JP6262125B2 - イソプレンを産出する組成物および方法 - Google Patents

イソプレンを産出する組成物および方法 Download PDF

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Description

＜関連する出願とのクロスリファレンス＞
本願は2007年12月13日出願の米国仮出願番号61/013,574に基づく優先権を主張する。この仮出願の内容は全て本願に参照として組み込まれる。
この発明は培養物中の細胞からイソプレンを産出する方法と、この培養物中の細胞を含む組成物に関する。
イソプレン (2-メチル- 1,3 -ブタジエン) は様々な合成ポリマー、特に合成ゴムの重要な原料である。イソプレンは様々な微生物、植物、及び動物から天然に産出されている。特に、メバロン酸塩 (MVA) 経路と非メバロン酸塩 (DXP) 経路 (図19A及び19B参照) の、2つイソプレンの生合成経路が明らかにされている。
しかし、天然生命体に由来するイソプレンの産出量は少なく、商業的には不利である。イソプレンの重合により毎年約800,000トンのシス-ポリイソプレンが製造されており、大部分のポリイソプレンはタイヤ及びゴム工業において用いられている。またイソプレンは共重合されて、履物、機械部品、医薬品、スポーツ用品、ラテックス等に加工される合成ゴムの原料にも用いられている。
現在、タイヤ及びゴム工業では、天然及び合成ゴムの使用により成立している。天然ゴムはゴムの木やアフリカの熱帯雨林で見られる植物の乳液から得られる。合成ゴムはブタジエンのポリマーを基本としている。このようなポリマーで用いられるブタジエンは、エチレン及びプロピレン製造工場の副産物として得られる。
イソプレンは石油の分留により得られるが、イソプレンの精留コストは高く、また時間がかかる。炭化水素のC5ストリームの石油クラッキングではイソプレンは約15%しか得られない。したがって、イソプレンをより低コストで得られる方法が求められている。特に、商業プロセスの要求に十分適合する収量、力価、及び純度でイソプレンを製造することができる方法が求められている。また、安価な原料からイソプレンを製造することができるシステムが求められている。
一つの側面では、この発明はイソプレンを産出する培養物中の細胞に関する。いくつかの実施形態では、この発明により、イソプレン約400ナノモル／細胞1g (湿潤重量)／時間 (nmole/gwcm/hr)以上のイソプレンを産出する培養物中の細胞が提供される。いくつかの実施形態では、この細胞は (i) イソプレンシンターゼ(isoprene synthase)ポリペプチドをコードし、(ii) プロモータに作動可能に結合した非相同核酸を備える。
いくつかの実施形態では、この細胞は炭素源を有する培地で培養され、このような炭素源の非限定的例示として炭化水素 (例えば キシロースまたはグルコース)、酢酸塩、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、1−炭素源、油、動物性油脂、動物油、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、 ジグリセリド、トリグリセリド、再生可能な炭素源 (例えば加水分解バイオマス炭素源)、ポリペプチド (例えば微生物性または植物性タンパク質またはペプチド)、酵母エキス、酵母エキス成分、またはこれらの2以上の組み合わせが挙げられる。
いくつかの実施形態では、この発明により、イソプレンの平均容積生産性が約0.1mg/Lbroth/hr以上の培養物中の細胞が提供される。いくつかの実施形態では、この発明により、イソプレンのピーク容積生産性が約0.5mg/Lbroth/hr以上の培養物中の細胞が提供される。いくつかの実施形態では、この細胞は(i) イソプレンシンターゼポリペプチドをコードし、(ii)プロモータに作動可能に結合した非相同核酸を備える。
いくつかの実施形態では、この細胞は炭素源を有する培地で培養され、このような炭素源の非限定的例示として炭化水素 (例えば キシロースまたはグルコース)、酢酸塩、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、1−炭素源、油、動物性油脂、動物油、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、 ジグリセリド、トリグリセリド、再生可能な炭素源(例えば加水分解バイオマス炭素源)、ポリペプチド (例えば微生物性または植物性タンパク質またはペプチド)、酵母エキス、酵母エキス成分、またはこれらの2以上の組み合わせが挙げられる。
いくつかの実施形態では、この発明により細胞培地中の炭素の約0.002%以上をイソプレンに転換する培養物中の細胞が提供される。いくつかの実施形態では、この細胞は (i) イソプレンシンターゼポリペプチドをコードし、(ii) プロモータに作動可能に結合した非相同核酸を備える。
いくつかの実施形態では、この細胞は炭素源を含有する培地で培養され、このような炭素源の非限定的例示として炭化水素(例えば キシロースまたはグルコース)、酢酸塩、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、1−炭素源、油、動物性油脂、動物油、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、 ジグリセリド、トリグリセリド、再生可能な炭素源 (例えば加水分解バイオマス炭素源)、ポリペプチド (例えば微生物性または植物性タンパク質またはペプチド)、酵母エキス、酵母エキス成分、またはこれらの2以上の組み合わせが挙げられる。
いくつかの実施形態では、この発明によりイソプレンシンターゼポリペプチドをコードする非相同核酸を備える培養物中の細胞が提供される。
いくつかの実施形態では、この培養物中の細胞は (i) イソプレンシンターゼポリペプチドをコードし、(ii) プロモータに作動可能に結合した非相同核酸を備える。
いくつかの実施形態では、この細胞は炭素源を有する培地で培養され、このような炭素源の非限定的例示として炭化水素(例えば キシロースまたはグルコース)、酢酸塩、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、1−炭素源、油、動物性油脂、動物油、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、 ジグリセリド、トリグリセリド、再生可能な炭素源 (例えば加水分解バイオマス炭素源)、ポリペプチド (例えば微生物性または植物性タンパク質またはペプチド)、酵母エキス、酵母エキス成分、またはこれらの2以上の組み合わせが挙げられる。
一側面では、この発明は本願に開示するイソプレンを産出する細胞を用いてイソプレンを製造する方法に関する。いくつかの実施形態では、この方法には約400 nmole/gwcm/hrより多いイソプレンを産出可能な条件下で細胞を培養する工程が含まれる。いくつかの実施形態では、この方法にはさらに細胞から産出されたイソプレンを回収する工程が含まれる。いくつかの実施形態では、この方法には細胞から産出されたイソプレンを精製する工程が含まれる。いくつかの実施形態では、この方法には得られたイソプレンを重合する工程が含まれる。
いくつかの実施形態では、この培養物中の細胞は (i) イソプレンシンターゼポリペプチドをコードし、(ii)プロモータに作動可能に結合した非相同核酸を備える。
いくつかの実施形態では、この細胞は炭素源を有する培地で培養され、このような炭素源の非限定的例示として炭化水素 (例えば キシロースまたはグルコース)、酢酸塩、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、1−炭素源、油、動物性油脂、動物油、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、 ジグリセリド、トリグリセリド、再生可能な炭素源 (例えば加水分解バイオマス炭素源)、ポリペプチド (例えば微生物性または植物性タンパク質またはペプチド)、酵母エキス、酵母エキス成分、またはこれらの2以上の組み合わせが挙げられる。
一側面では、この発明は本願に開示するイソプレンを産出する細胞を用いてイソプレンを製造する方法に関する。いくつかの実施形態では、この方法には、イソプレンの平均容積生産性が約0.1mg/Lbroth/hr以上となる条件下で細胞を培養する工程が含まれる。いくつかの実施形態では、この方法には、イソプレンのピーク容積生産性が約0.5mg/Lbroth/hr以上となる条件下で細胞を培養する工程が含まれる。
いくつかの実施形態では、この方法にはさらに細胞から産出されたイソプレンを回収する工程が含まれる。いくつかの実施形態では、この方法には細胞から産出されたイソプレンを精製する工程が含まれる。いくつかの実施形態では、この方法には得られたイソプレンを重合する工程が含まれる。
いくつかの実施形態では、この培養物中の細胞は(i) イソプレンシンターゼポリペプチドをコードし、(ii)プロモータに作動可能に結合した非相同核酸を備える。
いくつかの実施形態では、この細胞は炭素源を有する培地で培養され、このような炭素源の非限定的例示として炭化水素 (例えば キシロースまたはグルコース)、酢酸塩、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、1−炭素源、油、動物性油脂、動物油、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、 ジグリセリド、トリグリセリド、再生可能な炭素源(例えば加水分解バイオマス炭素源)、ポリペプチド (例えば微生物性または植物性タンパク質またはペプチド)、酵母エキス、酵母エキス成分、またはこれらの2以上の組み合わせが挙げられる。
いくつかの実施形態では、この方法には細胞培地中の炭素の約0.002%以上をイソプレンに転換可能な条件下で細胞を培養する工程が含まれる。いくつかの実施形態では、この方法にはさらに細胞から産出されたイソプレンを回収する工程が含まれる。いくつかの実施形態では、この方法には細胞から産出されたイソプレンを精製する工程が含まれる。いくつかの実施形態では、この方法には得られたイソプレンを重合する工程が含まれる。
いくつかの実施形態では、この培養物中の細胞は(i) イソプレンシンターゼポリペプチドをコードし、(ii)プロモータに作動可能に結合した非相同核酸を備える。
いくつかの実施形態では、この細胞は炭素源を有する培地で培養され、このような炭素源の非限定的例示として炭化水素 (例えば キシロースまたはグルコース)、酢酸塩、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、1−炭素源、油、動物性油脂、動物油、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、 ジグリセリド、トリグリセリド、再生可能な炭素源(例えば加水分解バイオマス炭素源)、ポリペプチド(例えば微生物性または植物性タンパク質またはペプチド)、酵母エキス、酵母エキス成分、またはこれらの2以上の組み合わせが挙げられる。
この発明のいくつかの実施形態では、培養物中の細胞は、イソプレン約400nmole/gwcm/hr以上、または 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,250, 1,500, 1,750, 2,000, 2,500, 3,000, 4,000, 5,000, 10,000, 12,500, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, 75,000, 100,000, 125,000, 150,000, 188,000nmole/gwcm/hr以上、またはこれら以上のイソプレンを産出する。
いくつかの実施形態では、培養物中の細胞のイソプレンの平均容積生産性が約0.1mg/Lbroth/hr以上、または1.0, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1100, 1200, 1300, 1,400, 1,500, 1,600, 1,700, 1,800, 1,900, 2,000, 2,100, 2,200, 2,300, 2,400, 2,500, 2,600, 2,700, 2,800, 2,900, 3,000, 3,100, 3,200, 3,300, 3,400, 3,500mg/Lbroth/hr以上、またはこれら以上である。（mg/Lbroth/hrはブロス1リットルから1時間当り産出されるイソプレンのmg数を表し、ブロスの容積には細胞及び細胞培地の容積が含まれる。）
いくつかの実施形態では、培養物中の細胞のイソプレンのピーク容積生産性が約0.5mg/Lbroth/hr以上、または1.0, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1100, 1200, 1300, 1,400, 1,500, 1,600, 1,700, 1,800, 1,900, 2,000, 2,100, 2,200, 2,300, 2,400, 2,500, 2,600, 2,700, 2,800, 2,900, 3,000, 3,100, 3,200, 3,300, 3,400, 3,500, 3,750, 4,000, 4,250, 4,500, 4,750, 5,000, 5,250, 5,500, 5,750, 6,000, 6,250, 6,500, 6,750, 7,000, 7,250, 7,500, 7,750, 8,000, 8,250, 8,500, 8,750, 9,000, 9,250, 9,500, 9,750, 10,000, 12,500, 15,000mg/Lbroth/hr以上、またはこれら以上である。（mg/Lbroth/hrはブロス1リットルから1時間当り産出されるイソプレンのmg数を表し、ブロスの容積には細胞及び細胞培地の容積が含まれる。）
この発明のいくつかの実施形態では、培養物中の細胞は培地中の炭素の0.002モル％以上をイソプレンに転換し、あるいは培地中の炭素の0.005, 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.12, 0.14, 0.16, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6, 2.0, 2.2, 2.4, 2.6, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, 11.0, 12.0, 13.0, 14.0, 15.0, 16.0, 17.0, 18.0, 19.0, 20.0, 21.0, 22.0, 23.0, 23.2, 23.4, 23.6, 23.8, 24.0, 25.0, 30.0, 31.0, 32.0, 33.0, 35.0, 37.5, 40.0, 45.0, 47.5, 50.0, 55.0, 60.0, 65.0, 70.0, 75.0, 80.0, 85.0, 90.0モル％以上、またはこれら以上をイソプレンに転換する。
この発明のいくつかの実施形態では、培養物中の細胞は約1ng/gwcm/hr以上のイソプレンを産出し、あるいは10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,250, 1,500, 1,750, 2,000, 2,500, 3,000, 4,000, 5,000, 10,000, 100,000ng/gwcm/hr以上またはこれら以上のイソプレンを産出する。ここで、ng/gwcm/hrは湿潤細胞1グラムから1時間当り産出されるイソプレンのng（ナノグラム）数を表す。
この発明のいくつかの実施形態では、培養物中の細胞は累積力価（総産出量）が約1mg/Lbroth以上のイソプレンを産出し、あるいは約10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,250, 1,500, 1,750, 2,000, 2,500, 3,000, 4,000, 5,000, 10,000, 50,000, 100,000mg/Lbroth以上またはこれら以上のイソプレンを産出する。ここでmg/Lbrothはブロス1リットルあたりから産出されるイソプレンのmg（ミリグラム）数を表し、ブロスの容積には細胞及び培地の容積が含まれる。
この外のイソプレン産出速度とイソプレン総産出量の例を本願に開示する。
この発明のいくつかの実施形態では、細胞にはさらにIDIポリペプチドをコードする非相同核酸が含まれる。この発明のいくつかの実施形態では、細胞にはさらにIDIポリペプチドをコードする内因性核酸のコピーの挿入が含まれる。
この発明のいくつかの実施形態では、細胞にはさらにDXSポリペプチドをコードする非相同核酸が含まれる。この発明のいくつかの実施形態では、細胞にはさらにDXSポリペプチドをコードする内因性核酸のコピーの挿入が含まれる。この発明のいくつかの実施形態では、細胞にはさらにIDIポリペプチド及びDXSポリペプチドをコードする1以上の核酸が含まれる。
この発明のいくつかの実施形態では、1つの核酸がイソプレン合成ポリペプチド、IDIポリペプチド、及びDXSポリペプチドをコードする。この発明のいくつかの実施形態では、1つのベクターがイソプレン合成ポリペプチド、IDIポリペプチド、及びDXSポリペプチドをコードする。この発明のいくつかの実施形態では、 ベクターは抗生物質耐性等の選択マーカーを備える。
この発明のいくつかの実施形態では、非相同イソプレンシンターゼ核酸は、培地または高コピープラスミドに含まれるT7プロモータ等のT7プロモータに作動可能に結合している。この発明のいくつかの実施形態では、非相同イソプレンシンターゼ核酸は、培地または高コピープラスミドに含まれるTrcプロモータ等のTrcプロモータに作動可能に結合している。この発明のいくつかの実施形態では、非相同イソプレンシンターゼ核酸は、低コピープラスミドに含まれるLacプロモータ等のLacプロモータに作動可能に結合している。この発明のいくつかの実施形態では、非相同イソプレンシンターゼ核酸は、内因性アルカリセリンプロテアーゼプロモータ等の内因性プロモータに作動可能に結合している。いくつかの実施形態では、非相同イソプレンシンターゼ核酸は、選択マーカーを含まない細胞の染色体に組み込まれている。
この発明のいくつかの実施形態では、連続培養（例えば希釈しない連続培養）において細胞分裂を少なくとも5回, 10回, 20回, 40回, 50回, 60回, 65回,またはそれ以上繰り返した後でも、細胞の少なくとも一部が非相同イソプレンシンターゼ核酸を保持している。この発明のいくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼ、IDI, またはDXSを含む核酸には、抗生物質抵抗性核酸等の選択マーカーも含まれている。
この発明のいくつかの実施形態では、細胞にはMVA経路ポリペプチド(例えばサッカロミセス・セレビシ(Saccharomyces cerevisi)、メタロサルキナ・マゼイ(Methanosarcina mazei)、またはエンテロコカス・ファエカリス(Enterococcus faecalis)由来のMVA経路ポリペプチド)をコードする非相同核酸が含まれる。
この発明のいくつかの実施形態では、細胞にはさらにMVA経路ポリペプチド(例えばサッカロミセス・セレビシ(Saccharomyces cerevisi)、メタロサルキナ・マゼイ(Methanosarcina mazei)、またはエンテロコカス・ファエカリス(Enterococcus faecalis)由来のMVA経路ポリペプチド)をコードする内因性核酸のコピーの挿入が含まれる。
この発明のいくつかの実施形態では、細胞にはイソプレンシンターゼ、DXS、及びMVA経路核酸が含まれる。この発明のいくつかの実施形態では、細胞にはイソプレンシンターゼ核酸、DXS核酸、IDI核酸、及び (IDI核酸に加えて) MVA経路核酸が含まれている。
この発明のいくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドは植物由来の天然ポリペプチドであり、このような植物は例えばプエラリア(Pueraria)属 [例えばプエラリア・モンタナ(Pueraria montana)]、またはポプラ(Populus)属 [例えばポプラ・トレムロイデス(Populus tremuloides)、ポプラ・アルバ((Populus alba)(P. alba))、ポプラ・ニグラ(Populus nigra)、ポプラ・トリコカーパ(Populus trichocarpa)、またはポプラ・アルバ×ポプラ・トレムラ(Populus tremula)のハイブリッド]等である。
この発明のいくつかの実施形態では、細胞は細菌性の細胞であり、例えばグラム陽性細菌性細胞(例えばバシラス・スブチリス(Bacillus subtilis) 細胞等のバシラス(Bacillus) 属細胞、または、例えばストレプトミセス・リビダンス(Streptomyces lividans)、ストレプトミセス・コエリカラー(Streptomyces coelicolor)、ストレプトミセス・アルバス(Streptomyces albus)、またはストレプトミセス・グリセウス(Streptomyces griseus) 細胞等のストレプトミセス(Streptomyces) 属細胞)である。この発明のいくつかの実施形態では、細胞はグラム陰性細胞(例えば大腸菌(E. coli)) 細胞等のエシェリキア(Escherichia) 属細胞、または パントエア・シトレア（Pantoea citrea）細胞等のパントエア(Pantoea) 属細胞である。
いくつかの実施形態では、E. coli細胞はE. coli FadR atoC 突然変異細胞である。いくつかの実施形態では、E. coli細胞はybhE(pglとも呼ばれる)を発現(例えば構成的に発現)する。
この発明のいくつかの実施形態では、細胞は糸状菌(例えばトリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)細胞等のトリコデルマ(Trichoderma) 属、またはアスペルギルス・オリザエ(Aspergillus oryzae) やアスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger) 等のアスペルギルス(Aspergillus) 属細胞)等の菌類細胞、または酵母細胞 (例えばヤロウイア・リポリチカ(Yarrowia lipolytica)細胞等のヤロウイア(Yarrowia)属細胞) である。
この発明のいくつかの実施形態では、微生物性ポリペプチド炭素源には、酵母または細菌由来の1以上のポリペプチドが含まれる。この発明のいくつかの実施形態では、植物性ポリペプチド炭素源には、大豆、コーン、キャノーラ、ジャトロファ、パーム、ピーナッツ、ヒマワリ、ココナッツ、マスタード、菜種、綿実、パーム核油、オリーブ、紅花、ゴマ、または亜麻仁由来の1以上のポリペプチドが含まれる。
一側面では、この発明によりポリイソプレンから成るタイヤが提供される。いくつかの実施形態では、ポリイソプレンは (i)本願に開示する組成物または方法に係るイソプレンを重合するか、または (ii)本願に開示する組成物または方法に係るイソプレンを回収して重合することにより製造される。いくつかの実施形態では、ポリイソプレンはシス-l,4-ポリイソプレンから成る。
一側面では、この発明は本願の組成物または方法により製造された製品 (例えばタイヤ) に関する。
本願に開示する様々な実施形態のいくつか、または全てを組み合わせて本願の別の実施形態とすることができることを理解できるであろう。本願の様々な側面について説明する。
E. coli 中での発現に最適化したコドンを備えるクズ（kudzu）イソプレンシンターゼ遺伝子のヌクレオチド配列である(SEQ ID NO: 1)。atg開始コドンをイタリック体で示し、終止コドンを太字で示し、追加したPstI部位に下線を付して示した。 pTrcKudzuのマップである。 pTrcKudzuのヌクレオチド配列を表す(SEQ ID NO:2)。RBSに下線を付して表し、kudzuイソプレンシンターゼ開始コドンを太字の大文字で表し、終止コドンを太字で大文字のイタリック体で表した。ベクターバックボーンはpTrcHis2Bである。 pETNHisKudzuのマップである。 pETNHisKudzuのヌクレオチド配列である(SEQ ID NO:5)。 pCL-lac-Kudzuのマップである。 pCL-lac-Kudzuのヌクレオチド配列である(SEQ ID NO:7)。 ベクターの無いE. coli BL21細胞中でのイソプレンの産出を表すグラフである。 pCL-lac-Kudzuを備えるE. coli BL21細胞中でのイソプレンの産出を表すグラフである。 pTrcKudzuを備えるE. coli BL21細胞中でのイソプレンの産出を表すグラフである。 pETN-HisKudzuを備えるE. coli BL21細胞中でのイソプレンの産出を表すグラフである。 14リットルの流加培養法式発酵におけるE. coli BL21/pTrcKudzuの発酵時間とODの関係を表すグラフである。 14リットルの流加培養法式発酵におけるE. coli BL21/pTrcKudzuの発酵時間とイソプレン産出量の関係を表すグラフである。 遺伝仕組み換えクズ・イソプレンシンターゼを備えないコントロールのパントエア・シトレア細胞におけるイソプレン産出を表すグラフである。灰色の菱形はイソプレン産出を表し、黒四角はOD600を表す。 pCL-lac Kudzuを発現するパントエア・シトレアにおけるイソプレン産出を表すグラフである。灰色の菱形はイソプレン合成を表し、黒四角はOD600を表す。 pTrcKudzuを発現するパントエア・シトレアにおけるイソプレン産出を表すグラフである。灰色の菱形はイソプレン合成を表し、黒四角はOD600を表す。 組み換えイソプレンシンターゼを発現するバシラス・スブチリスにおけるイソプレン産出を表すグラフである。BG3594comKはプラスミド(天然イソプレン産出)を備えないバシラス・スブチリス株である。CF443-BG3594comKはpBSKudzu(組み換えイソプレン産出）を備えるバシラス・スブチリス株である。Y軸のISはイソプレンを表す。 pBS Kudzu #2のヌクレオチド配列である(SEQ ID NO:57)。 ヤロウイア(Yarrowia)中での発現に最適化したコドンを備えるクズ・イソプレンシンターゼ遺伝子のヌクレオチド配列である(SEQ ID NO: 8)。 ヤロウイア中での発現に最適化したコドンを備えるクズ・イソプレンシンターゼ遺伝子を含むpTrex3gのマップである。 pSPZ1 (MAP29Spb)ベクターのヌクレオチド配列である(SEQ ID NO : 11 )。 ヤロウイア中での発現に最適化したコドンを備える合成クズ(プエラリア・モンタナ)イソプレンシンターゼ遺伝子のヌクレオチド配列である(SEQ ID NO: 12)。 合成ハイブリッド・ポプラ(ポプラ・アルバ×ポプラ・トレムラ)イソプレンシンターゼ遺伝子のヌクレオチド配列である(SEQ ID NO: 13)。ATG開始コドンを太字で示し、終止コドンに下線を付して示した。 pYLA 1ベクター、pYLlベクター、及びpYL2ベクター構築の概略を表す模式図である。 pYLA(POP1)ベクター構築の概略を表す模式図である。 pYLA(KZ1)ベクター構築の概略を表す模式図である。 pYLI(KZl)ベクター構築の概略を表す模式図である。 pYLI(MAP29)ベクター構築の概略を表す模式図である。 pYLA(MAP29)ベクター構築の概略を表す模式図である。 イソプレンのMVA及びDXP代謝経路を表す (F. Bouvier et al, Progress in Lipid Res. 44: 357-429, 2005による)。以下の開示には代謝経路における各ポリペプチドの別名と、そのポリペプチドの活性を測定する分析方法が記載された参照文献とが含まれている。（これらの参照文献の内容、特にMVA及びDXP代謝経路における各ポリペプチドのポリペプチド活性の測定方法の全てが、本願に組み込まれる。）メバロン酸経路：AACT;アセチル-CoA アセチルトランスフェラーゼ、MvaE, EC 2.3.1.9. 測定方法:J. Bacteriol, 184: 2116-2122, 2002；HMGS;ヒドロキシメチルグルタアリール-CoAシンターゼ、MvaS, EC 2.3.3.10. 測定方法:J. Bacteriol, 184: 4065-4070, 2002; HMGR;3-ヒドロキシ-3-メチルグルタアリール-CoAリダクターゼ、MvaE, EC 1.1.1.34. 測定方法:J. Bacteriolx, 184: 2116-2122, 2002;MVK; メバロン酸キナーゼ, ERG12, EC 2.7.1.36. 測定方法: Curr Genet 19:9-14, 1991. PMK; ホスホメバロン酸キナーゼ, ERG8, EC 2.7.4.2, 測定方法: Mol Cell Biol., 11:620-631, 1991; DPMDC; ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ, MVDl, EC 4.1.1.33. 測定方法: Biochemistry, 33:13355-13362, 1994; IDI; イソペンチル−ジホスフェート デルタ-イソメラーゼ, IDIl, EC 5.3.3.2. 測定方法: J. Biol. Chem. 264:19169-19175, 1989. DXP経路: DXS; l-デオキシキシルロース-5-ホスフェートシンターゼ, dxs, EC 2.2.1.7. 測定方法: PNAS, 94:12857-62, 1997; DXR; 1-デオキシ-D-キシルロース5-ホスフェート・リダクトイソメラーゼ, dxr, EC 2.2.1.7. 測定方法: Eur. J. Biochem. 269:4446-4457, 2002; MCT; 4-ジホスホシチジル-2C-メチル-D-エリスリトール・シンターゼ, IspD, EC 2.7.7.60. 測定方法: PNAS, 97: 6451-6456, 2000; CMK; 4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリスリトール・キナーゼ, IspE, EC 2.7.1.148. 測定方法: PNAS, 97:1062-1067, 2000; MCS; 2C-メチル-D-エリスリトール 2,4-シクロジホスフェート・シンターゼ, IspF, EC 4.6.1.12. 測定方法: PNAS, 96:11758-11763, 1999; HDS; l-ヒドロキシ-2-メチル-2-(E)-ブテニル 4-ジホスフェート・シンターゼ, ispG, EC 1.17.4.3. 測定方法: J. Org. Chem., 70:9168-9174, 2005; HDR; l-ヒドロキシ-2-メチル-2-(E)-ブテニル 4-ジホスフェート・リダクターゼ, IspH, EC 1.17.1.2. 測定方法: JACS, 126:12847-12855, 2004. 従来のMVA経路及び修正されたMVA経路を表す。1, アセチル-CoA アセチルトランスフェラーゼ(AACT); 2, HMG-CoA シンターゼ (HMGS); 3, HMG-CoA リダクターゼ(HMGR); 4, メバロン酸キナーゼ(MVK); 5, ホスホメバロン酸キナーゼ(PMK); 6, ジホスホメバロン酸 デカルボキシラーゼ(MVDまたはDPMDC); 7, イソペンテニル ジホスフェート イソメラーゼ (IDI); 8, ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ(PMDC); 9, イソペンテニル ホスフェート キナーゼ(IPK)。 従来のMVA経路は反応1から反応5,6を経て反応7まで進む。一方、修正されたMVA経路は反応8と9まで進行する。構造式中のPとPPはそれぞれホスフェートとピロフォスフェートである。この図は、Koga and Morii, Microbiology and Mol. Biology Reviews, 71:97-120, 2007から引用した。この文献は、特に修正されたMVA経路の核酸及びポリペプチドに関する記載を含め、全体を本願に参照として組み込まれる。修正されたMVA経路は、例えばメタロサルキナ・マゼイ等の古細菌有機体において認められる。 クズ(kudzu)・イソプレンシンターゼ遺伝子を備える組み換えY.リポリチカ株(右)及びkudzu・イソプレンシンターゼ遺伝子を備えない組み換えY.リポリチカ株(左)から産出されたイソプレンのGC-MS分析結果を表すグラフである。矢印は純粋な標準イソプレンの流出時間を示す。 pTrcKudzu yIDI DXS Kanのマップである。 pTrcKudzu yIDI DXS Kanのヌクレオチド配列である(SEQ ID NO:20)。 BL21/pTrcKudzukan中におけるグルコースからのイソプレン産出を表すグラフである。時間0はIPTG (400μmol)による誘導開始時である。x-軸は誘導後の時間である。y-軸はOD600で、y2-軸はイソプレンの全生産性 (μg/Lヘッドスペース) または固有生産性 (μg/Lヘッドスペース/OD) である。菱形はOD600を表し、丸は全生産性 (μg/Lヘッドスペース)、四角はイソプレンの固有生産性 (μg/L/OD) を表す。 BL21/pTrcKudzu yIDI kan中におけるグルコースからのイソプレン産出を表すグラフである。時間0はIPTG (400μmol) による誘導開始時である。x-軸は誘導後の時間である。y-軸はOD600で、y2-軸はイソプレンの全生産性 (μg/Lヘッドスペース) または固有生産性 (μg/Lヘッドスペース/OD) である。菱形はOD600を表し、丸は全生産性 (μg/Lヘッドスペース)、四角はイソプレンの固有生産性 (μg/L/OD)を表す。 BL21/pTrcKudzu DXS kan中におけるグルコースからのイソプレン産出を表すグラフである。時間0はIPTG (400μmol)による誘導開始時である。x-軸は誘導後の時間である。y-軸はOD600で、y2-軸はイソプレンの全生産性 (μg/Lヘッドスペース) または固有生産性 (μg/Lヘッドスペース/OD) である。菱形はOD600を表し、丸は全生産性 (μg/Lヘッドスペース)、四角はイソプレンの固有生産性 (μg/L/OD)を表す。 BL21 /pTrcKudzu yIDI DXS kan中におけるグルコースからのイソプレン産出を表すグラフである。時間0はIPTG (400μmol)による誘導開始時である。x-軸は誘導後の時間である。y-軸はOD600で、y2-軸はイソプレンの全生産性 (μg/Lヘッドスペース)または固有生産性 (μg/Lヘッドスペース/OD)である。菱形はOD600を表し、丸は全生産性 (μg/Lヘッドスペース)、四角はイソプレンの固有生産性 (μg/L/OD)を表す。 BL21/pCL PtrcKudzu中におけるグルコースからのイソプレン産出を表すグラフである。時間0はIPTG (400μmol)による誘導開始時である。x-軸は誘導後の時間である。y-軸はOD600で、y2-軸はイソプレンの全生産性 (μg/Lヘッドスペース) または固有生産性 (μg/Lヘッドスペース/OD) である。菱形はOD600を表し、丸は全生産性 (μg/Lヘッドスペース)、四角はイソプレンの固有生産性 (μg/L/OD) を表す。 BL21/pCL PtrcKudzu yIDI中におけるグルコースからのイソプレン産出を表すグラフである。時間0はIPTG (400μmol)による誘導開始時である。x-軸は誘導後の時間である。y-軸はOD600で、y2-軸はイソプレンの全生産性 (μg/Lヘッドスペース) または固有生産性 (μg/Lヘッドスペース/OD)である。菱形はOD600を表し、丸は全生産性 (μg/Lヘッドスペース)、四角はイソプレンの固有生産性 (μg/L/OD)を表す。 BL21/pCL PtrcKudzu DXS中におけるグルコースからのイソプレン産出を表すグラフである。時間0はIPTG (400μmol)による誘導開始時である。x-軸は誘導後の時間である。y-軸はOD600で、y2-軸はイソプレンの全生産性 (μg/Lヘッドスペース)または固有生産性 (μg/Lヘッドスペース/OD)である。菱形はOD600を表し、丸は全生産性 (μg/Lヘッドスペース)、四角はイソプレンの固有生産性 (μg/L/OD)を表す。 BL21/pTrcKudzuIDIDXSkan中におけるグルコースからのイソプレン産出を表すグラフである。矢印はIPTG (400μmol)による誘導開始時を表す。x-軸は誘導後の時間である。y-軸はOD600で、y2-軸はイソプレンの全生産性 (μg/Lヘッドスペース)または固有生産性 (μg/Lヘッドスペース/OD)である。黒の菱形はOD600を表し、黒三角はイソプレンの生産性 (μg/Lヘッドスペース)、白抜きの四角はイソプレンの固有生産性 (μg/L/OD)を表す。 pTrcKKDyIkIS kanのマップである。 pTrcKKDyIkIS kanのヌクレオチド配列である(SEQ ID NO:33)。 pCL PtrcUpperPathwayのマップである。 pCL PtrcUpperPathwayのヌクレオチド配列である(SEQ ID NO:46)。 B.スブチリス染色体のnprEローカスに組み込まれる下流MVA経路と酵母idiを含むカセットのマップを表す。nprEの上流/下流は、組み込み用nprEローカスから各1kbの範囲のシーケンスを意味する。aprEプロモータ (アルカリセリンプロテアーゼプロモータ)は、aprE遺伝子のプロモータ(-35, -10, +1 転写開始部位, RBS)を意味する。MVKlは、酵母メバロン酸キナーゼ遺伝子を意味する。RBS-PMKは、酵母ホスホメバロン酸キナーゼ遺伝子と開始部位上流のバシラスRBSを意味する。RBS-MPDは、酵母ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ遺伝子と開始部位上流のバシラスRBSを意味する。RBS-IDIは、酵母idi遺伝子と開始部位上流のバシラスRBSを意味する。ターミネータは、B.アミリケファシエンス(amyliquefaciens)由来のアルカリセリンプロテアーゼ転写ターミネータを意味する。SpecRは、スペクチノマイシン耐性マーカーを意味する。「nprE upstream repeat for amp.」は増幅に用いられた上流領域の重複配列を意味する。 B.スブチリス染色体のnprEローカスに組み込まれる下流MVA経路と酵母idiを含むカセットのヌクレオチド配列を表す(SEQ ID NO:47)。 p9796-poplarのマップである。 p9796-poplarのヌクレオチド配列である(SEQ ID NO:48)。 pTrcPoplarのマップである。 pTrcPoplarのヌクレオチド配列である(SEQ ID NO:49)。 pTrcKudzu yIDI Kanのマップである。 pTrcKudzu yIDI Kanのヌクレオチド配列である(SEQ ID NO:50)。 pTrcKudzuDXS Kanのマップである。 pTrcKudzuDXS Kanのヌクレオチド配列である(SEQ ID NO:51)。 pCL PtrcKudzuのマップである。 pCL PtrcKudzuのヌクレオチド配列である(SEQ ID NO:52)。 pCL PtrcKudzuA3のマップである。 pCL PtrcKudzu A3のヌクレオチド配列である (SEQ ID NO:53)。 pCL PtrcKudzu yIDIのマップである。 pCL PtrcKudzu yIDIのヌクレオチド配列である(SEQ ID NO:54)。 pCL PtrcKudzu DXSのマップである。 pCL PtrcKudzu DXSのヌクレオチド配列である(SEQ ID NO:55)。 バイオマス原料からのイソプレン産出を表すグラフである。図４６Ａはトウモロコシ茎葉からのイソプレン産出を表す。図４６Ｂはサトウキビバガスからのイソプレン産出を表す。図４６Ｃは針葉樹パルプからのイソプレン産出を表す。図４６Ｄはグルコースからのイソプレン産出を表す。図４６Ｅは原料無添加の細胞からのイソプレン産出を表す。灰色の四角は植菌後の培地のOD600測定値の経時変化を表し、黒三角は植菌後のイソプレン産出の時変化を表す。 グルコース無添加の培地におけるBL21 (λDE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan)によるイソプレン産出を表すグラフである。四角はOD600を表し、三角はイソプレン産出(μg/ml)を表す。 BL21 (λDE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan)による1%グルコース原料転化糖からのイソプレン産出を表すグラフである。四角はOD600を表し、三角はイソプレン産出(μg/ml)を表す。 BL21 (λDE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan)による1%転化糖原料からのイソプレン産出を表すグラフである。四角はOD600を表し、三角はイソプレン産出(μg/ml)を表す。 BL21 (λDE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan))による1%AFEXトウモロコシ茎葉からのイソプレン産出を表すグラフである。四角はOD600を表し、三角はイソプレン産出(μg/ml)を表す。 酵母エキスのイソプレン産出に及ぼす効果を示すグラフである。図４８Ａは発酵槽への酵母エキスの添加量を変えたときの光学密度の経時変化を表す図である。図４８Ｂは発酵槽への酵母エキスの添加量を変えたときのイソプレン力価の経時変化を表す図である。力価は、発酵培養液1リットル当りのイソプレン産出量と定義される。図４８Ｃは流加培養法で培養したE. coli中でのイソプレン産出に酵母エキスが及ぼす効果を示すグラフである。 pTrcKudzu、yIDI、及びDXSプラスミドを含むE. coli細胞を用いた500Lバイオリアクターにおけるイソプレン産出を表すグラフである。図４９Ａは、グルコースと酵母エキスを添加した500Lバイオリアクターにおける光学密度の経時変化を表す。図４９Ｂは、グルコースと酵母エキスを添加した500Lバイオリアクターにおけるイソプレン力価の経時変化を表す。力価は、発酵培養液1リットル当りのイソプレン産出量と定義される。図４９Ｃは、グルコースと酵母エキスを添加した500Lバイオリアクターにおける総イソプレン産出量の経時変化を表す。 pJMupperpathway2のマップである。 pJMupperpathway2のヌクレオチド配列である(SEQ ID NO:56)。 pBS Kudzu #2のマップである。 14リットル流加培養法発酵中で組み換えkudzuイソプレンシンターゼを発現するバシラスを発酵させた時の成長を表すグラフである。黒い菱形は組み換えイソプレンシンターゼを備えないコントロール株(BG3594comK)を表し(天然イソプレン産出)、灰色の三角はpBSKudzuを備えるバシラスを表す(組み換えイソプレン産出)。 14リットル流加培養法発酵中で組み換えkudzuイソプレンシンターゼを発現するバシラスを発酵させた時の成長を表すグラフである。黒い菱形は組み換えイソプレンシンターゼを備えないコントロール株(BG3594comK)を表し(天然イソプレン産出)、灰色の三角はpBSKudzuを備えるバシラスを表す(組み換えイソプレン産出)。 プラスミドpET24 P.alba HGSのマップである。 図５５Ａ及びＢはプラスミドpET24 P.alba HGSのヌクレオチド配列である(SEQ ID NO:87)。 プラスミドEWL230と、BspHI及びNcol部位間の適合性付着端とを構築するためのエンドヌクレアーゼ消化に用いた制限酵素認識部位を表す模式図である。 プラスミドEWL230のマップである。 図５８Ａ及びＢはプラスミドEWL230のヌクレオチド配列である(SEQ ID NO:88)。 プラスミドEWL244と、Nsil及びPstI部位間の適合性付着端とを構築するためのエンドヌクレアーゼ消化に用いた制限酵素認識部位を表す模式図である。 EWL244のマップである。 図６１Ａ及びＢはプラスミドEWL244のヌクレオチド配列である(SEQ ID NO:89)。 プラスミドMCM484-487のマップである。 図６３Ａ〜６３ＣはプラスミドMCM484のヌクレオチド配列である(SEQ ID NO:90)。 図６４Ａ〜６４ＣはプラスミドMCM485のヌクレオチド配列である(SEQ ID NO:91)。 図６５Ａ〜６５ＣはプラスミドMCM486のヌクレオチド配列である(SEQ ID NO:92)。 図６６Ａ〜６６ＣはプラスミドMCM487のヌクレオチド配列である(SEQ ID NO:93)。 図６７Ａ〜６７Ｄは、15L(リットル)スケールの流加培養法により酵素エキス無添加で培養したMVA経路由来の遺伝子を発現するE. coli株(EWL256)のイソプレン産出を表すグラフである。図６７Ａは、グルコースを添加した15Lバイオリアクターにおける光学密度の経時変化を表す。図６７Ｂは、グルコースを添加した15Lバイオリアクターにおけるイソプレン力価の経時変化を表す。力価は、発酵培養液1リットル当りのイソプレン産出量と定義される。図６７Ｃは、グルコースを添加した15Lバイオリアクターにおけるイソプレン産出量の経時変化を表す。図６７Ｄは、グルコースを添加した15Lバイオリアクターにおける総二酸化炭素生成速度(TCER)、あるいは代謝活性プロファイルの経時変化を表す。 図６８Ａ〜６８Ｅは、15Lスケールの流加培養法において酵素エキスを添加して培養したMVA経路由来の遺伝子を発現するE. coli株(EWL256)のイソプレン産出を表すグラフである。図６８Ａは、グルコースを添加した15Lバイオリアクターにおける光学密度の経時変化を表す。図６８Ｂは、グルコースを添加した15Lバイオリアクターにおけるイソプレン力価の経時変化を表す。力価は、発酵培養液1リットル当りのイソプレン産出量と定義される。図６８Ｃは、グルコースを添加した15Lバイオリアクターにおけるイソプレン産出量の経時変化を表す。図６８Ｄは、グルコースを添加した15Lバイオリアクターにおける容積生産性を表す。グルコース添加により、平均1.1g/L/hrの容積生産性が40時間にわたり(23時間目-63時間目の間）維持された。図６８Ｅは、グルコースを添加した15Lバイオリアクターにおける二酸化炭素生成速度(CER)、あるいは代謝活性プロファイルの経時変化を表す。 図６９Ａから６９Ｄは、種々の炭素源を用いたときのMVA(経路)によるイソプレン産出を表す。図６９Ａは、グルコース、バイオマス加水分解物、グリセロール、またはアセテートを唯一の炭素源として用いたときの、MVA経路及びイソプレンシンターゼの両者を含むE. coli EWL256の成長を表す図である。種々の炭素源の倍地中の濃度は1%であった。炭素源無添加の陰性コントロールも含めて試験した。成長は600nMの光学密度で評価した。図６９Ｂは、グルコース、バイオマス加水分解物、グリセロール、またはアセテートを唯一の炭素源として用いたときの、MVA経路及びイソプレンシンターゼの両者を含むE. coli EWL256からのイソプレン固有生産性を表す図である。種々の炭素源の倍地中の濃度は1%であった。炭素源無添加の陰性コントロールも含めて試験した。サンプルは植菌してから190分、255分、及び317分経過後に採取し、細菌から産出されたイソプレンの量をGC-MSで測定した。図６９Ｃは、グルコースまたはキシロースを唯一の炭素源として用いたときの、E. coli EWL256の成長を表す図である。種々の炭素源の倍地中の濃度は1%であった。炭素源無添加の陰性コントロールも含めて試験した。成長は600nMの光学密度で評価した。図６９Ｄは、グルコースまたはキシロースを唯一の炭素源として用いたときの、E. coli EWL256からのイソプレン固有生産性を表す図である。炭素源の倍地中の濃度は1%であった。炭素源無添加の陰性コントロールも含めて試験した。サンプルは植菌してから260分、322分、及び383分経過後に採取し、細菌から産出されたイソプレンの量をGC-MSで測定した。 図７０Ａと図７０Ｂはそれぞれ、E.coli株によるグルコースからのイソプレン産出と、E.coli株による脂肪酸からのイソプレン産出を表す。図７０Ａでは、プラスミドが下流メバロン酸経路を備えるpMCMl18によるWW4の形質転換で得た11のコロニーを採取して下流経路の存在を確認した。コロニー中の細胞を、0.1%酵母エキス及び2%グルコースを含むTM3培地で培養した。誘導された培養物のイソプレン産出を、誘導してから4時間後に測定した。全てのコロニーからイソプレンが産出された。誘導物質のIPTGは、誘導物質の濃度を50から900μMに増やしたとき細胞濃度が3から4.6倍低下したことから分かるように、強い成長抑制効果を有する（データは示していない）。このグラフは、高度に誘導するとイソプレンの固有力価が高くなることを示している。図７０Ｂでは、洗浄し10倍に希釈した一夜培養物を製造培地に植菌した。培養物を数時間成長させた後、50μMのIPTGで誘導した。左側の棒は誘導後4時間目にイソプレン産出試験を1時間行った試験結果を表す。中央の棒は、同じ培養物について同じ誘導期間で、12時間のイソプレン産出試験を行った結果を1時間に正規化した値を表す。右側の棒は、13時間誘導した培養物についてイソプレン産出試験を1時間行ったときの値を表す。 Kudzu.Tsr, チオストレプトン耐性遺伝子由来のイソプレンシンターゼのクローン化に用いたE. coli-ストレプトミセスシャトルベクターpUWL201PW (6400bp)のマップを表す。図はDoumith et ah, Mol. Gen. Genet. 264: 477-485, 2000から引用した。 野生型(wt)ストレプトミセス・アルバス株、及びプラスミドpUWL201PW (陰性コントロール)またはpUWL201_iso (Kudzu由来のイソプレンシンターゼをコードする)を備える株によるイソプレン産出を表す。 メタロサルキナ・マゼイ古細菌の下流経路オペロンのマップを表す。 図７３Ｂと７３Ｃは、メタロサルキナ・マゼイ古細菌の下流経路オペロンのヌクレオチド配列を表す(SEQ ID NO: 113)。 メタロサルキナ・マゼイ古細菌のLowerin pET200D由来のMCM376-MVKのマップを表す。 図７４Ｂと７４Ｃは、メタロサルキナ・マゼイ古細菌のLowerin pET200D由来のMCM376-MVKのヌクレオチド配列を表す(SEQ ID NO:114)。 図７５Ａ〜７５Ｄは、RMl1608-2と比較したEWL256のイソプレン産出の成長及び固有生産性を表す。成長(OD550)は、白抜きの菱形で示し、イソプレンの固有生産性は棒グラフで示す。x-軸は、200μMのIPTG (図７５Ａ及び７５Ｂ)または400μMのIPTG(図７５Ｃ及び７５Ｄ)で誘導した後の経過時間(hours)である。Y-1軸はイソプレンの生産性(μg/L/OD/hr)、Y-2軸は波長550nmにおける光学密度の任意単位である。培養物の実際のODを求めるには、これらのOD550の値を6.66倍にしなければならない。 プラスミドpBBRCMPGI1.5-pglのマップである。 図７７Ａと図７７Ｂは、プラスミドpBBRCMPGI1.5-pglのヌクレオチド配列であるSEQ ID NO: 122)。 図７８Ａ〜７８Ｆは、M.マゼイメバロン酸キナーゼ, P.アルバイソプレンシンターゼ, 及び pgl (RHMl 11608-2)を発現するE. coli株を15Lスケールの流加培養法で成長させたときのイソプレン産出を表すグラフである。図７８Ａは、グルコースを添加した15Lバイオリアクター内の光学密度の経時変化を表す。図７８Ｂは、グルコースを添加した15Lバイオリアクターにおけるイソプレン力価の経時変化を表す。力価は、発酵ブロス1リットル当りのイソプレン産出量と定義される。イソプレンの計算方法は：59時間に産出された累積イソプレン、59時間目のg/発酵物容積、L [=] g/Lブロスである。図７８Ｃも、グルコースを添加した15Lバイオリアクターにおけるイソプレン力価の経時変化を表す。イソプレンの計算方法は：∫(イソプレン産出速度、g/L/hr)dt、t = 0から59時間[=] g/Lブロスである。図７８Ｄは、グルコースを添加した15Lバイオリアクターにおいて産出された総イソプレンの経時変化を表す。図７８Ｅは、グルコースを添加した15Lバイオリアクターにおける容積生産性を表す。図７８Ｆは、グルコースを添加した15Lバイオリアクターにおける二酸化炭素発生速度(CER)、または代謝活性の経時変化を表す。 プラスミドpJ201 :19813のマップである。 pJ201 : 19813のヌクレオチド配列である(SEQ ID NO:123)。 pJ201 : 19813のヌクレオチド配列である(SEQ ID NO:123)。
