CN1981038A - 具有颗粒淀粉水解活性的酸稳定性α淀粉酶和酶组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及源自白曲霉菌株的、具有颗粒淀粉水解(GSH)活性的酸稳定性α淀粉酶(asAA)、具有GSH活性的asAA在丝状真菌宿主细胞中的异源表达以及包括具有GSH活性的asAA的酶组合物，所述的酶组合物任选包括葡糖淀粉酶。

Description

具有颗粒淀粉水解活性的酸稳定性α淀粉酶和酶组合物

[0001]本申请要求下列优先权：申请日为2004年5月27日的美国临时专利申请序列第60/575,175号；申请日为2004年8月30日的美国临时专利申请序列第60/605,437号；申请日为2004年11月30日的国际申请PCT/US04/040040；申请日为2004年12月9日的国际申请PCT/US04/041276；以及申请日为2005年1月28日的美国临时申请序列第60/647,925号；其内容被全部引入于此作为参考。

                             技术领域

[0002]本发明涉及来自白曲霉(Aspergillus kawachi)菌株的酸稳定性α淀粉酶(asAA)，该酸稳定性α淀粉酶具有颗粒淀粉水解(GSH)活性。进一步地，本发明涉及具有GSH活性的asAA在丝状真菌宿主细胞中尤其是木霉属(Trichoderma)和曲霉属(Aspergillus)细胞中的异源表达，以及涉及具有GSH活性的asAA在组合物中的用途，该组合物任选地包括葡糖淀粉酶，以增强淀粉水解。

                             技术背景

[0003]葡糖淀粉酶，尤其是具有颗粒淀粉水解(GSH)活性的葡糖淀粉酶是重要的工业酶，用于由来自谷物(grains)和谷类(cereals)的淀粉底物生产各种产品例如有机酸(例如乳酸)、氨基酸(例如谷氨酸)、糖类增甜剂产品(例如葡萄糖和高果糖玉米糖浆)、醇类(例如乙醇)和其它化合物。在微生物发酵期间，尤其是在同步糖化发酵(SSF)期间，当颗粒淀粉底物被用作碳料时降低发酵中残留淀粉的量将是有利的。本发明通过提供具有颗粒淀粉水解活性的酸稳定性α淀粉酶(asAA)响应这种需求，所述酸稳定性α淀粉酶可以与葡糖淀粉酶结合使用，以增强淀粉水解和醇产量。

[0004]此外，本发明相对于现有技术组合物和方法的益处包括下列中的一个或更多个：a)在淀粉水解和终产物生产期间对热能的使用减少；b)对高酶剂量的需要降低；c)利用葡萄糖从淀粉的连续释放来喂养酵母；d)在发酵罐中维持相对低的葡萄糖水平，其显著降低微生物污染的高风险和消除由于高浓度游离葡萄糖导致的对酵母的降解物阻遏；e)褐变反应产物的形成减少；f)降低或免除钙的添加，这在现有技术喷煮工艺(jet cooking process)期间是必须的；g)降低在发酵工艺期间对水的使用；h)在发酵中使用较高的固体含量，其可以导致较高的终产物形成和降低的能量成本；i)降低某些副产物的产量水平，例如甘油；和j)含可溶物干酒糟(distillers dry grains plus solubles)中降低的残留淀粉含量和增加的蛋白质含量。

                          发明概述

[0005]在一方面，本发明涉及真菌宿主细胞，其包括编码与SEQ ID NO：3的序列具有至少90％序列同一性的、具有颗粒淀粉水解(GSH)活性的酸稳定性α淀粉酶(asAA)的异源多核苷酸。在一些实施方式中，该异源多核苷酸将编码与SEQ IDNO：3的序列具有至少95％的序列同一性的、具有GSH活性的asAA。在一些实施方式中，与在天然真菌宿主中内源表达所产生的相应asAA相比，在包含编码asAA的异源多核苷酸的真菌宿主中表达的asAA将具有至少一个不同的性质。在一些实施方式中，不同的性质是asAA的最适pH或活性的pH范围。在该方面的一个实施方式中，真菌宿主细胞是木霉属细胞。在进一步的实施方式中，木霉属宿主细胞是里氏木霉(T.reesei)细胞。在另一个实施方式中，真菌宿主细胞是曲霉属细胞。

[0006]在第二方面，本发明涉及具有GSH活性的asAA，该asAA包括与SEQID NO：3具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列。在这个方面的一些实施方式中，具有GSH活性的asAA将是截短型asAA。在一些实施方式中，截短型asAA包括SEQ ID NO：9的序列或与SEQ ID NO：9的序列具有至少97％序列同一性的序列。

[0007]在第三方面，本发明涉及颗粒淀粉水解酶组合物，其包括具有颗粒淀粉水解(GSH)活性的酸稳定性α淀粉酶(asAA)，其中所述具有GSH活性的asAA与SEQ ID NO：3的序列具有至少90％的序列同一性。在一些实施方式中，颗粒淀粉水解酶组合物包括截短型asAA酶，所述酶与SEQ ID NO：9具有至少97％的序列同一性。在一些实施方式中，asAA得自异源多核苷酸在真菌宿主细胞中的表达。在进一步的实施方式中，真菌宿主细胞是木霉属和曲霉属宿主细胞。在其它实施方式中，组合物进一步包括葡糖淀粉酶。在一些优选的实施方式中，葡糖淀粉酶将从曲霉属或根霉属(Rhizopus)的菌株获得。在其它实施方式中，葡糖淀粉酶将是具有GSH活性的葡糖淀粉酶，并从曲霉属、木霉属、根霉属或腐质霉属(Humicola)的菌株获得。在其它实施方式中，asAA和葡糖淀粉酶都将在真菌宿主中被表达，所述真菌宿主含有表达具有GSH活性的asAA和葡糖淀粉酶的异源多核苷酸。在一些实施方式中，真菌宿主菌株将是相同的，在其它实施方式中真菌宿主菌株将是不同的菌株。在其它实施方式中，本发明涉及使用本方面的酶组合物水解颗粒淀粉的方法。

