CN113774092B - 一种由环境废水合成异戊二烯的方法 - Google Patents

一种由环境废水合成异戊二烯的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种由环境废水合成异戊二烯的方法，其包括如下步骤：S1.将菌株接种于LB固体培养基上培养，形成菌落；S2.一次传代，其中，所述培养液包括LB液体培养基、环境废水的一种或两种；S3.多次传代，形成驯化后的菌株；S4.将所述驯化后的菌株放置于容器中离心，除去上清液，并将磷酸盐溶液与残留物共混，得到悬浊菌液；S5.将所述悬浊菌液加入到环境废水中培养，从而产生混合气体，所述混合气体中含有异戊二烯。本发明的有益效果在于：实现高价值化工产品异戊二烯的低成本生产，将环境废水稳定处理并资源化利用。

Description

一种由环境废水合成异戊二烯的方法
技术领域
本发明属于微生物培养领域，具体涉及一种由环境废水合成异戊二烯的方法。
背景技术
异戊二烯，即2-甲基-1,3-丁二烯(2-methyl-1,3-butadiene)，是一种共轭二烯烃，分子式为C5H8。异戊二烯在常温下是一种无色、易挥发、有刺激性气味的油状液体，沸点较低(约为34℃)。异戊二烯含有共轭双键，是萜烯类物质生物合成的共同前体，化学性质非常活泼，能与多种化合物发生共聚合反应。异戊二烯是合成橡胶(SR)的重要单体，主要用于合成异戊橡胶(IR)，苯乙烯-异戊二烯-苯乙烯嵌段共聚物(SIS)，和丁基橡胶(IIR)等；香料制造方面，可以用于合成如熏衣草醇、芳樟醇、柠檬醛等，医药方面，可用于制造甲基庚烯酮、角鲨烯和角鳖烷、异戊烯氯等产品；另外，异戊二烯还可用于制作喷雾剂及黏结剂以及合成润滑油添加剂、橡胶硫化剂等。
异戊二烯目前主要通过化工生产，生产方法主要有3种：C5馏分萃取蒸馏法、异戊烷/异戊烯脱氢法、化学合成法(包括异丁烯-甲醛法、乙炔-丙酮法、丙烯二聚法)等。以上几种方法主要以石油等不可再生资源为原料获得异戊二烯，生产过程能耗高且原材料价格不断上涨，造成异戊二烯生产成本增高，并且随着石油等原料的消耗，异戊二烯生产还将面临原料稀缺问题。同时，生产过程中副产物较多，产率需进一步提高。
由于上述问题，绿色环保的生物合成法合成异戊二烯备受关注。生物体内合成异戊二烯主要有两种途径：甲羟戊酸(MVA)途径和甲基赤藓糖醇磷酸(MEP)途径。MVA途径天然存在于一些古菌、真核生物和高等植物细胞质基质内，大多数细菌、蓝细菌、绿色微藻和植物质体中都含有MEP途径，但通过植物生产异戊二烯存在收集可能性低的问题，天然微生物生产产量低，不能满足生产需求，因此使用基因工程和代谢工程改造过的微生物更符合工业生产需求。
大肠杆菌个体小、生长快、能够利用可再生底物，是理想的基因工程受体菌。研究表明，将MEP途径导入到大肠杆菌体内并进行代谢工程改造获得的产量较低，MVA途径过表达产量也不够理想，MEP途径与MVA途径同时导入并过表达能够利用两途径的协同作用获得更高产量。有研究表明，双途径导入的CIBTS1440菌株提高了约20倍异戊二烯产量(ChenYang，Xiang Gao.et.al.,Metabolic Engineering,2016,37,79-91)。但目前已有的研究普遍使用纯底物或专门的培养基加入无机盐及微生物生长所需的生长因子，该培养方法只适合实验室小规模发酵实验，对于工业化生产仍需进一步降低成本以实现大规模生产。
因此，亟需找到一种技术方案，可以解决目前现有技术所存在的缺陷。
发明内容
现代社会中，生产/生活废水中蕴含着大量的能量，理论上是处理污水所需能量的2-4倍，因此开发回收废水中的能量具有极大的潜力。环境废水处理主要通过生物化学法处理，处理过程消耗电能和药品，整体为负成本过程。一方面浪费废水中的资源，另一方面消耗电能，排放大量温室气体，不利于节能减排。因此，我们设想利用现有的环境废水合成异戊二烯，可以减少温室气体排放量同步实现回收废水中能源和资源，达到环境效益和经济效益的统一。
本发明旨在利用菌株进行生物发酵，将环境废水中的碳、氮、硫、磷等生命必备营养元素转化利用从而生产高价值的化工原料——异戊二烯。该方法既实现了环境废水中有机物的降解和稳定，同时还将其资源化利用合成了高价值化工原料异戊二烯。