この発明は、従来よりも多量のイソプレンを産出する組成物及び方法に関する。特に本願の組成物と方法は、イソプレンの産出速度及び産出されるイソプレンの総量を増加させることができる。例えば、イソプレンを4.8×104nmole/gwcm/hr産出可能な培養細胞系が得られた（Table 1）。この培養細胞系の効率として、細胞が消費した培地中の炭素を23.6モル%の収率(10.7重量%の収率)でイソプレンに転換する(炭素収率%)ことが示された。実施例とTable 2に示すように、培養液1リットル当り約60.5gのイソプレンが産出された。
イソプレンは、1.88×105 nmol/OD/hr (1.88×105 nmole/gwcm/hr)のピーク固有速度で産出された。所望であれば、さらに多量のイソプレンを本願に開示する別の条件によって得ることもできる。いくつかの実施形態では、イソプレンの産出に再生可能な炭素源を用いることもできる。この発明の組成物と方法は、細胞当りの収率が高く、炭素収率が高く、イソプレンの純度が高く、生産性が高く、エネルギー消費量が少なく、製造コスト及び設備投資費用が低く、副反応が最小限である点で好ましい。
この高効率、大スケールのイソプレン産出生合成プロセスにより、イソプレンベースの合成ゴム用原料が提供され、天然ゴムの低コスト代替物が提供される。
以下に説明するように、細胞にイソプレンシンターゼポリペプチド(例えば植物由来イソプレンシンターゼポリペプチド) をコードする非相同核酸を導入することにより、細胞から産出されるイソプレンの量を大幅に増加させることができる。イソプレンシンターゼポリペプチドは、ジメチルアリルジホスフェート(DMAPP)をイソプレンに転換する。
実施例に示すように、非相同プエラリア・モンタナ(kudzu)またはポプラ・アルバ(Poplar)イソプレンシンターゼポリペプチドが、大腸菌、パントエア・シトレア、バシラス・スブチリス、ヤロウイア・リポリチカ、及びトリコデルマ・リーゼイ等の様々な宿主細胞から発現された。また、実施例に示すように、非相同メタロサルキナ・マゼイ (M. mazei)メバロン酸キナーゼ(MVK)が、大腸菌等の宿主細胞から発現され、イソプレンの産出量が増加した。
このような細胞は全て、非相同イソプレンシンターゼ・ポリペプチドを備えない対応する細胞よりも多くのイソプレンを産出した。Table 1と2に示す様に、本願の方法により多量のイソプレンが産出された。
例えば、非相同イソプレンシンターゼ核酸を備えるバシラス・スブチリス細胞は、これに対応し非相同核酸を備えないコントロールのバシラス・スブチリス細胞と比較して、14リットルの培養槽において約10倍のイソプレンを産出した(Table 2)。
培養槽においてE. coliによりブロス1リットル当り(mg/L、ここでブロスの容積には細胞及び培地の容積が含まれる) 60.5gのイソプレンが産出され、バシラス・スブチリスにより30mg/Lのイソプレンが産出されたことは、顕著な量のイソプレンが産出されたことを示している(Table 2)。所望であれば、より大スケールまたは本願に開示する別の方法を用いて、イソプレンの産出量を更に増加させることができる。
Table 1及び2 に挙げたベクターと実験条件については、下記及び実施例において更に詳しく説明する。
Table 1に、この発明の細胞培地と方法を用いた振蕩フラスコでのイソプレン収量の例を示す。
イソプレン産出量の測定方法は実施例1のパートIIに記載されている。この試験では、振蕩フラスコから所定時間ごとに採取した各サンプルを30分間培養し、次に、このサンプルのイソプレン産出量を測定した。産出されたイソプレンのヘッドスペース濃度、及びイソプレン産出固有速度をTable 1に示すとともに、以下に詳しく説明する。
Figure 0006262125
Table 2に、この発明の細胞培地と方法を用いた培養槽におけるイソプレン収量の例を示す。
イソプレン産出量の測定方法は実施例1のパートIIに記載されている。この試験では、培養槽からオフガスのサンプルを採取してイソプレンの量を測定した。産出されたイソプレンのピークヘッドスペース濃度(発酵時の最高ヘッドスペース濃度)、力価(ブロス1リットル当りの累積全イソプレン産出量)、及びピーク固有速度(発酵時の最高固有速度濃度)をTable 2に示すとともに、以下に詳しく説明する。
Figure 0006262125
さらに、非相同イソプレンシンターゼ核酸を含む細胞によるイソプレン産出は、細胞から発現されるl-デオキシ-D-キシルロース-5-ホスフェートシンターゼ(DXS)ポリペプチド、および／または、イソペンチルジホスフェートイソメラーゼ(IDI)ポリペプチドの量を増やすことによって増加させることができる。DXS核酸は、非相同核酸または内因性核酸の複製である。同様に、IDI核酸は、非相同核酸または内因性核酸の複製である。
いくつかの実施形態では、DXSおよび／またはIDIポリペプチドの量は、内因性DXSおよび／またはIDIプロモータを、DXSおよび／またはIDI核酸の転写を増加させることができる別のプロモータおよび／または調節領域で置換することにより増加させる。
いくつかの実施形態では、細胞にはイソプレンシンターゼポリペプチド(例えば植物性イソプレンシンターゼ核酸)をコードする非相同核酸と、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする内因性核酸の複製の両者が含まれる。
コードされたDXS及IDIポリペプチドは、イソプレンの生合成のDXP経路の一部である（図19A）。DXSポリペプチドはピルビン酸塩とD-グリセルアルデヒド-3-ホスフェートをl-デオキシ-D-キシルロース-5-ホスフェートに転換する。理論により限定することは意図しないが、DXSポリペプチドの量を増やすことによってDXP経路への炭素の供給量が増加する結果、イソプレン産出量が増えると考えられる。
IDIポリペプチドはイソペンテニルジホスフェート(IPP)とジメチルアリルジホスフェート(DMAPP)の相互変換を触媒する。理論により限定することは意図しないが、細胞中のIDIポリペプチドを増やすことにより、DMAPPに転換され、さらにイソプレンに転換されるIPPの量が増える。
例えば、kudzuイソプレンシンターゼ、サッカロミセス・セレビシアIDI、及びE. coli DXS核酸を備えるE. coli細胞の培養によりイソプレンを産出させた。イソプレンの産出量は、15時間が経過する間に50から300μg/Lの範囲で変化した(実施例7、パートVII)。
別の例では、メタロサルキナ・マゼイ(M. mazei)メバロン酸キナーゼ(MVK)、ポプラ・アルバ(P. alba) イソプレンシンターゼ、上流MVA経路, 及び下流MVA経路を備えるE. coli細胞の培養によりイソプレンを産出させた。イソプレンの産出量は、67時間が経過する間に32から35.6g/Lの範囲で変化した(実施例10、パートIII)。
また別の例では、メタロサルキナ・マゼイ・メバロン酸キナーゼ(MVK)、ポプラ・アルバ・イソプレンシンターゼ、pgl過剰発現(RHMl 11608-2)、上流MVA経路、及び下流MVA経路を備えるE. coli細胞の培養によりイソプレンを産出させた。イソプレンの産出量は、40時間が経過する間に33.2から40.0g/Lの範囲で変化し、または59時間が経過する間に48.6から60.5g/Lの範囲で変化した(実施例13、パート(ii))。
いくつかの実施形態では、細胞中に非相同または追加の内因性イソプレンシンターゼ、IDI及びDXS核酸が存在することにより、これらの非相同または追加の内因性核酸が無い場合と比較して、細胞はより長期間増殖または成長することができる。例えば、非相同イソプレンシンターゼ、IDI、及びDXS核酸を含む細胞は、非相同イソプレンシンターゼ及びDXS核酸のみを含む細胞、または非相同イソプレンシンターゼのみを含む細胞より成長しやすい。
また、非相同イソプレンシンターゼ、IDI、及びDXS核酸は、E. coli細胞中に保持された高コピープラスミド上の強プロモータに作動可能に結合していた。このことから、これらのポリペプチドの大部分が、過剰な量の毒性を生じることなく細胞中で発現されることが示唆される。理論により限定することは意図しないが、非相同または内因性イソプレンシンターゼ及びIDI核酸の存在により、細胞中に非相同または追加の内因性DXS核酸しか存在していなければ蓄積していたであろう1以上の潜在的に毒性を有する中間体の量が低下すると考えられる。
いくつかの実施形態では、細胞により産出されるMVAポリペプチドの量を増やすことにより、非相同イソプレンシンターゼ核酸を含む細胞によるイソプレン産出が増大される(図19A及び19B)。MVA経路のポリペプチドの例として、以下のポリペプチドが挙げられる。アセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼ (AA-CoA チオラーゼ)ポリペプチド、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタアリール-CoAシンターゼ(HMG-CoAシンターゼ) ポリペプチド、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタアリール-CoAリダクターゼ(HMG-CoAリダクターゼ)ポリペプチド、 メバロン酸キナーゼ(MVK)ポリペプチド、ホスホメバロン酸キナーゼ(PMK)ポリペプチド、 ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ(MVD)ポリペプチド、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ(PMDC)ポリペプチド、 イソペンテニルホスフェートキナーゼ(IPK)ポリペプチド、IDIポリペプチド、及び2以上のMVA経路ポリペプチド活性を有するポリペプチド(例えば融合ポリペプチド)。
例えば1以上のMVA経路核酸を細胞に導入することができる。いくつかの実施形態では、細胞はAA- CoA チオラーゼ、HMG-CoAシンターゼ、及びHMG-CoAリダクターゼ核酸を含有する上流MVA経路を備える。
いくつかの実施形態では、細胞はMVK, PMK, MVD,及びIDI核酸を含有する下流MVA経路を備える。
いくつかの実施形態では、細胞はAA-CoAチオラーゼ、HMG-CoAシンターゼ、HMG-CoAリダクターゼ、MVK, PMK, MVD, 及び IDI核酸を含有する全MVA経路を備える。
いくつかの実施形態では、細胞はAA-CoAチオラーゼ、HMG-CoA シンターゼ、HMG-CoAリダクターゼ、MVK, PMDC, IPK, 及びIDI核酸を含有する全MVA経路を備える。
MVA経路核酸は、非相同核酸または内因性核酸の複製である。いくつかの実施形態では、1以上のMVA経路ポリペプチドの量は、MVA経路核酸の内因性プロモータまたは調節領域をMVA経路核酸の転写を増大させる別のプロモータおよび／または調節領域で置換することにより増加させることができる。
いくつかの実施形態では、細胞にはイソプレンシンターゼポリペプチド(例えば植物性イソプレンシンターゼ核酸)をコードする非相同核酸と、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする内因性核酸との両者を備える。
例えば、kudzuイソプレンシンターゼポリペプチドをコードする核酸と、サッカロミセス・セレビシアMVK, PMK, MVD, 及びIDIポリペプチドをコードする核酸とを備えるE. coli細胞が、6.67×104 nmol/Lbroth/OD600/hrの速度でイソプレンを産出した(実施例8参照）。
さらに、エンテロコカス・ファエカリスAA-CoA チオラーゼ、HMG-CoAシンターゼ、及びHMG-CoAリダクターゼポリペプチドをコードする核酸を備えるE. coli細胞を14リットルスケールで培養することにより、メバロン酸(MVA経路の中間体)22グラムが産出された。これらの細胞を振蕩フラスコで培養することにより、1リットル当り2-4グラムのメバロン酸が産出された。これらの結果は、E. coli中においても非相同MVA経路核酸は活性であることを示している。
上流MVA経路と下流MVA経路の両者の核酸と、kudzuイソプレンシンターゼ(MCM 127株)の核酸とを備えるE. coli細胞は、下流MVA経路とkudzuイソプレンシンターゼ(MCM 131株)しか備えないE. coli細胞と比較して、明らかに多量(874μg/Lbroth/hr/OD)のイソプレンを産出した(Table 3及び実施例8, パートVIII参照)。
別の例では、ポプラ・アルバ・イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする核酸とM.マゼイMVKポリペプチドをコードする核酸とを備えるE. coli細胞は、酵母エキス無添加の発酵を67時間行ったとき320.6g (9.54×104nmol/Lbroth/OD600/hr (すなわち9.5×10-5mol/Lbroth/OD600/hr)のピーク固有速度において) のイソプレンを産出し、あるいは、酵母エキス無添加の発酵を68時間行ったとき395.5g (8.66×104 nmol/Lbroth/OD600/hrのピーク固有速度において) のイソプレンを産出した (実施例10参照)。
いくつかの実施形態では、連続培養（例えば希釈しない連続培養）において細胞分裂を少なくとも5回, 10回, 20回, 50回, 75回, 100回, 200回, 300回またはそれ以上繰り返した後でも、細胞の少なくとも一部が非相同イソプレンシンターゼ、DXS、IDI、および／またはMVA経路核酸を保持している。
この発明のいくつかの実施形態では、非相同イソプレンシンターゼ、DXS、IDIを備える核酸、および／またはMVA経路核酸、または内因性イソプレンシンターゼ、DXS、IDIを備える核酸、および／またはMVA経路の複製を備える核酸は、カナマイシン、アンピシリン、カルベニシリン、ゲンタマイシン、ヒグロマイシン、フレオマイシン、ブレオマイシン、ネオマイシン、またはクロラムフェニコール等の抗生物質耐性核酸の選択マーカーを備える。
実施例7のパートVIに示すように、kudzuイソプレンシンターゼ, S.セレビシアIDI、及びE. coli DXS核酸を備えイソプレンを産出するE. coli細胞を用いた細胞培地に酵母エキスを添加することにより、産出されるイソプレンの量をさらに増加させることができる。特に、試験した濃度範囲では、細胞培地に添加する酵母エキスの量に比例してイソプレン産出量が直線的に増加した(図48C)。
さらに、酵母エキスとグルコースとを添加したブロス1リットルから約0.11グラムのイソプレンが産出された(実施例7のパートVIII参照)。グルコース存在下で酵母エキスの量を増やしたときの方が、酵母エキスの存在下でグルコースを増やしたときよりも、多くのイソプレンが産出された。また酵母エキスの量を増やすことにより、より多くのイソプレンを長時間産出できるとともに、細胞の健全性が向上した。
また、炭素源として3種類の加水分解したバイオマス(サトウキビバガス、トウモロコシ茎葉、及び軟質木材パルプ)を用いたイソプレン産出を行った (図46A-C、及び図69Aと図69B)。
kudzuイソプレンシンターゼ、S.セレビシアIDI、及びE. coli DXS核酸を備えるE. coli細胞は、これらの加水分解されたバイオマス炭素源から、均等量のグルコース(例えば1%グルコース, w/v)を用いたときとほぼ同じ量のイソプレンを産出した。
P.アルバイソプレンシンターゼ及びMVA経路を発現するE. coli細胞は、アンモニア繊維膨潤(ammonia fiber expansion:AFEX)処理されたトウモロコシ茎葉から、均等量のグルコースよりも高い初期速度でイソプレンを産出した(図69 A及び69B)。
所望により、この発明の組成物及び方法において、別のバイオマス炭素源を用いることもできる。バイオマス炭素源は従来の培地よりも安価で、イソプレンの製造を経済的に行うことができるので好ましい。
さらに、イソプレンの製造の炭素源として、転化糖を用いることができる(図47D)。
さらに、キシロース、アセテート、及びグリセロールを、イソプレン産出の炭素源として用いることができる(図69A-69D)。例えば、アセテートを唯一の炭素源として用いてP.アルバイソプレンシンターゼ及びMVA経路を備えるE. coli細胞を培養したとき、イソプレンの固有生産性はグルコースを用いて培養したときの約2倍であった(実施例10, パートIV; 図69A及び69B)。
いくつかの実施形態では、細胞培地にオイルを添加する。例えばkudzuイソプレンシンターゼ核酸を備えるB.スブチリス細胞は、オイルとグルコース源を含有する細胞培地で培養したときイソプレンを産出する(実施例4, パートIII)。 別の例では、上流及び下流MVA経路及びkudzuイソプレンシンターゼを備えるE. coli fadR atoC突然変異細胞は、パームオイルとグルコース源を含有する細胞培地で培養したときイソプレンを産出した (実施例12, パートII)。
いくつかの実施形態では、細胞培地には1種類以上のオイル(例えば2, 3, 4, 5種類またはそれ以上)を添加する。理論により限定することは意図しないが、(i) オイルが細胞中でイソプレンに転換される炭素の量を増加させる、(ii) オイルが細胞中のアセチル-CoAを増加させることによりMVA経路に供給される炭素の量が増加する、および／または(ii)オイルが細胞の追加の栄養源となると考えられる。細胞中の多くの炭素が、他の化合物ではなくイソプレンに転換されるため、オイルを細胞の追加の栄養源として用いることが好ましい。
いくつかの実施形態では、オイルを含む細胞培地で培養される細胞は、必然的にMVA経路によりイソプレンを産出するか、あるいは全てのMVA経路の核酸を備えるように修飾されている。いくつかの実施形態では、宿主細胞によるオイルの消費を促進するために、オイルの一部または全部を、細胞培地に添加する前に加水分解しておく。
＜ポリペプチド及び核酸の例＞
この発明の組成物及び方法では、様々なイソプレンシンターゼ、DXS, IDI,および／または MVA経路ポリペプチド及び核酸を用いることができる。
本願の「ポリペプチド」には、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、ポリペプチドの断片、及び融合ポリペプチドが含まれる。融合ポリペプチドは、第1ポリペプチド(例えばイソプレンシンターゼ、DXS, IDI, またはMVA経路ポリペプチド) の一部または全部と、第2ポリペプチド(例えばHis-tag等のように融合ポリペプチドの精製と検出を促進するペプチド) の一部または全部とを含んでいる。
いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは2以上のMVA経路ポリペプチド(AA-CoAチオラーゼ及びHMG-CoAリダクターゼポリペプチド等) 活性を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは2以上のMVA経路ポリペプチド活性を有する天然ポリペプチド(エンテロコカス・ファエカリス mvaE核酸によりコードされたポリペプチド等)である。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは少なくとも約50, 100, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400またはこれ以上のアミノ酸を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドの断片には完全長ポリペプチドに由来する少なくとも約25, 50, 75, 100, 150, 200, 300またはこれ以上の隣接アミノ酸が含まれ、対応する完全長ポリペプチドの活性を少なくとも約5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, または100% 保有する。
特定の実施形態では、ポリペプチドには天然由来のイソプレンシンターゼ、DXS, IDI, またはMVA経路ポリペプチドの断片または全アミノ酸配列が含まれる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは野生型(すなわち天然由来の配列) イソプレンシンターゼ、DXS, IDI, またはMVA経路ポリペプチドに対し、1以上の突然変異を有する。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは単離されたポリペプチドである。「単離されたポリペプチド」とは、例えば2, 5, 10, 20, 50またはそれ以上の異なるポリペプチドから成るライブラリ等のライブラリの一部ではなく、少なくとも1の天然由来の成分から分離されたポリペプチドである。単離されたポリペプチドは、例えばそのポリペプチドをコードする組み換え核酸の発現により得られる。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは非相同ポリペプチドである。「非相同ポリペプチド」とは、そのポリペプチドのアミノ酸配列が、同じ宿主細胞から自然に発現される別のポリペプチドのアミノ酸配列とは異なるポリペプチドを意味する。
「核酸」とは、一本鎖または二本鎖の形態の、2以上のデオキシリボヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドを意味する。いくつかの実施形態では、核酸は組み換え核酸である。「組み換え核酸」とは、対象とする核酸が由来する天然有機体のゲノムにおいて対象とする核酸に隣接する1以上の核酸(例えば遺伝子）から開放された核酸を意味する。この用語には、例えばベクター、自己複製プラスミドまたはウイルス、または原核生物または真核生物のゲノムDNAに導入された組み換えDNA、あるいは他の配列から独立して分離された分子(例えばcDNA、ゲノムDNA断片、あるいはPCRまたは制限エンドヌクレアーゼ消化により産出されたcDNA断片)として存在する組み換えDNAが含まれる。
いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼ、DXS, IDI, またはMVA経路核酸は、組み換え核酸が融合ポリペプチドをコードするようにして、別のポリペプチドの全部または一部をコードする別の核酸に作動可能に結合している。ここで、融合ポリペプチドにはイソプレンシンターゼ、DXS, IDI, またはMVA経路ポリペプチド、及び別のポリペプチド(例えばHis-tagのように、融合ポリペプチドの精製または検出を促進するペプチド)の全部または一部が含まれる。いくつかの実施形態では、組み換え核酸の一部または全部が化学的に合成される。
いくつかの実施形態では、核酸は非相同核酸である。「非相同核酸」とは、その核酸配列が同じ宿主細胞において見られる天然の核酸の配列とは異なる核酸を意味する。
いくつかの実施形態では、核酸には天然由来イソプレンシンターゼ, DXS, IDI,またはMVA経路核酸の核酸配列のセグメントまたは全配列が含まれている。いくつかの実施形態では、核酸にはイソプレンシンターゼ, DXS, IDI,またはMVA経路核酸由来の隣接ヌクレオチドが少なくとも約50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800,またはこれ以上含まれている。いくつかの実施形態では、核酸は野生型(すなわち天然の配列) イソプレンシンターゼ, DXS, IDI,またはMVA経路核酸と比較して1以上の突然変異体を有する。
いくつかの実施形態では、核酸はイソプレンシンターゼ, DXS, IDI,またはMVA経路核酸の転写または翻訳を増加させる1以上の突然変異体(例えばサイレント突然変異体)を有する。いくつかの実施形態では、核酸はイソプレンシンターゼ, DXS, IDI,またはMVA経路核酸をコードする核酸の縮重変異体である。
「縮重コドン」とは、コードされたペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼすことなくヌクレオチド配列の変動を許容する、遺伝子コードの多様性を意味する。所与のアミノ酸を特定するためのヌクレオチドコドンの使用時に特定の宿主が示す「コドン-バイアス」は当業者にとって周知である。従って、宿主細胞中での発現を改善するための核酸を合成する際、いくつかの実施形態では、核酸のコドン使用頻度が宿主細胞の好適なコドン使用頻度に近づくようにして核酸を設計することが好ましい。
Appendix 1に、いくつかのイソプレンシンターゼ, DXS, IDI,および／またはMVA経路ポリペプチド及び核酸の例の登録番号を示す。(Appendix 1の登録番号及びこれらに対応する配列は、本願に参照として組み込まれ、特にイソプレンシンターゼ, DXS, IDI,および／またはMVA経路ポリペプチド及び核酸のアミノ酸及び核酸配列について本願に参照として組み込まれる。)
Keggデータベースにも、様々なイソプレンシンターゼ, DXS, IDI,および／またはMVA経路ポリペプチド及び核酸のアミノ酸配列及び核酸配列の例が含まれている。(例えば"genome.jp/kegg/pathway/map/map00100.html" 及びそこに開示された配列参照。これらは本願に参照として組み込まれ、特にイソプレンシンターゼ, DXS, IDI,および／またはMVA経路ポリペプチド及び核酸のアミノ酸及び核酸配列について本願に参照として組み込まれる。)
いくつかの実施形態では、1以上のイソプレンシンターゼ、 DXS、 IDI、及び／またはMVA経路ペプチドおよび／または核酸は、2007年12月12日または2008年12月11日に公知であったAppendix 1に示す登録番号に対応する配列と同じ配列を有するか、あるいは、Keggデータベースに示されていた配列を有する。以下に、別のイソプレンシンターゼ、 DXS、 IDI、及び／またはMVA経路ペプチドおよび核酸の例を示す。
＜イソプレンシンターゼポリペプチド及び核酸の例＞
上記のように、イソプレンシンターゼポリペプチドはジメチルアリルジホスフェート(DMAPP)をイソプレンに転換する。イソプレンシンターゼポリペプチドの例として、ポリペプチド、ポリペプチドの断片、ペプチド、及び少なくとも1のイソプレンシンターゼポリペプチド活性を有する融合ポリペプチドが挙げられる。
ポリペプチドがイソプレンシンターゼポリペプチド活性を有するか否かは、in vitro, 細胞抽出物中、またはin vivoで、そのポリペプチドのDMAPPをイソプレンに転換する能力を測定する公知の方法によって評価することができる。このような評価方法の一例では、実施例1に示す振蕩フラスコ法により培養した細菌株 (例えば本願に示すE. coli/pTrcKudzu)を用いて細胞抽出物を調製する。誘導完了後、約10 mLの細胞を7000×gで10分間遠心分離してペレット化し、5 mlのグリセロール無添加PEB中に再懸濁させる。フレンチプレス細胞破砕機を用いる標準的な方法により細胞を溶解させる。あるいは、細胞を-80℃で凍結／解凍した後、リゾチーム(Ready-Lyseリゾチーム溶液; Epicentre社)で処理する。
細胞抽出液中のイソプレンシンターゼポリペプチド活性は、例えばSilverらのJ. Biol. Chem. 270:13010-13016, 1995に記載された方法で測定することができる。Silverらの文献は本願に参照として組み込まれ、特にイソプレンシンターゼポリペプチド活性の評価方法に関する記載が本願に参照として組み込まれる。DMAPP (Sigma社)を窒素気流下で蒸発乾固させ、pH8.2の100mMリン酸カリウム緩衝液中に濃度100mMで再水和させ、-20℃で保管する。
測定は、20 ml のヘッドスペースバイアル中で細胞抽出液25 μlに、1M MgCl2, 1mM (250 μg/ml) DMAPP, 65 μlのPlant Extract緩衝液(PEB) (50mM Tris-HCl, pH 8.0, 20mM MgCl2, 5%グリセロール, 及び2mM DTT) を含む溶液5 μlを添加し、次に、振蕩しながら37℃で15分間培養することにより行う。ヘッドスペースバイアルは金属製スクリューキャップと、テフロン（登録商標）コーティングされたシリコーン隔膜(Agilent Technologies社)とを備える。
200μlの250mM EDTAを添加して反応を終了させ、実施例1、パートIIに開示するように、GC/MSで定量する。
イソプレンシンターゼ核酸の例として、少なくとも1のイソプレンシンターゼポリペプチド活性を有するポリペプチド、ポリペプチドの断片、ペプチド、及び融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。
イソプレンシンターゼポリペプチド及び核酸の例として、本願に開示するいずれかの有機体源由来の天然ポリペプチド及び核酸、あるいは本願に開示するいずれかの有機体源由来のポリペプチド及び核酸の突然変異体が挙げられる。
いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドまたは核酸は、例えばマメ亜科等のマメ科に由来する。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドまたは核酸は、プエラリア・モンタナ［Pueraria montana (kudzu)］ (Sharkey et al, Plant Physiology 137: 700-712, 2005)、プエラリア・ロバタ［Pueraria lobata］、ポプラ(例えば ポプラ・アルバ、 ポプラ・ニグラ、ポプラ・トリコカーパ、ポプラ・アルバ×ポプラ・トレムラ (CAC35696)、またはポプラ・アルバ) (Sasaki et al, FEBS Letters 579(11): 2514-2518, 2005; Miller et al, Planta 213: 483-487, 2001), アスペン［aspen］ (例えばポプラ・トレムロイデス(Populus tremuloides)) (Silver et al, JBC 270(22): 13010-1316, 1995),、マタハヨーロッパナラ(学名Quercus robur)(Zimmer et al, WO 98/02550)由来のポリペプチドまたは核酸である。これらの文献は本願に参照として組み込まれ、特にイソプレンシンターゼ核酸とイソプレンシンターゼポリペプチドの発現に関する記載が本願に参照として組み込まれる。
好ましいイソプレンシンターゼの非限定的例示として、ジェンバンク（Genbank）登録番号AY341431, AY316691, AY279379, AJ457070, 及びAY 182241のイソプレンシンターゼが挙げられる。これらのイソプレンシンターゼは本願に参照として組み込まれ、特にイソプレンシンターゼ核酸及びポリペプチドの配列について本願に参照として組み込まれる。
いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドまたは核酸は、天然由来のポリペプチドまたはヨーロッパナラ(Quercus robur)由来の核酸ではない (すなわち、イソプレンシンターゼポリペプチドまたは核酸は天然由来以外のポリペプチド、またはヨーロッパナラ由来以外の核酸である)。
いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドまたは核酸は、ポプラ由来の天然ポリペプチドまたは核酸である。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドまたは核酸は、ポプラ由来の天然ポリペプチドまたは核酸ではない。
＜DXSポリペプチド及び核酸の例＞
上記のように、l-デオキシ-D-キシルロース-5-ホスフェートシンターゼ(DXS)ポリペプチドは、ピルビン酸塩及びD-グリセルアルデヒド-3-ホスフェートを、l-デオキシ-D-キシルロース-5-ホスフェートに転換する。
DXSポリペプチドの例として、少なくとも1のDXSポリペプチド活性を有するポリペプチド、ポリペプチドの断片、ペプチド、及び融合ポリペプチドが挙げられる。
ポリペプチドがDXSポリペプチド活性を有するか否かは、in vitro, 細胞抽出物中、またはin vivoで、そのポリペプチドのピルビン酸塩及びD-グリセルアルデヒド-3-ホスフェートを、l-デオキシ-D-キシルロース-5-ホスフェートに転換する能力を測定する標準的方法（例えば本願に開示する方法）によって評価することができる。
DXS核酸の例には、少なくとも1のイソプレンシンターゼポリペプチド活性を有するポリペプチド、ポリペプチドの断片、ペプチド、及び融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。
DXSポリペプチド及び核酸の例として、本願に開示するいずれかの有機体源由来の天然ポリペプチド及び核酸、あるいは本願に開示するいずれかの有機体源由来のポリペプチド及び核酸の突然変異体が挙げられる。
＜IDIポリペプチド及び核酸の例＞
イソペンテニルジホスフェートイソメラーゼポリペプチド (イソペンテニル-ジホスフェートデルタ- イソメラーゼ、またはIDI)は、イソペンテニルジホスフェート(IPP)と、ジメチルアリルジホスフェート(DMAPP)の相互変換を触媒する (例えばconverting IPPをDMAPPに転換し、および／または、DMAPPをIPPに転換する)。
IDIポリペプチドの例として、ポリペプチド、ポリペプチドの断片、ペプチド、及び少なくとも1のIDIポリペプチド活性を有する融合ポリペプチドが挙げられる。
ポリペプチドがIDIポリペプチド活性を有するか否かは、in vitro, 細胞抽出物中、またはin vivoで、そのポリペプチドのIPP 及びDMAPPを相互変換する能力を測定する標準的方法（例えば本願に開示する方法）によって評価することができる。
IDI核酸の例には、少なくとも1のIDIポリペプチド活性を有するポリペプチド、ポリペプチドの断片、ペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。
IDISポリペプチド及び核酸の例として、本願に開示するいずれかの有機体源由来の天然ポリペプチド及び核酸、あるいは本願に開示するいずれかの有機体源由来のポリペプチド及び核酸の突然変異体が挙げられる。
＜MVA経路ポリペプチド及び核酸の例＞
MVA経路のポリペプチドの例として、アセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼ (AA-CoA チオラーゼ)ポリペプチド、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタアリール-CoAシンターゼ(HMG-CoAシンターゼ) ポリペプチド、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタアリール-CoAリダクターゼ(HMG-CoAリダクターゼ)ポリペプチド、 メバロン酸キナーゼ(MVK)ポリペプチド、ホスホメバロン酸キナーゼ(PMK)ポリペプチド、 ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ(MVD)ポリペプチド、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ(PMDC)ポリペプチド、 イソペンテニルホスフェートキナーゼ(IPK)ポリペプチド、IDIポリペプチド、及び2以上のMVA経路ポリペプチド活性を有するポリペプチド(例えば融合ポリペプチド)が挙げられる。
特に、MVA経路ポリペプチドには、少なくとも1のMVA経路ポリペプチド活性を有するポリペプチド、ポリペプチドの断片、ペプチド、及び融合ポリペプチドが含まれる。
MVA経路核酸の例には、少なくとも1のMVA経路ポリペプチド活性を有するポリペプチド、ポリペプチドの断片、ペプチド、及び融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。
MVA経路ポリペプチド及び核酸の例として、本願に開示するいずれかの有機体源由来の天然ポリペプチド及び核酸、あるいは本願に開示するいずれかの有機体源由来のポリペプチド及び核酸の突然変異体が挙げられる。
特に、アセチル-CoA アセチルトランスフェラーゼポリペプチド(AA-CoA thiolase or AACT)は、アセチル-CoAの2分子をアセトアセチル-CoAに転換する。ポリペプチドがAA-CoA チオラーゼポリペプチド活性を有するか否かは、in vitro, 細胞抽出物中、またはin vivoで、そのポリペプチドのアセチル-CoAの2分子をアセトアセチル-CoAに転換する能力を測定する標準的方法（例えば本願に開示する方法）によって評価することができる。
3-ヒドロキシ-3-メチルグルタアリールメチルグルタアリール-CoAシンターゼ(HMG-CoAシンターゼまたはHMGS)ポリペプチドは、アセトアセチル-CoAを3-ヒドロキシ-3-メチルグルタアリール-CoAに転換する。
ポリペプチドがHMG-CoAシンターゼポリペプチド活性を有するか否かは、in vitro, 細胞抽出物中、またはin vivoで、そのポリペプチドのアセトアセチル-CoAを3-ヒドロキシ-3-メチルグルタアリール-CoAに転換する能力を測定する標準的方法（例えば本願に開示する方法）によって評価することができる。
3 -ヒドロキシ-3 -メチルグルタアリール-Co Aリダクターゼ(HMG-CoAリダクターゼまたはHMGR) ポリペプチドは、3 -ヒドロキシ-3 -メチルグルタアリール-Co Aをメバロン酸に転換する。ポリペプチドがHMG-CoAリダクターゼポリペプチド活性を有するか否かは、in vitro, 細胞抽出物中、またはin vivoで、そのポリペプチドの3 -ヒドロキシ-3 -メチルグルタアリール-Co Aをメバロン酸に転換する能力を測定する標準的方法（例えば本願に開示する方法）によって評価することができる。
メバロン酸キナーゼ(MVK)ポリペプチドは、メバロン酸をリン酸化してメバロン酸-5 -ホスフェートにする。ポリペプチドがMVKポリペプチド活性を有するか否かは、in vitro, 細胞抽出物中、またはin vivoで、そのポリペプチドのメバロン酸をメバロン酸-5-ホスフェートに転換する能力を測定する標準的方法（例えば本願に開示する方法）によって評価することができる。
ホスホメバロン酸キナーゼ(PMK)ポリペプチドは、メバロン酸-5-ホスフェートをリン酸化してメバロン酸-5 -ジホスフェートにする。ポリペプチドがPMKポリペプチド活性を有するか否かは、in vitro, 細胞抽出物中、またはin vivoで、そのポリペプチドのメバロン酸-5-ホスフェートをメバロン酸-5 -ジホスフェートに転換する能力を測定する標準的方法（例えば本願に開示する方法）によって評価することができる。
ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ(MVDまたはDPMDC)ポリペプチドは、メバロン酸-5-ジホスフェートをイソペンテニルジホスフェート(IPP)に転換する。ポリペプチドがMVDポリペプチド活性を有するか否かは、in vitro, 細胞抽出物中、またはin vivoで、そのポリペプチドのメバロン酸-5-ジホスフェートをイソペンテニルジホスフェート(IPP)に転換する能力を測定する標準的方法（例えば本願に開示する方法）によって評価することができる。
ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ(PMDC)ポリペプチドは、メバロン酸-5-ホスフェートをイソペンテニルホスフェート(IP)に転換する。ポリペプチドがPMDCポリペプチド活性を有するか否かは、in vitro, 細胞抽出物中、またはin vivoで、そのポリペプチドのメバロン酸-5-ホスフェートをイソペンテニルホスフェート(IP)に転換する能力を測定する標準的方法（例えば本願に開示する方法）によって評価することができる。
イソペンテニルホスフェートキナーゼ(IPK)ポリペプチドは、イソペンテニルホスフェート(IP)をリン酸化してイソペンテニルジホスフェート(IPP)を生成させる。ポリペプチドがIPKポリペプチド活性を有するか否かは、in vitro, 細胞抽出物中、またはin vivoで、そのポリペプチドのIPをIPPに転換する能力を測定する標準的方法（例えば本願に開示する方法）によって評価することができる。
上記にIDIポリペプチド及び核酸の例を示した。
＜核酸の単離方法の例＞
イソプレンシンターゼDXS, IDI,および／またはMVA経路核酸は標準的方法により単離することができる。対象とする有機体源から所望の核酸(例えば細菌のゲノム）を得る方法は一般的であり、分子生物学の分野で周知である（例えばWO 2004/033646とそこに引用された文献が参照される。これらは本願に参照として組み込まれ、特に核酸を単離する方法が本願に組み込まれる。）
例えば、核酸の配列が公知であれば（例えば本願に開示する公知の核酸）、制限エンドヌクレアーゼ消化により適切なゲノムライブラリを構築して、所望の核酸配列に相補的なプローブを用いてスクリーニングすることができる。所望の配列を単離したら、DNAをポリメラーゼ連鎖反応(PCR) (本願に参照として組み込まれ、特にPCR法が本願に参照として組み込まれるU.S.P 4,683,202参照)等の標準的なプライマーによる増幅方法で 、適切なベクターを用いた形質転換に適したDNAを大量に得ることができる。
あるいは、イソプレンシンターゼDXS, IDI,および／またはMVA経路核酸(例えば公知の核酸配列を備えるイソプレンシンターゼDXS, IDI,および／またはMVA経路核酸）を、標準的な方法を用いて化学的に合成することができる。
本願の組成物及び方法に用いることができる更に別のイソプレンシンターゼDXS, IDI,および／またはMVA経路ポリペプチド及び核酸を、公知の方法で特定することができる。
例えば、天然にイソプレンを産出することが知られている有機体の染色体DNAのコスミドライブラリをE. coli等の有機対中に構築し、次にイソプレン産出についてスクリーニングを行うことができる。特に、コスミドライブラリを構築し、ゲノムDNAの大きなセグメント(35-45 kb)をベクターに組み込み、適切な宿主の形質転換に用いることができる。コスミドベクターは大量のDNAに対応できることが特徴である。
通常コスミドベクターは、非相同DNAの組み込みとその後の環状化に必要なcos DNA配列のコピーを少なくとも1備えている。cos配列に加え、コスミドベクターにはColEI等の複製の起点と、アンピシリンやネオマイシン等に耐性を有する核酸等の薬品耐性マーカーとが含まれる。
コスミドベクターを用いて適切な細菌宿主を形質転換する方法は、特に形質転換方法について本願に参照として組み込まれるSambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor, 1989に記載されている。
通常、コスミドをクローン化する場合、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて非相同DNAを単離し、この非相同DNAを適切なリガーゼを用いてコスミドベクターのcos領域の近傍に結紮する。次に、直線化された非相同DNAを含むコスミドベクターを、バクテリオファージ等のDNAを組み込む媒体と反応させる。組み込みの過程で、cos部位が開裂し非相同DNAが細菌のビールス性粒子の頭部に組み込まれる。これらの粒子を用いてE. coli等の適切な宿主細胞に核酸を導入する。非相同DNAは、細胞に導入された後、cosの粘着性末端の作用により環状化する。このようにして、非相同DNAの大きなセグメントを宿主細胞中に導入して発現させることができる。
イソプレンシンターゼDXS, IDI,および／またはMVA経路核酸を得る別の方法では、メタゲノミックライブラリをアッセイ（本願に開示するヘッドスペースアッセイ）するか、または保存されたアミノ酸の長さ（例えば少なくとも3つの保存されたアミノ酸）をコードするヌクレオチドに対するプライマーを用いたPCRによりスクリーニングする。
保存されたアミノ酸は、公知のイソプレンシンターゼDXS, IDI,および／またはMVA経路ポリペプチドのアミノ酸配列に対しアライメントすることにより特定することができる。イソプレンシンターゼポリペプチドの保存されたアミノ酸は、公知のイソプレンシンターゼポリペプチドのアライメントされた配列に基づき特定することができる。
天然にイソプレンを産出することが分かっている有機体を標準的タンパク質精製法（公知の方法である）で精製し、得られた精製ポリペプチドの配列を標準的方法で求める。この他の方法が文献に記載されている（例えば、特にイソプレン合成に関与する核酸の同定方法に関して本願に参照として組み込まれるJulsing et al, Applied. Microbiol. Biotechnol. 75: 1377-84, 2007; Withers et al, Appl Environ Microbiol. 73(19):6277-83, 2007を参照)。
さらに、別のイソプレンシンターゼDXS, IDI,および／またはMVA経路ポリペプチド及び核酸を、標準的配列アライメントおよび／または構造予測プログラムを用いて、公知のイソプレンシンターゼDXS, IDI,および／またはMVA経路ポリペプチド及び核酸との一次構造および／または予測されるポリペプチドの二次構造の類似性に基づいて特定することもできる。
swissprot-tremblデータベース（ワールドワイドウエブの"expasy.org", Swiss Institute of Bioinformatics Swiss-Prot group CMU - 1 rue Michel Servet CH- 1211 Geneva 4, Switzerland）等の標準データベースを用いてイソプレンシンターゼDXS, IDI,またはMVA経路ポリペプチド及び核酸を特定することもできる。
イソプレンシンターゼDXS, IDI,またはMVA経路ポリペプチドの二次および／または三次構造を、PredictProtein (630 West, 168 Street, BB217, New York, N.Y. 10032, USA)等の標準構造予測プログラムの初期設定を用いて予測することもできる。
または、イソプレンシンターゼDXS, IDI,またはMVA経路ポリペプチドの実際の二次および／または三次構造を、標準的方法を用いて決定することもできる。別のイソプレンシンターゼDXS, IDI,またはMVA経路核酸を、公知のイソプレンシンターゼDXS, IDI,またはMVA経路核酸から調製したプローブとのハイブリッド化によって特定することもできる。
＜プロモータとベクターの例＞
本願のイソプレンシンターゼDXS, IDI,またはMVA経路核酸は、1以上のベクターに含まれていてもよい。すなわち、この発明は本願のイソプレンシンターゼDXS, IDI,またはMVA経路ポリペプチドをコードする1以上の核酸を備えるベクターにも関する。
「ベクター」とは、宿主細胞中で対象とする1以上の核酸を輸送し、望ましくは発現することができる構造体を意味する。ベクターの非限定的例示としてプラスミド、ビールス性ベクター、DNAまたはRNA発現ベクター、コスミド、及びファージベクターが挙げられる。いくつかの実施形態では、ベクターは発現制御配列により制御された核酸を備える。
「発現制御配列」とは対象とする核酸の転写を管理する核酸配列を意味する。発現制御配列は、構成的プロモータまたは誘導プロモータ等のプロモータ、またはエンハンサーであってもよい。「誘導プロモータ」とは、環境的または発生的調整において活性なプロモータである。発現制御配列は、転写される核酸セグメントに作動可能に結合している。
いくつかの実施形態では、ベクターには選択マーカーが含まれている。「選択マーカー」とは、宿主細胞中で発現することができ、導入された核酸またはベクターを含む宿主細胞の選別を容易にする核酸を意味する。選択マーカーの非限定的例示として抗生物質耐性核酸(例えば、カナマイシン、アンピシリン、カルベニシリン,ゲンタマイシン,ハイグロマイシン,フレオマイシン,ブレオマイシン,ネオマイシン,またはクロラムフェニコール)および／または宿主細胞に栄養的利益等の代謝上の利益を付与する核酸が挙げられる。 栄養的選択マーカーの例としてamdS, argB, 及びpyr4として知られているマーカーが挙げられる。トリコデルマ(Trichoderma)の形質転換のベクター系において有用なマーカーが公知である（例えば特に選択マーカーに関して本願に参照として組み込まれるFinkelstein, Chapter 6 in Biotechnology of Filamentous Fungi, Finkelstein et al, Eds. Butterworth-Heinemann, Boston, MA, Chap. 6., 1992; and Kinghorn et al, Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi, Blackie Academic 及び Professional, Chapman and Hall, London, 1992を参照）。
いくつかの実施形態では、選択マーカーは、アセトアミダーゼ酵素をコードして、アセトアミドを窒素源として形質転換された細胞を成長させるamdS核酸である。A. ニジュランス(nidulans)amdSを選択マーカーとして用いた例がKelley et al, EMBO J. 4:475 - 479, 1985 及び Penttila et al, Gene 61 :155-164, 1987に開示されている（本願に参照として組み込まれ、特に選択マーカーに関して本願に参照として組み込まれる）。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼDXS, IDI,またはMVA経路核酸は、選択マーカーを備えない細胞の染色体に組み込まれている。
好ましいベクターは、使用する宿主細胞とコンパチブルなベクターである。好ましいベクターは、例えば細菌、ビールス（例えばバクテリオファージT7またはM-13誘導ファージ等）、コスミド、酵母、または植物から誘導される。このようなベクターを得る方法、及び使用する方法は公知である（例えば特にベクターの使用に関して本願に参照として組み込まれるSambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor, 1989参照）。
プロモータは周知である。宿主細胞中で機能するプロモータであれば、どのようなものでも宿主細胞中のイソプレンシンターゼDXS, IDI,またはMVA経路核酸の発現に用いることができる。
様々な宿主細胞においてイソプレンシンターゼDXS, IDI,またはMVA経路核酸の発現の推進に有用な開始制御領域またはプロモータは多数存在し、当業者に広く知られている（特に対象とする核酸の発現用ベクターに関して本願に参照として組み込まれるWO 2004/033646及びそこに引用された文献参照）。
これらの核酸の発現を推進可能な全てのプロモータが本願に適しており、非限定的例示としてCYCl, HIS3, GALl, GALlO, ADHl, PGK, PHO5, GAPDH, ADCI, TRPl, URA3, LEU2, ENO, 及びTP1 (サッカロミセス属(Saccharomyces)中での発現に有用); AOXl (ピチア属(Pichia)中での発現に有用); 及び lac, trp, λPL, λPR, T7, tac, 及びtrc (E. coli中での発現に有用)が挙げられる。
いくつかの実施形態では、グルコースイソメラーゼプロモータを用いる（例えば、特に対象とするポリペプチドの発現用のプロモータ及びプラスミド系が本願に参照として組み込まれるU.S.P 7,132,527及びそこに引用された文献を参照）。公知のグルコースイソメラーゼプロモータ変異体(U.S.P 7,132,527)を用いて、グルコースイソメラーゼプロモータに作動可能に結合した核酸によりコードされるポリペプチドの発現の程度を変化させることができる。いくつかの実施形態では、グルコースイソメラーゼプロモータは低、中、または高コピープラスミドに含まれている(U.S.P 7,132,527)。
いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼ, DXS, IDI,および／またはMVA経路核酸は、低コピープラスミド(例えば細胞1個当たり1から約4のコピーを保有するプラスミド)、中コピープラスミド(例えば細胞1個当たり約10から約15のコピーを保有するプラスミド)、または高コピープラスミド(例えば細胞1個当たり約50以上のコピーを保有するプラスミド) に含まれている。
いくつかの実施形態では、非相同または追加の内因性イソプレンシンターゼ, DXS, IDI,またはMVA経路核酸がT7プロモータに作動可能に結合している。いくつかの実施形態では、T7プロモータに作動可能に結合した非相同または追加の内因性イソプレンシンターゼ, DXS, IDI,またはMVA経路核酸が、中または高コピープラスミドに含まれている。
いくつかの実施形態では、非相同または追加の内因性イソプレンシンターゼ, DXS, IDI,またはMVA経路核酸がTrcプロモータに作動可能に結合している。いくつかの実施形態では、Trcプロモータに作動可能に結合した非相同または追加の内因性イソプレンシンターゼ, DXS, IDI,またはMVA経路核酸が、中または高コピープラスミドに含まれている。
いくつかの実施形態では、非相同または追加の内因性イソプレンシンターゼ, DXS, IDI,またはMVA経路核酸がLacプロモータに作動可能に結合している。いくつかの実施形態では、Lacプロモータに作動可能に結合した非相同または追加の内因性イソプレンシンターゼ, DXS, IDI,またはMVA経路核酸が、低コピープラスミドに含まれている。
いくつかの実施形態では、非相同または追加の内因性イソプレンシンターゼ, DXS, IDI,またはMVA経路核酸が内因性プロモータに作動可能に結合している。この内因性プロモータは、エシェリキア(Escherichia)属、パントエア属(Pantoea)、バシラス(Bacillus) 属、ヤロウイア(Yarrowia)属、ストレプトミセス属（Streptomyces）、またはトリコデルマ属(Trichoderma)の内因性プロモータ、またはアルカリセリンプロテアーゼや、イソプレンシンターゼ, DXS, IDI,またはMVA経路の内因性プロモータ等である。
いくつかの実施形態では、内因性プロモータに作動可能に結合した非相同または追加の内因性イソプレンシンターゼ, DXS, IDI,またはMVA経路核酸は、高コピープラスミドに含まれている。いくつかの実施形態では、ベクターは細胞中の染色体に組み込まれていない複製型プラスミドである。いくつかの実施形態では、ベクターの一部または全部が細胞中の染色体に組み込まれている。
いくつかの実施形態では、ベクターは菌類の宿主細胞中に導入されたとき宿主細胞ゲノムに組み込まれ、複製される任意のベクターである。このようなベクターのリストとして、Fungal Genetics Stock Center Catalogue of Strains (FGSC、ワールドワイドウエブの "fgsc.net" 及びそこに引用された文献。これらは特にベクターに関して本願に参照として組み込まれる)を参照することができる。さらに別の好適な発現および／または組込みベクターの例が、Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor, 1989, Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al (eds) 1987, Supplement 30, section 7.7.18); van den Hondel et al in Bennett and Lasure (Eds.) に記載されている。
特にベクターに関して、More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press pp. 396-428, 1991; 及びU.S.P 5,874,276を本願に参照として組み込む。特に好ましいベクターとして、pFB6, pBR322, PUC18, pUC100、及びpENTR/Dが挙げられる。
いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼ, DXS, IDI,またはMVA経路核酸は、菌類の宿主細胞中で転写活性を示す適切なプロモータに作動可能に結合している。このようなプロモータは、宿主細胞に対し非相同または内因性のポリペプチドをコードする1以上の核酸に由来する。いくつかの実施形態では、プロモータはトリコデルマ宿主中において有用である。好適なプロモータの非限定的例示としてcbhl, cbh2, egl1, egl2, pepA, hfb1, hfb2, xyn1, 及びamyが挙げられる。
いくつかの実施形態では、プロモータは宿主細胞の天然のプロモータである。例えば、T. リーゼイが宿主の場合、プロモータは天然のT. リーゼイプロモータである。いくつかの実施形態では、プロモータは誘導プロモータのT.リーゼイcbh1である。T.リーゼイcbh1はGenBankに登録番号D86235で寄託されており、特にプロモータに関して本願に参照として組み込まれる
いくつかの実施形態では、プロモータは宿主細胞に対し非相同のプロモータである。
別の有用なプロモータの例には、アスペルギルス・アワモリ(awamori)及びアスペルギルス・ニガー・グルコアミラーゼ(glaA) (特にプロモータに関して本願に参照として組み込まれるNunberg et al. , Mol. Cell Biol. 4:2306-2315, 1984 及び Boel et al. , EMBO J. 3 : 1581 - 1585, 1984参照)；アスペルギルス・ニガー・アルファアミラーゼ、アスペルギルス・オリザエ(oryzae) TAKAアミラーゼ、T. リーゼxln1、及びT. リーゼイ・セロビオヒドロラーゼ1 (特にプロモータに関して本願に参照として組み込まれるEP 137280参照) 等の遺伝子由来のプロモータが含まれる。
いくつかの実施形態では、発現ベクターは終止配列を備える。終止制御領域は、宿主細胞中の種々の天然遺伝子に由来する。いくつかの実施形態では、終止配列とプロモータ配列は同一起源に由来する。別の実施形態では、終止配列は宿主細胞に対し内因性である。
特に好適な終止配列はトリコデルマ株(例えばT. リーゼイ)由来のcbh1である。別の有用な菌類のターミネータには、A.ニガーまたはA.アワモリ グルコアミラーゼの核酸(特に菌類のターミネータに関して本願に参照として組み込まれるNunberg et al, Mol. Cell Biol. 4:2306-2315, 1984 及び Boel et al, EMBO J. 3:1581-1585, 1984 参照)由来のターミネータが含まれる。あるいは、ターミネータ部位が含まれていてもよい。
ポリペプチドを十分発現させるために、ポリペプチドをコードするDNAを、開始コドンを介して選択した発現制御領域に作動可能に結合し、適切なメッセンジャーRNAを発現させる。
いくつかの実施形態では、プロモータ、コード、領域、及びターミネータの全てが、発現させるイソプレンシンターゼ, DXS, IDI,またはMVA経路核酸を起源とする。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼ, DXS, IDI,またはMVA経路核酸のコード領域を、発現構築プロモータと終止配列の転写制御下におかれるようにして汎用発現ベクターに挿入する。いくつかの実施形態では、遺伝子の一部または全部を強cbh1プロモータの下流側に挿入する。
イソプレンシンターゼ, DXS, IDI,またはMVA経路核酸を、標準的方法 (特に適切なDNA配列のスクリーニング及びベクターの構築に関して本願に参照として組み込まれるSambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982参照) を用いて発現ベクター等のベクター中に組み込む。
対象とする核酸 (例えばイソプレンシンターゼ, DXS, IDI,またはMVA経路核酸), プロモータ, ターミネータ, 及び多の配列を備えるDNA 構築体を結紮する方法、及びこれらを適切なベクター中に挿入する方法は周知である。
例えば制限酵素を用いて、イソプレンシンターゼ, DXS, IDI,またはMVA経路核酸、及びベクターを切り取ることができる。次に、切り取ったイソプレンシンターゼ, DXS, IDI,またはMVA経路核酸と、切り取ったベクターのコンパチブルな末端同士を結紮する。通常、結合は適切な制限酵素認識部位を結紮することにより行う。このような部位が存在しない場合は、公知の方法に従って合成オリゴヌクレオチドリンカーを用いる(特にオリゴヌクレオチドリンカーに関して本願に参照として組み込まれるSambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor, 1989, 及び Bennett and Lasure, More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, San Diego, pp 70-76, 1991参照)。
また、公知の方法によりベクターを構築することができる (例えばInvitrogen Life Technologies社の Gateway Technology) 。
いくつかの実施形態では、現在天然細胞中で見られるよりもはるかに高いレベルでイソプレンシンターゼ, DXS, IDI,またはMVA経路核酸を過剰発現させることが好ましい。これは、これらのポリペプチドをコードする核酸をマルチコピープラスミド中に選択的にクローン化するか、これらの核酸を強誘導プロモータまたは構築プロモータの下に置くことにより達成できる。
所望のポリペプチドを過剰発現させる方法は分子生物学の分野において周知であり、その例が、特にクローン化技術に関して本願に参照として組み込まれるSambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor, 1989に記載されている。
次の文献に、この発明に関して有用な一般的手法がさらに記載されている。Kreigler, Gene Transfer and Expression; A Laboratory Manual, 1990、及びAusubel et al, Eds. Current Protocols in Molecular Biology, 1994。これらの文献は、特に分子生物学及びクローン化技術に関して本願に参照として組み込まれる。
＜有機体源の例＞
イソプレンシンターゼ, DXS, IDI,またはMVA経路核酸 (及びこれによりコードされたポリペプチド) は、天然のイソプレンシンターゼ、 DXS、 IDI、及び／またはMVA経路核酸を含む有機体から得ることができる。
上記のように、イソプレンは細菌、酵母、植物、及び動物等の様々な有機体により天然に産出されている。有機体は、イソプレンを産出するためのMVA経路、 DXP経路、またはMVA及びDXP経路の双方を備える（図19）。
DXS核酸は、例えばDXP経路、またはMVA及びDXP経路の双方を備える有機体から得ることができる。
IDI及びイソプレンシンターゼ核酸は、例えばMVA経路、 DXP経路、またはMVA及びDXP経路の双方を備える有機体から得ることができる。
MVA経路核酸は、例えばMVA経路、またはMVA及びDXP経路の双方を備える有機体から得ることができる。
いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼ, DXS, IDI,またはMVA経路核酸の核酸配列は、以下の天然有機体から産出される核酸配列と同様である。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼ, DXS, IDI,またはMVA経路ポリペプチドのアミノ酸配列は、以下の天然有機体から産出されるポリペプチドの配列と同様である。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼ, DXS, IDI,またはMVA経路核酸またはポリペプチドは、本願に開示する有機体に由来する核酸変異体またはポリペプチド変異体である。
「に由来する」とは、１以上の実施形態ではの突然変異が導入された核酸またはポリペプチドの起源を意味する。例えば、「植物ポリペプチドに由来する」ポリペプチドとは、対象とするポリペプチドが野生型 (すなわち、天然の配列) 植物ポリペプチドに1以上の突然変異を導入して得られたことを意味する。
いくつかの実施形態では、起源となる有機体の例は、A. オリザエ及びA. ニガー等のアスペルギルス属の種、サッカロミセス・セレビシアエ (cerevisiae) 等のサッカロミセス属の種、シゾサッカロミセス・ポンベ (pombe) 等のシゾサッカロミセス (Schizosaccharomyces) 属の種、及びT. リーゼイ等のトリコデルマ属の種である。いくつかの実施形態では、起源となる有機体は繊維状菌類の細胞である。
「繊維状菌類」とは、ユーマイコチナ(Eumycotina) (Alexopoulos, C. J. (1962), Introductory Mycology, Wiley, New York参照) の下位区分の、全ての糸状のものを意味する。これらの糸状菌は、キチン、セルロース、及び他の複合ポリサッカライドから成る植物性菌糸体を供えることを特徴とする。繊維状糸状菌は、形態学的、生理学的、及び遺伝的に酵母とは異なる。繊維状糸状菌の植物的成長は分岐菌糸の伸長により、炭素異化は好気的である。
繊維状糸状菌の親細胞の非限定的例示として、トリコデルマ (例えばトリコデルマ・リーゼイ、以前はT. ロンジブラチアタム(longibrachiatum) として分類されていた無性形態のヒポクレア・ジュコリナ (Hypocrea jecorina)、トリコデルマ・ビリデ (Trichoderma viride)、トリコデルマ・コニンギー(Trichoderma koningii)、トリコデルマ・ハージアナム (Trichoderma harzianum) (Sheir-Neirs et al., Appl. Microbiol. Biotechnol 20: 46-53, 1984; ATCC No. 56765及び ATCC No. 26921)；ペニシリウム属、フミコーラ属 (例えばH.インソレンス(insolens)、H.ラヌギノス(lanuginose)、またはH. グリセア(grisea))；クリソスポリウム属 (Chrysosporium) (例えばC. ラクノウエンス (lucknowense))、グリオクラディウム属 (Gliocladium)、 アスペルギルス属 (例えばA. オリザエ, A. ニガー, A ソジャエ(sojae), A.ジャポニカス(japonicus), A. ニジュランス (nidulans), または A. アワモリ) (Ward et al, Appl. Microbiol. Biotechnol. 39: 7380743, 1993 及び Goedegebuur et al, Genet 41: 89-98, 2002)、フザリウム(Fusarium)属 (例えばF. ロゼウム(roseum), F. グラミナム(graminum), F. セレアリス(cerealis), F. オキスポルイム(oxysporuim), またはF. ベネナタム(venenatum))、ニューロスポラ属(Neurospora) (例えばN. クラッサ(crassa)), ヒポクレア属、 ムコール属(Mucor) (例えばM. ミエヘイ(miehe))、 リゾパス属(Rhizopus)、及びエメリセラ属(Emericella) (Innis et al, Sci. 228: 21-26, 1985参照) 等が挙げられる。
「トリコデルマ」または「トリコデルマ属」または「トリコデルマ種」というときは、過去または現在においてトリコデルマに分類されている菌類を意味する。
いくつかの実施形態では、菌類はA.ニジュランス、A.アワモリ、A.オリザエ、A.アクレアタス(aculeatus)、 A.ニガー、A.ジャポニカス、T.リーゼイ、T.ビリデ、F.オキシスポラム、またはF.ソラニ(solani)のいずれかである。アスペルギルス株は、特に菌類に関して本願に参照として組み込まれるWard et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 39:738-743, 1993及びGoedegebuur et al., Curr Gene 41 :89-98, 2002に開示されている。
特定の実施形態では、菌類はT.リーゼイ等のトリコデルマ株である。T.リーゼイ株は公知であり、非限定的例示としてATCC No. 13631, ATCC No. 26921, ATCC No. 56764, ATCC No. 56765, ATCC No. 56767, 及びNRRL 15709が挙げられる。これらは、特にT.リーゼイ株に関して本願に参照として組み込まれる。いくつかの実施形態では、宿主株はRL-P37の誘導体である。RL-P37は、特にT.リーゼイ株に関して本願に参照として組み込まれるSheir-Neiss et al., Appl. Microbiol. Biotechnology 20:46-53, 1984に開示されている。
いくつかの実施形態では、有機体の起源は、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、ピチア属、またはカンジダ属等の酵母である。
いくつかの実施形態では、有機体の起源は、B.リケニフォルミスまたはB.スブチリス等のバシラス株、P. シトレア等のパントエア (Pantoea)株、P. アルカリゲンス(alcaligenes) 等のシュードモナス (Pseudomonas) 株、S.アルバス(albus), S.リビダンス (lividans), またはS.ルビジノサス (rubiginosus)等のストレプトミセス (Streptomyces) 株、またはE. coli等のエシェリキア株等の細菌である。
「バシラス属」には、当業者に知られている全ての「バシラス」属の種が含まれ、非限定的例示としてB. スブチリス、バシラス・リケニホルミスLicheniformis)、B. レンタス(lentus)、B.ブレビス (brevis)、B. ステアロサーモフィラス (stearothermophilus)、B.アルカロフィラス (alkalophilus)、B. アミロリケファシエンス (amyloliquefaciens)、B.クラウシー (clausii)、B.ハロヂュランス (halodurans)、B.メガテリウム (megaterium)、B.コーギュランス (coagulans)、B.サーキュランス (circulans)、B.ロータス (lautus)、及び B.チューリンゲンシス (thuringiensis)が挙げられる。
バシラス属に関して、分類学上の見直しが引き続いて行われている。したがって、本願のバシラス属には、現在は「ゲオバシラス・ステアロサーモフィラス」と呼ばれているB. ステアロサーモフィラス等の、再分類された有機体も含まれる。酸素の存在下で耐性内生胞子を産出することがバシラス属の特徴と考えられるが、このような特徴は最近アリシクロバシラス(Alicyclobacillus), アンフィバシラス(Amphibacillus), アニューリニバシラス(Aneurinibacillus), アノキシバシラス(Anoxybacillus), ブレビバシラス (Brevibacillus), フィロバシラス(Filobacillus), グラシリバシラス(Gracilibacillus), ハロバシラス(Halobacillus), パエニバシラス(Paenibacillus), サリバシラス(Salibacillus), サーモバシラス(Thermobacillus), ウレイバシラス(Ureibacillus), 及びバージバシラス (Virgibacillus)と命名されたものにも当てはまる。
いくつかの実施形態では、有機体の起源はグラム陽性細菌である。非限定的例示として、ストレプトミセス株 (例えばS.アルバス, S.リビダンス, S.コエリカラー(coelicolor),またはS.グリセウス(griseus))、及びバシラスが挙げられる。
いくつかの実施形態では、有機体の起源はE. coliまたはシュードモナス属等のグラム陰性細菌である。
いくつかの実施形態では、有機体の起源はマメ亜科等のマメ科由来の植物等の植物である。いくつかの実施形態では、有機体の起源はクズ、ポプラ(例えばポプラ・アルバ×ポプラ・トレムラCAC35696またはポプラ・アルバ) (Sasaki et al, FEBS Letters 579(11): 2514-2518, 2005)、アスペン(例えばポプラ・トレムロイデス)、またはヨーロッパナラ等である。
いくつかの実施形態では、有機体の起源は緑藻類、紅藻類、灰色藻類(glaucophytes)、クロララクニオン藻(chlorarachniophytes)、ユーグレナ(euglenids)、クロミスタ(chromista)、または渦鞭毛藻(dinoflagellates)等の藻類である。
いくつかの実施形態では、有機体の起源は形態に基づき以下に分類されるシアノバクテリアである：クロオコッカス目(Chroococcales)、プレウロカプサ目(Pleurocapsales)、ユレモ目(Oscillatoriales)、ネンジュモ目(Nostocales)、スティゴネマ目(Stigonematales)。
本願の方法により、種々の宿主細胞を用いてイソプレンシンターゼ, DXS, IDI,および／またはMVA経路ポリペプチドを発現させてイソプレンを産出させることができる。宿主細胞の例には前記の「有機体源の例」に示した有機体が含まれる。宿主細胞は、天然にイソプレンを産出するか、または天然にイソプレンを産出しない細胞である。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は天然でDXP経路によりイソプレンを産出し、イソプレンシンターゼ、 DXS、 IDI、および／またはMVA経路核酸を追加することにより、DXP経路によるイソプレン産出が強化される。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は天然でMVA経路によりイソプレンを産出し、イソプレンシンターゼ、 DXS、 IDI、および／またはMVA経路核酸を追加することにより、MVA経路によるイソプレン産出が強化される。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は天然でDXP経路によりイソプレンを産出し、イソプレンシンターゼ、 DXS、 IDI、および／またはMVA経路核酸を追加することにより、MVA経路及びDXP経路の一部または全部を用いることによってもイソプレンが産出される。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は天然でDXP経路及びMVA経路によりイソプレンを産出し、イソプレンシンターゼ、 DXS、 IDI、および／またはMVA経路核酸を追加することにより、DXP経路及びMVA経路のいずれか一方または両方によるイソプレン産出が強化される。
＜形質転換方法の例＞
標準的方法により、イソプレンシンターゼ, DXS, IDI,および／またはMVA経路核酸、あるいはこれらを含むベクターを宿主細胞(例えば本願に開示する植物性細胞、菌類細胞、酵母細胞、または細菌細胞) 中に挿入し、コードされたイソプレンシンターゼ, DXS, IDI,および／またはMVA経路ポリペプチドを発現させることができる。
宿主細胞へのDNA構築体又はベクターの導入方法として、形質転換、エレクトロポレーション、核酸のマイクロインジェクション、形質導入、トランスフェクション(例えばリポフェクション仲介、DEAE−デキストリン仲介トランスフェクションまたは組み換えファージビールスを用いたトランスフェクション)、リン酸カルシウムDNA沈殿によるインキュベーション、DNAで被覆したマイクロプロジェクタイルを用いた高速遺伝子銃、及びプロトプラスト融合が挙げられる。
一般的な形質転換技術は公知である。（例えばCurrent Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al. (eds) Chapter 9, 1987; Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor, 1989; 及び Campbell et al, Curr. Genet. 16:53-56, 1989,参照。これらの文献は、特に形質転換の方法に関して本願に参照として組み込まれる。）
トリコデルマ中での非相同ポリペプチドの発現が、U.S.P 6,022,725; U.S.P 6,268,328; U.S.P 7,262,041 ;WO 2005/001036; Harkki et al; Enzyme Microb. Technol. 13:227-233, 1991; Harkki et al, Bio Technol. 7:596-603, 1989; EP 244,234; EP 215,594; 及び Nevalainen et al. , "The Molecular Biology of Trichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous and Heterologous Genes " in Molecular Industrial Mycology, Eds. Leong and Berka, Marcel Dekker Inc., NY pp. 129 - 148, 1992に記載されている。これらの文献は、特に形質転換及び発現方法に関して本願に参照として組み込まれる。
また、アスペルギルス株の形質転換に関しては、Cao et al, (Sci. 9:991-1001, 2000; EP 238023; and Yelton et al, Proceedings. Natl. Acad. Sci. USA 81:1470-1474, 1984 が参照される。この文献は特に形質転換の方法に関して本願に参照として組み込まれる。
導入された核酸は染色体DNA中に組み込むか、または染色体外の複製用配列として保管する。
形質転換細胞は、公知の方法により選別することができる。非限定的例示として、amdSマーカーを含む安定な形質転換細胞は、アセトアミドを含む固形状培地において成長速度が速いこと、及び形成されたコロニーの輪郭形状がギザギザではなくきれいな円形であることにより、不安定な形質転換細胞から区別することができる。
あるいは、形質転換細胞を固形状の非選択的培地（例えばアセトアミドを含まない培地）で培養し、この培地から胞子を回収し、次にアセトアミドを含む選択的固形状培地において発芽し成長する胞子のパーセンテージを測定することにより安定性試験を行なう場合がある。
いくつかの実施形態では、菌類細胞をプロトプラスト形成及びプロトプラストの形質転換を含む方法により形質転換し、次に公知の方法で細胞壁を再生する。特定の実施形態では、形質転換用のトリコデルマ属の調製において、菌の菌糸体 (特に形質転換方法に関して本願に参照として組み込まれるCampbell et al, Curr. Genet. 16:53-56, 1989,参照) からプロトプラストを調製する。
いくつかの実施形態では、菌糸体を成長した植物性胞子から得る。菌糸体を、細胞壁を消化する酵素で処理することによりプロトプラストを得ることができる。次に懸濁媒体中のプロトプラストを、浸透圧安定剤により保護する。浸透圧安定剤はソルビトール、マンニトール、塩化カリウム、硫酸マグネシウム等を含有する。浸透圧安定剤の濃度は0.8 Mから1.2 Mの間である。懸濁媒体中のソルビトールが約1.2Mの溶液を用いることが好ましい。
宿主トリコデルマ属株中へのDNAの取込は、カルシウムイオン濃度に依存する。通常、取り込み溶液には約10mMのCaCl2及び50mMのCaCl2が用いられる。取り込み溶液にはカルシウムイオンの他に、TE 緩衝液 (10Mm Tris, pH7.4; 1mM EDTA) または10mM MOPS, pH6.0 緩衝液 (モルフォリンプロパンスルホン酸) 及びポリエチレングリコール (PEG)などの成分が通常含まれる。理論により限定することは意図しないが、ポリエチレングリコールが細胞膜を溶解させることにより、媒体の成分をトリコデルマ属株の細胞質中へ浸入させ、プラスミドDNAを核に移動させることができる。この溶解により、宿主染色体中へ多数のプラスミドDNAのコピーを組み込むことができる。
通常、形質転換には、トリコデルマ属プロトプラスト、または濃度105から107/mL (例えば2×106/mL)において浸透性処理された細胞を含む懸濁液が用いられる。これらのプロトプラストまたは細胞を含む適切な溶液（例えば1.2Mソルビトール及び50mM CaCl2）100μLを所望のDNAと混合する。通常、高濃度のPEGを取込溶液に添加する。0.1から1容積の25% PEG 4000をプロトプラスト懸濁液に添加することができる。いくつかの実施形態では、約0.25容積をプロトプラスト懸濁液に添加する。ジメチルスルホキシド、ヘパリン、スペルミジン、塩化カリウム等の添加剤を取込溶液に添加して、形質転換を補助することもできる。同様の方法を他の菌類宿主細胞に適用することもできる(特に形質転換方法に関して本願に参照として組み込まれるU.S.P 6,022,725 及び 6,268,328参照)。
通常、この混合物を約0℃において10から30分間培養する。所望の核酸配列の取り込みを促進するために、混合物にさらにPEGwp添加する。通常、形質転換混合物の容積の5から15倍の量の25% PEG 4000を添加する。しかし、これより多い量、または少ない量であってもよい。好ましくは、形質転換混合物の容積の約10倍の量の25% PEG 4000を添加する。PEGを添加した後、形質転換混合物を室温または氷上で培養し、次にソルビトール及びCaCl2溶液を添加する。次に、プロトプラスト懸濁液を成長培地の溶融アリコート(aliquot)に添加する。培地に成長選択剤（例えばアセトアミドまたは抗生物質）が含まれているとき、形質転換細胞のみが成長する。
細菌細胞の形質転換は、特に形質転換方法に関して本願に参照として組み込まれるSambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982に記載された方法等の、公知の方法に従って行うことができる。
＜細胞培養培地の例＞
この発明は、イソプレンを産出する培養物中の細胞または細胞の集団にも関する。「培養物中の細胞」とは、細胞が1以上の細胞分裂することを可能にする溶液中（例えば細胞培地）にある2以上の細胞を意味する。「培養物中の細胞」には、植物組織に分化した細胞を含む生きた多細胞植物の一部である植物細胞は含まれない。いくつかの実施形態では、培養された細胞には少なくとも約10, 20, 50, 100, 200, 500, 1,000, 5,000, 10,000またはそれ以上の細胞が含まれる。
宿主細胞の培養には任意の炭素源を用いることができる。「炭素源」とは、1以上の炭素を含む化合物であって、宿主細胞または有機体によって代謝される化合物を意味する。例えば、宿主細胞を培養する細胞培地には、宿主細胞の生存能力または成長を維持することができる炭素源が含まれている。
いくつかの実施形態では、炭素源は炭水化物 (例えばモノサッカライド、ジサッカライド、オリゴサッカライド、またはポリサッカライド)、転化糖 (例えば酵素処理されたサッカロースシロップ)、グリセロール、グリセリン (例えばバイオディーゼル油またはセッケン製造工程の副産物のグリセリン)、ジヒドロキシアセトン、1-炭素源、オイル (例えばコーン油、パーム油、大豆油等の植物または野菜のオイル)、アセテート、動物油脂、動物オイル、脂肪酸(例えば飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、またはポリ不飽和脂肪酸)、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセライド、ジグリセライド、トリグリセライド、ポリペプチド (例えば微生物製または植物性タンパク質またはペプチド)、再生可能な炭素源(例えば加水分解されたバイオマス炭素源等のバイオマス炭素源)、酵母エキス、酵母エキスの成分、ポリマー、酸、アルコール、アルデヒド、ケトン、アミノ酸、コハク酸エステル、乳酸塩、アセテート、エタノール、またはこれらの2以上の組合せ等である。
いくつかの実施形態では、炭素源は光合成の生成物であり、例えばグルコースであるが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、炭素源はキシロースまたはグルコースである。
モノサッカライドの例にはグルコースとフルクトースが含まれる。オリゴサッカライドの例にはラクトースとサッカロースが含まれる。ポリサッカライドの例には澱粉とセルロースが含まれる。炭水化物の例にはC6糖(例えばフルクトース、マンノース、ガラクトース、またはグルコース)及びC5糖(例えばキシロースまたはアラビノース)が含まれる。
いくつかの実施形態では、細胞培地には炭水化物と炭水化物以外の炭素源(例えばグリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、1-炭素源、オイル、動物油脂、動物オイル、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセライド、ジグリセライド、トリグリセライド、再生可能な炭素源、または酵母エキスの成分)とが含まれる。
いくつかの実施形態では、細胞培地には炭水化物と、ポリペプチド(例えば細菌性または植物性タンパク質またはペプチド)とが含まれる。いくつかの実施形態では、細菌性ポリペプチドは、酵母または細菌由来のポリペプチドである。いくつかの実施形態では、植物性ポリペプチドは、大豆、コーン、キャンーラ、ジャトロファ、パーム、ピーナッツ、ヒマワリ、ココナッツ、マスタード、菜種、綿実、パーム核油、オリーブ、紅花、ゴマ、または亜麻仁由来のポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、炭水化物の濃度は、ブロス1リットルについて少なくとも約5グラム(g/L, ここでブロスの容積には細胞の容積及び細胞培地の容積が含まれる) であり、例えば少なくとも約10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 300, 400g/L以上、またはこれら以上である。いくつかの実施形態では、炭水化物の濃度は約50から約400g/L、例えば約100から約360g/L、約120から約360g/L、約200から約300g/Lである。いくつかの実施形態では、この炭水化物の濃度は、宿主細胞の培養の前および／または途中に添加した炭水化物の総量に基づく濃度である。
脂質の例は、C4以上の飽和、不飽和、または分岐脂肪酸を1以上含む物質である。
オイルの例は、室温で液体の脂質である。いくつかの実施形態では、脂質にはC4以上の脂肪酸(例えば4以上の炭素から成る飽和、不飽和、または分岐脂肪酸の1以上)が1以上含まれる。いくつかの実施形態では、オイルは大豆、コーン、キャンーラ、ジャトロファ、パーム、ピーナッツ、ヒマワリ、ココナッツ、マスタード、菜種、綿実、パーム核油、オリーブ、紅花、ゴマ、亜麻仁、油性微生物細胞、ナンキンハゼまたはこれらの2以上の組み合わせから成る。
脂肪酸の例には、式RCOOHであらわされる化合物が含まれ、ここで「R」は炭化水素である。不飽和脂肪酸の例には、「R」に少なくとも1の炭素−炭素二重結合を有する化合物が含まれる。不飽和脂肪酸の非限定的例示としてオレイン酸、バクセン酸、リノール酸、パルミテライジン酸、及びアラキドン酸が挙げられる。多価不飽和脂肪酸の例には、「R」に複数の炭素−炭素二重結合を有する化合物が含まれる。飽和脂肪酸の例には、「R」が飽和脂肪族基である化合物が含まれる。
いくつかの実施形態では、炭素源には1以上のC2からC22の脂肪酸が含まれ、例えばC12脂肪酸、C14脂肪酸、C16脂肪酸、C18脂肪酸、C20脂肪酸、C22脂肪酸が含まれる。1つの実施形態では、脂肪酸はパルミチン酸である。
いくつかの実施形態では、炭素源は脂肪酸 (例えば不飽和脂肪酸) の塩 (例えば不飽和脂肪酸)、脂肪酸 (例えば不飽和脂肪酸) の誘導体、または脂肪酸 (例えば不飽和脂肪酸) の誘導体の塩である。好ましい塩の非限定的例示として、リチウム塩、カリウム塩、及びナトリウム塩等が挙げられる。ジ−及びトリ−グリセロールは、グリセロールの脂肪酸エステルである。
いくつかの実施形態では、脂質、オイル、油脂、脂肪酸、モノグリセライド、ジグリセライド、またはトリグリセライドの濃度はブロス1リットル当り少なくとも1グラム(g/L, ここでブロスの容積には細胞の容積及び細胞培地の容積が含まれる) であり、例えば少なくとも約5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 300, 400g/L以上、またはこれら以上である。
いくつかの実施形態では、脂質、オイル、油脂、脂肪酸、モノグリセライド、ジグリセライド、またはトリグリセライドの濃度は約10から約400g/Lであり、例えば約25から約300g/L、約60から約180g/L、または約75から約150g/Lである。いくつかの実施形態では、この濃度は、宿主細胞の培養の前および／または途中に添加した脂質、オイル、油脂、脂肪酸、モノグリセライド、ジグリセライド、またはトリグリセライドの総量に基づく濃度である。
いくつかの実施形態では、炭素源には(i)脂質、オイル、油脂、脂肪酸、モノグリセライド、ジグリセライド、またはトリグリセライド、及び(ii)グルコース等の炭水化物が含まれる。
いくつかの実施形態では、脂質、オイル、油脂、脂肪酸、モノグリセライド、ジグリセライド、またはトリグリセライドと炭水化物との比率は炭素を基準として（すなわち、脂質、オイル、油脂、脂肪酸、モノグリセライド、ジグリセライド、またはトリグリセライド中の炭素1個に対する炭水化物中の炭素の数）約1:1である。特定の実施形態では、脂質、オイル、油脂、脂肪酸、モノグリセライド、ジグリセライド、またはトリグリセライドの量は約60から180g/Lで、炭水化物の量は約120から360 g/Lである。
微生物ポリペプチド炭素源の例には、酵母または細菌由来のポリペプチドの1以上が含まれる。植物性ポリペプチド炭素源の例には、大豆、コーン、キャンーラ、ジャトロファ、パーム、ピーナッツ、ヒマワリ、ココナッツ、マスタード、菜種、綿実、パーム核油、オリーブ、紅花、ゴマ、または亜麻仁由来のポリペプチドの1以上が含まれる。
再生可能な炭素源の例には、チーズホエーパーミエイト(cheese whey permeate)、コーンスティープリカー(cornsteep liquor)、シュガービートモラス(sugar beet molasse)、大麦モルト、及びこれらに由来する成分が含まれる。また再生可能な炭素源の例には、バイオマス中のアセテート, グルコース, ヘキソース, ペントース、及びキシロース、例えばコーン、スイッチグラス、サトウキビ、発酵プロセスにおける廃細胞、及び大豆、コーン、または小麦製粉時のタンパク質副産物が含まれる。
いくつかの実施形態では、バイオマス炭素源はリノグリセロール系、ヘミグリセロール系、またはセロール系の基質であり、その非限定的例示として草、小麦、麦わら、 バガス、サトウキビバガス、軟質木材パルプ、コーン、コーン穂軸または皮、コーン穀粒、コーン穀粒繊維、コーン茎葉、スイッチグラス、籾殻、または穀物(例えばコーン、ソルガム、ライ麦、トリティケイト(triticate)、大麦、小麦、および／または蒸留酒穀物残渣)の湿式または乾式製粉における副産物が挙げられる。
セルロース系基質の例には、木、紙、及びパルプの廃材、葉状植物、及び果肉が含まれる。いくつかの実施形態では、炭素源には柄、穀粒、根、塊茎等の植物の一部分が含まれる。
いくつかの実施形態では、次の植物の一部または全部を炭素源として用いる。コーン, 小麦, ライ麦, ソルガム, トリティケイト, コメ, アワ, 大麦, キャッサバ, エンドウマメ等のマメ科植物, ジャガイモ, サツマイモ, バナナ, サトウキビおよび／またはタピオカ。
いくつかの実施形態では、炭素源はバイオマス加水分解物であり、例えばキシロースとグルコースの両者を含むバイオマス加水分解物、またはサッカロースとグルコースの両者を含むバイオマス加水分解物である。
いくつかの実施形態では、再生可能な炭素源 (例えばバイオマス)を細胞培地に添加する前に前処理する。いくつかの実施形態では、前処理には酵素的前処理、化学的前処理、及び酵素的前処理と化学的前処理の組み合わせ (例えば、特に再生可能な炭素源の前処理に関して本願に参照として組み込まれるFarzaneh et al, Bioresource Technology 96 (18): 2014-2018, 2005; U.S.P 6,176,176; U.S.P 6,106,888参照)が含まれる。
いくつかの実施形態では、再生可能な炭素源を細胞培地に添加する前に、その全部または一部を加水分解する。
いくつかの実施形態では、再生可能な炭素源（例えばコーン茎葉）を細胞培地に添加する前に、アンモニア繊維膨潤(AFEX)前処理する（例えばFarzaneh et al, Bioresource Technology 96 (18): 2014-2018, 2005参照）。AFEX前処理の間、再生可能な炭素源を、液状無水アンモニアにより中程度の温度（例えば約60から約100℃）において高圧（例えば約250から約300psi）で約5分間処理する。次に、圧力を急激に下げる。
このプロセスでは、リグニン可溶化、ヘミセルロース加水分解、セルロース非結晶化、及び表面積増加等の化学的及び物理的効果の組み合わせにより、セルロースとヘミセルロースを酵素転換してほぼ完全に発酵性糖へ転換することができる。AFEX前処理ではアンモニアのほぼ全量を回収して再使用することができるとともに、残量を下流側プロセス中の細菌の窒素源として用いることができる。また、AFEX前処理では洗浄ストリームは不要である。AFEX処理後の乾燥物質の回収率は実質的に100%である。基本的にAFEXは乾燥状態から乾燥状態へのプロセスである。
処理された再生可能な炭素源は長期間安定であり、酵素加水分解または発酵プロセスへ高固形成分率で供給することができる。AFEX処理中、ヘミセルロース及びセルロースは殆ど分解せず、十分保存される。AFEX前処理した再生可能な炭素源は、酵素加水分解する前に中和する必要は無い。AFEX処理炭素源を酵素加水分解することにより、次の発酵工程で使用するための清浄な糖ストリームを製造することができる。
いくつかの実施形態では、炭素源（例えば再生可能な炭素源）の濃度は、少なくとも約0.1, 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, または50%グルコース(w/v) に等しい量である。グルコースに等しい量は、標準的HPLC法においてグルコースを参照として用いて、炭素源から生成するグルコースの量を測定することにより求めることができる。
いくつかの実施形態では、炭素源（例えば再生可能な炭素源）の濃度は、約0.1から約20%グルコースであり、例えば約0.1から約10%グルコース、約0.5から約10%グルコース、約1から約10%グルコース、約1から約5%グルコース、または約1から約2%グルコースである。
いくつかの実施形態では、炭素源には酵母エキス、または酵母エキスの1以上の成分が含まれる。いくつかの実施形態では、酵母エキスの濃度は、ブロス1リットル当り少なくとも1グラム（g/L、ここでブロスの容積には細胞及び細胞培地の容積が含まれる）であり、例えば少なくとも約5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 300g/Lまたはそれ以上である。
いくつかの実施形態では、酵母エキスの濃度は、ブロス1リットル当り約1から約300g/L、例えば約1から約200g/L、約5から約200g/L、約5から約100g/L、約5から約60g/Lである。いくつかの実施形態では、酵母エキスの濃度は、宿主細胞の培養の前および／または途中に添加した酵母エキスの総量に基づく濃度である。
いくつかの実施形態では、炭素源には酵母エキス（またはその成分の1以上）と、グルコース等の他の炭素源との両者が含まれる。いくつかの実施形態では、酵母エキスと他の炭素源の比率は約1 :5、約1 : 10、または約1 :20 (w/w)である。
あるいは、炭素源は二酸化炭素やメタノール等の1炭素基質でもよい。メチロトローフ酵母 (特に炭素源に関して本願に参照として組み込まれるYamada et al, Agric. Biol. Chem., 53(2) 541-543, 1989参照) や細菌 (特に炭素源に関して本願に参照として組み込まれるHunter et al, Biochemistry, 24, 4148-4155, 1985参照) により、1炭素基質 (例えばメタノール、ホルムアルデヒド、またはギ酸塩) からグリセロールが産出されることが報告されている。
これらの有機体はメタンからギ酸塩の範囲の酸化状態にある1炭素基質を取り込んでグリセロールを産出することができる。炭素の取り込み経路は、リブロースモノホスフェート経由の経路、セリン経由の経路、またはキシロースモノホスフェート経由の経路(特に炭素源に関して本願に参照として組み込まれるGottschalk, Bacterial Metabolism, Second Edition, Springer-Verlag: New York, 1986参照)のいずれかである。
リブロースモノホスフェート経路では、リブロース-5-ホスフェートによりギ酸塩が縮合されてフルクトースと成る炭素数6の糖が形成され、最終的に炭素数3のグリセルアルデヒド-3-ホスフェートとなる。またセリン経路では、1炭素基質をメチレンテトラヒドロフォレートを経由して糖分解経路に取り込む。
炭素数が1または2の基質の他に、メチロトローフ有機体は、例えばメチルアミン、グルコースアミン、及び代謝活性に関与する種々のアミノ酸等、様々な種類の炭素含有化合物を利用することが知られている。
例えばメチロトローフ酵母はメチルアミンの炭素からトレハロースまたはグリセロールを形成することが知られている(例えば特に炭素源に関して本願に参照として組み込まれるBellion et al, Microb. Growth Cl Compd, [Int. Symp.], 7th ed., 415-32. Editors: Murrell et al, Publisher: Intercept, Andover, UK, 1993参照)。また、種々のカンジダ(Candida)属の種がアラニンまたはオレイン酸を代謝する（特に炭素源に関して本願に参照として組み込まれるSulter et al, Arch. Microbiol. 153(5), 485-9, 1990）。
いくつかの実施形態では、細胞を生理食塩水と栄養源を含む標準的培地で培養する（例えば、特に細胞培地に関して本願に参照として組み込まれるPourquie, J. et al, Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation, eds. Aubert et al, Academic Press, pp. 71-86, 1988 and Ilmen et al, Appl. Environ. Microbiol. 63: 1298-1306, 1997参照）。
培養培地の例として、Luria Bertani (LB) ブロス、Sabouraud Dextrose (SD)ブロス、またはYeast medium (YM)ブロス等の一般的に市販されている既成の培地が挙げられる。これ以外の合成培地を用いることもできる。分子生物学または発酵の分野の当業者であれば、特定の宿主細胞の培養に適した培地を適宜選択して用いることができる。
細胞培地には適切な炭素源の他に、適切なミネラル、塩、補助因子、緩衝液、及び培養に適していること、またはイソプレン産出を促進すること（例えば、特に細胞培地及び培養条件に関して本願に参照として組み込まれるWO 2004/033646及びWO 96/35796及びこれらに引用された文献参照）が当業者にとって公知の成分が含まれていることが望ましい。
いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼDXS, IDI,および／またはMVA経路核酸が誘導プロモータの制御下にある場合、イソプレンシンターゼDXS, IDI,および／またはMVA経路ポリペプチドの発現を誘発させるために有効な濃度の誘発剤（例えば糖、金属塩、または抗菌剤）を培地に添加することが望ましい。いくつかの実施形態では細胞培地には抗生物質（例えばカナマイシン）が含まれ、この抗生物質は、1以上のイソプレンシンターゼDXS, IDI,および／またはMVA経路核酸を有するベクターに含まれる抗生物質耐性核酸（例えばカナマイシン耐性核酸）に対応する。
＜細胞培養条件＞
細菌培地の維持及び培養に適した物質と方法は公知である。一例として、例えば、特に細胞培養技術に関して本願に参照として組み込まれるManual of Methods for General Bacteriology Gerhardt et al, eds), American Society for Microbiology, Washington, D.C. (1994) または Brock in Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Second Edition (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MAを参照することができる。
いくつかの実施形態では、宿主細胞に挿入した核酸によりコードされるイソプレンシンターゼDXS, IDI,および／またはMVA経路ポリペプチドが発現される条件下で、細胞培地において細胞を培養する。
細胞の培養には、標準的な細胞培養条件を用いることができる（例えば、特に細胞培養及び発酵に関して本願に参照として組み込まれるWO2004/033646及びそこに引用された文献参照）。細胞は適切な温度、ガス組成、及びpH(例えば約20から約37℃、CO2約6%から約84%、pH 約5から約9)において培養され、維持される。
いくつかの実施形態では、細胞を適切な培地において35℃で培養する。いくつかの実施形態では、所望の量のイソプレンが産出されるまで、振蕩培地または培養中の適切な培地において約28℃で細胞を培養する。いくつかの実施形態では、発酵時のpHは約pH5.0から約pH9.0の範囲（例えば約pH6.0から約pH8.0、または約pH6.5から約pH7.0）である。反応は、宿主細胞の性質に応じて好気性、無酸素性、または嫌気性条件下で行う。
糸状菌類の培養条件は公知であり、科学技術文献、および／またはAmerican Type Culture Collection and Fungal Genetics Stock Center等の菌類の供給源から情報を得ることができる。
いくつかの実施形態では、細胞をバッチ法、流加培養法、または連続法等の公知の発酵方法を用いて培養する。いくつかの実施形態では、
バッチ法を用いて培養する。従来のバッチ法発酵はクローズドシステムであり、発酵開始時に培地組成物に仕込み、発酵中人為的な変更は行わない。すなわち、発酵開始時に所定の宿主細胞を細胞培地に植菌し、何も添加せずに発酵させる。しかし、一般には「バッチ法」発酵は炭素源の添加に関してバッチであり、通常はpHや酸素濃度等の制御が行われる。バッチシステムでは、システムの代謝体とバイオマス組成が発酵を停止するまで連続的に変化する。
バッチ法の培地では、細胞は穏やかな誘導期から対数増殖期を経て最終的に成長速度が減少または停止する定常期に至る。いくつかの実施形態では、対数増殖期の細胞が大部分のイソプレンを産出する。いくつかの実施形態では、定常期の細胞がイソプレンを産出する。
いくつかの実施形態では、流加培養法等の標準的バッチ法を一部変更して実施する。流加培養法発酵プロセスは、発酵プロセスが進行するに従い徐々に炭素源を添加する点を除き、通常のバッチ法と同様にして行う。流加培養法は、異化代謝産物抑制により細胞の代謝が抑制される傾向があり、細胞培地中の炭素源の量を制限することが好ましいとき有効である。流加培養法発酵は、制限された量または過剰な量の炭素源（例えばグルコース）を用いて行うことができる。