[0008]在第四方面，本发明涉及在丝状真菌宿主细胞中制备具有颗粒淀粉水解(GSH)活性的酸稳定性α淀粉酶(asAA)的方法，该方法包括用DNA构建物转化丝状真菌宿主细胞，所述DNA构建物包括在该丝状真菌宿主细胞中具有转录活性的启动子，该启动子可操作性地连接于编码具有GSH活性的、并与SEQ ID NO：3有至少90％序列同一性的asAA的异源多核苷酸；在合适的培养基中培养转化的丝状真菌宿主细胞，以允许所述asAA表达；以及产生asAA。在一个实施方式中，该方法进一步包括回收所产生的asAA。在第二个实施方式中，真菌宿主细胞是木霉属细胞尤其是里氏木霉(T.reesei)细胞。

[0009]在第五方面，本方明涉及提高含葡糖淀粉酶的组合物的颗粒淀粉水解活性的方法，其包括将具有颗粒淀粉水解(GSH)活性的酸稳定性α淀粉酶(asAA)加入到包括颗粒淀粉底物和葡糖淀粉酶的组合物中，以产生可溶性淀粉水解产物。在一些实施方式中，具有GSH活性的asAA具有与SEQ ID NO：3有至少90％的序列同一性的氨基酸序列。在其它实施方式中，具有GSH活性的asAA是截短型asAA。在一些实施方式中，截短型asAA包括与SEQ ID NO：9有至少97％的序列同一性的序列。在进一步的实施方式中，溶解的淀粉的量大于缺少含有GSH活性的asAA的相应组合物。

                          附图简述

[0010]图1A-B提供了编码天然白曲霉酸稳定性α淀粉酶的基因组DNA序列，其被称为asaA(SEQ ID NO：1)。八个推定的内含子用下划线表示。

[0011]图2提供了白曲霉酸稳定性α淀粉酶(SEQ ID NO：4)的信号序列(SEQ IDNO：2)和成熟氨基酸序列(SEQ ID NO：3)(AsaA)。推定的信号序列(氨基酸1-21)用下划线和粗体表示。推定的接头是TTTTTTAATSTSKATTSSSSSSAAATTSSSCTATSTT(SEQ ID NO：8)。接头上游未加下划线的氨基酸包括催化结构域(catalytic domain)(SEQ ID NO：9)，接头下游的氨基酸包括淀粉结合结构域(starch binding domain(SBD))(SEQ ID NO：10)。SBD包括图2多肽的最后102个氨基酸。

[0012]图3A-D提供了质粒pTrex3g_Akalpha(图4)的完整的核苷酸序列(SEQ IDNO：5)，10990bp。

[0013]图4提供了pTrex3g_Akalpha的图谱，其被用于表达编码AsaA(白曲霉asAA)的核酸，并且其含有位于真菌表达载体两侧上的EcoRI位点(EcoRI sites)，其中：

a)cbhI启动子是里氏木霉纤维二糖水解酶启动子；

b)asaA是编码SEQ ID NO：4的酸稳定性α淀粉酶的白曲霉多核苷酸；

c)cbhI终止子是里氏木霉纤维二糖水解酶终止子；

d)amdS是构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶营养标记基因；和

e)attB是用于重组的Gateway克隆系统(Invitrogen)λ噬菌体位点。

[0014]图5A和B提供了SDS-PAGE凝胶，显示了在克隆的里氏木霉代表性发酵试验中来自里氏木霉的asaA的表达，如实施例5所描述。在图5A中，泳道1代表标准See Blue+2标志物；泳道2代表在80小时后里氏木霉表达的AsaA；泳道3代表在162小时后里氏木霉表达的AsaA；以及泳道4代表在162小时时的里氏木霉宿主细胞对照，其中所述宿主细胞对照未用asaA转化。AsaA蛋白质带被清楚地观察到，约为90kDa，并且该带在宿主菌株对照中不存在。在图5B中，泳道1代表在210小时后里氏木霉表达的完整型AsaA，泳道2代表在200小时后里氏木霉以完整型和截短型形式所表达的AsaA的3条带，以及泳道3代表分子量标志物。

[0015]图6以残留活性百分率说明了天然白曲霉(nAk-AsaA)和在里氏木霉宿主中表达的白曲霉(rAk-AsaA)(SEQ ID NO：3)的pH稳定性，如实施例6中所述。

[0016]图7说明了在pH5.0中，随着时间的过去，从用葡糖淀粉酶(0.5GAU/gDISTILLASE)和α淀粉酶发酵玉米面粉醪液得到的乙醇(EtOH)产量百分数(v/v)，其中AkAA表示Tr-AsaA(在里氏木霉中表达的白曲霉酸稳定性α淀粉酶)；LF75表示SPEZYME LT75α淀粉酶；FRED表示SPEZYME FRED；ETHYL表示SPEZYME ETHYL；FA表示CLARASE以及DISTILLASE是对照。参考实施例8。

[0017]图8说明了：在pH5.0下，在与纯化的DISTILLASE(GA)、纯化的AkAA(在里氏木霉中表达的白曲霉酸稳定性α淀粉酶)以及与AkAA和GA的组合温育4小时之后，颗粒淀粉降解成葡萄糖释放出来。参考实施例11。

[0018]图9图示了对用图8所描述的酶温育的颗粒玉米淀粉的SEMs(扫描电子显微镜图)：纯化的DISTILLASE(GA)、纯化的AkAA(在里氏木霉中表达的白曲霉酸稳定性α淀粉酶)，以及AkAA和GA的组合。

[0019]图10说明了：对于每一玉米醪液固体(corn mash solids)(％ds)，采用AkAA的乙醇增加百分率，以相对于醪液固体(％ds)进行测量。

[0020]图11描绘了在71小时测量的发酵液的乙醇体积百分比v/v，所述发酵液以1.5SUU/g ds AkAA的固定剂量水平包括不同比例的完整型和截短型AkAA。

[0021]图12说明了来自里氏木霉菌株的葡糖淀粉酶的氨基酸序列(SEQ IDNO：11)。

[0022]图13说明了来自灰腐质霉高温变种(Humicola grisea var.thermoidea)菌株的葡糖淀粉酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：12)。

[0023]图14说明了来自泡盛曲霉河内变种(Aspergillus awamori var.kawachi)菌株的葡糖淀粉酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：13)。

                            发明详述

[0024]在一些方面，本发明依靠在遗传工程和分子生物学领域中使用的常规技术和方法。下面的资源含有对根据本发明有用的一般方法学的描述：Sambrook et al.，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL(2nd Ed.，1989)；Kreigler，GENE TRANSFER AND EXPRESSION；A LABORATORY MANUAL(1990)以及Ausubel et al.，Eds.CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(1994)。这些一般性的参考资料提供了本领域技术人员所知的定义和方法。然而，并不意欲将本发明限制到所述的任何具体的方法、步骤和试剂，因为这些可以变化。