本发明中的术语“CIBTS1440菌株”，是指基因工程改造过的大肠杆菌，该菌体内同时过表达MEP途径与MVA途径中的关键酶和辅因子，提高微生物宿主细胞中前体物质异戊烯基焦磷酸(IPP)和3,3-二甲基丙烯基焦磷酸(DMAPP)的供应，有更高的异戊二烯产量(ChenYang，Xiang Gao.et.al.,Metabolic Engineering,2016,37,79-91)。
本发明中的术语“LB液体培养基”，是指用于培养基因工程受体菌(大肠杆菌)的常用半合成培养基。LB液体培养基的主要成分是胰蛋白胨、酵母提取物和NaCl。
本发明中的术语“LB固体培养基”，是指LB液体培养基中加入1.0-2.0％琼脂后制作的固体培养基。
本发明中的术语“密闭摇瓶”，是指带有胶塞、气密性良好并可置于摇床中培养微生物的容器。
本发明公开了一种由环境废水合成异戊二烯的方法，其包括如下步骤：
S1.将菌株接种于LB固体培养基上培养，形成菌落；
S2.将所述菌落接种到培养液中，驯化菌落中的菌株，作为一次传代，
其中，所述培养液包括LB液体培养基、环境废水的一种或两种；
S3.在多次传代过程中，每一次传代中所述培养液中LB液体培养基的含量，比上一次传代中所述培养液中LB液体培养基的含量更低，直至所述液体培养基中不含LB液体培养基，结束多次传代，形成驯化后的菌株；
S4.将所述驯化后的菌株放置于容器中离心，除去上清液，并将磷酸盐溶液与残留物共混，得到悬浊菌液；
S5.将所述悬浊菌液加入到环境废水中培养，从而产生混合气体，所述混合气体中含有异戊二烯。
进一步地，所述环境废水中，pH值为4.5-8.5；
所述环境废水用滤膜进行过滤预处理。
进一步地，所述环境废水中，包括无机盐。
进一步地，所述LB固体培养基中，包括氨苄青霉素、大观霉素和氯霉素。
进一步地，所述LB液体培养基中，包括氨苄青霉素、大观霉素和氯霉素。
进一步地，所述一次传代中的培养液，LB液体培养基的含量为所述培养液的40-50wt％。
进一步地，所述环境废水中，多糖浓度≤1000mg/L，蛋白浓度≤200mg/L，氨氮浓度≤3500mg/L；多糖、蛋白、氮等物质，可以为微生物生长提供营养。
进一步地，所述悬浊菌液的OD值为0.05-0.5。
进一步地，所述菌株为经基因改造后的大肠杆菌菌株，其制备方法为：向大肠杆菌中导入并过表达4-磷酸甲基赤藓糖醇途径和甲羟戊酸途径基因的质粒。
进一步地，所述质粒上，含有氨苄青霉素、大观霉素和氯霉素抗性基因。
进一步地，所述由环境废水合成异戊二烯的方法还包括如下步骤：
S5.对所述混合气体进行蒸馏分离，得到异戊二烯。
进一步地，所述无机盐选自钠盐、铵盐、镁盐、钙盐的一种或多种；所述无机盐可溶于水。
优选地，所述无机盐选自NaCl、NH4Cl、MgSO4、CaCl2、NaHPO4、KH2PO4的一种或其混合物。
本发明具有以下有益效果：本发明所公开的由环境废水合成异戊二烯的方法，可将环境废水中的有机物、无机盐等营养物质资源化利用，以极低的成本生产高价值化工原料异戊二烯。
附图说明
图1示出了实施例1和实施例2的由环境废水合成异戊二烯的方法中，环境废水中的COD的去除率曲线。
图2示出了实施例1和实施例3的由环境废水合成异戊二烯的方法中，异戊二烯的浓度(mg/L)图。
图3示出了实施例1和实施例4由环境废水合成异戊二烯的方法中，添加不同种类无机盐对应的异戊二烯产量(mg/L)图。
图4示出了实施例5由玉米废水和氨氮废水混合液合成异戊二烯的方法中，样本1-3的异戊二烯产率图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明的技术方案，列举如下实施例。实施例中所出现的原料、反应和后处理手段，除非特别声明，均为市面上常见原料，以及本领域技术人员所熟知的技术手段。
本发明实施例中的工程菌，为经基因改造后的大肠杆菌CIBTS1440菌株，其制备方法为：向大肠杆菌中导入并过表达4-磷酸甲基赤藓糖醇途径和甲羟戊酸途径基因的质粒；该质粒上含有氨苄青霉素、大观霉素和氯霉素抗性基因，用于筛选CIBTS1440菌株。
经基因改造后的大肠杆菌CIBTS1440菌株的详细制备方法，参见文献(Chen Yang，Xiang Gao.et.al.,Metabolic Engineering,2016,37,79-91)。