流加培養法において実際の炭素源濃度を測定することは難しいため、pH、溶存酸素、またはCO2等の廃棄ガスの分圧等の測定可能な項目の変化から推定する。バッチ法及び流加培養法培養は一般的であり公知である。これらの例は、特に細胞培地と発酵条件に関して本願に参照として組み込まれるBrock, Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Second Edition (1989) Sinauer Associates, Inc.に記載されている。
いくつかの実施形態では、連続培養法を用いる。連続発酵は、バイオリアクターに所定量の発酵培地を連続的に供給しながら、同量の処理された培地を回収してさらに加工する。連続培養法では培養物を一定の高密度に保ち、細胞は主に対数増殖期にある。
連続培養法では、細胞の成長に影響する1以上の因子を調節することができる。例えば、一例では炭素源または窒素のレベル等の栄養素を一定値に保ちながら他の因子を調節する。別の例では、細胞濃度（例えば培養液の懸濁度から求めた濃度）を一定に保ちながらその他の細胞の成長に影響する複数の因子を調節する。
連続培養法では、安定な成長状態を維持するようにする。すなわち、培地の抜き出しによる細胞の減少を、発酵による細胞の増加で補う。連続培養法における栄養素と成長因子の調節方法と製品の産出速度を最大にする方法は分子生物学の分野では公知であり、特に細胞培地と発酵条件に関して本願に参照として組み込まれるBrock, Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Second Edition (1989) Sinauer Associates, Inc.に記載されている。
いくつかの実施形態では、細胞を基材上に固定して全細胞触媒とし、イソプレンを産出するための発酵条件下におく。
いくつかの実施形態では、ボトルに入れた培養液を振蕩機に取り付け、酸素に培養液に導入するとともに、培養液を均一にする。いくつかの実施形態では、インキュベータを用いて細胞を成長させる際の温度、湿度、振蕩速度および／または他の条件を制御する。最も簡単なインキュベータは断熱された箱と調整可能なヒーターから成り、通常65℃まで加熱できる。
より洗練されたインキュベータは（冷凍機により）温度下げる機能を備え、あるいは湿度またはCO2濃度を調整する機能を備える。大多数のインキュベータはタイマーを備え、温度、湿度等のサイクルをプログラム可能なインキュベータもある。インキュベータのサイズは卓上型から小さな部屋程度の大きさまで様々である。
所望により、細胞培地の一部または全部を入れ換えることにより、栄養素の補給、および／または悪影響を及ぼす可能性のある代謝副産物と死んだ細胞の蓄積を防ぐことができる。懸濁培養液の場合、培養液から細胞を遠心分離または濾過により分離し、次に新鮮な培養液中に分離した細胞を再懸濁させることができる。粘着性の培養物の場合、培養液をアスピレーションにより直接除去して入れ換えることができる。
いくつかの実施形態では、連続培養法（例えば希釈しない連続培養法）において、細胞培地中で細胞の少なくとも一部を少なくとも約5回,または 10, 20, 40, 50, 60, 65回またはそれ以上細胞分裂させることができる。
いくつかの実施形態では、構成的プロモータまたは漏出型（leaky）プロモータ（例えばTrcプロモータ）を用い、プロモータに作動可能に結合したイソプレンシンターゼDXS, IDI,またはMVA経路核酸の発現を誘発するための化合物（例えばIPTG）は添加しない。
いくつかの実施形態では、化合物（例えばIPTG）を添加してプロモータに作動可能に結合したイソプレンシンターゼDXS, IDI,またはMVA経路核酸の発現を誘導する。
＜イソプレン産出の例＞
いくつかの実施形態では、細胞をイソプレンが産出される条件下の細胞培地において培養する。
「ピーク絶対生産性」とは、細胞を特定の時間（例えば特定の発酵操業時の細胞の培養）培養したときのオフガス中のイソプレンの最大絶対量を意味する。
「ピーク絶対生産性時点」とは、発酵操業時における時点であって、細胞を特定の時間（例えば特定の発酵操業時の細胞の培養）培養したときにオフガス中のイソプレンの絶対量が最大になる時点を意味する。
いくつかの実施形態では、イソプレンの量をピーク絶対生産性時点において測定する。いくつかの実施形態では、細胞のピーク絶対産出は、概略本願に開示するイソプレンの量のいずれである。
「ピーク固有生産性」とは、細胞を特定の時間（例えば特定の発酵操業時の細胞の培養）培養したときの、細胞当りのイソプレン産出の最大量を意味する。
「ピーク固有生産性時点」とは、細胞を特定の時間（例えば特定の発酵操業時の細胞の培養）培養したときに、細胞当りのイソプレン産出が最大になる時点を意味する。
ピーク固有生産性は、全生産性を600nmにおける光学密度(OD600)により求められる細胞の量で割り算して求めることができる。いくつかの実施形態では、イソプレンの量をピーク固有生産性時点において測定する。いくつかの実施形態では、細胞のピーク固有生産性は、概略本願に開示する細胞当りのイソプレンの量のいずれかである。
「ピーク容積生産性」とは、細胞を特定の時間（例えば特定の発酵操業時の細胞の培養）培養したときに、ブロス容積（細胞及び細胞培地の容積が含まれる）当りから産出されるイソプレンの最大量を意味する。
「ピーク固有容積生産性時点」とは、細胞を特定の時間（例えば特定の発酵操業時の細胞の培養）培養しているときの時点であって、ブロス容積当りから産出されるイソプレンの量が最大になる時点を意味する。
ピーク固有容積生産性は、全生産性をブロスの容積と時間で割り算することにより求められる。いくつかの実施形態では、イソプレンの量をピーク固有容積生産性時点で測定する。いくつかの実施形態では、細胞のピーク固有容積生産性は、概略本願に開示する容積及び時間当りのイソプレンの量のいずれかである。
「ピーク濃度」とは、細胞を特定の時間（例えば特定の発酵操業時の細胞の培養）培養したときに産出されるイソプレンの最大量を意味する。
「ピーク濃度時点」とは、細胞を特定の時間（例えば特定の発酵操業時の細胞の培養）培養しているときに、産出されるイソプレンの細胞当りの量が最大になる時点を意味する。いくつかの実施形態では、イソプレンの量をピーク濃度時点で測定する。いくつかの実施形態では、細胞のピーク濃度は概略本願に開示するイソプレンの量のいずれかである。
「平均容積生産性」とは、細胞を特定の時間（例えば特定の発酵操業時の細胞の培養）培養しているときに、ブロスの容積（細胞及び細胞培地の容積が含まれる）当りから産出されるイソプレンの量の平均値を意味する。平均容積生産性は、全生産性をブロスの容積及び時間で割り算することにより求められる。いくつかの実施形態では、細胞の平均固有容積生産性は、概略本願に開示する容積及び時間当たりのイソプレンの量のいずれかである。
「累積全生産性」とは、細胞を特定の時間（例えば特定の発酵操業時の細胞の培養）培養しているときに産出されたイソプレンの累積全量を意味する。いくつかの実施形態では、イソプレンの累積全量を測定する。いくつかの実施形態では、細胞の累積全生産性は、概略本願に開示するイソプレンの量のいずれかである。
いくつかの実施形態では、培養物中の細胞はイソプレン約1nmole/gwcm/hr以上、または 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,250, 1,500, 1,750, 2,000, 2,500, 3,000, 4,000, 5,000, 10,000, 12,500, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, 75,000, 100,000, 125,000, 150,000, 188,000nmole/gwcm/hr以上、またはこれら以上のイソプレンを産出する。ここで、nmole/gwcm/hrは湿潤細胞1グラムから1時間当り産出されるイソプレンのnmole（ナノモル）数を表す。
いくつかの実施形態では、イソプレンの量は約2から約200,000nmole/gwcm/hr、例えば約2から約100nmole/gwcm/hr、約100から約500nmole/gwcm/hr、約150から約500nmole/gwcm/hr、約500から約1,000nmole/gwcm/hr、約1,000から約2,000nmole/gwcm/hr、約2,000から約5,000nmole/gwcm/hr、約5,000から約10,000nmole/gwcm/hr、約10,000から約50,000nmole/gwcm/hr、約50,000から約100,000nmole/gwcm/hr、約100,000から約150,000nmole/gwcm/hr、または約150,000から約200,000nmole/gwcm/hrである。いくつかの実施形態では、イソプレンの量は約20から約200,000nmole/gwcm/hr、約100から約5,000nmole/gwcm/hr、約200から約2,000nmole/gwcm/hr、約200から約1,000nmole/gwcm/hr、約300から約1,000nmole/gwcm/hr、約400から約1,000nmole/gwcm/hr、約1,000から約5,000nmole/gwcm/hr、約2,000から約20,000nmole/gwcm/hr、約5,000から約50,000nmole/gwcm/hr、約10,000から約100,000nmole/gwcm/hr、約20,000から約150,000nmole/gwcm/hr、または約20,000から約200,000nmole/gwcm/hrである。
単位nmole/gwcm/hrで表されるイソプレンの量は、特にイソプレンの産出量測定に関して本願に参照として組み込まれるU.S.P 5,849,970に開示されている。例えば、2mLのヘッドスペース（例えば、密封したバイアル中で2mLの培地を32℃で3時間200rpmで振蕩しながら培養したときのヘッドスペース）中のイソプレンについて、標準的ガスクロマトグラフィーで分析する。標準的ガスクロマトグラフィーは、等温(85℃)で操作され、n-オクタン/porasil Cカラム(Alltech Associates, Inc社., Deerfield, Ill.)を備え、RGD2酸化水銀還元ガス検出器(Trace Analytical, Menlo Park, CA)に接続されている(例えば、特にイソプレンの産出量測定に関して本願に参照として組み込まれるGreenberg et al, Atmos. Environ. 27A: 2689-2692, 1993; Silver et al, Plant Physiol. 97:1588-1591, 1991参照)。
ガスクロマトグラフィー測定カーブから得られる面積を、標準イソプレン濃度検量線を用いてイソプレン量（nmol）に換算する。いくつかの実施形態では、細胞の湿潤重量のグラム数は、細胞培地のサンプルのA600の値を測定し、このA600の値を既知の細胞の湿潤重量に対するA600の値の検量線に基づいて換算することにより求める。いくつかの実施形態では、細胞のグラム数は、A600の値が1の1リットルのブロス（細胞及び細胞培地の容積が含まれる）には湿潤重量が1グラムの細胞が含まれるとみなすことにより求める。また、この値を培養時間、例えば3時間で割り算する。
いくつかの実施形態では、培養物中の細胞は約1ng/gwcm/hr以上のイソプレンを産出し、あるいは10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,250, 1,500, 1,750, 2,000, 2,500, 3,000, 4,000, 5,000, 10,000, 100,000ng/gwcm/hr以上またはこれら以上のイソプレンを産出する。ここで、ng/gwcm/hrは湿潤細胞1グラムから1時間当り産出されるイソプレンのng（ナノグラム）数を表す。
いくつかの実施形態では、産出されるイソプレンの量は約2から約5,000ng/gwcm/hr、例えばbetween約2から約100ng/gwcm/hr、約100から約500ng/gwcm/hr、約500から約1,000ng/gwcm/hr、約1,000から約2,000ng/gwcm/hr、または約2,000から約5,000ng/gwcm/hrである。いくつかの実施形態では、産出されるイソプレンの量は約20から約5,000ng/gwcm/hr、約100から約5,000ng/gwcm/hr、約200から約2,000ng/gwcm/hr、約200から約1,000ng/gwcm/hr、約300から約1,000ng/gwcm/hr、または約400から約1,000ng/gwcm/hrである。
ng/gwcm/hrで表されるイソプレンの量は、上記の単位nmole/gwcm/hrで表されるイソプレン産出値に68.1を掛けることで計算により求めることができる（下記の式5参照）。
いくつかの実施形態では、培養物中の細胞は累積力価（総産出量）が約1mg/Lbroth以上のイソプレンを産出し、あるいは約10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,250, 1,500, 1,750, 2,000, 2,500, 3,000, 4,000, 5,000, 10,000, 50,000, 100,000mg/Lbroth以上またはこれら以上のイソプレンを産出する。ここでmg/Lbrothはブロス1リットルあたりから産出されるイソプレンのmg（ミリグラム）数を表し、ブロスの容積には細胞及び培地の容積が含まれる。
いくつかの実施形態では、イソプレンの総産出量は約2から約5,000mg/Lbroth、例えば約2から約100mg/Lbroth、約100から約500mg/Lbroth、約500から約1,000mg/Lbroth、約1,000から約2,000mg/Lbroth、または約2,000から約5,000mg/Lbrothである。いくつかの実施形態では、イソプレンの総産出量は約20から5,000mg/Lbroth、約100から5,000mg/Lbroth、約200から2,000mg/Lbroth、約200から1,000mg/Lbroth、約300から1,000mg/Lbroth、または約400から1,000mg/Lbrothである。
振蕩フラスコまたは同様の培地の、イソプレンのmg数/ヘッドスペースのリットル(L)数で表されるイソプレンの固有生産性は、OD600の値が約1の細胞培地から1 mlのサンプルを採取し、このサンプルを20 mLのバイアルに入れ、30分間培養し、次にヘッドスペース中のイソプレンの量を（例えば実施例1のパートIIに記載した方法により）測定する。OD600の値が1.0でない場合は、OD600の値で割り算することにより、OD600の値が1.0のときの値に正規化する。イソプレンのmg数/ヘッドスペースのリットル(L)数の値に38を掛け算することにより、培養ブロスのmg/Lbroth/hr/OD600に換算することができる。単位mg/Lbroth/hr/OD600で表される値に時間数とOD600の値とを掛け算することにより、単位がイソプレンのmg数/ブロスのリットル(L)数で表される累積力価を求めることができる。
いくつかの実施形態では、培養物中の細胞のイソプレンの平均容積生産性が約0.1mg/Lbroth/hr以上、または1.0, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1100, 1200, 1300, 1,400, 1,500, 1,600, 1,700, 1,800, 1,900, 2,000, 2,100, 2,200, 2,300, 2,400, 2,500, 2,600, 2,700, 2,800, 2,900, 3,000, 3,100, 3,200, 3,300, 3,400, 3,500mg/Lbroth/hr以上、またはこれら以上である。（mg/Lbroth/hrはブロス1リットルから1時間当り産出されるイソプレンのmg数を表し、ブロスの容積には細胞及び細胞培地の容積が含まれる。）
いくつかの実施形態では、培養物中の細胞のイソプレンの平均容積生産性が約0.1から約3,500mg/Lbroth/hr、例えば約0.1から約100mg/Lbroth/hr、約100から約500mg/Lbroth/hr、約500から約1,000mg/Lbroth/hr、約1,000から約1,500mg/Lbroth/hr、約1,500から約2,000mg/Lbroth/hr、約2,000から約2,500mg/Lbroth/hr、約2,500から約3,000mg/Lbroth/hr、または約3,000から約3,500mg/Lbroth/hrである。いくつかの実施形態では、培養物中の細胞のイソプレンの平均容積生産性が約10から約3,500mg/Lbroth/hr、約100から約3,500mg/Lbroth/hr、約200から約1,000mg/Lbroth/hr、約200から約1,500mg/Lbroth/hr、約1,000から約3,000mg/Lbroth/hr、または約1,500から約3,000mg/Lbroth/hrである。
いくつかの実施形態では、培養物中の細胞のイソプレンのピーク容積生産性が約0.5mg/Lbroth/hr以上、または1.0, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1100, 1200, 1300, 1,400, 1,500, 1,600, 1,700, 1,800, 1,900, 2,000, 2,100, 2,200, 2,300, 2,400, 2,500, 2,600, 2,700, 2,800, 2,900, 3,000, 3,100, 3,200, 3,300, 3,400, 3,500, 3,750, 4,000, 4,250, 4,500, 4,750, 5,000, 5,250, 5,500, 5,750, 6,000, 6,250, 6,500, 6,750, 7,000, 7,250, 7,500, 7,750, 8,000, 8,250, 8,500, 8,750, 9,000, 9,250, 9,500, 9,750, 10,000, 12,500, 15,000mg/Lbroth/hr以上、またはこれら以上である。（mg/Lbroth/hrはブロス1リットルから1時間当り産出されるイソプレンのmg数を表し、ブロスの容積には細胞及び細胞培地の容積が含まれる。）
いくつかの実施形態では、培養物中の細胞のイソプレンの平均容積生産性が約0.5から約15,000mg/Lbroth/hr、例えば約0.5から約10mg/Lbroth/hr、約1.0から約100mg/Lbroth/hr、約100から約500mg/Lbroth/hr、約500から約1,000mg/Lbroth/hr、約1,000から約1,500mg/Lbroth/hr、約1,500から約2,000mg/Lbroth/hr、約2,000から約2,500mg/Lbroth/hr、約2,500から約3,000mg/Lbroth/hr、約3,000から約3,500mg/Lbroth/hr、約3,500から約5,000mg/Lbroth/hr、約5,000から約7,500mg/Lbroth/hr、約7,500から約10,000mg/Lbroth/hr、約10,000から約12,500mg/Lbroth/hr、または約12,500から約15,000mg/Lbroth/hrである。いくつかの実施形態では、培養物中の細胞のイソプレンの平均容積生産性が約10から約15,000mg/Lbroth/hr、約100から約2,500mg/Lbroth/hr、約1,000から約5,000mg/Lbroth/hr、約2,500から約7,500mg/Lbroth/hr、約5,000から約10,000mg/Lbroth/hr、約7,500から約12,500mg/Lbroth/hr、または約10,000から約15,000mg/Lbroth/hrである。
単位mg/Lbroth/hrで表される発酵槽中におけるイソプレン産出速度は、発酵槽オフガスのサンプルを採取し、このサンプル中のイソプレンの量（単位イソプレンmg/Lgas）を、例えば実施例1のパートIIに記載した方法により測定し、この測定値にブロス1リットル当りのオフガス流量(例えば1 vvm (気体容積/ブロス容積/分)これは60 Lgas/hourに等しい)を掛け算することにより求めることができる。すなわち、1 mg/Lgasのオフガス濃度は、1 vvmの気体流量において産出速度60 mg/Lbroth/hrに相当する。
所望により、単位mg/Lbroth/hrの値をOD600の値で割り算することにより、単位mg/Lbroth/hr/ODの固有速度を求めることができる。イソプレンmg/Lgasの平均値は、このイソプレン濃度の平均値に発酵中に発酵ブロス1リットルから放出されたオフガスの全量を掛け算することにより、全製品生産性(発酵ブロス1リットル当りのイソプレングラム数、mg/Lbroth)に変換することができる。すなわち、1 vvmにおいて平均オフガスイソプレン濃度0.5 mg/Lbroth/hrで10時間製造したときの全製品濃度はイソプレン300mg/Lbrothである。
いくつかの実施形態では、培養物中の細胞は培地中の炭素の約0.0015モル％以上をイソプレンに転換し、あるいは培地中の炭素の0.002, 0.005, 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.12, 0.14, 0.16, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6, 2.0, 2.2, 2.4, 2.6, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, 11.0, 12.0, 13.0, 14.0, 15.0, 16.0, 17.0, 18.0, 19.0, 20.0, 21.0, 22.0, 23.0, 23.2, 23.4, 23.6, 23.8, 24.0, 25.0, 30.0, 31.0, 32.0, 33.0, 35.0, 37.5, 40.0, 45.0, 47.5, 50.0, 55.0, 60.0, 65.0, 70.0, 75.0, 80.0, 85.0モル％以上、または,90.0モル％以上をイソプレンに転換する。
いくつかの実施形態では、イソプレンに転換される炭素のパーセントは約0.002から約90.0モル%、例えば約0.002から0.005%、約0.005から0.01%、約0.01から0.05%、約0.05から0.15%、0.15から0.2%、約0.2から0.3%、約0.3から0.5%、約0.5から0.8%、約0.8から1.0%、約1.0から1.6%、約1.6から3.0%、約3.0から5.0%、約5.0から8.0%、約8.0から10.0%、約10.0から15.0%、約15.0から20.0%、約20.0から25.0%、約25.0%から30.0%、約30.0%から35.0%、約35.0%から40.0%、約45.0%から50.0%、約50.0%から55.0%、約55.0%から60.0%、約60.0%から65.0%、約65.0%から70.0%、約75.0%から80.0%、約80.0%から85.0%、または約85.0%から90.0%である。
いくつかの実施形態では、イソプレンに転換される炭素のパーセントは約0.002から0.4モル%、0.002から0.16モル%、0.04から0.16モル%、約0.005から0.3モル%、約0.01から0.3モル%、約0.05から0.3モル%、約0.1から.3モル%、約0.3から1.0モル%、約1.0から5.0モル%、約2から5.0モル%、約5.0から10.0モル%、約7から10.0モル%、約10.0から20.0モル%、約12から20.0モル%、約16から20.0モル%、約18から20.0モル%、約18から23.2モル%、約18から23.6モル%、約18から23.8モル%、約18から24.0モル%、約18から25.0モル%、約20から30.0モル%、約30から40.0モル%、約30から50.0モル%、約30から60.0モル%、約30から70.0モル%、約30から80.0モル%、または約30から90.0モル%である。
炭素からイソプレンへの転換パーセント（「炭素収率%」とも呼ぶ）は、産出されたイソプレン中の炭素モル数を、炭素源中の炭素モル数（例えばバッチ中と供給されたグルコース及び酵母エキス中の炭素モル数）で割り算することにより求めることができる。（式1に示すように）この数字に100をかけてパーセントの値とする。
＜式１＞
炭素収率% = (産出されたイソプレン中の炭素モル数)/(炭素源中の炭素モル数)×100
この計算では、酵母エキスは炭素を50% w/w含むとみなすことができる。例えば、実施例7、パートVIIIに開示する500リットルの場合、イソプレンへの炭素転換率は式2に示すようにして計算することができる。
＜式2＞
炭素収率% = (39.1gイソプレン×l/68.1モル/g×5C/モルmol)/[(181221gグルコース×1/180モル/g×6 C/モル) + (17780g酵母エキス×0.5×1/12モル/g)]×100 = 0.042%
本願に開示する2例の500リットルの発酵（実施例7のパートVII及びVIII）では、イソプレンへの炭素転換率は0.04-0.06%であった。本願に開示するように、14リットルの系で0.11-0.16%の炭素収率が得られた。
当業者であれば、イソプレン産出速度または産出されたイソプレンの量を容易に他の単位に変換することができるであろう。以下に、単位間の変換式の例を示す。
＜イソプレン産出速度の単位（全または固有）
＜式3＞
イソプレン1 g/Lbroth/hr = 14.7ミリモルイソプレン/Lbroth/hr (全容積速度)
＜式4＞
イソプレン1ナノモル/gwcm/hr = イソプレン1ナノモル/Lbroth/hr/OD600(この変換式では、OD600の値が1の1リットルのブロス中には湿潤重量1グラムの細胞が含まれるとみなす）。
＜式5＞
イソプレン1ナノモル/gwcm/hr = イソプレン68.1ナノグラム/gwcm/hr (イソプレンの分子量に基づく)
＜式６＞
イソプレン1ナノモル/Lgas 02/hr = イソプレン90ナノモル/Lbroth/hr （培養ブロス1リットル当りのO2流量が90 L/hrのとき）
＜式7＞
イソプレン1μg/オフガス中のイソプレンLgas = イソプレン60μg/Lbroth/hr （Lbroth 当りの流量が60 Lgasのとき(1 vvm)）
＜力価の単位＞（全及び固有）
＜式8＞
イソプレン1 ナノモル/タンパク質細胞mg = イソプレン150 ナノモル/Lbroth/OD600 (この変換式では、OD600の値が1の1リットルのブロス中には約150ミリグラムの全タンパク質細胞が含まれるとみなす) (固有生産性)
＜式9＞
イソプレン1 g/Lbroth = イソプレン14.7ミリモル/Lbroth (全力価)
所望により、式10によって細胞の湿潤重量を含むいずれかの単位を細胞の乾燥重量を含む単位に変換することができる。
＜式10＞
細胞の乾燥重量 = （細胞の湿潤重量）/3.3
この発明のいくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする非相同核酸を備える細胞は、実質的に同じ条件で培養したイソプレンシンターゼポリペプチドをコードする非相同核酸を備えない対応する細胞と比較して、少なくとも約2倍, 3倍, 5倍, 10倍, 25倍, 50倍, 100倍, 150倍, 200倍, 400倍またはそれ以上の量のイソプレンを産出する。
この発明のいくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする非相同核酸及び1以上のDXS, IDI,および／またはMVA経路ポリペプチドをコードする非相同核酸を備える細胞は、実質的に同じ条件で培養したこれらの非相同核酸を備えない対応する細胞と比較して、少なくとも約2倍, 3倍, 5倍, 10倍, 25倍, 50倍, 100倍, 150倍, 200倍, 400倍またはそれ以上の量のイソプレンを産出する。
＜イソプレン精製方法の例＞
いくつかの実施形態では、本願の方法にはイソプレンの回収工程が含まれる。例えば、本願の方法及び組成物を用いて産出したイソプレンを標準的方法で回収することができる。このような標準的方法の例は、ガスストリッピング、分留、吸着／脱着、パーベーパレーション、熱または真空によるイソプレンの固相からの脱着、または固相に固着または吸着させたイソプレンの溶媒による抽出 (特にイソプレンの回収及び精製方法に関して本願に参照として組み込まれるU.S.P. 4,703,007 及び4,570,029参照)等である。
いくつかの実施形態では、イソプレンの回収工程には、イソプレンを液相状態(例えばイソプレンのみの液体、またはイソプレンを含む溶媒)で単離することが含まれる。
ガスストリッピングでは、発酵オフガスから連続的にイソプレン蒸気を除去する。このようなイソプレン蒸気の除去は種々の方法で行うことができ、非限定的例示として固相への吸着、液相への分離、または直接凝縮させることが挙げられる。いくつかの実施形態では、露点以上の希釈されたイソプレン蒸気を膜により濃縮して、イソプレンを液相で凝縮させることができる。
イソプレンの回収は一段階または多段階で行うことができる。いくつかの実施形態では、発酵オフガスからのイソプレンの分離と、イソプレンの液相への変換を同時に行う。例えば、イソプレンをオフガスから直接凝縮させて液相にすることができる。いくつかの実施形態では、発酵オフガスからのイソプレンの分離と、イソプレンの液相への変換とを順次行う。例えば、イソプレンを固相に吸着させ、次に溶媒で固相から抽出することができる。
いくつかの実施形態では、本願の方法にはさらにイソプレンを精製する工程が含まれる。例えば、本願の組成物と方法により産出したイソプレンを標準的方法で精製することができる。精製とは、イソプレンを産出させるときに介在していた1以上の他の成分からイソプレンを分離する工程である。いくつかの実施形態では、純粋な液体のイソプレンが得られる。精製方法の例として、(i) 液相抽出物からの蒸留による分離、及び(ii)クロマトグラフィーが挙げられる。
本願では、「精製されたイソプレン」とは、イソプレンを産出させるときに介在していた1以上の他の成分から分離されたイソプレンを意味する。
いくつかの実施形態では、イソプレンはイソプレンを産出させるときに介在していた1以上の他の成分中に少なくとも約20重量%含まれる。いくつかの実施形態では、イソプレンの純度は少なくとも約25重量%, 30重量%, 40重量%, 50重量%, 60重量%, 70重量%, 75重量%, 80重量%, 90重量%, 95重量%, または99重量%である。純度は、カラムクロマトグラフィー、HPLC分析、またはGC- MS分析等の適切な方法によって求めることができる。
いくつかの実施形態では、本願に開示した方法にはさらにイソプレンの重合が含まれる。例えば、精製したイソプレンを標準的な方法で重合して c/s-ポリイソプレン、または公知の方法により他の下流製品を製造することができる。
この他の方法と組成物が2008年9月15日出願の米国仮出願61/097,186、2008年9月15日出願の米国仮出願61/097,189、及び2008年9月15日出願の米国仮出願61/097,163に記載されている。これらは、特にイソプレンを産出する方法及び組成物に関して本願に参照として組み込まれる。
実施例はこの発明の例示を目的とするものであり、本願発明を限定するものではない。また実施例は、上記に説明した発明の実施形態と詳細を説明するものである。特に断りの無い限り、温度は摂氏であり、圧力はほぼ大気圧である。以下の実施例と詳しい説明はこの発明の説明を目的としており、この発明を限定するものではない。本願に引用する刊行物、特許出願、及び特許は参照として本願に組み込まれる。特に、この発明において用いられるであろう方法と組成物に関連して本願に引用する刊行物、特許出願、及び特許を、本願に参照として組み込む。以下、本願発明の理解を容易にするため実施例に基づき詳しく説明するが、当業者であれば本願の開示内容に照らし、本願の要旨から逸脱しない範囲で本願発明を種々変更して実施できることは明らかであろう。
＜実施例1＞
＜組み換えkudzuイソプレンシンターゼを発現するE. coliによるイソプレン産出＞
＜I. E. coliにおいてkudzuイソプレンシンターゼを発現させるためのベクターの構築＞
kudzu (プエラリア・モンタナ) イソプレンシンターゼ遺伝子(IspS)のタンパク質配列をGenBank (AAQ84170)から得た。E. coliコドンとしての使用に最適化されたkudzuイソプレンシンターゼ遺伝子は、DNA2.0から購入した (SEQ ID NO: 1)。
購入したプラスミドからイソプレンシンターゼ遺伝子をBspLU11I/PstIによる制限エンドヌクレアーゼ消化で分離し、ゲル精製し、NcoI/PstIで消化したpTrcHis2B (Invitrogen社)に結紮した。ベクター構築体は、イソプレンシンターゼ遺伝子5’からPstI部位中の終止コドンになるように設計した。この結果、構築体を発現させたときHis-Tagはイソプレンシンターゼタンパク質に結合していなかった。得られたプラスミドpTrcKudzuの配列をシークエンシングにより検証した（図2及び3）。
また、イソプレンシンターゼ遺伝子をpET16b (Novagen社)中にクローン化した。この場合、組み換えイソプレンシンターゼタンパク質がN-末端His tagを含むようにして、イソプレンシンターゼ遺伝子をpET16b中に、挿入した。
イソプレンシンターゼ遺伝子を、pTrcKudzuからプライマーセットを用いたPCRにより増幅した。
用いたプライマーセットは、
pET-His-Kudzu-2F
Figure 0006262125
 及び
pET-His- Kudzu-R
Figure 0006262125
 であった。
これらのプライマーのそれぞれにより、遺伝子の5 '-末端にNdeI部位が付加され、3'末端にBamH1部位が付加された。
上記のpTrcKudzuプラスミドをテンプレートDNAとして用い、Herculaseポリメラーゼ(Stratagene社)は製造者の取扱説明書に従って用い、プライマーは濃度が10 ピコモルとなるように添加した。
PCRは全容積25μlで行なった。PCR産品をNdeI/BamHlで消化し、同じ酵素で消化したpET16b中にクローン化した。結紮混合物をE. coli Top 10 (Invitrogen社)中に形質転換し、正規のクローンをシークエンシングにより選択した。これにより得られ、T7プロモータから発現されたkudzuイソプレンシンターゼ遺伝子を含むプラスミドを、pETNHisKudzuと命名した (図4及び5)。
また、kudzuイソプレンシンターゼ遺伝子を、低コピー数プラスミドpCL1920中にクローン化した。プライマーを用いて、上記のpTrcKudzuからkudzuイソプレンシンターゼ遺伝子を増幅した。フォワードプライマーが5'末端にHindIII部位とE. coliコンセンサスRBSを付加した。PstIクローン化部位は既に終止コドンの3'のpTrcKudzuに存在しているので、リバースプライマーは最終PCR産品にPstI部位が含まれる様にして構築した。
プライマーの配列は以下の通りである。
HindIII-rbs-Kudzu F:
Figure 0006262125
 及び
and BamHl-Kudzu R:
Figure 0006262125
PCR産品の増幅は、プライマーの濃度10ピコモル、1ナノグラムのテンプレートDNA (pTrcKudzu)、及びHerculaseポリメラーゼを用いて行った。増幅は(95℃で1分間、60℃で1分間、72℃で2分間)のサイクル30を含んで行った。PCR産品をHindIII及びPstIにより消化し、Hindlll及びPstIで消化したpCL1920に結紮した。結紮混合物をE. coli Top10中に形質転換した。いくつかの形質転換体をシークエンシングにより検査した。得られたプラスミドを、pCL-lac-Kudzu (図6及び7)と命名した。
＜イソプレン産出の評価＞
フラスコでの培養の場合、1 mlの培養物を浸透フラスコから20 ml CTCヘッドスペースバイアル(Agilent社、 バイアルのカタログ# 5188 2753; キャップのカタログ# 5188 2759)へ移した。キャップを強くねじ込み、バイアルを250 rpmで振蕩しながら一定温度で培養した。30分後、バイアルをインキュベータから取り外し、下記のようにして分析した（この分析結果のいくつかを表1に示す）。
培養槽でイソプレンを産出させた場合、培養槽のオフガスからサンプルを採取し、下記のようにして直接分析した（この分析結果のいくつかを表2に示す）。
分析はAgilent 6890 GC/MSシステムと、このシステムに接続され、ヘッドスペースモードで作動するCTC Analytics (Switzerland) CombiPALオートサンプラーを用いて行った。サンプル中の被検体の分離には、Agilent ΗP-5MS GC/MS カラム(30 m×0.25 mm; フィルム厚み0.25 μm)を用いた。
サンプルとして、ヘッドスペースガス500μLを注入した。GC/MS測定ではヘリウムをキャリヤーガスとして用い、1 ml/分で流通させた。インジェクションポートを250℃に保ち、分割比を50:1とした。2分間の分析中、オーブンの温度を37℃に保った。Agilent 5793N質量分析選択検出器を、シングルイオンモニタリング(SIM)モードでm/z 67で用いた。この検出器のスイッチを1.4から1.7分間オフにして、永久気体を流出させた。
これらの条件下で、イソプレン(2-メチル-1,3-ブタジエン)は1.78分後に流出することが観察された。イソプレンの絶対量の定量には検量表を用いた。この結果、1 μg/Lから200 μg/Lの範囲では直線的であることが観察された。この方法の検出限界は50から100 ng/Lと見積もられた。
＜III. 組み換えイソプレンシンターゼを発現するE. coli細胞を入れた振蕩フラスコにおけるイソプレン産出＞
上記のベクターをE. coli株BL21 (Novagen社)に導入し、BL21/ptrcKudzu株、 BL21/pCL-lac-Kudzu株、及びBL21/pETHisKudzu株を産出させた。これらの株を単離するために、LA (Luriaアガー)及びカルベニシリン(50μg/ml)上に塗布し、37℃で一晩培養した。単一コロニーを、20 mlのLuria Bertaniブロス(LB)とカルベニシリン(100μg/ml)を含むバッフル付き振蕩フラスコに植菌した。200rpmで振蕩しながら、20℃で一晩培養物を成長させた。
一晩培養した養培物のOD600を測定し、養培物を30mlのMagicMedia (Invitrogen社)とカルベニシリン(100μg/ml)を含むバッフル付き250ml振蕩フラスコ中で、OD600が約0.05になるまで希釈した。養培物を200rpmで振蕩しながら30℃で培養した。OD600が約0.5- 0.8になったとき、400μMのIPTGを添加し、細胞をさらに200rpmで振蕩しながら30℃で6時間培養した。IPTGを添加した2, 4 及び6時間後に、培養物のサンプル1 mlを採取し、OD600を測定し、上記のようにしてイソプレン産出量を測定した。結果を表8に示す。
＜IV. 14リットルの培養槽でのBL21/ptrcKudzuからのイソプレン産出＞
組み換えkudzuイソプレンシンターゼ遺伝子を含むE. coliからの大スケールでのイソプレン産出を、流加培養法により行った。発酵培地1リットルの組成は次の通りであった：K2HPO4 13.6 g、KH2PO4 13.6 g、 MgSO4 * 7H2O 2 g、クエン酸一水和物 2 g、クエン酸第二鉄アンモニウム0.3 g、(NH4) 2SO4 3.2 g、酵母エキス 5 g、1000X Modified Trace Metal Solution 1ml。
全成分をともに添加し、diH2Oに溶解させた。水酸化カリウム(KOH)でpHを6.8に調整した。最終産品を0.22 μ フィルター(フィルターのみ、加熱滅菌せず)で濾過滅菌した。
1000X Modified Trace Metal Solutionの組成は以下の通りである：クエン酸* H 2O 40 g、MnSO4 * H2O 30 g、NaCl 10 g、FeSO4 * 7H2O 1 g、CoCl2 * 6H2O 1 g、ZnSO * 7H2O 1 g、CuSO4 * 5H2O 100 mg、H3BO3 100 mg、NaMoO4 * 2H2O 100 mg。
各成分を一度にdiH2Oに添加して溶解させ、HCl/NaOHでpHを3.0にし、次に容積を調整し、0.22μのフィルターで濾過滅菌した。
実験は14 Lのバイオリアクターにおいて温度34℃、pH6.7で発酵させ、グルコースからのイソプレンの産出をモニターしながら行った。接種菌株のE. coli株BL21/ptrcKudzuはソイトン(soytone) -酵母エキス-グルコース培地で調製した。この接種菌株を凍結させたバイアルから採取した。この接種菌株がOD550 = 0.6になるまで成長させた後、2つの600 mlフラスコを遠心分離し、細胞ペレットをバイオリアクターに移すために、内容物を70 mlの上清に再懸濁させた(70 mlのOD 3.1の材料)。接菌した後、所定時間毎にサンプルを採取し、上記の方法でイソプレン産出量を測定した。結果を図9に示す。
＜実施例2＞
＜組み換えポプライソプレンシンターゼを発現するE. coliによるイソプレン産出＞
ポプラ (ポプラ・アルバ×ポプラ・トレムラ)イソプレンシンターゼ (Schnitzler, J-P, et al. (2005) Planta 222:777-786) のタンパク質配列をGenBank (CAC35696) から入手した。遺伝子、E. coliに最適化させたコドンは、DNA2.0 (p9796-poplar, 図30及び31参照) から購入した。
購入したプラスミドからイソプレンシンターゼ遺伝子をBspLU11I/PstIによる制限エンドヌクレアーゼ消化で分離し、ゲル精製し、NcoI/PstIで消化したpTrcHis2Bに結紮した。構築体は、終止コドンがPstI部位の前に挿入されるようにクローン化し、この結果、His-Tagがイソプレンシンターゼタンパク質に結合していない構築体が得られた。得られたプラスミドpTrcPoplar(図32及び33)の配列をシークエンシングにより検証した。
＜実施例3＞
＜パンテオア・シトレアを発現する組み換えkudzuイソプレンシンターゼにおけるイソプレンの産出＞
実施例1に記載したpTrcKudzuプラスミド及びpCL-lac KudzuプラスミドをP. シトレア (U.S.P 7,241,587) 中にエレクトロポレートした。形質転換体はそれぞれ、カルベニシリン(200 μg/ml)またはスペクチノマイシン(50 μg/ml)を含むLAにおいて選択した。振蕩フラスコによるイソプレン産出と、産出されたイソプレンの量の測定は、実施例1の組み換えkudzuイソプレンシンターゼを発現するE. coli株の場合と同様にして行った。結果を図10に示す。
＜実施例4＞
＜kudzuイソプレンシンターゼを発現するバシラス・スブチリスによるイソプレン産出＞
＜kudzuイソプレンシンターゼの発現用プラスミドを複製するB. スブチリスの構築＞
aprE プロモータで制御された複製プラスミド(クロラムフェニコール耐性カセットを有するpBS19)を用いて、kudzuイソプレンシンターゼ遺伝子をバシラス・スブチリスaprEnprE Pxyl-comK株(BG3594comK)中で発現させた。
イソプレンシンターゼ遺伝子、aprE プロモータ、及び転写ターミネータを別々に増幅し、PCRにより融合させた。この構築体をpBS19中にクローン化し、B. スブチリス中に形質転換した。
a) aprEプロモータの増幅
aprEプロモータは、以下のプライマーを用いて、バシラス・スブチリス由来の染色体DNAから増幅した：
CF 797 (+) 開始aprEプロモータMfel
Figure 0006262125
 CF 07-43 (-) aprEプロモータをKudzu ispSに融合
Figure 0006262125
b) イソプレンシンターゼ遺伝子の増幅
kudzuイソプレンシンターゼ遺伝子は、プラスミドpTrcKudzu (SEQ ID NO:2)から増幅した。この遺伝子はコドンがE. coliに最適化され、DNA 2.0によって合成されたものであった。
次のプライマーが用いられた。
CF 07-42 (+) aprEプロモータをkudzuイソプレンシンターゼ遺伝子に融合(GTG 開始コドン)
Figure 0006262125
 CF 07-45 (-) kudzuイソプレンシンターゼ遺伝子の3'末端をターミネータに融合
Figure 0006262125
c) 転写ターミネータの増幅
バシラス・ アミロリケファシエンスのアルカリセリンプロテアーゼ由来のターミネータを、次のプライマーを用いて以前配列同定したプラスミドpJHPms382により増幅した：
CF 07-44 (+) kudzuイソプレンシンターゼの3'末端をターミネータに融合
Figure 0006262125
 CF 07-46 (-) B. アミロリケファシエンスのターミネータの末端(BamHI)
Figure 0006262125
次のプライマーにより、PCRを用いてkudzu断片をターミネータ断片に融合した：
CF 07-42 (+) aprEプロモータをkudzuイソプレンシンターゼ遺伝子(GTG開始コドン)に融合
Figure 0006262125
 CF 07-46 (-) B. アミロリケファシエンスのターミネータの終端(BamHI)
Figure 0006262125
次のプライマーにより、PCRを用いてkudzu-ターミネータ断片をプロモータ断片に融合した：
CF 797 (+) 開始aprEプロモータMfeI
Figure 0006262125
 CF 07-46 (-)B. アミロリケファシエンスのターミネータの終端(BamHI)
Figure 0006262125
融合PCR断片をQiagen kitを用いて精製し、制限酵素MfeI及びBamHIで消化した。消化したDNA断片をQiagen kitを用いてゲル精製し、pBS19として知られているベクターに結紮した。pBS19はEcoRI及びBamHIで消化され、ゲル精製されている。
結紮混合物をE. coli Top 10細胞中に形質転換し、コロニーをLA及び50カルベニシリンプレート上で選択した。全部で6個のコロニーを選び、LB 及び50カルベニシリン上で一晩培養し、次にQiagen kitを用いてプラスミドを単離した。挿入を確認するためプラスミドをEcoRI及びBamHIで消化し、正規の3つのプラスミドについて次のプライマーによるシークエンシングを行った：
CF 149 (+) aprEプロモータのEcoRI開始
Figure 0006262125
 CF 847 (+) pXX 049中の配列 (aprEプロモータの終端)
Figure 0006262125
 CF 07-45 (-) kudzuイソプレンシンターゼの3’末端をターミネータに融合
Figure 0006262125
 CF 07-48 (+) kudzuイソプレンシンターゼのシークエンシングプライマー
Figure 0006262125
 CF 07-49 (+) イソプレンシンターゼ中のシークエンシング
Figure 0006262125
pBS Kudzu #2 (図52及び12) と命名したプラスミドが、シークエンシングにより正規にものであることが確認され、バシラス・スブチリス宿主細胞であるBG 3594 comK中に形質転換した。選択は、LA及び5クロラムフェニコールプレート上で行った。形質転換体を選択し、LA及び5クロラムフェニコールにシングルコロニーを植菌し、OD600が1.5に達するまでLA及び5クロラムフェニコールにおいて培養した。これをバイアルに入れて-80℃で凍結し、グリセロールの存在下で保管した。得られた株をCF 443と命名した。
＜組み換えイソプレンシンターゼを発現するB.スブチリス細胞が入れられた振蕩フラスコにおけるイソプレン産出＞
LA及びクロラムフェニコール(Cm, 25 μg/ml)からのCF 443のシングルコロニーを一夜培養物に植菌した。培養物を200rpmで振蕩しながら、37℃でLB及びCmにおいて成長させた。一夜培養物(1 ml)を、25ml のGrants II培地と最終濃度が25 μg/mlのクロラムフェニコールとを含む250mlのバッフル付き振蕩フラスコに植菌した。
Grants II培地の組成は、10g ソイトン、3mlの1M K2HPO4 、75g グルコース、3.6 g 尿素、100 ml 10X MOPS, H2Oで容積を1 Lに調整、pH 7.2である。
10X MOPSの組成は、83.72g MOPS、7.17g トリシン、 12g KOHペレット、10mlの0.276M K2SO4溶液、10 mlの0.528M MgCl2溶液、29.22 g NaCl、100mlの100X微量栄養素、H2Oでに容積を1 L調整；また100X微量栄養素の組成は次の通りである。1.47g CaCl2*2H2O、0.4g FeSO4*7H20、0.1g MnSO4*H20、0.1g ZnSO4*H2O、0.05g CuCl2*2H2O、0.1g CoCl2*6H2O、0.1g Na2MoO4*2H2O、H2Oで容積を1 Lに調整。
振蕩フラスコを37℃でインキュベートし、サンプルを18, 24,及び44時間後に採取した。18時間後に、CF443のヘッドスペースとコントロール株のサンプルを採取した。これは18時間で累積したイソプレンのサンプルである。イソプレンの量は、実施例1に示したガスクロマトグラフィーにより求めた。組み換えイソプレンシンターゼの発現によりイソプレンの産出が顕著に増加した(図11)。
＜III. 14 L培養槽中でのCF443によるイソプレン産出＞
複製プラスミド上に組合せkudzuイソプレンシンターゼ遺伝子を有するB. スブチリスを用いた大スケールでのイソプレン産出を、流加培養法により実施した。
Kudzuイソプレンシンターゼ遺伝子を発現するバシラス株CF 443、またはkudzuイソプレンシンターゼ遺伝子を発現しないコントロール株を、流加培養法で培養した。
流加培養法の栄養培地には、大豆ミール(Cargill社)、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、及びクエン酸、塩化鉄、塩化マグネシウムを含む溶液が含まれていた。発酵させる前に、培地をセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、及びペクチナーゼ(WO95/04134参照)を含む酵素混合物により軟浸させた。
14-Lの発酵バッチに60%wt/wtのグルコース(Cargill社 DE99 デキストロース、ADM社 Versadex greens またはDanisco社 転化糖)と、99% wt/wtのオイル(Western Family社 大豆油、ここで、99% wt/wt は細胞培地に添加する前のオイルの濃度である)を添加した。
バッチ中のグルコース濃度が検出限界以下になったとき、供給を開始した。供給速度を数時間にわたり変化させ、オイルを添加して等炭素ベースで調整した。28% w/v水酸化アンモニウムを用いて、pHを6.8 - 7.4に調整した。泡が生じたときは、培地に消泡剤を添加した。
発酵温度を37℃に制御し、発酵培養物を750rpmで撹拌した。発酵操作中、pH、DO%、空気流量、及び圧力等のその他のパラメータを常時監視した。DO%を20以上に維持した。サンプルを36時間にわたり所定時間毎に採取し、細胞の成長(OD550)、及びイソプレン産出量を分析した。
これらの実験結果を図53 A及び53Bに示す。
＜IV. kudzuイソプレンシンターゼ(ispS)のB. スブチリス中への組込み＞
kudzuイソプレンシンターゼ遺伝子を、aprEプロモータで制御された組込みプラスミド(pJH101- cmpR) 中にクローン化した。試験した条件下では、イソプレンは検出されなかった。
＜実施例5＞
＜トリコデルマ中でのイソプレン産出＞
＜I. トリコデルマ・リーゼイ中でkudzuイソプレンシンターゼを発現させるためのベクターの構築＞
DNA 2.0 (SEQ ID NO: 8) (図13)により、ヤロウイア・リポリチカ(Yarrowia lipolytica)コドン最適化kudzu IS遺伝子を合成した。このプラスミドを、以下のPCR増幅反応のテンプレートとして用いた：1μl プラスミドテンプレート(20 ng/μl)、1μl プライマーEL-945 (10μM)、1μl プライマーEL-965 (10μM)、1 μl dNTP (10mM)、5 μl 10x PfuUltra II Fusion HS DNA ポリメラーゼ緩衝液、 1 μl PfuUltra II Fusion HS DNAポリメラーゼ、 40 μl 水、全反応容積50 μl。