[0025]除非本文中另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属技术领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。Singleton，et al.，DICTIONARY OFMICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY，2D ED.，John Wiley and Sons，New York(1994)和Hale & Markham，THE HARPER COLLINS DICTIONARY OFBIOLOGY，Harper Perennial，NY(1991)为技术人员提供了本发明所用的许多术语的通用词典。

[0026]尽管类似或等同于本文中所描述的那些的任何方法和材料都可以在本发明的实践和测试中使用，但所描述的是优选的方法和材料。

[0027]现在将仅通过参考的方式，使用下面的定义和例子，详细地描述本发明。本文中所引用的所有专利和出版物，包括在这类专利和出版物中公开的所有序列，被清楚地引入作为参考。

[0028]数值范围包括限定该范围的数字。

[0029]除非另外指出，分别地，核酸以5′到3′方向从左到右书写；氨基酸序列以氨基端到羧基端的方向从左到右书写。

[0030]本文所提供的标题不是对本发明的各个方面或者实施方式的限制，本发明的各个方面或者实施方式可以通过从整体上参阅说明书而拥有。

A.定义

[0031]如本文中所使用，术语“淀粉(starch)”是指含有植物的复合多糖碳水化合物的任何物质，包括具有式(C₆H₁₀O₅)_x的直链淀粉和支链淀粉，其中X可以是任意数字。具体而言，该术语是指任何植物基物质，包括但不限于谷粒、草、块茎和根，更特别地是小麦、大麦、玉米、黑麦、水稻、高梁、麸、木薯、黍、马铃薯、甘薯和木薯。

[0032]术语“颗粒淀粉(granular starch)”是指生(未蒸煮过的)淀粉，例如未经历糊化作用的颗粒淀粉。

[0033]术语“颗粒淀粉水解(granular starch hydrolyzing(GSH))酶”或“具有颗粒淀粉水解(GSH)活性”是指具有能够水解颗粒形式的淀粉之能力的酶。

[0034]术语“α淀粉酶(alpha-amylase)(例如E.C.3.2.1.1类)”是指催化α-1，4-糖苷键水解的酶。这些酶还被描述为那些导致含有1，4-α-连接D-葡萄糖单元的多糖中的1，4-α-D-糖苷键外切或内切水解的酶。用于描述这些酶的另一个术语是“糖原酶(glycogenase)”。示例性的酶包括α-1，4-葡聚糖4-葡聚糖水化酶葡聚糖水解酶(alpha-1，4-glucan 4-glucanohydrase glucanohydrolase)。

[0035]术语“酸稳定性α淀粉酶(acid-stable alpha amylase(“asAA”))”是指在pH3.0到7.0的pH范围内有活性的α淀粉酶，优选3.5到6.0的pH范围。

[0036]术语“截短型asAA(truncated asAA)”是指具有GSH活性的asAA多肽，其中至少部分淀粉结合结构域已被去除。在一些实施方式中，截短型asAA是指包含SEQ ID NO：3的至少65％的氨基酸序列，或包括与SEQ ID NO：3有至少90％序列同一性的序列的至少65％。

[0037]术语“淀粉结合结构域(strach binding domain(SBD))”是指优先结合淀粉(多糖)底物的氨基酸序列。

[0038]术语“接头(linker)”是指通常具有3到40个氨基酸的短氨基酸序列，其共价结合包含淀粉结合结构域的氨基酸序列和包含催化结构域的氨基酸序列。

[0039]术语“催化结构域(catalytic domain)”是指区别于SBD并且含有底物水解的活性部位的多肽结构区域。

[0040]术语“葡糖淀粉酶(glucoamylase)”是指淀粉葡萄糖苷酶这一酶类(例如E.C.3.2.1.3、葡糖淀粉酶、1，4-α-D葡聚糖葡糖水解酶)。这些酶是外切作用的酶，其从直链淀粉和支链淀粉分子的非还原端释放葡糖基残基。该酶还水解α-1，6键和α-1，3键，尽管速率比α-1，4键慢得多。

[0041]术语“糖基化(glycosylation)”是指通过加入糖部分而对蛋白质进行转录后修饰，其中碳水化合物可以是N-连接的或O-连接的，从而形成糖蛋白。糖蛋白的N-连接碳水化合物部分是通过糖苷键被连接到天冬酰胺残基的β-酰胺氮上。O-连接碳水化合物是通过丝氨酸或苏氨酸残基的羟基以糖苷键被连接到蛋白质上。

[0042]术语“重组体(recombinant)”，当被用于细胞、核酸、蛋白质或载体时，是指该细胞、核酸、蛋白质或载体通过引入异源核酸或蛋白质或对天然核酸或蛋白质的改变而被修饰，或者是指细胞是来自被如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在该细胞的天然(非重组型)形式内未发现的基因，或者重组细胞表达在其他情况下将异常表达、欠表达或完全不表达的天然基因。

[0043]术语“蛋白质(protein)”和“多肽(polypeptide)”在本文中可以互换使用。氨基酸残基的传统的单字母代码和三字母代码在本文中被使用。

[0044]“信号序列(signal sequence)”指连接到蛋白质的N末端部分上的氨基酸的序列，其帮助该蛋白质的成熟形式分泌到细胞外。对信号肽的定义是功能性定义。胞外蛋白的成熟形式缺少信号序列，信号序列在分泌过程中被切割掉。

[0045]术语“天然酸稳定性α淀粉酶(native acid-stable alpha amylase(n-asAA))”是指由asAA的内源性表达而产生的asAA。例如，术语“n-asAA”意指白曲霉的酸稳定性α淀粉酶(即，SEQ ID：3)的内源表达。

[0046]术语“重组酸稳定性α淀粉酶(recombinant acid-stable alpha amylase(r-asAA))”、“重组表达的asAA(recombinantly expressed asAA)”和“重组产生的asAA(recombinantly produced asAA)”是指成熟asAA蛋白质序列，其在宿主细胞中由异源多核苷酸的表达而被产生。例如，术语“r-asaA”意指白曲霉酸稳定性α淀粉酶(即SEQ ID NO：3)在引入编码该asaA的多核苷酸的宿主中被表达和产生。r-asAA的成熟蛋白质序列不包括信号序列。