本发明实施例中所述的废水为玉米废水和氨氮废水的混合物，
其中，玉米废水来自玉米淀粉加工行业，为多糖、蛋白、可溶性无机盐、固体杂质的混合物；氨氮废水来自焦化、合成氨等工业废水；
经检测，其中玉米废水中的多糖浓度为620mg/L，蛋白浓度为163.67mg/L，氨氮的浓度为172.68mg/L，pH值为5.0；
经检测，其中氨氮废水中氨氮的浓度为2447.1mg/L，总氮浓度为6465.2mg/L，pH值为8.23。
实施例1
一种由环境废水合成异戊二烯的方法，其包括如下步骤：
S1.将菌株接种于LB固体培养基(LB固体培养基中，氨苄青霉素浓度为100μg/ml，大观霉素浓度为100μg/ml，氯霉素浓度为30μg/ml)上，37℃的培养箱中，培养15h，形成菌落；
S2.将所述菌落接种到培养液中，在37℃下、220rpm的旋转摇床中，培养8h，初步驯化菌落中的菌株，作为一次传代(在一次传代的过程中，LB液体培养基的含量为所述培养液的50wt％)；
S3.然后，重复上述步骤三次，做为多次传代(在多次传代的过程中，每一次传代中所述培养液中LB液体培养基的含量分别为培养液的25wt％、10wt％、0wt％)，直至菌株能在环境废水中适应良好并稳定增殖，结束多次传代，形成驯化后的菌株；
S4.将上述驯化后的菌株，放置于容积为50ml的离心管中，在4000rpm的转速下离心5min，撇去上清液后，并将体积为10ml的磷酸钠缓冲溶液与残留物共混，从而得到悬浊菌液，其OD为0.2；
S5.在250ml的密闭摇瓶中，将所述悬浊菌液加入到环境废水中(悬浊菌液：环境废水＝1:25，m/m)，在37℃下、220rpm的旋转摇床中，培养24h，从而产生混合气体，其中含有异戊二烯；
S6.将密闭摇瓶中的混合气体，采用常规蒸馏分离(蒸馏温度60℃，蒸馏时间4h)，即可收集到液态异戊二烯产物。所收集液态异戊二烯中有部分冷凝水，采用静置分层法，待异戊二烯上浮后予以再收集。
从密闭摇瓶中抽取1ml混合气体，使用气相色谱-氢火焰离子化检测器检测异戊二烯浓度为5.6mg/L；根据异戊二烯浓度与环境废水中多糖浓度求得，异戊二烯产率为0.08g/g多糖。检测环境废水中COD，发现24h后环境废水的COD去除率达到了55％。这说明对环境废水具有一定处理能力。
实施例2
在实施例1的基础上，对该制备方法进行进一步的优化。
对上述环境废水，用滤膜进行预处理。将上述废水经0.45μm的滤膜过滤，除去环境废水中的悬浮物。
在其余步骤与实施例1相同的条件下，进行异戊二烯的制备。
图1示出了实施例1和实施例2中的由环境废水合成异戊二烯的方法中，环境废水中的COD的去除率曲线，其清楚地表明了环境废水中的有机物被工程菌利用，环境废水的COD有显著的降低。这说明实施例2在实施例1的基础上，体现出更优异的废水的COD去除能力。
实施例3
在实施例1的基础上，对该制备方法进行进一步的优化。
首先，对上述环境废水，用滤膜进行预处理。将上述废水经0.45μm的滤膜过滤，除去环境废水中的悬浮物；然后将上述环境废水的pH值调节至7.0。
在其余步骤与实施例1相同的条件下，进行异戊二烯的制备。
从250ml密闭摇瓶中抽取1ml混合气体使用气相色谱-氢火焰离子化检测器检测异戊二烯浓度。检测异戊二烯浓度为15.5mg/L；根据异戊二烯浓度与玉米废水中多糖浓度求得，异戊二烯产率为0.225g/g糖。与实施例1中未调节的玉米废水相比，异戊二烯产率提高了176％。
图2示出了实施例1和实施例3的由环境废水合成异戊二烯的方法中，异戊二烯的产量图(单位用mg/L表示)。其清楚地表明了调节环境废水的pH能够显著提高环境废水产异戊二烯的能力。
实施例4
在实施例1的基础上，对该制备方法进行进一步的优化。
将实施例1中所用的环境废水，平行分为若干组样品，分别为样品1-样品7，然后向各个样品中，分别补充5ml不同种类的无机盐。然后在其余步骤与实施例1相同的条件下，进行异戊二烯的制备。
添加的无机盐的种类如下表1所示。
表1环境废水中添加的无机盐的种类
Figure BDA0003282470530000061
其中，所述复配无机盐，为上述浓度的所有无机盐之和。