プライマーEL-945 (10μM)
Figure 0006262125
 プライマーEL-965 (10μM)
Figure 0006262125
 フォワードプライマーの5 '-末端には、Y. リポリチカコドン最適化kudzuイソプレンシンターゼ遺伝子に対応しないが、pENTR/D- TOPOベクター中へのクローン化に必要な追加の4つのヌクレオチドが含まれていた。
リバースプライマーの5 '-末端には、Y. リポリチカコドン最適化kudzuイソプレンシンターゼ遺伝子に対応しないが、他のベクターの骨格にクローン化するために挿入した21個のヌクレオチドが含まれていた。
PCR反応は、MJ Research PTC-200 Thermocyclerを用いて次の手順で行った：95℃で2分間 (最初のサイクルのみ)、95℃で30秒間、55℃で30秒間、72℃で30秒間、(このサイクルを27回繰り返す)、最終サイクルの後72℃で1分間。
1.2% E-gel によりPCR産品を分析し、Y.リポリチカコドン最適化kudzuイソプレンシンターゼ遺伝子が正常に増幅されたことを確認した。
次に、TOPO pENTR/D-TOPO Cloning Kitを用いて、PCR産品を製造者の取扱説明書に従ってクローン化した：1μl PCR反応、1μl塩溶液、1μlTOPO pENTR/D- TOPOベクター、及び3μl水、全反応容積6μl。反応物を室温で5分間インキュベートした。1マイクロリットルのTOPO反応物を、TOP10化学的コンピテントE. coli細胞中に形質転換した。形質転換体を、LA及び50μg/mlカナマイシンプレート上で選択した。いくつかのコロニーを拾い出して、それぞれをLB及び50μg/mlカナマイシンが入れられた5 mlチューブ中に植菌し、200 rpmで振蕩しながら37℃で一晩培養した。製造者の取扱説明書に従ってQIAprep Spin Miniprep Kitを用いて、プラスミドを一夜培養チューブから単離した。いくつかのプラスミドについてシークエンシングを行い、DNA配列が正しいことを検証した。
Y. リポリチカコドン-最適化kudzuイソプレンシンターゼ遺伝子をコードするシングルpENTR/D-TOPO プラスミドを、特注のpTrex3gベクター中へのGateway Cloningによるクローン化に用いた。pTrex3gの構築方法は、WO 2005/001036 A2に記載されている。反応は、Gateway LR Clonase II Enzyme Mix Kit (Invitrogen社) の取扱説明書に従い、次のようにして行った：1μl Y.リポリチカコドン-最適化kudzuイソプレンシンターゼ遺伝子pENTR/D-TOPOドナーベクター、1μl pTrex3g目的ベクター、6 μl TE緩衝液、 pH 8.0、全反応容積8μl。
反応物を室温で1時間インキュベートし、次にプロテイナーゼK溶液1 μlを添加し、37℃で10分間インキュベーションを続けた。反応物1μlをTOP10化学的コンピテントE. coli細胞中に形質転換した。
形質転換体を、LA及び50μg/mlカルベニシリンプレート上で選択した。いくつかのコロニーを拾い出して、それぞれをLB及び50μg/mlカルベニシリンが入れられた5 mlチューブ中に植菌し、200rpmで振蕩しながら37℃で一晩培養した。製造者の取扱説明書に従ってQIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen, Inc.社)を用いて、プラスミドを一夜培養チューブから単離した。いくつかのプラスミドについてシークエンシングを行い、DNA配列が正しいことを検証した。
Biolistic PDS-1000/HE Particle Delivery System (WO 2005/001036 A2参照) を用いて、Y. リポリチカコドン-最適化kudzuイソプレンシンターゼpTrex3gプラスミド (図14) の4欠失トリコデルマ・リーゼイ株中への遺伝子銃形質転換を行った。安定な形質転換体の単離と、振蕩フラスコによる評価は、WO 2005/001036 A2の実施例11に記載された方法に従って行った。
＜T.リーゼイの組み換え株中でのイソプレン産出＞
上記のイソプレンシンターゼ形質転換体を15時間及び36時間培養した培養物1 mlを、ヘッドスペースバイアルに入れた。バイアルを密封し、30℃で5時間培養した。ヘッドスペースガスを測定し、実施例1に記載した方法でイソプレンを測定した。2種の形質転換体から痕跡量のイソプレンが認められた。イソプレンの量は、14時間培養することにより増加させることができた。2種の陽性のサンプルは、14時間の培養により約0.5 μg/Lの濃度のイソプレンを生じた。形質転換されていないコントロールからは、検出可能な濃度のイソプレンは生じなかった。
この実施例は、T. リーゼイは外因性イソプレンシンターゼを賦与されたとき、内因性前駆体からイソプレンを産出することができることを示している。
＜実施例6＞
＜ヤロウイア属におけるイソプレン産出＞
＜ヤロウイア・リポリチカ中でkudzuイソプレンシンターゼを発現させるためのベクターの構築＞
ヤロウイア・リポリチカ中でkudzuイソプレンシンターゼを発現させるためのベクターの構築の出発点はpSPZl(MAP29Spb)ベクターであった。このベクター(SEQ ID No:11)の全配列を図15に示す。
Y. リポリチカ株GICC 120285の染色体DNAをテンプレートに用いて、次の断片をPCRにより増幅した：プロモータの無い形態のURA3遺伝子、18SリボソームRNA遺伝子の断片、Y. リポリチカ XPR2遺伝子の転写ターミネータ、及びXPR2遺伝子のプロモータとICL1遺伝子のプロモータを含む2つのDNA断片。
以下のPCRプライマーを用いた。
ICLl 3
Figure 0006262125
 ICLl 5
Figure 0006262125
 XPR 3
Figure 0006262125
 XPR 5
Figure 0006262125
 XPRT3
Figure 0006262125
 XPRT 5
Figure 0006262125
 Y18S3
Figure 0006262125
 Y18S 5
Figure 0006262125
 YURA3
Figure 0006262125
 YURA 50
Figure 0006262125
 YURA 51
Figure 0006262125
PfuUltraIIポリメラーゼ(Stratagene社)のPCR増幅では、製造者が供給した緩衝液及びdNTPs、2.5μMのプライマー、及び指示されたテンプレートDNAを、製造者の取扱説明書に従って用いた。増幅は次のサイクルで行った：95℃で1 分間、34×(95℃で30秒間、55℃で30秒間、72℃で3分間)、及び72℃で10分間、次いで4℃でのインキュベーション。
kudzuイソプレンシンターゼ遺伝子、ヤロウイアでの発現に最適化されたコドンをコードする合成DNA分子は、DNA 2.0 (図16; SEQ ID NO:12) から入手した。合成kudzuイソプレンシンターゼ遺伝子を備え、それぞれXPR2及び ICLlプロモータで制御されるpYLA(KZl)及びpYLI(KZl)プラスミドの構築方法の詳細を図18に示す。イソプレンシンターゼ遺伝子の代わりに接合因子遺伝子(MAP29)が挿入されたコントロールプラスミドも構築した(図18E及び18F)。
同様のクローン化方法を、ポプラ(ポプラ・アルバ×ポプラ・トレムラ)イソプレンシンターゼ遺伝子の発現に用いることもできる。ポプライソプレンの配列は、Miller B. et al. (2001) Planta 213, 483-487に記載されており、図17に示す(SEQ ID NO:13)。合成ポプライソプレンシンターゼ遺伝子を備え、それぞれXPR2及び ICL1プロモータで制御されるpYLA(POP1)及びpYLI(POP1)プラスミドの構築方法の詳細を図18 A 及びBに示す。
＜II. Y.リポリチカの組み換え株によるイソプレン産出＞
pYLA(KZl), pYLI(KZl), pYLA(MAP29) 及びpYLI(MAP29)ベクターをSacIIで消化し、Y.リポリチカ CLIB 122株の、標準的リチウムアセテート/ポリエチレングリコール法によるウリジンプロトトロフィーへの変換に用いた。
すなわち、YEPD (1%酵母エキス、2% ペプトン, 2% グルコース)で一晩培養した酵母細胞を遠心分離(4000 rpm, 10分間)により回収し、滅菌水で1回洗浄し、pH 6.0の0.1 M 酢酸リチウム溶液中に懸濁させた。この細胞懸濁液のサンプル200μlと、線状化プラスミドDNA溶液(10-20μg)とを混合し、室温で10分間インキュベートした後、同じ緩衝液中の50% PEG 4000溶液1mlと混合した。この懸濁液を室温でさらに1時間インキュベートした後、42℃で2分間のヒートショックを与えた。細胞をSC his leuプレート(0.67% 酵母窒素ベース、2%グルコース、ロイシン及びヒスチジンがそれぞれ100 mg/L)上に塗布した。30℃で3-4日間インキュベートした後、形質転換体が得られた。
pYLA(KZl)形質転換体からの3種の単離物、pYLI(KZl) 形質転換体からの3種の単離物、pYLA(MAP29) 形質転換体からの2種の単離物、及びpYLI(MAP29) 形質転換体からの2種の単離物を、YEP7培地(1% 酵母エキス、2%ペプトン、pH 7.0) を用いて振蕩しながら30℃で24時間培養した。
各培養物の10mlから細胞を遠心分離で回収し、新鮮なYEP7で再懸濁させ、それぞれ15mlのスクリューキャップバイアルに入れた。各バイアルを穏やかに振蕩(60 rpm)しながら、室温で一晩インキュベートした。各バイアルのヘッドスペース中のイソプレン濃度を、実施例1に記載のマススペクトル検出器を備えたガスクロマトグラフィーで分析した。pYLA(KZl)及び pYLI(KZl)から得られた全ての形質転換体は、容易に検出可能な量のイソプレンを産出した(0.5 μg/Lから1 μg/L、図20)。
イソプレンシンターゼ遺伝子の代わりにフィターゼ遺伝子を備えたコントロール株のヘッドスペースからは、イソプレンは検出されなかった。
＜実施例7＞
Kudzuイソプレンシンターゼ及びidi、またはdxsまたはidi及びdxsを発現するE. coliにおけるイソプレン産出＞
＜I. E. coli中でイソプレンを産出させるためのkudzuイソプレンシンターゼ及びidi、またはdxsまたはidi及びdxsをコードするベクターの構築＞
i) pTrcKudzuKanの構築
pTrcKudzu (実施例1に記載)のbla遺伝子を、カナマイシン耐性を賦与する遺伝子で置換した。bla遺伝子を除去するために、pTrcKudzuをBspHIで消化し、Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP)で処理し、65℃で熱殺菌し、次にKlenow断片とdNTPで末端処理した。5kbpの大きさの断片をアガロースゲルで精製し、kanr 遺伝子に結紮した。kanr 遺伝子は、pCR-Blunt-II-TOPOからプライマーMCM22
Figure 0006262125
 と、プライマーMCM23
Figure 0006262125
 とを用いてPCR増幅され、HindIII及びPvuIで消化され、末端処理されたものである。
カナマイシン耐性(pTrcKudzuKan)を賦与されたプラスミドを備える形質転換体を、カナマイシンを50μg/ml含むLA上で選択した。
ii) pTrcKudzu yIDI Kanの構築
pTrcKudzuKanをPstIで消化し、SAPで処理し、熱殺菌し、ゲル精製した。次にS. cerevisiae由来のidiをコードし合成RBSを備えるPCR産品に結紮した。
PCRに用いたプライマーはNsiI-YIDI 1 F
Figure 0006262125
 及びPstI- YIDI 1 R
Figure 0006262125
 であり、テンプレートはサッカロミセス・セレビシアエのゲノムDNAであった。
PCR産品をNsiI及びPstIで消化し、結紮の前にゲル精製した。結紮混合物を化学的コンピテントTOP10細胞中に形質転換し、カナマイシンを50 μg/ml含むLA上で選択した。いくつかの形質転換体を単離し、シークエンシングを行い、得られたプラスミドをpTrcKudzu-yIDI(kan) (図 34及び35)と名付けた。
iii) pTrcKudzu DXS Kanの構築
プラスミドpTrcKudzuKanをPstIで消化し、SAPで処置し、熱殺菌し、ゲル精製した。次に、E. coli由来のdxsをコードし合成RBSを備えるPCR産品に結紮した。
PCRに用いたプライマーはMCM 13
Figure 0006262125
 及びMCM14
Figure 0006262125
 であり、テンプレートはE. coliのゲノムDNAであった。
PCR産品をNsiI及びPstIで消化し、結紮の前にゲル精製した。得られた形質転換反応物をTOP10細胞中に形質転換し、カナマイシンを50 μg/ml含むLA上で選択した。いくつかの形質転換体を単離し、シークエンシングを行い、得られたプラスミドをpTrcKudzu- DXS(kan) (図36及び37)と名付けた。
iv) pTrcKudzu-yIDI-dxs (kan)の構築
pTrcKudzu-yΙDI(kan) をPstIで消化し、SAPで処置し、熱殺菌し、ゲル精製した。次に、E. coli由来のdxsをコードし合成RBSを備えるPCR産品に結紮した。
PCRに用いたプライマーはMCM 13
Figure 0006262125
 及びMCM14
Figure 0006262125
 であり、テンプレートはTOP 10細胞であった。
PCR産品をNsil及びPstIで消化し、ゲル精製した。得られたプラスミドをpTrcKudzu-yIDI-dxs (kan) (図 21及び22)と名付けた。
v) pCL PtrcKudzuの構築
上記の実施例1のプロモータ、構造遺伝子、及びターミネータを備えるDNAの断片を、Ssplを用いてpTrcKudzuから消化し、ゲル精製した。次に、pCL1920に結紮した。pCL1920は、PvuIIで消化され、SAPで処理され、熱殺菌されていた。得られた結紮混合物をTOP 10細胞中に形質転換し、スペクチノマイシンを50 μg/ml含むLA上で選択した。いくつかのクローンを単離し、シークエンシングを行い、2種類を選択した。pCL PtrcKudzu及びpCL PtrcKudzu (A3) は、反対方向の挿入を備えていた(図38-41)。
vi) pCL PtrcKudzu yIDIの構築
上記(ii)のNsiI-PstI消化、ゲル精製、IDI PCRアンプリコンをpCL PtrcKudzuに結紮した。pCL PtrcKudzuは、PstIで消化され、SAPで処理され、熱殺菌されていた。結紮混合物をTOP 10細胞中に形質転換し、スペクチノマイシンを50 μg/ml含むLA上で選択した。いくつかのクローンを単離し、シークエンシングを行い、得られたプラスミドをpCL PtrcKudzu yIDI (図42及び43)と名付けた。
vii) pCL PtrcKudzu DXSの構築
上記(iii)のNsiI-PstI消化、ゲル精製、DXS PCRアンプリコンをpCL PtrcKudzu (A3) に結紮した。pCL PtrcKudzu (A3)は、PstIで消化され、SAPで処理され、熱殺菌されていた。結紮混合物をTOP 10細胞中に形質転換し、スペクチノマイシンを50 μg/ml含むLA上で選択した。いくつかのクローンを単離し、シークエンシングを行い、得られたプラスミドをpCL PtrcKudzu DXS (図44及び45)と名付けた。
＜II. 異なるコピー数のkudzuイソプレンシンターゼ、idi、および／またはdxsを発現する培養物のヘッドスペースにおけるイソプレンの測定＞
予めプラスミドpTrcKudzu(kan) (A)、pTrcKudzu-yIDI kan (B)、pTrcKudzu-DXS kan (C)、pTrcKudzu-ylDI-DXS kan (D)で形質転換したE. coli BL21(λDE3)の培養物を、LB カナマイシン50 μg/mLを含むLBにおいてで成長させた。
pCL PtrcKudzu (E)、pCL PtrcKudzu、pCL PtrcKudzu-yIDI (F)及び pCL PtrcKudzu-DXS (G)の培養物を、スペクチノマイシン50 μg/mLを含むLBにおいてで成長させた。
時間0(OD600は約0.5)において、培養物を400μM IPTGにより誘導し、ヘッドスペースのイソプレン測定用に、複数のサンプルを採取した(実施例1参照)。結果を図23A-23Gに示す。
プラスミドpTrcKudzu-yIDI-dxs (kan)を形質転換によりE. coli株BL21中に導入した。得られたBL21/pTrc Kudzu IDI DXS株を、カナマイシン(50 μg/ml)を含むLBにおいて20℃で一晩培養し、次に、振蕩フラスコ中の1%グルコースを含むTM3 (13.6 g K2PO4, 13.6 g KH2PO4, 2.0 g MgSO4*7H2O), 2.0 g クエン酸一水和物, 0.3 gクエン酸第二鉄アンモニウム, 3.2 g (NH4) 2SO4, 0.2 g 酵母エキス, 1.0 ml 1000x Modified Trace Metal Solution, pH 6.8に調整、H2Oで容積調整、濾過滅菌) に植菌した。振蕩フラスコをOD600が0.8になるまで30℃で培養し、400μM IPTGで誘導した。誘導後、所定時間ごとにサンプルを採取し、実施例1に示した方法でヘッドスペース中のイソプレンの量を測定した。結果を図23Hに示す。
＜III. E. coli/pTrcKudzu yIDI DXSによるバイオマスからのイソプレン産出＞
BL21 pTrcKudzuIDIDXS株について、バガス、トウモロコシ茎葉、針葉樹パルプの3種のバイオマスからのイソプレン産出能力を、グルコースをコントロールに用いて試験した。酵素加水分解法 (Brown, L and Torget, R., 1996, NREL standard assay method Lap-009 "Enzymatic Saccharification of Lignocellulosic Biomass") により、バイオマスの加水分解物を調製し、等価グルコースになるように希釈して用いた。この実施例では、等価グルコースはグルコース1%に等しい。
BL21 (DE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan)の形質転換細胞のプレートからシングルコロニーを採取し、LBとカナマイシン(50 μg/ml)を含む培養液5 mlに植菌した。培養物を25℃で一晩、振蕩しながらインキュベートした。翌日、一夜培養物を25 mlのTM3、0.2% YE、1%フィードストック溶液中のOD600が0.05になるように希釈した。フィードストックは、トウモロコシ茎葉、バガス、または針葉樹パルプであった。
グルコースを陽性コントロールに用い、グルコース無添加を陰性コントロールに用いた。培養物を180rpmで振蕩しながら、30℃でインキュベートした。培養物のOD600を監視し、OD600が約0.8に達したら、実施例1に記載した方法により、培養液物の1時間目と3時間目のイソプレン産出を測定した。培養液物の誘導は行わなかった。フィードストックを添加した培養物は、いずれもグルコースの陽性コントロールと同等量のイソプレンを産出した。実験は2回繰り返した。結果を図46に示す。
＜IV. E. coli/pTrcKudzuIDIDXSによる転化糖からのイソプレン産出＞
BL21 (λDE3)/pTrcKudzu yIDI DXS (kan)の形質転換細胞のプレートからシングルコロニーを採取し、LBとカナマイシン(50 μg/ml)を含む培養液5 mlに植菌した。培養物を25℃で一晩、振蕩しながらインキュベートした。翌日、一夜培養物を25 mlのTM3、0.2% YE、1%フィードストック溶液中のOD600が0.05になるように希釈した。フィードストックは、グルコース、転化糖、またはトウモロコシ茎葉であった。
転化糖フィードストック(Danisco Invert Sugar)は、ショ糖シロップを酵素処理して調製した。AFEXトウモロコシ茎葉は下記の方法で調製した(パートV)。細胞を30℃で成長させ、培養物のOD600が0.8-1.0(0 時間目)になったとき、最初のサンプルの測定を行った。0, 1 及び3時間目に、培養物について細胞の成長をOD600で測定し、イソプレン産出を実施例1に記載した方法で測定した。結果を図47に示す。
＜V. AFEX前処理トウモロコシ茎葉からの加水分解物の調製＞
AFEX前処理トウモロコシ茎葉は、Michigan Biotechnology Instituteから入手した。前処理は、湿度60%、1 : 1アンモニアにより90℃において30分間処理、その後風乾して行った。AFEX前処理トウモロコシ茎葉の水分は21.27%であった。AFEX前処理トウモロコシ茎葉中のグルカン及びキシラン含有量はそれぞれ31.7%及び19.1% (乾燥ベース) であった。
糖化プロセスは次の通りであった； 5 mlの1Mクエン酸緩衝液(pH4.8)、2.25 ml のAccellerase 1000、0.1 mlのGrindamyl H121 (Danisco 社の製パン用のアスペルギルス・ニガー由来キシラナーゼ) 、及び72.65 mlの脱イオン水が入れられた500 mlフラスコに、AFEX前処理トウモロコシ茎葉20 gを投入した。このフラスコをオービタルシェーカーに取り付け、50℃で96時間インキュベートした。シェーカーのフラスコからサンプルを採取し、HPLCで分析した。加水分解物には、グルコース38.5 g/L、キシロース21.8 g/L、及びグルコースおよび／またはキシロースのオリゴマー10.3 g/Lが含まれていた。
＜VI. 流加培養法で培養したE. coliによるイソプレン産出における酵母エキスの効果＞
上記のプラスミドpTrcKudzu yIDI DXSを含むE. coli細胞を用いて、上記の14-Lスケールの発酵を行った。酵母エキス(Bio Springer社, Montreal, Quebec, Canada)を指数関数的に添加した。40時間の発酵の間に発酵槽に添加した酵母エキスの総量は、70-830gの間で変化した。
波長550 nmにおいて発酵ブロスの光学密度を測定した。発酵槽の最終的光学密度は、添加した酵母エキスの量に比例した(図48A)。発酵槽からのオフガス中のイソプレン濃度は、前記の方法で測定した。発酵している間、イソプレンの力価が増加した(図48B)。イソプレンの産出量は、酵母エキスの添加量に直線的に比例した(図48C)。
＜VII. pTrcKudzu DXS yIDIの500 Lスケールの発酵におけるイソプレン産出＞
Kudzuイソプレンシンターゼ、サッカロミセス・セレビシアエIDI、及びE. coli DXS核酸(E. coli BL21 (λDE3) pTrc Kudzu dxs yidi)を備えるE. coli細胞を500リットルスケールで発酵させて、イソプレンを産出させた。15時間の発酵中、イソプレンの濃度は50から300 μg/Lの範囲で変動した。平均イソプレン濃度、装置における平均流量、及びイソプレンの破過の程度に基づき、回収されたイソプレンは計算により約17 gと見積もられた。
＜VIII. 流加培養法で成長させたE. coliの500 Lスケールの発酵におけるイソプレン産出＞
＜培地の組成＞
K2HPO4 7.5 g、MgSO4*7H2O 2 g、クエン酸一水和物 2 g、クエン酸第二鉄アンモニウム0.3 g、酵母エキス 0.5 g、1000X Modified Trace Metal Solution 1 ml。
すべての成分を同時に添加し、diH2O中に溶解させた。この溶液を加熱滅菌した。アンモニアガスでpHを7.0に調整し、所定容積にした。滅菌及びpH調整後、グルコース10 g、チアミン* HCl 0.1g、及び抗菌剤を添加した。
＜1000X Modified Trace Metal Solutionの組成＞
クエン酸* H2O 40g, MnSO4 * H2O 30g, NaCl 10g, FeSO4 * 7H2O 1g, CoCl2 * 6H2O 1g, ZnSO4 * 7H2O 1g, CuSO4 * 5H2O 100mg, H3BO3 100mg, NaMoO4 * 2H2O 100mg。
すべての成分を同時に添加してDI H2O中に溶解させ、HCl/NaOHでpHを3.0に調整し、所定容積にし、0.22ミクロンのフィルターで濾過滅菌した。
pTrcKudzu yIDI DXSプラスミドを備えるE. coli細胞を用い、500-Lバイオリアクター中で発酵させた。
この実施例は、pH 7.0、温度30℃で発酵させ、グルコースと酵母エキスから産出されるイソプレンの量を監視しながら行った。凍結したバイアルから取ったE. coli株接種材料は、ソイトン-酵母エキス-グルコース培地により調製した。550nmにおける光学密度が0.15になるまで接種材料を成長させた。次に、その20mlをソイトン-酵母エキス-グルコース培地が入れられた2.5-Lバイオリアクターに植菌した。2.5-Lバイオリアクターを30℃において光学密度が1.0になるまで培養し、2.0Lを500-Lバイオリアクターへ移した。
酵母エキス(Bio Springer社, Montreal, Quebec, Canada)及びグルコースは、指数関数的に供給した。50時間の発酵中にバイオリアクターに供給されたグルコース及び酵母エキスの量は、それぞれ181.2kg及び17.6 kgであった。バイオリアクター内の光学密度の経時変化を図49Aに示す。バイオリアクターのオフガス中のイソプレン濃度は、前記の方法で測定した。発酵中、イソプレン力価が増加した(図49B)。50時間の発酵中に産出されたイソプレンの総量は55.1gであった。イソプレン産出量の経時変化を図49Cに示す。
＜実施例8＞
＜kudzuイソプレンシンターゼ及び組み換えメバロン酸経路遺伝子を発現するE. coliによるイソプレンの産出＞
＜I. 下流MVA経路のクローン化＞
以下の方法で下流メバロン酸経路をクローン化した。
4種のメバロン酸生合成経路の遺伝子；メバロン酸キナーゼ (MVK)、ホスホメバロン酸キナーゼ (PMK)、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ (MVD)、及びイソペンテニルジホスフェートイソメラーゼを、S.セレビシアエ染色体DNAによるPCRで増幅し、それぞれpCR BluntII TOPOプラスミド (Invitrogen社) 中にクローン化した。いくつかの例では、idi遺伝子をE. coli染色体DNAにより増幅した。
プライマーは、E. coliのコンセンサスRBS
Figure 0006262125
 または
Figure 0006262125
 が5'末端において開始コドンの8 bp上流に挿入され、PstI部位が3'末端に付加されるるように設計した。これらの遺伝子をpTrcHis2Bベクター中に１つずつクローン化して、全経路を形成した。
S. セレビシアエS288C由来の染色体DNAは、ATCC (ATCC 204508D) から入手した。MVK遺伝子を、S. セレビシアエの染色体により増幅した。このとき、プライマーには
MVKF
Figure 0006262125
 及びMVK-PstI-R
Figure 0006262125
 を用い、PfuTurboを製造者の取扱説明書に従って用いた。
1.2% E-gel (Invitrogen社)を用いた電気泳動により、PCR産品(1370 bp)が正規のサイズであることを確認し、pZeroBLUNT TOPO中にクローン化した。得られたプラスミドをpMVK1と命名した。
プラスミドpMVK1をSacI及びTaq1制限エンドヌクレアーゼで消化し、断片をゲル精製し、SacI及びBstBIで消化したpTrcHis2Bと結紮した。得られたプラスミドをpTrcMVK1と命名した。
メバロン酸生合成経路の2番目の遺伝子であるPMKは、プライマーにPstI-PMK1 RとBsiHKA I-PMK1 Fを用いたPCRで増幅した。
PstI-PMK1 R
Figure 0006262125
 BsiHKA I-PMK1 F
Figure 0006262125
 PCR反応は、Pfu Turbo ポリメラーゼ (Stratagene社)を製造者の取扱説明書に従って用いて行った。正規のサイズの産品(1387 bp)をPstIとBsMKIで消化し、PstIで消化したpTrcMVK1と結紮した。得られたプラスミドをpTrcKKと命名した。
MVD及びidi遺伝子を同様にしてクローン化した。PCRは、MVD遺伝子を増幅するためにPstI-MVD 1 R及びNsiI-MVD 1 Fのプライマーのペアを用い、yIDI遺伝子を増幅するためにPstI- YIDI 1 R及びNsiI- YIDI 1 Fのプライマーのペアを用いて行った。
PstI-MVD 1 R
Figure 0006262125
 NsiI-MVD 1 F
Figure 0006262125
 PstI- YIDI 1 R
Figure 0006262125
 NsiI- YIDI 1 F
Figure 0006262125
 いくつかの例では、IPPイソメラーゼ遺伝子、E. coli由来のidiを用いた。E. coli染色体DNA由来のidiを増幅するために、以下のプライマーのセットを用いた。
PstI-CIDI 1 R
Figure 0006262125
 NsiI-CIDI 1 F
Figure 0006262125
 テンプレートDNAは、標準的な方法でE. coli FM5 (特に核酸の単離に関して本願に参照として組み込まれるWO 96/35796 及びWO 2004/033646参照) から単離した染色体DNAであった。
最終的に得られた酵母のidi遺伝子をコードする構築体のプラスミドをpKKDIyと命名した。また、最終的に得られたE. coliのidi遺伝子をコードする構築体のプラスミドを、pKKDIcと命名した。
このプラスミドをE. coli宿主細胞BL21中に形質転換して、以下の分析に用いた。いくつかの実施例では、kudzu由来のイソプレンシンターゼをpKKDIy中にクローン化して、プラスミドpKKDIylSを得た。
また、下流MVA経路を、カナマイシン抗生物質耐性マーカーを備えるpTrc中にクローン化した。プラスミドpTrcKKDIyを制限エンドヌクレアーゼApaI及びPstIで消化して、5930 bpの断片を1.2%アガロース E-gelで分離し、Qiagen Gel Purification kitを製造者の取扱説明書に従って用いて精製した。実施例7に記載したプラスミドpTrcKudzuKanを制限エンドヌクレアーゼApaI及びPstIで消化して、ベクターを含む3338 bpの断片を、Qiagen Gel Purification kitを用いて1.2% E-gelから精製した。3338 bpのベクターの断片と、5930 bpの下流MVA経路の断片を、Roche Quick Ligation kitを用いて結紮した。結紮混合物をE. coli TOP10細胞中に形質転換し、形質転換体を37℃で一晩成長させ、カナマイシン(50 μg/ml)を含むLAで選択した。形質転換体を制限酵素消化で検証し、1をストックとして凍結保管した。このプラスミドをpTrcKanKKDIyと命名した。
＜II. kudzuイソプレンシンターゼ遺伝子のpTrcKanKKDIy中へのクローン化＞
kudzuイソプレンシンターゼ遺伝子を、実施例1に示したように、プライマーMCM50及びMCM53を用いたPCRによりpTrcKudzuから増幅した。
MCM50
Figure 0006262125
 MCM53
Figure 0006262125
 得られたPCR断片を、pCR2.1中にクローン化して、E. coli TOP10中に形質転換した。この断片は、kudzuイソプレンシンターゼのコード配列、及びE. coli由来のRBSを含む上流側領域を備える。形質転換体を37℃で一晩培養し、カルベニシリン (50 μg/ml)を含むLAで選択した。断片が正しく挿入されていることをシークエンシングで検証した。この株をMCM93と命名した。
株MCM93のプラスミドをを制限エンドヌクレアーゼNsiI及びPstIで消化して、RBS及びkudzuイソプレンシンターゼを含む1724 bpの挿入部分を放出させた。1724 bpの断片を1.2%アガロースE-gelで分離し、Qiagen Gel Purification kitを製造者の取扱説明書に従って用いて精製した。プラスミドpTrcKanKKDIyを制限エンドヌクレアーゼPstIで消化して、SAPにより37℃で30分間処理し、Qiagen PCR cleanup kitを用いて精製した。DNA断片のコードするプラスミドとkudzuイソプレンシンターゼをRoche Quick Ligation kitを用いて結紮した。結紮混合物をE. coli TOP10細胞中に形質転換し、形質転換体を37℃で一晩培養し、カナマイシン50 μg/mlを含むLAで選択した。正規の形質転換体であることを制限酵素消化で検証した。このプラスミドをpTrcKKDylklSKan (図24 及び25) と命名した。
このプラスミドを、BL21(λDE3)細胞 (Invitrogen社) 中に形質転換した。
＜III.組み換え下流メバロン酸経路及びkudzu由来のイソプレンシンターゼを発現するE. coliによるメバロン酸塩からのイソプレン産出＞
BL21/pTrcKKDyIkISKan株をMOPS培地(Neidhardt et al, (1974) J. Bacteriology 119:736-747)で培養した。MOPS培地は、pH 7.1に調整され、0.5%グルコースと0.5%メバロン酸が添加されていた。0.5%メバロン酸が添加されていない点を除き同様の組成のコントロール培地を調製した。
培養は1%の接種材料の一夜種培養から開始し、培養物のOD600が0.3から0.5に達したとき、500μMのIPTGで誘導した。培養物を250ｒｐｍで振蕩しながら、30℃で成長させた。誘導してから3時間後に、イソプレンの産出を実施例1に記載したヘッドスペース法により分析した。イソプレンの最大産出は6.67×104 nmol/Lbroth/OD600/hrであった。ここで、Lbrothはブロスの容積であり、細胞培地容積と細胞容積の両者を含む。メバロン酸無添加のコントロール培地からは、検出可能な量のイソプレンは産出されなかった。
＜IV. 上流MVA経路のクローン化＞
3種の酵素活性をコードするする2種の遺伝子を備える上流メバロン酸生合成経路を、エンテロコカス・ファエカリスからクローン化した。mvaE遺伝子は、この経路における1番目と3番目のタンパク質であるアセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼ、及び3-ヒドロキシ-3- メチルグルタアリール-CoA (HMG-CoA) リダクターゼの双方の酵素活性を備えるタンパク質をコードし、mvaS遺伝子は、この経路の2番目の酵素であるHMG-CoAシンターゼをコードする。
mvaE遺伝子は、E. coliリボソームの結合部位及びその前方のスペーサを供えるE.ファエカリスのゲノムDNA (ATCC 700802D-5) から、下記のプライマーを用いて増幅した。