[0047]“基因(gene)”是指DNA片段，其参与产生多肽，并包括编码区前后的区域以及单独的编码区(外显子)之间的间插序列(内含子)。

[0048]术语“核酸(nucleic acid)”包涵DNA、RNA、其单链或双链及化学修饰体。术语“核酸(nucleic acid)”和“多核苷酸(polynucleotide)”在本文中可以互换使用。因为遗传密码具有简并性，一个以上的密码子可以被用于编码一个具体的氨基酸，并且本发明涵盖编码一条具体的氨基酸序列的多条多核苷酸。

[0049]“载体(vector)”是指被设计用于将核酸引入到一种或更多种细胞类型内的多核苷酸序列。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌粒、表达盒及类似物。

[0050]本文中所使用的“表达载体(expression vector)”是指DNA构建物，其包括可操作性连接到合适的调控序列上的DNA序列，所述调控序列能够引起该DNA在合适宿主中的表达。这样的调控序列可以包括引起转录的启动子、调控转录的任选的操纵子序列、编码mRNA上合适的核糖体结合位点的序列、增强子和调控转录与翻译终止的序列。

[0051]“启动子(promoter)”是调控序列，其涉及结合RNA聚合酶以起始基因的转录。启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。本发明使用的优选的启动子是里氏木霉cbhl，其是诱导型启动子。

[0052]“受转录调控(under transcriptional control)”是本领域中被充分理解的一个术语，其表明：多核苷酸序列，通常是DNA序列的转录，取决于其被可操作性连接到有助于转录起始或促进转录的元件上。

[0053]“受翻译调控(under translational control)”是本领域中被充分理解的一个术语，其表示发生在mRNA业已形成之后的调控过程。

[0054]如本文中在描述蛋白质和编码它们的基因时所使用，关于基因的术语是斜体字，(例如，编码asaA(白曲霉asAA)的基因可以被表示为asaA)。关于蛋白质的术语通常不是斜体并且第一个字母一般是大写，(例如，由asaA基因编码的蛋白质可以被表示为AsaA或asaA)。

[0055]术语“源自(derived)”包括术语“起源自(originated from)”、“得自(obtained)”或“可以得自(obtainable from)”、和“分离自(isolated from)”以及如本文中所使用的，是指由核苷酸序列编码的多肽从细胞产生，在所述细胞中该核苷酸天然存在，或该核苷酸被插入到所述细胞中。

[0056]术语“可操作性连接(operably linked)”是指并列关系(juxtaposition)，其中元件处于使得它们在功能上相关的排列中。例如，如果启动子调控编码序列的转录时，那么其则被可操作性连接到该序列上。

[0057]术语“选择性标记(selective marker)”是指能够在宿主中表达的基因，其使得容易选择那些含有引入的核酸或载体的宿主。选择性标记的例子包括但不限于抗微生物剂(例如潮霉素、博莱霉素或氯霉素)和/或赋予宿主细胞代谢优势的基因，例如营养优势。

[0058]多核苷酸或多肽与另一条序列具有某一百分比(例如80％、85％、90％、95％或99％)的序列同一性是指：当比对时，在比较的两条序列中，该百分比的碱基或氨基酸残基是相同的。该比对和百分比同源性或同一性可以使用本领域中已知的任何合适软件程序来确定，例如在CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY(F.M.Ausubel et al.(eds)1987，Supplement 30，7.7.18部分)中描述的那些程序。优选的程序包括GCG Pileup程序、FASTA(Pearson et al.(1988)Proc.Natl，Acad.Sci USA 85：2444-2448)、和BLAST(BLAST Manual，Altschul et al.，Natl.Cent.Biotechnol.Inf.，Natl Lib.Med.(NCIB NLM NIH)，Bethesda，MD，和Altschul et al.，(1997)NAR 25：3389-3402)。另一个优选的程序是ALIGN Plus(Scientific andEducational Software，PA)，优选使用默认参数。发现有用的另一个序列软件程序是TFASTA Data Searching Program，其在Sequence Software Package Version 6.0(Genetics Computer Group，University of Wisconsin，Madison，WI)中可得到。

[0059]本领域的技术人员将认识到本发明包含的序列还由在严格杂交条件下与示例性的asaA序列(例如SEQ ID NO：1)进行杂交的能力所定义。当单链形式的核酸在适当的温度和溶液离子强度条件下能与另一条核酸退火，则该核酸可以与另一条核酸序列杂交。杂交和洗涤条件在本领域中是熟知的(参见，例如Sambrook(1989)，见上文，特别是第9章和第11章)。在一些实施方式中，严格条件相当于65℃的Tm和0.1×SSC，0.1％SDS。

[0060]“宿主菌株(host strain)”或“宿主细胞(host cell)”是指对于含有编码本发明的颗粒淀粉水解酶的多核苷酸的表达载体或DNA构建物合适的宿主。特别地，宿主菌株优选地是丝状真菌细胞。宿主细胞可以是野生型丝状真菌细胞或经遗传学修饰的宿主细胞。在本发明的优选方案中，“宿主细胞”是指从丝状真菌菌株以及尤其是木霉属某种(Trichoderma sp.)或曲霉属某种(Aspergillus sp.)的细胞产生的细胞和原生质体。

[0061]术语“丝状真菌(filamentous fungi)”是指所有丝状形式的真菌亚门(subdivision Eumycotina)(参见Alexopoulos，C.J.(1962)，INTRODUCTORYMYCOLOGY，Wiley，New York以及AINSWORTH AND BISBY DICTIONARY OFTHE FUNGI，9^th Ed(2001)，Kirk et al Eds.，CAB，International Publishing)。这些真菌的特征在于营养菌丝体具有由几丁质、纤维素和其它复合多糖组成的细胞壁。本发明的丝状真菌在形态学上、生理学上和遗传学上不同于酵母。丝状真菌的营养生长是通过菌丝延伸实现，并且碳分解代谢是专性需氧的。在本发明中，丝状真菌母细胞可以是但不限于下列种的细胞：木霉属(例如里氏木霉(以前分类为长枝木霉(T.longibrachiatum)以及目前也被称为红褐肉座菌(Hypocrea jecorina))、绿色木霉(Trichoderma viride)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum))；青霉属某种(Penicillium sp.)、腐质霉属某种(Humicola sp.)(例如特异腐质霉(Humicola insolens)和灰腐质霉(Humicola grisea))；金孢霉属某种(Chrysosporium sp.)  (例如，拉克淖金孢菌(C.lucknowense))、粘帚霉属某种(Gliocladium sp.)、曲霉属某种(Aspergillus sp.)(例如米曲霉(A.oryzae)、白曲霉(A.kawachi)、黑曲霉(A.niger)和泡盛曲霉(A.awamori))、镰刀霉属某种(Fusarium sp.)、脉孢霉属某种(Neurospora sp.)、肉座霉属某种(Hypocrea sp.)和翘孢霉属某种(Emericella sp.)(还参见lnnis et al.，(1985)Sci.228：21-26)。