图3示出了实施例1和实施例4中样品1-样品7中的由环境废水合成异戊二烯的方法中，添加不同种类无机盐对应的异戊二烯产量(单位用mg/L表示)图。其清楚地表明了，添加氮元素、钙镁无机盐，能有效提高异戊二烯产量，添加复配无机盐，能大大提高产物产量。
实施例5
调节环境废水中碳氮比，从而进一步研究碳氮比对异戊二烯的产量的影响。
一种由环境废水混合液合成异戊二烯的方法，其包括如下步骤：
S1.对玉米废水与氨氮废水，用滤膜进行预处理。将上述废水经0.45μm的滤膜过滤，除去环境废水中的悬浮物；
S2.取三组样本，分别命名为样本1-3。
样本1：取20ml玉米废水，其中环境废水中的碳氮比＝7.8:1，多糖浓度为620mg/L；
样本2：取19ml玉米废水，1ml氨氮废水并混合，测得混合液碳氮比＝5.3:1，多糖浓度为589mg/L；
样本3：取15ml玉米废水，5ml氨氮废水并混合，测得混合液碳氮比＝1.7:1，多糖浓度为465mg/L；
S3.将上述环境废水混合液的pH值，均调节至7.0。
S4.将实施例1中驯化后的菌株，放置于容积为50ml的离心管中，在4000rpm的转速下离心5min，撇去上清液后，并将体积为10ml的磷酸钠缓冲溶液与残留物共混，从而得到悬浊菌液；
S5.在250ml密闭摇瓶中，向20ml的样本1-3中分别加入所述1ml的悬浊菌液和5ml的复配无机盐(复配无机盐的成分和比例同表1所述)，在37℃、220rpm的旋转摇床中，培养24h，从而产生混合气体，其中含有异戊二烯；
S6.从密闭摇瓶中抽取1ml混合气体，使用气相色谱-氢火焰离子化检测器检测样本1-3所产生的异戊二烯浓度，所得结果如表2所示。
表2样本1-3所产生的异戊二烯浓度
Figure BDA0003282470530000071
图4示出了实施例5由玉米废水和氨氮废水混合液合成异戊二烯的方法中，不同比例的环境废水混合液对应的异戊二烯产率图(以“g/g多糖”表示，数值越大，说明产率效果越佳)。其清楚地表明了，向缺乏适合氮源的玉米废水中补充富含氨氮的氨氮废水，可以提高单位多糖的异戊二烯产量，有利于异戊二烯生产。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (4)

1.一种由环境废水合成异戊二烯的方法，其特征在于，所述由环境废水合成异戊二烯的方法包括如下步骤：
S1. 将菌株接种于LB固体培养基上培养，形成菌落；
S2. 将所述菌落接种到培养液中，驯化菌落中的菌株，作为一次传代，
其中，所述培养液包括LB液体培养基和环境废水；
S3. 在多次传代过程中，每一次传代中所述培养液中LB液体培养基的含量，比上一次传代中所述培养液中LB液体培养基的含量更低，直至所述液体培养基中不含LB液体培养基，结束多次传代，形成驯化后的菌株；
S4. 将所述驯化后的菌株放置于容器中离心，除去上清液，并将磷酸盐溶液与残留物共混，得到悬浊菌液；
S5. 将所述悬浊菌液加入到环境废水中培养，从而产生混合气体，所述混合气体中含有异戊二烯；
所述环境废水中，包括无机盐；
所述环境废水为玉米废水和氨氮废水的混合物；
所述环境废水中，多糖浓度≤1000 mg/L，蛋白浓度≤200 mg/L，氨氮浓度≤3500 mg/L；
所述环境废水中，pH值为7.0；
所述环境废水用滤膜进行过滤预处理；
所述无机盐为复合无机盐，包括NaCl，浓度为0.5 g/L；NH4Cl，浓度为1.0 g/L；MgSO4，浓度为0.24 g/L；CaCl2，浓度为0.011 g/L；Na2HPO4，浓度为6.78 g/L；K2HPO4，浓度为3.0 g/L；
所述菌株为经基因改造后的大肠杆菌菌株CIBTS1440，其制备方法为：向大肠杆菌中导入并过表达4-磷酸甲基赤藓糖醇途径和甲羟戊酸途径基因的质粒；
所述质粒上，含有氨苄青霉素、大观霉素和氯霉素抗性基因。
2.根据权利要求1所述由环境废水合成异戊二烯的方法，其特征在于，所述LB固体培养基中，包括氨苄青霉素、大观霉素和氯霉素。
3.根据权利要求1所述由环境废水合成异戊二烯的方法，其特征在于，所述一次传代中的培养液，LB液体培养基的含量为所述培养液的40-50 wt%。
4.根据权利要求1所述由环境废水合成异戊二烯的方法，其特征在于，所述悬浊菌液的OD值为0.05-0.5。
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