CF 07-60 (+) mvaE w/ RBSの開始端+ATG開始コドンSacI
Figure 0006262125
 CF 07-62 (-) mvaEとmvaSとをRBSを介して融合
Figure 0006262125
mvaS遺伝子は、RBS及びその前方のE. coli由来のスペーサを供えるE.ファエカリスのゲノムDNA (ATCC 700802D-5) から、下記のプライマーを用いて増幅した。

CF 07-61 (+) RBSを介してmvaEとmvaSとを融合
Figure 0006262125
 CF 07-102 (-) mvaS gene BglIIの終端
Figure 0006262125
PCRとともに、各PCR断片を以下のプライマーを用いて融合した。

CF 07-60 (+) mvaE w/ RBSの開始端+ ATG 開始コドンSacI
Figure 0006262125
 CF 07-102 (-) mvaS gene BglIIの終端
Figure 0006262125
融合PCR断片をQiagen kitを用いて精製し、制限酵素SacI及びBglIIにより消化した。消化したDNA断片をQiagen kitを用いてゲル精製し、市販のベクターであるpTrcHis2Aと結紮し、さらに制限酵素SacI及びBglIIにより消化してゲル精製した。
結紮混合物をE. coli Top 10細胞中に形質転換し、コロニーをカルベニシリン50μg/mlを含有するLAプレート上で選択した。全部で6つのコロニーを選択し、カルベニシリン50μg/mlを含有するLB中で培養し、Qiagen kitを用いてプラスミドを単離した。挿入状態を確認するために、これらのプラスミドをSacI及びBglIIで消化し、次のプライマーにより1の正規のプラスミドについてシークエンシングを行った。

