACTGCTCCGAACAATAAA    (SEQ ID NO：3)

K3：AAGAGAGAACCGTCGCCAAA    (SEQ ID NO：4)

6.半乳糖诱导丢失KanMX抗性表达盒

将质粒pSH/ZEO电转化重组双GAL4酿酒酵母，涂于含150μg/ml Zeocin的YPD平板上，30℃培养3天。随机挑取100多个转化子于YPG液体培养基中180rpm/min震荡培养2-3小时诱导Cre重组酶的表达，然后将菌液稀释涂布于无抗生素的YPD平板培养2-3天，随机挑取生长出的100个单菌落分别对应点于含G418(200μg/ml)和无抗YPD平板，并做好标记。在G418平板上不能生长而正常平板上能生长的初步认定为Kan^r丢失的菌株，基因型为GAL1/gal1::GAL4。通过传代培养去除质粒pSH/ZEO，将其中一株双GAL4酵母命名为S.C DG115。

该酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S.C DG115，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2009年9月6日，保藏号：CGMCC NO.3262。

实施例2、重组菌株S.C DG115(酿酒酵母CGMCC NO.3262)表达外源蛋白β-1，3-1，4-葡聚糖酶：

1.将带有GAL1启动子指导下的β-1，3-1，4-葡聚糖酶表达框架的载体转入DG115，转化步骤同上述实施例1的步骤3，筛选转化子。

双层平板法：a，下层：已经生长出酵母菌落的YPG(甘油)平板；b，上层：诱导培养基，含0.1％地衣多糖和2％半乳糖以及0.5％琼脂。

将转化平板上长出的酵母菌落编号保存后转接于到YP+甘油平板，30℃培养24h，然后在生长平板上缓慢倒入5ml半乳糖诱导培养基，30℃放置12h-20h后，用0.1％的刚果红溶液染色。30min后出现透明圈的即为β-1，3-1，4-葡聚糖酶已经表达的阳性转化子(图3)。

2.测定DG115的β-1，3-1，4-葡聚糖酶表达量：

(1)将在平板上产生较大透明圈的酵母菌株编号保存，同时转接于YPD培养基中活化培养24h，然后按1％接种量转接于30ml YPGL培养基中培养24h，加入3ml过滤除菌的20％半乳糖溶液至终浓度为2％，定时取样测培养基上清液酶活。

(2)β-1，3-1，4-葡聚糖酶酶活测定，以GAL系统没有改造的酵母(MS-1)作为对照；具体如下：

①溶剂配制：

0.5％β-葡聚糖母液配制：准确称取0.05g β-葡聚糖加热溶解于10ml灭菌超纯水，定容，保存于4℃。

100μg/ml β-葡聚糖溶液：准确吸取2ml 0.5％β-葡聚糖溶液定容于100ml灭菌超纯水。

100μg/ml刚果红溶液：称取0.1g刚果红溶于1L 0.05M醋酸钠缓冲液。

②β-葡聚糖标准曲线制作：

取5组试管，分别加入100μg/ml β-葡聚糖溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml，每支试管用蒸馏水稀释到1.0ml，并做3次平行。各试管中分别加入100μg/ml的刚果红溶液1.0ml，旋涡振荡摇匀。20℃下准确作用10min，用1.0cm的比色杯于OD₅₄₀波长下测定吸光值。空白对照为1ml蒸馏水加1ml刚果红溶液，以空白对照调零。

③酶活测定：

0.6ml大麦β-葡聚糖溶液(100μg/ml)50℃预热10min，加入适当稀释的酶液，醋酸钠缓冲液补足到1ml，50℃反应10min。将反应体系煮沸灭活10min，冷却至室温。加1ml刚果红溶液(100μg/ml)，旋涡振荡混匀后20℃反应10min，测OD₅₄₀(Wood et al.1988；Rensburg et al.1997)。

酶单位定义为：在50℃，pH 6.0条件下，每分钟水解1μg β-葡聚糖所需的酶量为一个酶活单位(U)。

酶活测定结果如图4所示，MS-1的最高酶活为846.37U/ml，DG115的最高酶活为2480.43U/ml，是MS-1的2.93倍。

实施例3、重组菌株DG115对半乳糖的利用：

采用高效液相色谱法制作半乳糖标准曲线和测定YPGL培养基中半乳糖的含量。

色谱条件为：Waters Sugar PAK-I column(6.5mm×300mm)HPLC柱，流动相：0.1mMCa-EDTA的高纯水溶液，柱温：90℃，流速：0.25ml/min，样品的进样量：10ul，Waters2410RI监测器。测定结果如图5所示。半乳糖加入20h后MS-1已经将其消耗完毕，而DG115到44h才利用完半乳糖。

以上实验说明：本发明的重组菌株S.C DG115(酿酒酵母CGMCC NO.3262)具有如下特性：该酵母在发酵过程中，可以大幅度提高GAL1启动子控制下的外源蛋白的表达水平，同时延长培养基中半乳糖的利用半衰期，从而提高酶制剂的产量并降低生产成本。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

SEQ ID NO：1

gttaatatac ctctatactt taacgtcaag gagaaaaaac tataatgaag ctactgtctt    60

ctatcga                                                              67

SEQ ID NO：2

gaaaaaaatg agaagttgtt ctgaacaaag taaaaaaaag aagtataccc actagtggat    60

ctgatatc                                                             68

SEQ ID NO：3

gcactgctcc gaacaataaa                                                20

SEQ ID NO：4

aagagagaac cgtcgccaaa                                                20

Claims (3)

1.一种同源重组构建双GAL4基因型工业酿酒酵母，其特征在于：保藏名称为：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S.C DG115，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2009年9月6日，保藏号：CGMCC NO.3262。

2.根据权利要求1所述的同源重组构建双GAL4基因型工业酿酒酵母，其特征在于：染色体上的一个GAL1基因被敲除，同时在敲除位点处引入了一个GAL4基因拷贝。

3.如权利要求1或2所述的同源重组构建双GAL4基因型工业酿酒酵母的用途，其特征在于：作为宿主进行外源蛋白表达。

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