[0062]如本文中所使用，术语“木霉属(Trichoderma)”或“木霉属某种(Trichodermasp.)”是指以前或当前被分类为木霉属的任何真菌属。

[0063]术语“培养(culturing)”是指在合适的条件下在液体或固体培养基中生长一群微生物细胞。在一个实施方式中，培养是指含颗粒淀粉的淀粉底物变成终产物的发酵型生物转化(典型地，在容器或反应器中)。发酵(fermentation)是通过微生物对有机物质进行酶分解和无氧分解，产生较简单的有机化合物。尽管发酵在无氧情况下发生，并不意图使该术语完全限制于严格的无氧条件，因为发酵也可以在氧存在的情况下发生。

[0064]短语“同步糖化发酵(simultaneous saccharification and fermentation(SSF))”是指在产生终产物中的一种工艺，其中微生物例如乙醇生产微生物和至少一种酶例如asAA在同一个处理步骤中存在。在本发明的一个实施方式中，SSF是指：在同一个反应器容器中，同时发生颗粒淀粉底物水解成包括葡萄糖在内的糖类和糖类发酵成醇。

[0065]术语“接触(contacting)”是指使各个酶(一种或多种)足够近地接近各自的底物，以使得该酶(一种或多种)能够将该底物转化成所述终产物。本领域的技术人员将认识到将酶与各自底物的溶液混合可以实现接触。

[0066]术语“酶转化(enzymatic conversion)”通常是指通过酶作用改变底物。本文中所使用的该术语，还指颗粒淀粉通过酶的作用而改变。

[0067]正如本文中所使用，术语“糖化(saccharification)”是指淀粉被酶促转化成葡萄糖。

[0068]术语“糊化(gelatinization)”意思是通过蒸煮来增溶淀粉分子，以便形成粘性悬浮液。

[0069]术语“糊化温度(gelatinization temperature)”是指淀粉开始糊化的温度。糊化的确切温度取决于特定的淀粉，并且取决于多种因素可以变化，例如植物种类以及环境和生长条件。术语“在糊化温度以下(below gelatinization temperature)”是指温度小于开始糊化的温度。

[0070]术语“液化(liquefaction)”是指在淀粉转化中的阶段，在该阶段中，糊化的淀粉被水解，以产生低分子量的可溶性糊精。

[0071]术语“聚合度(degree of polymerization(DP))”是指：在给定的糖化物(saccharide)中的脱水吡喃型葡萄糖单元(anhydroglucopyranose unit)的数目(n)。DP1的例子是单糖，例如葡萄糖和果糖。DP2的例子是双糖，例如麦芽糖和蔗糖。DP＞3表示聚合度大于3的聚合物。

[0072]术语“终产物(end-product)”或“期望的终-产物(desired end-product)”是指任何碳源来源的分子产物，其从颗粒淀粉底物被酶促转化而来。

[0073]如本文中所使用，术语“干固体含量(dry solids content(ds))”是指基于干重的、以百分比(％)计的淤浆(slurry)中的总固体。

[0074]术语“淤浆(slurry)”是指含有不溶固体的含水混合物。

[0075]术语“可溶性淀粉水解产物(soluble starch hydrolysate)”是指淀粉水解所得到的可溶性产物，其可以包括单糖、双糖或寡糖(例如葡萄糖、麦芽糖和高级糖(higher sugar))。

[0076]术语“残留淀粉(residual starch)”是指：在含淀粉底物发酵之后，在组合物中剩余下来的残余的淀粉(可溶性的或不溶性的)。

[0077]术语“干酒糟(distillers dried grain(DDG))”和“含可溶物干酒糟(distillersdried grain with solubles(DDSG))”是指谷物发酵的有用的副产品。

[0078]术语“醪液(mash)”是指可发酵碳源(碳水化合物)在水中的的混合物，其被用于产生发酵产物，例如醇。在一些实施方式中，术语“发酵醪(beer)”、“醪液(mash)”和“发酵液(fermentation broth)”可以被互换使用。

[0079]如本文中所使用，“产乙醇微生物(ethanologenic microorganism)”是指具有将糖或寡糖转化成乙醇之能力的微生物。产乙醇微生物依靠它们表达单独或一起将糖转化成乙醇的一种或多种酶的能力而产生乙醇。

[0080]如本文中所使用，术语“乙醇生产者(ethanol producer)”或“乙醇生产微生物(ethanol producing microorganism)”是指能够从己糖或戊糖产生乙醇的任何生物体或细胞。通常，乙醇-生产细胞含有醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase)和丙酮酸脱羧酶(pyruvate decarboxylase)。乙醇生产微生物的例子包括真菌微生物，例如酵母。优选的酵母包括酵母属(Saccharomyces)的菌株，尤其是酿酒酵母(S.cerevisiae)。

[0081]当与多核苷酸或蛋白质有关时，术语“异源的(heterologous)”是指在宿主细胞里并非天然发生的多核苷酸或蛋白质。在一些实施方式中，该蛋白质是商业上重要的工业蛋白质。意图在于：该术语涵盖由天然发生的基因(naturrally occurringgenes)、突变基因(mutated genes)和/或合成基因(synthetic genes)编码的蛋白质。

[0082]当与多核苷酸或蛋白质有关时，术语“内源的(endogenous)”是指多核苷酸或蛋白质在宿主细胞中天然发生。

[0083]如同本文中所使用，术语“回收的(recovered)”、“分离的(isolated)”和“分开的(sepatated)”是指化合物、蛋白质、细胞、核酸或氨基酸从与其天然相关的至少一个组分中移出。

[0084]如本文中所使用，与细胞有关的术语“转化的(transformed)”、“稳定转化的(stably transformed)”和“转基因的(transgenic)”是指细胞具有非天然的(例如异源的)核酸序列，所述核酸序列被整合进细胞的基因组中或者作为游离型质粒经过多代依然被保留。