CF 07-58 (+) mvaE遺伝子の開始端
Figure 0006262125
 CF 07-59 (-) mvaE遺伝子の終端
Figure 0006262125
 CF 07-82 (+) mvaS遺伝子の開始端
Figure 0006262125
 CF 07-83 (-) mvaS遺伝子の終端
Figure 0006262125
 CF 07-86 (+) mvaE中の配列
Figure 0006262125
 CF 07-87 (+) mvaE中の配列
Figure 0006262125
 CF 07-88 (+) mvaE中の配列
Figure 0006262125
 CF 07-89 (+) mvaS中の配列
Figure 0006262125
シークエンシングによりpTrcHis2A上流経路#lと呼ばれるプラスミドが正規のものであることを確認し、市販のE. coli株BL21中に形質転換した。カルベニシリン50 μg/mlを含有するLA上で選択を行った。2つの形質転換体を選択し、カルベニシリン50μg/ml を含有するLB中で、OD600が1.5になるまで培養した。この2つの株を、グリセロールを添加したバイアルに入れ、-80℃で凍結させた。この2つの株について、BL21中に形質転換したpTrcHis2A上流経路#lの単離したサンプル#1をCF 449と命名し、BL21中に形質転換したpTrcHis2A上流経路#lの単離したサンプル#2をCF 450と命名した。いずれのクローンも、分析により同一の挙動を示すことが確認された。
＜pCL1920中への上流MVA経路のクローン化＞
プラスミドpTrcHis2A上流経路を、制限エンドヌクレアーゼSspIで消化してpTrc-mvaE-mvaS-(His tag)-ターミネータを含む断片を放出させた。この断片では、his-tagは翻訳されなかった。この平滑末端の4.5 kbpの断片を、Qiagen Gel Purification kitにより1.2% E-gelを用いて精製した。ベクターを制限エンドヌクレアーゼPvuIIで消化し、SAPで処理し、Qiagen Gel Purification kitにより1.2% E-gelを用いて精製することにより、pCL1920由来の脱リン酸化した平滑末端の4.2 kbpの断片を調製した。2つの断片をRoche Quick Ligation Kitを用いて結紮し、TOP10化学的コンピテント細胞中に形質転換した。形質転換体を、スペクチノマイシン(50 μg/ml)を含むLA上で選択した。PCRで正しく挿入されていることをスクリーニングすることにより、正規のコロニーを特定した。このプラスミドをpCL Ptrc上流径路 (図26及び27) と命名した。
＜VI. 上流及び下流メバロン酸経路の組合せを発現する株＞
全メバロン酸経路及びkudzuイソプレンシンターゼを備える株を得るため、プラスミドpTrcKKDyIkISkan及びプラスミドpCLpTrc上流経路を、BL21(λDE3) コンピテント細胞 (Invitrogen社) 中に形質転換した。この形質転換体を、カナマイシン(50μg/ml)及びスペクチノマイシン(50μg/ml)を含むLA上で選択した。形質転換体をプラスミドプレップで検査して両プラスミドが宿主中に組み入れられたことを確認した。この株をMCM127と命名した。
＜VII. E. coli上流経路 におけるグルコースからのメバロン酸の産出＞
BL21/pTrcHis2A-mvaE/mvaSまたはFM5/p pTrcHis2A-mvaE/mvaSの各シングルコロニーを、カルベニシリン (100 μg/ml)を含むLBにそれぞれ植菌し、200 rpmで振蕩しながら、37℃で一晩成長させた。これらの培養物を250 mlのバッフル付きフラスコ中の50 ml培地中に入れ、OD600が0.1になるまで希釈した。
用いた培地の組成は、TM3、1または2%グルコース、カルベニシリン(100μg/ml)、または、TM3、1%グルコース、加水分解大豆油、及びカルベニシリン(100μg/ml)、または、TM3及びバイオマス(調製したバガス、トウモロコシ茎葉、またはスイッチグラス)であった。
培養物を200rpmで振蕩しながら、OD600が0.4になるまで、30℃で約2-3時間成長させた。この時点でIPTG (400 μM) を添加することにより、mvaE mvaS構築体からの発現を誘導した。培養物をさらに20または40時間インキュベートした。誘導後6時間目まではサンプルを2時間おきに採取し、その後は必要に応じて24, 36 及び48時間後に採取した。サンプリングでは培養物1 mlを採取し、OD600を測定し、細胞をmicrofuge遠心分離機でペレット化し、次いで上清を採取してメバロン酸を分析した。
エンテロコカス・ファエカリス AA-CoAチオラーゼ、HMG-CoAシンターゼ、及びHMG-CoAリダクターゼポリペプチドをコードする核酸を備えるE. coli 細胞を、細胞培地としてグルコースを2%含むTM3培地を用いて14リットルスケールで発酵させたところ、22グラムのメバロン酸が産出された。
細胞培地としてグルコースを1%含むLB培地を用いて振蕩フラスコで発酵させたところ、1リットル当たり2-4グラムのメバロン酸が産出された。これらの株でメバロン酸が産出されたことがら、E. coli中でMVA経路が機能していることが確認された。
＜VIII. 上流及び下流MVA経路とkudzuイソプレンシンターゼを備えるE. coli BL21によるイソプレン産出＞
上記の上流及び下流MVA経路とkudzuイソプレンシンターゼ遺伝子と、実施例7に記載したidi, dxs, 及びdxr、及びイソプレンシンターゼ遺伝子を含むプラスミドとを様々に組み合わせて、以下の株を作った。使用した宿主細胞は化学的コンピテントBL21(λDE3)であった。形質転換は標準的な方法で行った。形質転換体は、カナマイシン(50 μg/ml)を含むLアガー、またはカナマイシンとスペクチノマイシン (両者とも濃度は50 μg/ml) を含むLアガーにより選択した。これらのプレートに塗布された細胞を、37℃で培養した。得られた株を以下のように命名した。

カナマイシンとスペクチノマイシンで培養 (各50 μg/ml)
MCM 127 - BL21(λDE3)中のpCL上流MVA及びpTrcKKDyIkIS (kan)
MCM 131 - BL21(λDE3)中のpCL1920及びpTrcKKDyIkIS (kan)
MCM 125 - BL21(λDE3)中のpCL上流MVA及びpTrcHis2B (kan)

カナマイシンで培養 (50 μg/ml)
MCM64 - BL21(λDE3)中のpTrcKudzu yIDI DXS (kan)
MCM50 - BL21(λDE3)中のpTrcKudzu (kan)
MCM123 - BL21(λDE3)中のpTrcKudzu yIDI DXS DXR (kan)
上記の各株の凍結保管した試料を、LAと適切な抗生物質を含むプレートに線状に塗布し、37℃で一晩培養した。各プレートのシングルコロニーを（25mlのLBと適切な抗生物質が入れられた）振蕩フラスコに植菌した。振蕩フラスコを200rpmで振蕩しながら、22℃で一晩培養した。翌朝、振蕩フラスコを37℃のインキュベータに移し、200rpmで振蕩しながら、37℃でさらに4.5時間培養した。
25mlの培養物を遠心分離して細胞をペレット化して、適切な抗生物質を含む5mlの LB中に再懸濁させた。次に、培養物を%グルコース及び適切な抗生物質を含む25mlのLBで、OD600が0.1になるまで希釈した。各株について、2つのフラスコで試験した。1つのフラスコではIPTG (800 μM)による誘導を行い、もう1つのフラスコでは誘導を行わなかった。
各培養物を250rpmで振蕩しながら、37℃で培養した。1.50時間後に、1つのフラスコの培養物を誘導した(この時点をサンプリング時点1とした)。各サンプリング時点でOD600を測定し、実施例1に記載した方法でイソプレンの量を測定した。結果をTable 3に示す。産出されたイソプレンの量は、その株のピーク産出における量で示した。
Figure 0006262125
＜IX. メバロン酸の分析＞
Sigma- Aldrich社製 (WI, USA) の、水(7.7 mL) に溶解されたシロップ状のメバロノラクトン(1.0 g、7.7 mmol) (CAS# 503-48-0)を水酸化カリウム(7.7 mmol)で処理して、メバロン酸のカリウム塩を生成させた。メバロン酸への転換は、1H NMR分析で確認した。
HPLC分析用のサンプルの調製では、先ず14,000rpmで5分間遠心分離して細胞を除去した後、得られた上清300μlを900μlのH2Oに添加した。次に、過塩素酸(70%溶液36μl)を添加し、混合して氷上で5分間冷却した。サンプルを再度遠心分離(14,000rpmで5分間)し、上清をHPLCに注入した。同様にして、メバロン酸標準液(20, 10, 5, 1 及び0.5 g/L)を調製した。
メバロン酸の分析(注入容積20μL)では、BioRad Aminex 87-H+ カラム(300mm×7.0 mm)を用い、5 mM硫酸を0.6 mL/分で流通させて溶出させ、屈折率(RI)検出器により測定した。この条件下で、メバロン酸がラクトンの形態で18.5分後に溶出した。
＜実施例９＞
＜バシラス・スブチリスに組み込むための上流及び下流MVA経路の構築＞
＜I.バシラス・スブチリスにおける上流MVA経路の構築＞
エンテロコカス・ファエカリス由来の上流MVA経路を、aprEプロモータで制御されたB.スブチリス中に組み込んだ。このMVA上流経路は、AACT及びHMGRをコードするmvaEと、HMGSをコードするmvaSの2種の遺伝子から成る。この2種の遺伝子は、これらの間に位置する終止コドンを介して融合されており、mvaSの前方にはRBSが位置し、aprEプロモータで制御されている。mvaE遺伝子の後方には、ターミネータが位置する。mvaE遺伝子と構築体を、相同の隣接領域を用いて二重交差によりaprEローカスに組み込んだ後、 クロラムフェニコール耐性マーカーをクローン化した。
4種のDNA断片を、これらの断片の各々がPCR反応により互いに融合できるようにするオーバーハングを備えるようにして、PCRで増幅した。PCR増幅は、Herculase polymeraseを製造者の取扱説明書に従って用いて行った。
1: PaprE
CF 07-134 (+) aprE プロモータPstIの開始端
Figure 0006262125
 CF 07-94 (-) PaprEをmvaEに融合
Figure 0006262125
 テンプレート：バシラス・スブチリス染色体DNA

2: mvaE
CF 07-93 (+) mvaEをaprEプロモータに融合 (GTG開始コドン)
Figure 0006262125
 CF 07-62 (-) RBSを間に介してmvaEをmvaSに融合
Figure 0006262125
 テンプレート：エンテロコカス・ファエカリス染色体DNA (ATCCから)

3. mvaS
CF 07-61 (+) RBSを間に介してmvaE をmvaSに融合
Figure 0006262125
 CF 07-124 (-) mvaSの末端をターミネータに融合
Figure 0006262125
 テンプレート：エンテロコカス・ファエカリス染色体DNA

4. バシラス・アミリケファシエンス(amyliquefaciens) アルカリセリンプロテアーゼ・ターミネータ
CF 07-123 (+) mvaSの末端をターミネータに融合
Figure 0006262125
 CF 07-46 (-) B. アミリケファシエンス・ターミネータBamHIの終端
Figure 0006262125
 テンプレート：バシラス・アミリケファシエンス染色体DNA

PCR融合反応

5. mvaEとmvaSの融合
CF 07-93 (+) mvaEをaprEプロモータに融合 (GTG開始コドン)
Figure 0006262125
 CF 07-124 (-) mvaSの末端をターミネータに融合
Figure 0006262125
 テンプレート：上記の2及び3

6. mvaE-mvaSをaprEプロモータに融合
CF 07-134 (+) aprEプロモータPstIの開始端
Figure 0006262125
 CF 07-124 (-) mvaSの末端をターミネータに融合
Figure 0006262125
 テンプレート：上記の1及び4

7. PaprE-mvaE-mvaSをターミネータに融合

CF 07-134 (+) aprEプロモータPstIの開始端
Figure 0006262125
CF 07-46 (-) B. アミリケファシエンス・ターミネータBamHIの終端
Figure 0006262125
 テンプレート：上記の4及び6
産品を制限エンドヌクレアーゼPstI/BamHIで消化し、PstI/BamHIで消化したpJM102 (Perego, M. 1993. Integrational vectors for genetic manipulation in Bacillus subtilis, p. 615-624. In A. L. Sonenshein, J. A. Hoch, 及びR. Losick (ed.), Bacillus subtilis and other gram- positive bacteria: biochemistry, physiology, and molecular genetics. American Society for Microbiology, Washington, D.C.参照) に結紮した。
結紮体をE.coli TOP 10化学的コンピテント細胞中に形質転換し、形質転換体をカルベニシリン(50 μg/ml)を含むLA上で選択した。シークエンシングにより正しいプラスミドを特定し、pJM上流経路2 (図50及び51) と命名した。精製したプラスミドDNAを、バシラス・スブチリスaprEnprE Pxyl-comK中に形質転換し、形質転換体をクロラムフェニコール (5 μg/ml)を含むLアガー上で選択した。
正しいコロニーを選択し、クロラムフェニコールを10, 15 及び25 μg/ml含むLアガー上に順次塗布して、上流経路を含むカセットの多数のコピーを増幅した。
得られた株を、1%グルコース及び1%を含むLBにおいて成長させて、メバロン酸産出の試験を行なった。培養物をGCで分析してメバロン酸産出の分析を行った。
次に、この株を宿主として用いて、下流メバロン酸経路を組み込んだ。
上記の種々の構築体のシークエンシングには、以下のプライマーを用いた。

シークエンシングプライマー：
CF 07-134 (+) aprEプロモータPstIの開始端
Figure 0006262125
 5'- GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC (SEQ ID NO:82)

CF 07-58 (+) mvaE遺伝子の開始端
Figure 0006262125
 CF 07-59 (-) mvaE遺伝子の終端
Figure 0006262125
 CF 07-82 (+) mvaS遺伝子の開始端
Figure 0006262125
 CF 07-83 (-) mvaS遺伝子の終端
Figure 0006262125
 CF 07-86 (+) mvaE中の配列
Figure 0006262125
 CF 07-87 (+) mvaE中の配列
Figure 0006262125
 CF 07-88 (+) mvaE中の配列
Figure 0006262125
 CF 07-89 (+) mvaSの配列
Figure 0006262125
形質転換体を、クロラムフェニコールを5 μg/ml含むLA上で選択した。シークエンシングにより、1つのコロニーが正しい組込みを有することが確認された。このコロニーを、クロラムフェニコールの濃度が次第に増加し、最終的に25 μg/mlに達するLA上に塗布して、数日にわたり培養した。これにより、対象とする遺伝子を含むカセットを増幅させた。得られた株を、CF 455: pJM上流経路#l Xバシラス・スブチリス aprEnprE Pxyl comKと命名した (クロラムフェニコールを25 μg/ml含むLA上で成長するように増幅)。
＜II. バシラス・スブチリス中の下流MVA経路の構築＞
mvkl, pmk, mpd 及び idi遺伝子を含む下流MVA経路を、B.スブチリス染色体 (組込み部位) のnprE領域由来の隣接DNA領域、aprEプロモータ、及びスペクチノマイシン耐性マーカーを含むカセット中に組み込んだ(図28及び29参照)。このカセットをDNA2.0により合成し、aprEローカスに組み込まれた上流MVA経路を有するB. スブチリス染色体中に組み込んだ。実施例4に記載した複製プラスミドからkudzuイソプレンシンターゼ遺伝子を発現させて、上流及び下流経路の両者の組合せを備える株中に形質転換した。
＜実施例１０＞
＜M. マゼイメバロン酸キナーゼ及びP. アルバイソプレンシンターゼを発現するE. coliにおけるイソプレンの産出＞
＜I. M. マゼイメバロン酸キナーゼ (MVK) 及びP. アルバイソプレンシンターゼを発現するベクター及び株の構築＞
＜(i) EWL201 (BL21, Cm-GI1.2-KKDyI) 株の構築＞
MCM331 Pl 溶解物で形質導入されたE. coli BL21 (商品名Novagen brand, EMD Biosciences, Inc.社) を受容菌に用いた。MCM331 Pl 溶解物は、Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, Inc.に記載された方法に従って調製された溶解物である。形質導入株クロラムフェニコールを20 μg/μl含むLアガー上に塗布して選択した。このプレートを30℃で一晩インキュベートした。形質導入株を分析した結果、コントロールのプレート上にはコロニーは認められなかった。（復帰試験用の水+細胞のコントロールプレート、及び溶解物混入試験用の水とPl溶解物のコントロールプレート）。
4種の形質導入株を採取して、クロラムフェニコール20 μg/μlを含むLブロス5mLに植菌した。培養物を200rpmで振蕩しながら、30℃で一晩成長させた。各形質導入株のPCR分析用の遺伝子DNAプレップを調製するために、一晩培養した細胞培養物1.5mLを遠心分離した。
細胞のペレットを、400μl の再懸濁緩衝液(20mM Tris, 1mM EDTA, 50mM NaCl, pH 7.5)中に再懸濁させ、DNase-フリーRNase(Roche社) 4μlを添加した。チューブを37℃で30分間インキュベートした後、4μlの10%SDSと、4μlの10mg/ml Proteinase Kストック溶液 (Sigma- Aldrich社) とを添加した。チューブを37℃で1時間インキュベートした。
細胞溶解物を複数本の2ml Phase Lock Light Gel チューブ(Eppendorf社) に移し、それぞれにpH7.9の飽和フェノール(Ambion Inc. 社) 200μlと、クロロホルム200μlを添加した。チューブをよく振り混ぜ、微小遠心分離を5分間行なった。
クロロホルム400μlを用いて2回目の抽出を行い、水層を新品のエッペンドルフチューブに移した。100%エタノール1mlを添加して5分間遠心分離することにより、ゲノムDNAを沈殿させた。ゲノムDNAのペレットを70%エタノール1mlで洗浄した。エタノールを除去し、ゲノムDNAペレットをしばらく風乾した。200μlのTE中にゲノムDNAペレットを再懸濁させた。
PfU Ultra II DNA ポリメラーゼ (Stratagene社)と、テンプレートの200ng/μlのゲノムDNAとを用い、製造者の取扱説明書に従って2種類のPCR反応液をチューブ内に調製した。第1のPCR反応液では、形質導入体が確実にattTn7 ローカスに組み込まれるように、MCM 130プライマー及びGB Cm-Revプライマー (Table 4)を用いた。第1のPCR反応液のPCR条件は、95℃で2分間 (最初のサイクルのみ), 95℃で25秒間、55℃で25秒間、72℃で25秒間 (ステップ2-4を28回繰り返した)、72℃で1分間であった。
第2のPCR反応液では、gi1.2-KKDyIオペロンが正しく組み込まれるようにMVD Forプライマー及びMVD Revプライマー (Table 4) を用いた。第2のPCR反応液のPCR条件は、95℃で2分間 (最初のサイクルのみ), 95℃で25秒間、55℃で25秒間、72℃で10秒間 (ステップ2-4を28回繰り返した)、72℃で1分間であった。
1.2% E-gel (Invitrogen Corp.社) 上でのPCRアンプリコンの分析により、4つの形質導入体クローンのすべてが正しいことが確認された（1つを採取し、EWL201株と命名した）。
ii) EWL204株の構築 (BL21、ループアウト-GI1.2-KKDyI)
DatsenkoとWanner (2000)らの方法(Datsenko et al, Proc Natl. Acad. Sci USA 97:6640-6645, 2000) により、プラスミドpCP20を用いてEWL201株からクロラムフェニコールマーカーをループアウトさせた。
PCR産品を用いて、エシェリキアcoli K-12中の染色体遺伝子の一段階不活性化を行った(Datsenko et al., PNAS, 97: 6640-6645, 2000)。Lブロス中でEWL201細胞を対数期の中間部まで成長させ、氷冷滅菌水で3回洗浄した。細胞懸濁液のサンプル50μlと、1μlのpCP20とを混合し、Gene Pulser Electroporator (Bio-Rad Inc.社)を用い、2mmのキュベット(Invitrogen Corp.社) 中で2.5 ボルト及び25μFdの条件下で細胞懸濁液混合物をエレクトロポレートした。
1mlのLBを手早く細胞に添加し、次に金属製キャップ付きの14mlポリプロピレンチューブ(Sarstedt社) に入れた。細胞を30℃で1時間成長させて、回復させた。形質転換体を、20μg/μlのクロラムフェニコール及び50μg/μlのカルベニシリンを含むL アガー上で30℃において一晩インキュベートして選択した。
翌日、シングルコロニーを50μg/μlのカルベニシリンを含むL ブロス10ml中で、対数増殖期に達するまで30℃において成長させた。次に、成長培地の温度を42℃に変更して2時間培養した。段階希釈を行い、次に細胞をLAプレート（抗生物質選択無し）上に塗布し、30℃で一晩インキュベートした。
翌日、20個のコロニーを採取してL アガープレート (抗生物質無し) 、及び 20μg/μlのクロラムフェニコールを含むLAプレート上に植えつけた。これらのプレートを30℃で一晩インキュベートした。LAプレート上で成長するが、20μg/μlのクロラムフェニコールを含むLAプレート上では成長しない細胞を、クロラムフェニコールマーカーがループアウトした細胞と見なした（1つを採取し、EWL204株と命名した）。
iii) プラスミドpEWL230 (pTrc P. アルバ) の構築
ポプラ・アルバ・イソプレンシンターゼ(P. alba HGS) をコードする合成遺伝子は、E. coli発現コドン最適化手法を有するDNA2.0 Inc.社 (Menlo Park, CA) に依頼した。この合成遺伝子をプラスミドpET24a(商品名Novagen、EMD Biosciences, Inc.社) 中に特注でクローン化し、凍結乾燥された形態で入手した(図54, 55A及び55B参照)。
PCR反応によりP.アルバイソプレンシンターゼ (P. alba HGS) 遺伝子を増幅した。このPCR反応ではテンプレートとしてのpET24 P. アルバHGSと、MCMl 82プライマー、及びMCM 192プライマーとを用い、さらにHerculase II Fusion DNAポリメラーゼ (Stratagene社) を製造者の取扱説明書に従って用いた。PCR反応条件は次の通りであった：95℃で2分間 (最初のサイクルのみ)、95℃で25秒間、55℃で20秒間、72℃で1分間、これを25回繰り返し、最後に72℃で3分間。
P.アルバイソプレンシンターゼPCR産品は、QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen Inc.社) により精製した。
次に、P.アルバイソプレンシンターゼPCR産品を、1μlのBspHI エンドヌクレアーゼ (New England Biolabs社) と2μlの10X NEB Buffer 4とを含む20μlの反応液中で消化した。反応液を37℃で2時間インキュベートした。消化されたPCR断片をQIAquick PCR Purification Kitを用いて精製した。
2回目の制限酵素消化は、lμlのPstIエンドヌクレアーゼ(Roche社) と2μlの10X Buffer Hとを含む20μlの反応液中で行った。反応液を37℃で2時間インキュベートした。消化されたPCR断片を、QIAquick PCR Purification Kitを用いて精製した。
プラスミドpTrcHis2B (Invitrogen Corp.社) を、lμlのNcol エンドヌクレアーゼ(Roche社)、1μlのPstI エンドヌクレアーゼ、及び2μlの10X Buffer Hを含む20μlの反応液中で消化した。反応液を37℃で2時間インキュベートした。消化されたpTrcHis2Bベクターを、1.2% E-gel (Invitrogen Corp.社) を用いてゲル精製し、QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen社) (図56参照) を用いて抽出した。
BspHI 及び NcoI部位の適合性付着端を用いて、5μlのP.アルバイソプレンシンターゼ挿入、2μlのpTrcベクター、1μlのT4 DΝAリガーゼ (New England Biolabs社)、2μlの10X リガーゼ緩衝液、及び10μlのddH2Oを含む20μlの結紮反応液を調製した。
結紮混合物を室温で40分間インキュベートした。ddH2Oの入ったペトリ皿に浮かせた0.025μmのニトロセルロース濾過膜 (Millipore社) 上に結紮混合物を静かに注ぎ、室温に30分間置くことにより、結紮混合物の脱塩化を行った。MCM446細胞（セクションII参照）をLB中で対数期の中間部まで成長させ、次に氷冷滅菌水で3回洗浄した。細胞懸濁液のサンプル50μlと、脱塩化したpTrc P.アルバ HGS結紮混合物5μlとを混合物した。
細胞懸濁液を、Gene Pulser Electroporator (Bio-Rad Inc.社)を用い、2mmのキュベット(Invitrogen Corp.社) 中で2.5 ボルト及び25μFdの条件下でエレクトロポレートした。1mlのLBを手早く細胞に添加し、次に金属製キャップ付きの14mlポリプロピレンチューブ(Sarstedt社) に入れた。細胞を30℃で2時間成長させて、回復させた。
形質転換体を、50μg/μlのカルベニシリン及び10mMのメバロン酸を含むL アガープレート上で30℃においてインキュベートして選択した。翌日、6個の形質転換体を採取し、それぞれ50μg/μlのカルベニシリンを含むL ブロス5mlが入れられたチューブの中で、30℃において一晩成長させた。QIAquick Spin Miniprep Kit (Qiagen社) を用いて、一夜培養物についてプラスミドプレップを行った。
プラスミドの増殖にBL21細胞を用いたため、より高品質のプラスミドDNAを得ることを目的として、製造者の取扱説明書に記載された手順に加え、遠心分離カラムをPB Buffer 5X 及びPE Buffer 3Xで洗浄した。
正しいサイズの線状断片を得るために、プラスミドを20μl反応液中のPstIで消化した。6種のプラスミドはいずれも正しいサイズであった。この6種のプラスミドを、Quintara Biosciences社 (Berkeley, CA)へ送り、MCM65プライマー、MCM66プライマー、EL1000プライマー(Table 4参照)によるシークエンシングを行った。DNAのシークエンシングの結果、6種のプラスミドはいずれも正しいことが分かった。
1つのプラスミドを採取し、EWL230と命名した (図57, 58A 及び58B参照)。
iv) プラスミドpEWL244 (pTrc P.アルバ-mMVK)の構築
PCR反応によりメタロサルキナ・マゼイ(M mazei)MVK遺伝子を増幅した。このPCR反応ではテンプレートとしてのMCM376と(セクションv参照)、MCM 165プライマー、及びMCM 177プライマーとを用い、さらにPfu Ultra II Fusion DNAポリメラーゼ (Stratagene社) を製造者の取扱説明書に従って用いた。PCR反応条件は次の通りであった：95℃で2分間 (最初のサイクルのみ)、95℃で25秒間、55℃で20秒間、72℃で18秒間、これを28回繰り返し、最後に72℃で1分間。
M.マゼイMVK PCR産品は、QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen Inc.社) により精製した。
次に、M.マゼイMVK PCR産品を、8μlのPCR産品、2μlのPmeIエンドヌクレアーゼ (New England Biolabs社)、4μlの10X NEB Buffer 4、4μlの10X NEB BSA、及び22μlのddH2Oを含む40μlの反応液中で消化した。反応液を37℃で3時間インキュベートした。消化されたPCR断片をQIAquick PCR Purification Kitを用いて精製した。
2回目の制限酵素消化は、2μlのNsiIエンドヌクレアーゼ(Roche社) と、4.7μlの10X Buffer Hと、40μl のPmeI消化M.マゼイMVK断片を含む47μlの反応液中で行った。反応液を37℃で3時間インキュベートした。消化されたPCR断片を1.2% E-geを用いてゲル精製し、次いでQIAquick Gel Extraction Kitを用いて抽出した。
プラスミドEWL230を、10μlのプラスミド、2μlのPmeIエンドヌクレアーゼ、4μlの10X NEB Buffer 4、4μlの10X NEB BSA、及び20μlのddH2Oを含む40μlの反応液中で消化した。反応液を37℃で3時間インキュベートした。消化されたPCR断片を、QIAquick PCR Purification Kitを用いて精製した。
2回目の制限酵素消化は、2μlのPstIエンドヌクレアーゼ、4.7μlの10X Buffer H、及び40μlのPmeI 消化EWL230線状断片を含む47μlの反応液中で行った。反応液を37℃で3時間インキュベートした。消化されたPCR断片を1.2% E-gelを用いてゲル精製し、QIAquick Gel Extraction Kitを用いて抽出した(図59参照)。
NsiI及びPstI部位の適合性付着端を用いて、8μlの M.マゼイMVK挿入、3μlのEWL230プラスミド、1μlのT4 DΝAリガーゼ、2μlの10X リガーゼ緩衝液、及び6μlのddH2Oを含む20μlの結紮反応液を調製した。結紮混合物を16℃で一晩インキュベートした。翌日、ddH2Oの入ったペトリ皿に浮かせた0.025μmのニトロセルロース濾過膜上に結紮混合物を静かに注ぎ、室温に30分間置くことにより、結紮混合物の脱塩化を行った。
MCM446細胞をLB中で対数期の中間部まで成長させ、次に氷冷滅菌水で3回洗浄した。細胞懸濁液のサンプル50μlと、脱塩化したpTrc P.アルバ-mMVK結紮混合物5μlとを混合物した。細胞懸濁液を、Gene Pulser Electroporatorを用い、2mmのキュベット中で2.5 ボルト及び25μFdの条件下でエレクトロポレートした。
1mlのLBを手早く細胞に添加し、次に金属製キャップ付きの14mlポリプロピレンチューブに入れた。細胞を30℃で2時間成長させて、回復させた。形質転換体を、50μg/μlのカルベニシリン及び5mMのメバロン酸を含むLAプレート上で30℃においてインキュベートして選択した。
翌日、6個の形質転換体を採取し、それぞれ50μg/μlのカルベニシリンを含む5mlのLBが入れられたチューブの中で、30℃において一晩成長させた。
QIAquick Spin Miniprep Kitを用いて、一夜培養物についてプラスミドプレップを行った。プラスミドの増殖にBL21細胞を用いたため、より高品質のプラスミドDNAを得ることを目的として、製造者の取扱説明書に記載された手順に加え、遠心分離カラムをPB Buffer 5X 及びPE Buffer 3Xで洗浄した。
正しいサイズの線状断片を得るために、プラスミドを20μl反応液中のPstIで消化した。
6種のプラスミドの内3種が正しいサイズであった。この3種のプラスミドを、Quintara Biosciences社 へ送り、MCM65プライマー、MCM66プライマー、EL1000プライマー、EL1003プライマー、及びEL1006プライマー (Table 4参照)によるシークエンシングを行った。DNAのシークエンシングの結果、3種のプラスミドはいずれも正しいことが分かった。1つのプラスミドを採取し、EWL244と命名した (図60及び61A-B参照)。
v) pET200DにおけるM.マゼイ古細菌下流経路由来のプラスミドMCM376 - MVKの構築
Invitrogen Platinum HiFi PCR mix及びプライマーMCM161 及び MCMl 62 (Table 4) を用いて、M. マゼイ古細菌下流経路オペロン (図73A-C) 由来のMVK ORFをPCR増幅した。
45μLのPCR mixを、1μLのテンプレート、濃度10μMの各プライマー1 μL、及び2 μLの水と混合した。PCR反応のサイクルは次の通りである：94℃で2分間；94℃で30秒、55℃で30秒、68℃で1分15 秒のサイクルを30回；次に72℃で7分間、次に4℃まで冷却。
このPCR産品3μLを、Invitrogen社のpET200Dプラスミドに、製造者の取扱説明書に従って結紮した。この結紮混合物3μLを、Invitrogen社のTOP10細胞に導入し、形質転換体をLA/kan50上で選択した。形質転換体からプラスミドを単離し、挿入のシークエンシングを行い、MCM376 (図74A-C) を得た。
vi) EWL251株 (BL21(DE3), Cm-GI 1.2-KKDyI, pTrc P.アルバ-mMVK) の構築
MCM331細胞 (S.セレビシアエ・メバロン酸キナーゼ、メバロン酸ホスフェートキナーゼ、メバロン酸ピロホスフェートデカルボキシラーゼ、及びIPPイソメラーゼをコードする染色体構造体gil.2KKDyIを備える) をLB中で対数期の中間部まで成長させ、次に氷冷滅菌水で3回洗浄した。
50μlの細胞懸濁物を、1μlのプラスミドEWL244と混合した。細胞懸濁液を、Gene Pulser Electroporatorを用い、2mmのキュベット中で2.5 ボルト及び25μFdの条件下でエレクトロポレートした。
1mlのLBを手早く細胞に添加し、次に金属製キャップ付きの14mlポリプロピレンチューブに入れた。細胞を30℃で2時間成長させて、回復させた。形質転換体を、50μg/μlのカルベニシリン及び5mMのメバロン酸を含むLAプレート上で37℃においてインキュベートして選択した。1つのコロニーを選択し、EWL251株と命名した。
vii) EWL256株 (BL21(DE3), Cm-GIl .2-KKDvI, pTrc P.alba-mMVK, pCL 上流MVA) の構築
EWL251細胞をLB中で対数期の中間部まで成長させ、次に氷冷滅菌水で3回洗浄した。50μlの細胞懸濁物を、1μlのプラスミドMCM82と混合した。（プラスミドMCM82は、エンテロコカス・ファエカリスのmvaE及びmvaSをコードするpCL Ptrc上流回路である。）細胞懸濁液を、Gene Pulser Electroporatorを用い、2mmのキュベット中で2.5 ボルト及び25μFdの条件下でエレクトロポレートした。
1mlのLBを手早く細胞に添加し、次に金属製キャップ付きの14mlポリプロピレンチューブに入れた。細胞を30℃で2時間成長させて、回復させた。形質転換体を、50μg/μlのカルベニシリン及び50μg/μlの スペクチノマイシンを含むLAプレート上で37℃においてインキュベートして選択した。1つのコロニーを選択し、EWL256株と命名した。
Figure 0006262125
＜MCM442-449の構築：FRT-cmR-FRT-gil.x-mKKDylを備えるBL21及びBL21(DE3)
i) 遺伝子組み換え用のテンプレートの構築
FRT-組み換えカセット、及びRed/ET-媒介組込み用プラスミド、及び抗生物質マーカーループアウトはGene Bridges GmbH (Germany) から入手した。これらの材料を、Gene Bridgesの取扱説明書に従って用いた。Stratagene Herculase II Fusion kitを製造者の取扱説明書に従って使用し、プライマーMCMl 93 及びMCM 195を用いてFRT-gb2-Cm-FRTテンプレート由来の耐性カセットを増幅した。50μLのPCR反応のサイクルは次の通りであった：95℃で2分間； (95℃, 20秒間, 55℃, 20秒間, 72°C, 1分間)×5回, (95℃, 20秒間, 60℃, 20秒間, 72℃, 1分間)×25回；72℃, 3分間；4℃まで冷却。Qiagen PCRカラムを製造者の取扱説明書に従って用いてアンプリコンを精製し、30μLのEB (溶出緩衝液) で溶出させた。
DNAを、1x Roche H 緩衝液及び0.5μLのBSAを含む20μLの反応溶液中で、NdeI及びPciIにより消化した。
プラスミドMCM376を、Ndel及びNcol各1μLと、Roche H 緩衝液とを含む10μLの反応溶液中で消化した。37℃で一晩反応させ、DNA断片をQiagen PCRカラムで精製し、30μL EBで溶出させた。
PCR産品を、1μLのベクター, 3μLのPCR産品, 1μLのRoche Quick Ligase Buffer2, 5μLのBuffer1,及び1μLのLigaseを含む反応液中で、MCM376に結紮した。室温で3時間反応させ、次に5μLをInvitrogen TOP10細胞中に、製造者の取扱説明書に従って形質転換した。得られた形質転換体を、クロラムフェニコール (10μg/mLO)を含むL アガー(LA)上で、37℃で一晩成長させて選択した。
形質転換体のコロニーを、貯蔵用のクロラムフェニコール(30 μg/mL) 及びカナマイシン(50 μg/ml) を含むLA上に植えつけ、Quintara (Berkeley, CA) へ送ってシークエンシングを行った。4種のクローンが、プロモータが挿入された正しい配列を有することが分かった。この4種のクローンでは、プライマーMCM195の"N"にそれぞれ異なる計4種のヌクレオチドが結合していた。これらのクローンをクロラムフェニコール(30 μg/mL) 及びカナマイシン(50 μg/mL) を含む5mLの LB中で成長させ、プラスミドDNAの調製に用いた。このプラスミドをTOP10細胞中に形質転換し、下記の株として凍結した。
Figure 0006262125
ii) 遺伝子組み換えターゲット株MCM349 及び MCM441の構築
プラスミドpGB706 (GeneBridges社)を製造者の取扱説明書に従って用いて、MCM331株からクロラムフェニコール耐性マーカーをループアウトさせた。MCM331細胞をLB中で対数期の中間部まで成長させ、次に氷冷滅菌水で3回洗浄した。
1μlのpGB706 DNAを50μLの細胞懸濁液に添加し、この混合物を2mmのキュベット中で2.5 ボルト及び25μFdの条件下でエレクトロポレートし、直ちに500μLのLBを用いて30℃で1時間処理して回復させた。得られた形質転換体を、テトラサイクリン(5μg/ml)を含むLB中で30℃において選択した。翌日、1つのクローンを、テトラサイクリン(5μg/ml)を含むLB中で不透明 (OD600が0.5-0.8) になるまで30℃において成長させた。この培養物をLBに塗布し、37℃で一晩成長させた。
クロラムフェニコール(10 μg/mL) またはテトラサイクリン(5 μg/mL) を含むLB中で成長できなかったクローンを、MCM348として凍結した。プラスミドMCM356 (pRedETカルベニシリン; GeneBridges社) を上記のようにしてエレクトロポレートし、得られた形質転換体を、カルベニシリン(50 μg/mL)を含むLBを用いて30℃において選択した。1つのクローンをカルベニシリン(50 μg/mL)を含むLB中で30℃において成長させ、MCM349として凍結した。
上記のようにしてプラスミドMCM356をEWL204中にエレクトロポレートすることにより、MCM441株を調製した。
iii) MCM349及びMCM441中へのFRT-cmR-FRT-gil.x-mMVKの遺伝子組み換え
プラスミドMCM484〜487をテンプレートとして用い、プライマーにMCM 120及びMCM 196を用い、Herculase II Fusion kitを製造者の取扱説明書に従って用いて、PCR増幅を行った。1つのテンプレートに付き、DMSOが0, 1,または3μLの3水準についてPCR反応を行った。50μLでのPCR反応は、次のサイクルで行った：95℃で2分間； (95℃, 20秒間, 55℃, 20秒間, 72°C, 1.5分間)×5回, (95℃, 20秒間, 60℃, 20秒間, 72℃, 1.5分間)×25回；72℃, 3分間；4℃で一晩。
各テンプレートの3水準の反応液を保管し、Qiagen PCRカラムで精製し、60℃において30μLのEBで溶出させた。5μLのDNAを、1x Roche Buffer A中の1μLのDpnIを用いて、37℃で3時間消化させた。このDNAを過剰の水に対して30分間ミクロ透析した。
各株を、カルベニシリン(50 μg/mL)を含む5mLのLB中で30℃において、OD600〜0.5になるまで成長させた。40mMのL-アラビノースを添加し、培養物を37℃で1.5時間インキュベートした。細胞を回収し、上記の透析したアンプリコンを用いてエレクトロポレートし、次いで、500μLのSOC中で37℃において1.5〜3時間回復させた。形質転換体を、クロラムフェニコール(5 ug/mL)を含むLAプレートを用いて37℃で選択した。
カナマイシン感受性クローンを、アンプリコン挿入のPCRによりスクリーニングした。陽性クローンのPCR産品のシークエンシングにより、DNAに挿入された配列を分析した。アンプリコンはMCM441中のattTn7のFRT-gil.2-yKKDyI、及びFRT-cmR-FRT-gil.x-mKKDyl (yKとmKはそれぞれサッカロミセス・セレビシアエ由来のメバロン酸キナーゼとメタロサルキナ・マゼイ由来のメバロン酸キナーゼ を表わす)で置換されたMCM348と一致した。
Figure 0006262125
Figure 0006262125
＜III. 15-Lスケールの流加培養法での、メバロン酸経路由来の遺伝子を発現するE. coliによるイソプレン産出における酵母エキス添加効果＞
培地の組成は以下の通りである（発酵培地1リットル当り）。
K2HPO4 7.5g, MgSO4 * 7H2O 2g, クエン酸一水和物 2g, クエン酸第二鉄アンモニウム 0.3g, 酵母エキス 0.5g, 1000X Modified Trace Metals Solution 1ml。 全ての成分を一度に添加し、diH2Oに溶解させた。この溶液をオートクレーブで滅菌した。水酸化アンモニウム(30%)でpHを7.0に調整し、所定の容積にした。培地を、0.22ミクロンのフィルターで濾過滅菌した。滅菌処理及びpH調整した後、グルコース10g, チアミン*HCl 0.1g, 及び抗生物質を添加した。
1000X Modified Trace Metal Solutionの組成は以下の通りである。
クエン酸* H2O 40g、MnSO4*H2O 30 g、NaCl 10g、FeSO4*7H2O 1g、CoCl2*6H2O 1g、ZnSO4*7H2O 1g、CuSO4*5H2O 100mg、H3BO3 100mg、NaMoO4*2H2O 100mg。各成分を一度にdiH2Oに添加して溶解させ、HCl/NaOHでpHを3.0にし、次に容積を調整し、0.22μのフィルターで濾過滅菌する。
発酵は、15-L バイオリアクター中で、上流メバロン酸(MVA)経路(pCL Upper), 組み込まれた下流MVA経路 (gil.2KKDyI), 及びM.マゼイ由来の高発現メバロン酸キナーゼ、及びP.アルバ(pTrcAlba-mMVK)由来のイソプレンシンターゼを備えるBL21 (DE3) E. coli細胞を用いて行った。
この試験は、pH7.0で温度30℃の発酵におけるグルコースによるイソプレン産出を測定するために行った。凍結したバイアルを解凍し、トリプトン-酵母エキス培地に植菌した。接種材料が成長して550nmで測定した光学密度が1.0になったとき、開始時の内容積を5Lにした15L バイオリアクターに500mLの接種材料を植菌した。
i) 酵母エキス無添加で流加培養法により成長させたE.coli細胞(EL256) におけるイソプレン産出
E.coli細胞が定常期になるまで、グルコースを指数関数的に供給した。その後、グルコース供給量を代謝上必要な量まで低下させた。67時間の発酵の間、バイオリアクターに供給したグルコースの総量は3.9kgであった。誘導は、イソプロピル-ベータ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG) を添加することにより行った。
550nmの光学密度(OD550)が9になったとき、IPTGの濃度を102μMにした。OD550が140になったとき、IPTGの濃度を192μMに増加させた。発酵中のバイオリアクター内のOD550の変化を図67Aに示す。バイオリアクターからのオフガス中のイソプレン濃度は、Hiden質量スペクトロメータにより測定した。発酵中イソプレンの力価が増加し、最終的に35.6 g/L (図67B) に達した。67時間の発酵の間に産出されたイソプレンの総量は320.6 gであった。
イソプレン産出総量の経時変化を図67Cに示す。TCERで測定した代謝活性の経時変化を図67Dに示す。発酵中にイソプレン産出に消費された炭素のモル収率は17.9%であった。グルコースに対するイソプレンの収率（重量パーセント）は8.1%であった。
酵母エキスを添加して流加培養法により成長させたE.coli細胞(EL256) におけるイソプレン産出
E.coli細胞が定常期になるまで、グルコースを指数関数的に供給した。その後、グルコース供給量を代謝上必要な量まで低下させた。68時間の発酵の間、バイオリアクターに供給したグルコースの総量は7.1kgであった。また、発酵の間に添加した酵母エキスの総量は1.06kgであった。誘導は、IPTGを添加することにより行った。550nmの光学密度(OD550)が7になったとき、IPTGの濃度を208μMにした。OD550が180になったとき、IPTGの濃度を193μMに増加させた。発酵中のバイオリアクター内のOD550の変化を図68Aに示す。バイオリアクターからのオフガス中のイソプレン濃度は、Hiden質量スペクトロメータにより測定した。発酵中イソプレンの力価が増加し、最終的に32.2 g/L (図68B) に達した。68時間の発酵の間に産出されたイソプレンの総量は395.5gであった。イソプレン産出総量の経時変化を図68Cに示す。
容積生産性の経時変化を図68Dに示す。この図から23時間目から63時間目までの間、平均速度1.1 g/L/hrで維持されることが分かる。CERで測定した代謝活性の経時変化を図68Eに示す。
発酵中にイソプレン産出に消費された炭素のモル収率は10.3%であった。グルコースに対するイソプレンの収率（重量パーセント）は5.2%であった。
＜IV. メバロン酸(MVA)経路とイソプレンシンターゼ(EWL256)を含むE. coliにおける異なる炭素源からのイソプレン産出＞
培地の組成は以下の通りである（発酵培地1リットル当り）。
K2HPO4 13.6g, KH2PO4 13.6g, MgSO4 * 7H2O 2g, クエン酸一水和物 2g, クエン酸第二鉄アンモニウム 0.3g, (NH4)2SO4 3.2g, 酵母エキス 1g, 1000X Modified Trace Metals Solution 1ml。 全ての成分を順次添加し、diH2Oに溶解させた。水酸化アンモニウム(30%)でpHを6.8に調整し、所定の容積にした。培地を、0.22ミクロンのフィルターで濾過滅菌した。炭素源は、最終濃度が1%になるように添加した。滅菌処理及びpH調整した後、必要な抗生物質を添加した。
1000X Trace Metal Solutionの組成は以下の通りである（発酵培地1リットル当り）。
クエン酸* H2O 40g、MnSO4*H2O 30g、NaCl 10g、FeSO4*7H2O 1g、CoCl2*6H2O 1g、ZnSO4*7H2O 1g、CuSO4*5H2O 100mg、H3BO3 100mg、NaMoO4*2H2O 100mg。各成分を一度にdiH2Oに添加して溶解させ、HCl/NaOHでpHを3.0にし、次に容積を調整し、0.22μのフィルターで濾過滅菌する。
i) AFEXバイオマス加水分解物の調製
AFEX前処理済トウモロコシ茎葉を加水分解して、キシロース、グルコース、及びアセテートを含むバイオマス加水分解物を調製した。
Michigan Biotechnology Instituteから入手したAFEX前処理済トウモロコシ茎葉を使用した。前処理は、水分60%, 1 : 1 アンモニア, 及び90℃で30分間処理し、その後、風乾して行った。AFEX前処理済トウモロコシ茎葉中の水分は21.27%であった。AFEX前処理済トウモロコシ茎葉中グルカンとキシランの含有量は、それぞれ31.7%及び19.1% (乾燥ベース) であった。使用した酵素はaccellerase 1000, Grindamyl H121 (Danisco社のアスペルギルス・ニガー由来キシラナーゼ、製パン用)であった。
糖化は、20gのAFEX前処理済トウモロコシ茎葉を500mlのフラスコに入れ、さらに5mlの1 Mクエン酸ナトリウム緩衝液(pH 4.8)、2.25mlのAccellerase 1000、0.1 mlのGrindamyl H121、及び72.65 mlのDI水を添加して行なった。このフラスコをオービタルシェーカーに取り付け、50℃で96時間インキュベートした。
分析は、フラスコからサンプルを採取してHPLCを用いて分析した。加水分解物には37.2g/1のグルコース、24.3g/Lのキシロース、及び7.6g/Lのグルコースおよび／またはキシロースのオリゴマーが含まれていた。また加水分解物には1.17 g/Lのアセテートが含まれていた。
ii) 試験方法
MVA経路及びイソプレンシンターゼを含むE. coli 株EWL256植種材料を、凍結したバイアルから採取し、スペクチノマイシン(50 μg/mL)とカルベニシリン(50 μg/mL)を含むLBブロスアガープレートに塗布し、300Cで一晩インキュベートした。シングルコロニーをグルコース、キシロース、グリセロール、アセテートまたはバイオマスのいずれかを唯一の炭素源として含むTM3培地に植菌し、30℃で一晩成長させた。
アセテート上で成長させた細胞の光学密度は著しく低い値であった。グルコース、グリセロール、バイオマス加水分解物、またはアセテート上で成長させた細胞を、各炭素源を含む20 mLのTM3倍地中に、600nmで測定した光学密度が0.1の間になるまで希釈した。炭素源を含まない陰性コントロールを、グルコースの一夜培養物を用いて調製した。
別の試験ではグルコースとキシロースを用い、培養物を光学密度が0.5になるまで希釈して行った。全ての培養物（アセテートとグリセロールを除く）について二回試験を行ない、試験結果はこれらの平均値で表示した。誘導は、試験開始時に200μMのIPTGを添加することにより行なった。フラスコをオービタルシェーカー(200rpm)に取り付けて30℃でインキュベートた後、光学密度を測定した。
グルコースを添加した培養物の光学密度が約0.4になったとき、評価する全ての炭素源のサンプルについて、イソプレン産出を1時間ごとに分析する試験を3時間にわたり行なった。複数本の2 mLガラス製バイアルの各々に100μLのサンプルを入れ、密封して30℃で30分間インキュベートした。その後、80℃で8分間インキュベートして、細菌を熱殺菌した。産出されたイソプレンの量をGC-MSを用いて測定し、固有生産性(μg/L*hr) を計算した。
iii) 結果
評価した全ての炭素源による細胞成長において、顕著な量のイソプレン産出が認められた。これらの実施例に用いた炭素源は、一般的なアルコール、有機酸、炭素数5または6 (C5 or C6)の糖、またはバイオマス加水分解物の一例である。
バイオマス加水分解物における初期成長速度は、グルコースにおける成長速度と同等である(図69A)。バイオマス加水分解物における初期固有生産性は、グルコースの場合よりもはるかに高い。これは、バイオマス加水分解物をイソプレン産出の有効な炭素源として使用できることを示している。
バイオマス加水分解物における固有生産性は、成長開始から255分後に低下する(図69B)。キシロースを唯一の炭素源として用いたとき、細菌の成長速度はグルコースと比較して遅いが(図69C)、顕著なイソプレン固有生産性が認められた(図 69D)。これは、C5及びC6の糖のどちらもメバロン酸経路によるイソプレン産出の炭素源として使用できることを示している。
予期せぬことに、アセテートを唯一の炭素源として成長させた細菌は、グルコースで成長させた場合と比較して約2倍のイソプレン固有生産性を示した(図69A)。アセテートの場合、細菌の成長速度はグルコースと比較して遅い (図69B)。しかし、これらの試験結果はアセテートもイソプレン産出の炭素源として使用できることを示している。HPLCにより、アセテートはバイオマス加水分解物中にも存在することが認められた。
細菌はグリセロールを唯一の炭素源として用いたときよく成長し (図69A)、顕著なイソプレン産出が認められた (図69B)。この結果は、一般的なアルコールもメバロン酸経路によるイソプレン産出の炭素源として使用できることを示している。
＜実施例１１＞
＜ストレプトミセス属の植物体からのイソプレンシンターゼの発現＞
イソプレンシンターゼKudzuの遺伝子をプラスミドpJ201:19813から得た。プラスミドpJ201:19813はプエラリア・ロバタ (クズ植物体[Kudzu plant])由来のイソプレンシンターゼをコードし、シュードモナス・ フルオレセンス(fluorescens)、シュードモナス・プチダ(putida)、ロドシュードモナス・パルストリス(Rhodopseudomonas palustris)、及び コリネバクテリウム(Corynebacterium) （図79A-79C (SEQ ID NO: 123)参照）に対し最適コドン化されていた。
プラスミドpJ201:19813を制限酵素NdeI及びBamHIで消化して遺伝子iso19813を分離した。遺伝子iso19813をストレプトミセス-E.coliシャトルベクターpUWL201PW (Doumith et al, Mol. Gen. Genet. 264: 477-485, 2000; Figure 71)に結紮して、pUWL201_isoを作った。pUWL201_isoを制限酵素分析して、正しくクローン化されていることを確認した。
イソプレンシンターゼiso19813の発現は、ストレプトミセテス(Streptomycetes)種中での構成的発現は許可するが、E. coli中での構成的発現は許可しない erm-プロモータの制御下で行った。
PUWL201PW (挿入無し) 及び pUWL201_isoを、ストレプトミセス・アルバス J1074 (Sanchez et al., Chem. Biol. 9:519-531, 2002) 中に、Hopwood et al., The John innes foundation, Norwich, 1985に記載された方法で原形質体を形質転換することにより導入した。
200 μlの原形質体懸濁液を1.9μgのpUWL201PW または2.9μgのpUWL201_isoで形質転換した。非選択性のR5-寒天プレート上で28℃において一晩インキュベートした後、陽性形質転換体をさらに4日間チオストレプトン(250 μg/ml)を含むR3 −重層寒天プレート上でインキュベートして選択した。
チオストレプトン耐性形質転換について、Plasmid Mini Kit (Qiagen)を用いたプラスミド精製によりpUWL-プラスミドの存否を検証した。精製したプラスミドDNAをE. coli DH5α中に再導入して、制限酵素分析を行うために必要な量のプラスミドDNAを生成させた。陽性形質転換体をアンピシリン含有L-アガープレート上で選択し、プラスミドDNAをNdeI及びBamYLIエンドヌクレアーゼで消化することにより挿入の分析を行った。
イソプレンシンターゼは、陽性のpUWL201 isoクローン中の1.7kbの断片として特定されたが、コントロール株(pUWL201PW)にはこのような断片は認められなかった。
コントロールプラスミドpUWL201PW、またはpUWL201_isoをコードするイソプレンシンターゼを含む野生型株及びS.アルバスの形質転換からのイソプレン産出について試験した。
各株について複数の被検体を、チオストレプトン(200 μg/ml) 添加または無添加の固体培地(トリプシン大豆ブロス寒天, TSB; 2.5 ml)を用いて、密封したヘッドスペースバイアル(全容積20 ml) 内で28℃において4日間インキュベートした。
ヘッドスペースのサンプル500μlを、SIM-モードのGC-MSで分析した。イソプレンは参照の保持時間と分子の質量(67 m/z)から同定した。ヘッドスペース中のイソプレンの低量は、予め作成した検量線を用いて行った。
野生型S.アルバス及びpUWL201PWを備えるコントロール株は、検出限界よりわずかに高い濃度(0.04 - 0.07 ppm)のイソプレンを産出した。一方、pUWL201_isoを備えるS.アルバスは、コントロール株よりも少なくとも10倍高濃度のイソプレン(0.75 ppm; 図72) を産出した。この結果は、アクチノミセテス(Actinomycetes)属の原核生物中で、植物体由来のイソプレンシンターゼが成功裡に発現されたことを示している。
＜実施例１２＞
＜上流メバロン酸経路、または上流及び下流メバロン酸経路、並びにkudzuイソプレンシンターゼを備えるE. coli fadR atoC LS5218中での脂肪酸またはパームオイルからの、イソプレンまたはメバロン酸塩の産出＞
エシェリキアcoli fadR atoC 株LS5218 (#6966) を、Coli Genetic Stock Centerから入手した。FadRは、脂肪酸分解酵素をコードする遺伝子の発現を抑制する転写リプレッサーをコードする(Campbell et al, J. Bacteriol. 183: 5982-5990, 2001)。AtoCは、AtoSを含む2成分調整系中の応答調整因子の1つであり、アセトラクテート代謝を調整する。fadR atoC株は脂肪酸分解遺伝子を構成的発現させ、長鎖脂肪酸を長鎖ポリヒドロキシアルカン酸中へ組み込む。
パームオイルをイソプレンまたはメバロン酸塩を産出させるための炭素源として用いる場合、パームオイルをグリセロールと脂肪酸に転換させる。この転換方法は公知であり、リパーゼ(例えば、豚膵臓由来リパーゼ、カンジダ・ルゴサ(Candida rugosa) リパーゼ、またはその他のリパーゼ)を用いる酵素的方法、または水酸化ナトリウム等の塩基で化学的にケン化する方法を用いることができる。
i) 上流メバロン酸経路を発現するE. coli fadR atoC株
標準的な方法(Sambrooke et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor, 1989) を用いてpCLPtrc上流経路をLS5218中にエレクトロポレートすることによりWW4株を作った。
プラスミドの導入は、細胞をC12脂肪酸(FA)またはパームオイルを炭素源として含むTM3培地で培養したとき、メバロン酸(MVA)が産出されることにより確認した。
WW4により脂肪酸からメバロン酸が産出されることを確認するために、0.25% C12 FA (Sigma社 cat # L9755)を含む5mLの修正TM3培地(酵素エキス無添加のTM3)で、一夜培養した細胞を100倍に希釈した。最初のメバロン酸産出の兆候(24 mg/L)は、IPTGで誘導した培養物を30℃で一夜培養した後表れた。産出量は3日間にわたり増え続け、最終的には194 mg/LのMVAが産出された。
WW4によりパームオイルからメバロン酸が産出されることを確認するために、消化したパームオイル200mgを含む5mLの修正TM3培地で、一夜培養した細胞を100倍に希釈した。最初のメバロン酸産出の兆候(50 mg/L)は、IPTGで誘導した培養物を30℃で一夜培養した後表れた。産出量は3日間にわたり増え続け、最終的には500 mg/LのMVAが産出された。
ii) 上流及び下流メバロン酸経路、並びにkudzuイソプレンシンターゼを備えるE. coli fadR atoC株
エシェリキアcoli株WW4 (LS5218 fadR atoC pCLPtrc上流経路) をpMCM118 [pTrcKKDyIkIS]で形質転換してWW10を作った。プラスミドの導入は、グルコース含有TM3培地をIPTG (100, 300, or 900 μM)で誘導してこの株を培養したとき、イソプレンが産出されることにより確認された。この株はIPTGに対し比較的敏感であり、IPTGが100μMのときでさえも増殖欠陥が認められた。これらの結果を図70Aに示す。
ドデカン酸からのイソプレン産出の試験を行なうために、WW10をスペクチノマイシン(50 μg/ml)及びカナマイシン(50 μg/ml)を含むLブロス中で、37℃において200 rpmで振蕩しながら一夜培養した。細胞を修正TM3培地で洗浄し、遠心分離し、修正TM3培地中に最初の培養液容積と同じになるようにして再懸濁させた。この開始培養物の洗浄し再懸濁させた細胞を、0.125% C12脂肪酸(Sigma社 cat # L9755)を含む修正TM3培地5mL中に、100倍及び10倍に希釈した。
パームオイルからメバロン酸塩が産出されることを確認するために、リパーゼを用いてパームオイルを37℃、250 rpmの条件下で数日間予備消化させて脂肪酸を生じさせた（加水分解されたことは、チューブを振ったとき泡が生じることで確認した）。
さらに、修正TM3培地とパームオイルが入れられたチューブ中で、洗浄した細胞を10倍に希釈して培養物を準備した。また別のチューブを、残りの洗浄した細胞(2.5 mL) 0.125% C12FAを添加することにより、さらに希釈（バイオコンバージョン）することなく準備した。
30℃において250rpmで振蕩しながら3.75時間成長させた後、全ての培養物に50μMのIPTGを添加して誘導した。4時間インキュベートした後、各培養物200μLについて、イソプレン産出量を修正ヘッドスペース分析法 (30℃において500rpmで振蕩しながらイソプレンを産出させる) により試験した。さらに、追加のイソプレン産出評価を、GCMS分析を行う前に試験ガラスブロック(assay glass block)を12時間インキュベートすることにより行った。
誘導された各培養物を一晩インキュベートし、翌朝、200μLの各サンプルについてイソプレン産出を試験した(1時間産出、30℃、500rpm Shel-Lab振蕩機)。これらの培養物を分析した結果、顕著な量のイソプレンが産出されたことが分かった。
誘導した後、一夜インキュベートした一夜開始培養物を1/10希釈した培養物から、最も多くのイソプレンが産出された。この結果から、この培養物は成長し続け、細胞密度が増加することが示唆される。
これらの結果を図70Bに示す。脂肪酸懸濁液は不透明なので細胞密度を直接測定することはできない。このため、この培養物の細胞密度は、少量の培養物を培地に塗布し、形成された8×107コロニーの数から求めた。これは、OD600が0.1の場合に相当する。この培養物から顕著な量のイソプレンが産出されたが、この実施例のメバロン酸経路を備えない類似の株からはイソプレンは産出されなかった。
＜実施例１３＞
＜E. coli.tyyでのybhEの構成的発現によるイソプレン産出の改善＞
この実施例には、ybhE (pgl)を構成的発現する株におけるイソプレン産出を、野生型ybhEを備えるコントロール株と比較して示す。
ybhE (pgl)遺伝子は、異種発現されたタンパク質の翻訳後のグルコニル化を抑制する6-ホスホグルコノラクトナーゼをコードし、産品の溶解性及び収率を改善するとともに、バイオマスの収率とペントースホスフェート経路の流量(Aon et al. Applied and Environmental Microbiology, 74(4): 950-958, 2008)を改善する。
イソプレンを産出するE. coliのBL21株(EWL256)を、複製型プラスミドpBBRlMCS5(Gentamycin) (Dr. K. Peterson, Louisiana State Universityから入手) を用いたybhE遺伝子の構成的発現により構築した。
FRT-ベース遺伝子組み換えカセット、Red/ET-媒介組み込み用のプラスミド、及び抗生物質マーカーループアウトは、Gene Bridges GmbH社 (Germany) から入手した。これらの材料はGene Bridges社の取扱説明書に従って使用した。Stratagene Herculase II Fusion kitを製造者の取扱説明書に従って用い、プライマーPgl-F及びPglGIl .5-RによりFRT-gb2-Cm-FRTテンプレート由来の耐性カセットを増幅した。
PCR反応液には以下が含まれていた（最終容積50μL）：5μLの緩衝液、1μLのテンプレートDNA (Gene Bridges社の FRT-gb2-Cm-F)、10pmolの各プライマー、及び1.5 μLの25mM dNTP混合、dH2Oで50μLに調整。PCR反応のサイクルは次の通りであった：1×2分間, 95℃、次に(95°Cで 30秒; 63℃で30秒; 72℃で3分間)を30回繰り返す。
得られたPCR産品をQiaQick PCR purification kit (Qiagen)を用いて精製し、以下に示すプラスミドを含むpRed-ET組み換え体を備えるエレクトロコンピテントMG 1655細胞中にエレクトロポレートした。
各細胞を、30℃の5mLのLブロス中で、OD600〜0.6になるまで成長させた。細胞に4%アラビノースを添加してリコンビナーゼの発現を誘導し、30℃で30分間成長させ、次に37℃で30分間成長させた。各細胞について、1.5mLを氷冷dH2Oで3-4回洗浄した。最終的な細胞ペレットを40μLの氷冷dH2O中に再懸濁させ、2-5μLのPCR産品を添加した。
エレクトロポレーションは、ギャップが1-mmのキュベットを用いて、Gene Pulser Electroporator (Bio-Rad Inc.社)により、1.3 kVで行った。細胞を30℃で1-2時間回復させ、クロラムフェニコール (5 ug/mL)を含むLアガーに塗布した。5種の形質転換体について、組込み部位に隣接するプライマー(2つのプライマーのセット: pgl 及び49 rev 及び3' EcoRV-pglstop； Bottom Pgb2 及びTop GB 's CMP (946))を用いてPCR及びシークエンシングにより分析した。正しい形質転換体を選択し、この株をMG1655 GI1.5-pgl::CMPと命名した。
MG1655 GI1.5-pgl::CMPの染色体DNAをテンプレートに用いて、FRT-CMP-FRT-GI 1.5 − ybhE構造体を含むPCR断片を作った。この構造体を、以下のようにしてpBBRlMCS5(Gentamycin)中にクローン化した。
以下CMP- GI1.5-pglと呼ぶ断片を、5' プライマーPglconfoirm-F及び3' プライマー3' EcoRV-pglstopを用いて増幅した。得られた断片を、Invitrogen TOPO-Bluntクローン化キットを用いて、製造者の示唆によりプラスミドベクターpCR-Blunt II-TOPO中にクローン化した。CMP-GI1.5-pgl断片を含むNsiI断片を、pBBRlMCS5(Gentamycin)のPstI部位にクローン化した。
5μlのCMP-GI1.5-pgl挿入、2μlのpBBRlMCS5(Gentamycin社)ベクター、lμlのT4 DNAリガーゼ(New England Biolabs社)、2μlの10X リガーゼ緩衝液、及び10μlのddH2Oを含む20μlの結紮反応液を調製した。
結紮混合物を室温で40分間インキュベートし、次に上記に記載した条件下で2-4μLをエレクトロコンピテントなTop10細胞 (Invitrogen社) 中にエレクトポレートした。形質転換体を、クロラムフェニコール10μg/ml及びゲンタマイシン5μg/mlを含むL アガーを用いて選択した。選択したクローンの配列を、上記の種々のプライマー、及びSequetech, CAから提供されたT3及びReverseプライマーを用いて決定した。このプラスミドをpBBRCMPGI1.5-pgl (図77A-B 及びSEQ ID NO: 122参照) と命名した。
上記実施例10に記載した方法により、プラスミドpBBRCMPGI1.5-pglをEWL256中にエレクトロポレートした。得られた形質転換体を、クロラムフェニコール(10μg/mL), ゲンタマイシン(5μg/mL), スペクチノマイシン(50μg/mL), 及びカルベニシリン(50μg/mL)を含むLアガー上に塗布した。1つの形質転換体を選択しRMl1608-2と命名した。
Primers: Pgl-F
Figure 0006262125
 PglGIl.5-R
Figure 0006262125
 3' EcoRV-pglstop:
Figure 0006262125
 pgl +49 rev:
Figure 0006262125
 Bottom Pgb2:
Figure 0006262125
 Top GB's CMP (946):
Figure 0006262125
 Pglconfirm-F
Figure 0006262125
i)小スケールでの分析
培地の組成は以下の通りである（発酵培地1リットル当り）。
K2HPO4 13.6 g, KH2PO4 13.6 g, MgSO4 * 7H2O 2 g, クエン酸一水和物 2 g, クエン酸第二鉄アンモニウム 0.3 g, (NH4)2SO4 3.2 g, 酵母エキス 1 g, 1000X Trace Metals Solution 1 ml. 全ての成分を一度に添加し、diH2Oに溶解させた。水酸化アンモニウム(30%)でpHを6.8に調整し、所定の容積にした。培地を、0.22ミクロンのフィルターで濾過滅菌した。滅菌処理及びpH調整した後、グルコース5.0gと抗生物質を添加した。
1000X Trace Metal Solutionの組成は以下の通りである（発酵培地1リットル当り）。
クエン酸* H2O 40g、MnSO4*H2O 30 g、NaCl 10g、FeSO4*7H2O 1g、CoCl2*6H2O 1g、ZnSO4*7H2O 1g、CuSO4*5H2O 100mg、H3BO3 100mg、NaMoO4*2H2O 100mg。各成分をそれぞれ一度にdiH2Oに添加して溶解させ、HCl/NaOHでpHを3.0にし、次に容積を調整し、0.22μのフィルターで濾過滅菌する。
a) 試験方法
各株をMicroReactor Technologies, Inc社製のCelleratorTMで培養して、イソプレン産出の試験を行なった。24ウエルのそれぞれの実効容積は4.5mLであった。温度を30℃に保ち、pHを7.0に設定し、酸素流量を20sccmに設定し、撹拌速度は800rpmであった。
E. coli株の接種材料を凍結したバイアルから採取し、LBブロスアガープレート (抗生物質含有) に線状に塗布し、30℃でインキュベートした。抗生物質を含有する培地にシングルコロニーを植菌し、一晩成長させた。抗生物質を含有する培地4.5ml中で、550nmで測定した光学密度が0.05になるまで細菌を希釈した。
イソプレンのオフガス分析は、ガスクロマトグラフ-マススペクトロメータ(GC-MS) (Agilent)ヘッドスペース分析を用いて行った。サンプルは次のようにして調製した。100μLの全培養液を密封可能なGCバイアルに入れ30℃で30分間インキュベートした。次の熱殺菌において70℃で5分間インキュベートし、次にサンプルをGCに注入した。
実験中、マイクロプレートリーダー(Spectramax社)を用いて波長550nmにおける光学密度(OD)を測定した。固有生産性は、イソプレン濃度(μg/L)をOD測定値及び時間(hour)で割り算して求めた。
EWL256及びRM11608-2の2種の株について、IPTGを200及び400μM添加して誘導した2水準について試験した。各サンプルのイソプレン産出及び細胞成長(OD550)を、誘導してから1, 2.5, 4.75, 及び8時間後に測定した。各サンプルは、2組準備した。
b) 結果
実験の結果、コントロール株との比較において、ybhE (pgl)を発現する株は2水準のIPTG濃度において2-3倍高い固有生産性を示すことが示された。
ii) 15Lスケールの流加培養法で成長させたM.マゼイメバロン酸キナーゼ, P. アルバイソプレンシンターゼを発現しpglを過剰発現するE. coli(RHMl 11608-2)のイソプレン発酵
使用した培地の組成は以下の通りである（発酵培地1リットル当り）。
K2HPO4 7.5 g, MgSO4 * 7H2O 2 g, クエン酸一水和物 2 g, クエン酸第二鉄アンモニウム 0.3 g, 酵母エキス 0.5 g, 1000X Trace Metals Solution 1 ml. 全ての成分を一度に添加し、diH2Oに溶解させた。この溶液をオートクレーブで滅菌した。水酸化アンモニウム(30%)でpHを7.0に調整し、所定の容積にした。滅菌処理及びpH調整した後、グルコース10g, チアミン* HCl 0.1 g, 及び抗生物質を添加した。
1000X Modified trace Metal Solutionの組成は以下の通りである：
クエン酸* H2O 40g、MnSO4*H2O 30g、NaCl 10g、FeSO4*7H2O 1g、CoCl2*6H2O 1g、ZnSO4*7H2O 1g、CuSO4*5H2O 100mg、 H3BO3 100mg、 NaMoO4*2H2O 100mg。各成分を一度にdiH2Oに添加して溶解させ、HCl/NaOHでpHを3.0にし、次に所定の容積に調整し、0.22μのフィルターで濾過滅菌する。
発酵は15Lのバイオリアクター中で、上流メバロン酸(MVA)経路(pCL Upper), 組み込まれた下流MVA経路(gil.2KKDyI)を備え、M.マゼイ由来のメバロン酸キナーゼ及び P.アルバ由来のイソプレンシンターゼ(pTrcAlba-mMVK)を高度に発現し、pgl (pBBR-pgl)を高度に発現するBL21 (DE3) E. coli細胞を用いて行った。この試験は、pH7.0で温度34℃の発酵においてグルコースから産出されるイソプレンを測定するために行った。
凍結したバイアル中のE.coli株を解凍し、トリプトン-酵母エキス培地に植菌した。550nmで測定した接種材料のODが1.0に達したとき、初期容積を5Lにした15Lのバイオリアクターに接種材料50mLを植菌した。
細胞が定常期に達するまで、グルコースを指数関数的に供給した。その後、グルコース供給量を代謝上必要な量まで低下させた。40時間(59時間) の発酵の間、バイオリアクターに供給したグルコースの総量は3.1kg(59時間の場合4.2kg)であった。誘導は、IPTG を添加することにより行った。550nmの光学密度(OD550)が4になったとき、IPTGの濃度を110μMにした。OD550が150になったとき、IPTGの濃度を192μMに増加させた。
発酵中のバイオリアクター内のOD550の変化を図78Aに示す。バイオリアクターからのオフガス中のイソプレン濃度は、Hiden質量スペクトロメータにより測定した。発酵中、イソプレンの力価が増加し、40時間の場合33.2g/L (59時間の場合48.6g/L) に達した(図78B)。発酵中、イソプレンの力価が増加し、40時間の場合最大40.0g/L (59時間の場合60.5g/L) に達した(図78C)。
40時間(59時間)の発酵の間に産出されたイソプレンの総量は281.3g(59時間の場合451.0g)であった。イソプレン産出総量の経時変化を図78Dに示す。容積生産性の経時変化を図78Eに示す。この図から0から40時間目までの間、平均速度1.0g/L/hrがいじされたことが分かる(19時間目から59時間目までの間は1.4g/L/hour)。
CERで測定した代謝活性の経時変化を図78Fに示す。発酵中にイソプレン産出に消費された炭素のモル収率は、40時間の場合19.6%であった(59時間の場合23.6%)。グルコースからのイソプレンの収率（重量パーセント）は40時間の場合8.9%であった(59時間の場合10.7%)。
特に断りのない限り、全ての科学及び技術用語は、この発明が属する技術分野において当業者が理解している通常の意味で用いられる。本願で用いられる用語の一般的意義はSingleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED., John Wiley and Sons, New York (1994)、及びHale & Markham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, N. Y. (1991) による。
この発明は本願に開示した特定の方法、手段、試薬に限定されず、種々変更することができる。当業者であれば、本願に開示した方法及び材料と同様または均等の方法及び材料を用いてこの発明を実施できることを理解できよう。
文中の見出しは、本願の明細書を参酌して全体として理解されるこの発明の種々の側面または実施形態を限定するものではない。
特に断りの無い限り、原文で"a", "an,"というときは単数または複数を意味する。
数値またはパラメータについて「約」というときは、その値についての実施形態も含む。例えば、「約X」というときは、「X」についての記載も含まれる。数値範囲には、その範囲を規定する値も含まれる。
本願に開示する側面及び実施形態には、原文で"comprising," "consisting,"及び"consisting essentially of と規定する側面及び実施形態も含まれる。
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Claims (16)

  1. 多くのイソプレンを生産可能な、培養物中の組み換え細菌細胞であって、
    前記細胞は以下に規定する（ａ）のポリペプチド、（ｂ）のポリペプチド、及び（ｃ）のポリペプチドをコードする核酸を含み、
    （ａ）イソプレンシンターゼポリペプチドであって、該イソプレンシンターゼポリペプチドは前記組み換え細胞の親細胞以外の細胞由来の異種核酸によりコードされ、前記イソプレンシンターゼポリペプチドはポプラ（Poplar）又はクズ（Kudzu）由来であることを特徴とする、イソプレンシンターゼポリペプチド、
    （ｂ）イソペンテニル−ジフォスフェートデルターイソメラーゼ（ＩＤＩ）ポリペプチド、
    （ｃ）（ｉ）１−デオキシキシルロース−５−フォスフェートシンターゼ（ＤＸＳ）ポリペプチドおよび／または（ｉｉ）全てのメバロン酸（ＭＶＡ）経路ポリペプチド、
    前記細胞が１０００ナノモル／ｇｗｃｍ／ｈｒを超えるイソプレンを産出する、
    培養物中の細胞。
  2. ４．０×１０３ナノモル／ｇｗｃｍ／ｈｒを超えるイソプレンを産出する、請求項１に記載の細胞。
  3. 前記細胞が２．０×１０５ナノモル／ｇｗｃｍ／ｈｒを超えるイソプレンを産出する、請求項１に記載の細胞。
  4. 前記細胞がさらにＩＤＩポリペプチドをコードする内因性核酸のコピーの挿入を備える、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞。
  5. 前記細胞がＤＸＳポリペプチドをコードする異種核酸を備える、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞。
  6. 前記細胞がさらにＤＸＳポリペプチドをコードする内因性核酸のコピーの挿入を備える、請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞。
  7. 前記細胞がＩＤＩポリペプチド及びＤＸＳポリペプチドをコードする核酸を１以上備える、請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞。
  8. １の核酸がイソプレンシンターゼポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、及びＤＸＳポリペプチドをコードする、請求項７に記載の細胞。
  9. １のプラスミドがイソプレンシンターゼポリペプチド、ＩＤＩポリペプチドおよびＤＸＳポリペプチドをコードする、請求項８に記載の細胞。
  10. 前記細胞がＭＶＡ経路ポリペプチドをコードする異種核酸を備える、請求項１〜９のいずれか１項に記載の細胞。
  11. 前記ＭＶＡ経路ポリペプチドがメバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）である、請求項１０に記載の細胞。
  12. 前記細菌細胞がグラム陽性細菌またはグラム陽性細菌の細胞である、請求項１に記載の細胞。
  13. 前記細胞がバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細胞、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細胞、およびパントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属細胞からなる群から選択される、請求項１２に記載の細胞。
  14. 前記細胞がバシラス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞、大腸菌、およびパントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａ）細胞からなる群から選択されるである、請求項１３に記載の細胞。
  15. イソプレンを産出する方法であって、
    （ａ）請求項１−１４のいずれか一項に記載の細胞を培養する工程と、
    （ｂ）イソプレンを産出する工程とを備える、イソプレンを産出する方法。
  16. さらに、細胞により産出されたイソプレンを回収する工程を備える、請求項１５に記載の方法。
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