[0085]如本文中所使用，术语“表达(expression)”是指基于基因的核酸序列而产生多肽的过程。该过程既包括转录又包括翻译。

[0086]在将核酸序列插入细胞的上下文中，术语“导入的(introduced)”是指“转染(transfection)”、或“转化(transformation)”或“转导(transduction)”，并且包括涉及将核酸序列引入真核或原核细胞中，其中所述核酸序列可以被整合入该细胞的基因组(例如，染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中，被转变成自主复制子，或被瞬时表达(例如转染的mRNA)。

[0087]如本文中所使用，术语“比活力(specific activity)”表示酶单位，由酶制剂在特定条件下每单位时间使底物转化成产物的底物摩尔数所定义。比活力被表示为单位(U)/毫克蛋白。

[0088]如本文所使用，术语“酶单位(enzyme unit)”是指酶的用量，是在试验条件下每给定量时间产生给定量产物的酶量。在一些实施方式中，酶单位(enzyme unit)是指在特定的试验条件下每分钟产生1微摩尔产物的酶量。例如，在一个实施方式中，术语“葡糖淀粉酶活性单位(glucoamylase activity unit”(GAU)被定义为：在60℃和pH4.2的试验条件下，每小时从可溶性淀粉底物(4％ds)产生1g葡萄糖所需的酶量。

[0089]在另一个实施方式中，颗粒淀粉水解酶单位(granular starch hydrolyzingenzyme unit(GSHE U))被定义为是指：在试验条件下，例如25℃、pH5.0下，每分钟从颗粒淀粉中产生1mg葡萄糖所需的GSHE的量。在一个优选的实施方式中，GSHE U被定义为是指在50℃下、在pH4.5下每分钟从颗粒淀粉底物中产生1mg葡萄糖所需的GSHE的量。

[0090]术语“产量(yield)”是指使用本发明的方法所产生的终-产物或期望的终-产物的量。在一些优选的实施方式中，产量大于使用本领域已知方法所产生的产量。在一些实施方式中，该术语是指终产物的体积；以及在其它实施方式中，该术语是指终产物的浓度。

[0091]“ATCC”是指位于Manassas，VA 20108的美国模式培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC；<www.atcc.com>)。

[0092]“NRRL”是指美国农业研究菌种保藏中心(Agricultural Research ServiceCulture Collection)，National Center for Agricultural Utilization Research(并且以前被称为USDA Northern Regional Research Laboratory)，Peoria，ILL。

[0093]“一个(a)”、“一(an)”或“该(the)”包括复数形式指代，除非上下文中另外明确指出。

[0094]如本文中所使用，术语“包括(comprising)”和其同源词以其包含性的意义使用；也就是说，等同于术语“包含(including)”及其相应的同源词。

B.优选的实施方式

具有颗粒淀粉水解(GSH)活性的酸稳定性α淀粉酶(asAA)——

[0095]在一个实施方式中，具有GSH活性的asAA得自曲霉属菌株，例如米曲霉、白曲霉、黑曲霉和泡盛曲霉。在优选的实施方式中，具有GSH活性的asAA得自白曲霉菌株。

[0096]在特别优选的实施方式中，具有GSH活性的asAA包括与SEQ ID NO：3列出的氨基酸序列有至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和至少99％序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方式中，具有GSH活性的asAA包括与SEQ ID NO：3有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在进一步的实施方式中，具有GSH活性的asAA包括与SEQID NO：3有至少95％序列同一性的氨基酸序列。asAA还可以包括与SEQ ID NO：3有至少98％序列同一性的氨基酸序列。在进一步的实施方式中，具有GSH活性的asAA包括SEQ ID NO：3的氨基酸序列。在一些实施方式中，SEQ ID NO：3或与其具有至少85％同一性的序列被认为是完整型asAA。

[0097]在一些实施方式中，具有GSH活性的asAA将包括与SEQ ID NO：9具有至少96％、97％、98％和99％序列同一性的催化结构域。在其它实施方式中，具有GSH活性的asAA将包括与SEQ ID NO：10的SBD具有至少70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％和99％序列同一性的SBD。

[0098]在进一步的实施方式中，具有GSH活性的asAA将包括与SEQ ID NO：9具有至少97％、98％和99％的序列同一性；与SEQ ID NO：8具有至少96％、97％、98％和99％的序列同一性；以及与SEQ ID NO：10具有至少95％、96％、97％、98％和99％的序列同一性。在优选的实施方式中，催化结构域和SBD得自白曲霉菌株的α淀粉酶。

[0099]在其它实施方式中，具有GSH活性的asAA是截短型酶。在一些实施方式中，具有GSH活性的截短型asAA将包括SEQ ID NO：3的氨基酸序列的至少60％、65％、70％、75％、80％、83％、85％、88％、90％、93％、95％、96％、97％、98％和99％，而在其它实施方式中截短型asAA将包括与SEQ ID NO：3具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性的序列的至少60％、65％、70％、75％、80％、83％、85％、88％、90％、93％、95％、96％、97％、98％和99％。酶可以在多肽的羧基端被截断。在一些实施方式中，截短型asAA将包括SEQ ID NO：3或与其具有至少90％序列同一性的序列的至少430个、至少440个、至少450个、至少460个和至少470个氨基酸。

[0100]在一些实施方式中，具有GSH活性的截短型asAA将包括SEQ ID NO：9的催化域的至少90％、95％、96％、97％、98％和99％，或者包括与SEQ ID NO：9的催化域具有至少97％、98％和99％序列同一性的序列的至少90％、95％、96％、97％、98％和99％。

[0101]在一些实施方式中，具有GSH活性的截短型asAA将包括SEQ ID NO：9的催化域或者包括与其具有至少96％、97％、98％和99％的序列同一性的序列以及与SEQ ID NO：8具有至少90％、95％、96％、97％、98％和99％序列同一性的接头。优选地，截短型酶将包括与SEQ ID NO：9具有至少97％的序列同一性的催化域和与SEQ ID NO：8具有至少95％的序列同一性的接头。在一些实施方式中，截短型酶将包括与SEQ ID NO：9具有至少96％、97％、98％和99％的序列同一性的催化域，并且至少约5、10、20、25、30和35个氨基酸位于该催化域的下游。在其它实施方式中，截短型酶将包括如上所定义的催化域和接头并且进一步包括与SEQID NO：10的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％和99％序列同一性的一部分SBD。这一部分SBD将包括位于所述接头下游的至少约5个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个和100个氨基酸。

[0102]在其它实施方式中，包括SEQ ID NO：3的氨基酸序列或者与SEQ ID NO：3有至少95％序列同一性的氨基酸序列的asAA，由与SEQ ID NO：1有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和至少99％序列同一性的多核苷酸编码。在特别优选的实施方式中，编码SEQ ID NO：3的asAA(AsaA)的核酸序列是SEQ ID NO：1的核酸序列。

重组表达的酶和宿主细胞——

[0103]在本发明的一些实施方式中，微生物被遗传工程化，以表达具有GSH活性的异源asAA，并且微生物还可以被工程化，以表达异源葡糖淀粉酶。优选的宿主细胞是丝状真菌细胞。在优选的实施方式中，丝状真菌宿主是曲霉属某种(Aspergillus sp)、木霉属某种(Trichoderma sp)、镰刀霉属某种(Fusarium sp)和青霉属某种(Penicillium sp)的菌株。特别优选的真菌宿主细胞包括构巢曲霉(A.nidulans)、泡盛曲霉(A.awamori)、米曲霉(A.oryzae)、棘孢曲霉(A.aculeatus)、黑曲霉(A.niger)、日本曲霉(A.japonicus)、里氏木霉(T.reesei)、绿色木霉(T.viride)、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)和茄腐皮镰孢霉(F.solani)。曲霉属菌株在Ward etal.(1993)Appl.Microbiol.Biotechnol.39：738-743和Goedegebuur et al.，(2002)CurrGene 41：89-98中被公开。在最优选的实施方式中，宿主是木霉属的菌株，并且特别是里氏木霉(T.reesei)的菌株。里氏木霉的菌株是已知的，非限制性例子包括ATCC No.13631、ATCC No.26921、ATCC No.56764、ATCC No.56765、ATCC No.56767和NRRL 15709。在一些优选实施方式中，宿主菌株是RL-P37的衍生物。RL-P37在Sheir-Neiss et al.(1984)Appl.Microbiol.Biotechnology 20：46-53中被公开。

[0104]在一些优选的实施方式中，木霉属宿主细胞或曲霉属宿主细胞被遗传工程化，以表达具有GSH活性的asAA，该asAA特征在于与SEQ ID NO：3具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％和99％的同一性。在进一步的实施方式中，具有GSH活性的asAA将包括：与SEQ ID NO：9具有至少97％、98％和99％的序列同一性；与SEQ ID NO：8具有至少96％、97％、98％和99％的序列同一性；以及与SEQ ID NO：10具有至少95％、96％、97％、98％和99％的序列同一性。在优选的实施方式中，asAA得自白曲霉菌株的α淀粉酶。

[0105]在其它实施方式中，本发明包括编码SEQ ID NO：3的多肽、SEQ ID NO：9的多肽或如本文中所定义的截短型酶的多核苷酸。在一些实施方式中，编码asAA的多核苷酸将具有核苷酸序列SEQ ID NO：1的核酸序列或与SEQ ID NO：1具有至少70％的序列同一性的核酸序列。

[0106]在一些实施方式中，在被工程化以包括编码具有GSH活性的asAA的异源多核苷酸的宿主细胞中所产生的asAA将具有不同的性质，例如相比起由在天然宿主中具有GSH活性的asAA的内源表达所产生的asAA具有改善的性质。这些性质可以包括，例如提高的酶活、在较低pH水平下提高的酶稳定性或提高的比活。在一些实施方式中，根据本发明异源产生的具有GSH活性的asAA将表现出如下pH范围内的最高pH活性：3.0至6.0的pH范围；3.0至5.0的pH范围；3.5至5.0的pH范围；以及，同样地，在3.5至4.5的pH范围内。在其它实施方式中，异源产生的asAA，在pH3.0、3.5、4.0、4.5和/或5.0的pH水平下，相比于在基本上相同的条件下从天然宿主内源产生的相应asAA，将具有更高的稳定性或残余活性。在一些实施方式中，在具体的pH水平下，相比于在同一pH水平下内源表达的asAA，异源产生的asAA的酶稳定性水平将高出至少0.5倍、至少1.0倍、至少2.0倍或至少2.5倍。在一些实施方式中，异源表达的具有GSH活性的asAA的这些提高的性质或不同的性质在木霉属宿主细胞中特别明显。在一些实施方式中，异源表达的asAA将作为具有GSH活性的完整型asAA而被产生，该完整型asAA含有催化结构域、接头和SBD，例如图2所示性说明的成熟多肽(SEQ ID NO：3)。在其它实施方式中，异源表达的asAA将作为具有GSH活性的截短型asAA而被产生，例如，其中SBD被部分地或全部地从催化结构域切割掉。

[0107]在其它实施方式中，被遗传工程化以表达具有GSH活性的asAA的宿主菌，还可以被遗传工程化以便表达异源GA。

[0108]在本发明中有用的宿主菌可能之前业已通过遗传工程进行操作。在一些实施方式中，遗传工程化宿主细胞或菌株可以是蛋白酶缺陷型菌株。在其它实施方式中，真菌宿主细胞的多种天然基因的表达将被减少或被失活。这些基因包括，例如编码蛋白酶和纤维素分解酶的基因，如内切葡聚糖酶(endoglucanases(EG))和外切纤维二糖水解酶(exocellobiohydrolases(CBH))的基因(例如cbh1、cbh2、egl1、egl2和egl3)。美国专利5,650,322公开了在cbh1基因和cbh2基因中具有缺失的RL-P37衍生菌株。也参考USP 5,472,864。

载体——

[0109]尽管下面的描述具体指asAA，本领域的技术人员将容易理解，相同或相似的方法适用于DNA构建物和载体，用于将编码GA的多核苷酸导入宿主细胞中。

[0110]根据本发明，构建包括编码本发明涉及的asAA之核酸的DNA构建物，以便将asAA转移进宿主细胞。在一个实施方式中，DNA构建物通过表达载体被转移进宿主细胞，该表达载体包括可操纵性连接到asAA编码序列上的调节序列。

[0111]载体可以是任何载体；当被导入真菌宿主细胞时，该载体被整合进宿主细胞基因组并被复制。对于载体列表，参考Fungal Genetics Stock Center Catalogue ofStrains(FGSC，<WWW.fgsc.net>)。合适的表达载体和/或整合载体的另外的例子被提供于上文中的Sambrook et al.，(1989)、上文中的Ausubel(1987)、van den Hondel etal.(1991)in Bennett and Lasure(Eds.)MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI，Academic Press pp.396-428以及美国专利5,874,276中。特别有用的载体包括pFB6、pBR322、PUC18、pUC100和pENTR/D。

[0112]在优选的实施方式中，编码本发明涉及的asAA的核酸被可操纵性连接到合适的启动子，其在真菌宿主细胞中显示转录活性。该启动子可以源自相对于宿主细胞是同源的或异源的蛋白质编码基因。优选地，该启动子在木霉属宿主中是有用的。启动子的合适的非限制性例子包括：cbh1、cbh2、egl1、egl2、pepA、hfb1、hfb2、xyn1和amy。在一个实施方式中，启动子对于宿主细胞而言是天然的启动子。例如，当里氏木霉是宿主时，启动子是天然的里氏木霉启动子。在优选的实施方式中，启动子是里氏木霉cbh1，其是诱导型启动子并且以登记号D86235(AccessionNo.D86235)被存于Genbank中。“诱导型启动子(inducible promoter)”为在环境调控或发育调控下具有活性的启动子。在另一个实施方式中，启动子为对于真菌宿主细胞而言是异源的启动子。有用的启动子的其它例子包括来自泡盛曲霉和黑曲霉葡糖淀粉酶(glaA)(Nunberg et al.，(1984)Mol.Cell Biol.4：2306-2315和Boel etal.，(1984)EMBO J.3：1581-1585)、黑曲霉α淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、里氏木霉xln1和里氏木霉纤维素二糖水解酶1(EPA 137280A1)的基因的启动子。

[0113]在一些优选的实施方式中，asAA编码序列被可操纵性地连接到信号序列上。编码信号序列的DNA优选地是与将被表达的asAA基因天然关联的序列。优选地，信号序列由编码Ak-asaA的白曲霉asaA基因编码。更优选地，信号序列与SEQ IDNO：2的信号序列具有至少90％、至少95％、至少97％和至少99％的序列同一性。在另外的实施方式中，包括在将被导入真菌宿主细胞中的DNA构建物或载体之中的信号序列和启动子序列来自相同的来源。例如，在一些实施方式中，信号序列是可操纵性连接到cdh1启动子上的cdh1信号序列。

[0114]在一些实施方式中，表达载体还包括终止序列。在一个实施方式中，终止序列和启动子序列来自相同的来源。在另一个实施方式中，终止序列与宿主细胞同源。一个特别合适的终止子序列是来自木霉属菌株特别是里氏木霉的cbh1。其它有用的真菌终止子包括来自黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的终止子(Nuberg et al.，(1984)，见上文；和Boel et al.，(1984)，见上文)。

[0115]在一些实施方式中，表达载体包括选择标记。优选的选择标记的例子包括赋予抗微生物抗性的标记(例如潮霉素和腐草霉素)。也发现营养选择标记在本发明中有用，包括本领域已知为amdS、argB和pyr4的那些标记。在用于木霉转化的载体系统中有用的标记在本领域中是已知的。(参见，例如Finkelstein，BIOTECHNOLOGY OF FILAMENTOUS FUNGI中第6章，Finkelstein et al.Eds.Butterworth-Heinemann，Boston，MA(1992)，第6章；以及Kinghorn et al.(1992)APPLIED MOLECULAR GENETICS OF FILAMENTOUS FUNGI，BlackieAcademic and Professional，Chapman and Hall，London)。在一个优选的实施方式中，选择标记是amdS基因，其编码酶-乙酰胺酶，从而允许转化细胞依靠乙酰胺作为氮源而生长。构巢曲霉amdS基因作为选择标记的使用在Kelley et al.，(1985)EMBOJ.4：475-479和Penttila et al.，(1987)Gene 61：155-164被描述。

[0116]包括具有编码asAA的多核苷酸的DNA构建物的表达载体，可以是能够在给定的真菌宿主微生物中自主复制或能够整合进宿主的DNA中的任何载体。在一些实施方式中，表达载体是质粒。在优选的实施方式中，考虑了两种类型的表达载体，用以获得基因表达。

[0117]第一表达载体包括DNA序列，其中启动子、asAA编码区以及终止子都起源自将被表达的基因。在一些实施方式中，通过缺失不期望的DNA序列(例如编码不需要的结构域的DNA)来截短基因，以留下在其自身转录和翻译调节序列的控制下而被表达的结构域。

[0118]第二类型表达载体被预先装配，并包含高水平转录所需的序列，以及选择标记。在一些实施方式中，asAA基因的编码区或其部分被插入这一通用表达载体，使得其处于表达构建物启动子和终止子序列的转录控制下。在一些实施方式中，基因或其部分被插入强cbh1启动子的下游。

[0119]用于连接包括编码asAA的多核苷酸、启动子、终止子和其它序列的DNA构建物的方法以及用于将它们插入到合适载体中的方法，在本领域中是已知的。连接(linking)通常通过在适宜的限制位点进行连接反应(ligation)而完成。如果这类位点不存在，则根据常规实践，使用合成的寡核苷酸接头。(参见，Sambrook(1989)，见上文；以及Bennett and Lasure，MORE GENE MANIPULATIONS INFUNGI，Academic Press，San Diego(1991)pp 70-76。)。另外，使用已知的重组技术，可以构建载体(例如Invitrogen Life Technologies，Gateway Technology)。

[0120]当期望获得具有一个或多个失活基因的真菌宿主细胞时，可以使用已知的方法(例如，美国专利5,246,853、美国专利5,475,101和WO92/06209中公开的方法。)。基因失活可以通过完全或部分缺失、通过插入失活或通过使得基因对于它的预期目的无功能化的任何其它手段(这样基因被阻止而不能表达功能蛋白)而实现。已被克隆的任何来自木霉属某种或其它丝状真菌宿主的基因可以被缺失，例如cbh1、cbh2、egl1和egl2基因。在一些实施方式中，可以通过用本领域已知的方法，将欲被失活的期望基因的一种形式插入到质粒中，实现基因缺失。然后，在位于期望基因编码区内部的适宜限制性酶切位点(一个或多个)处切割缺失质粒，并用选择标记取代基因编码序列或其部分。待被缺失基因的座位侧翼的DNA序列(优选约0.5至2.0kb之间)，保持在标记基因的任一边。适宜的缺失质粒通常具有存在于其中的单一限制性酶切位点，以使得含有缺失基因的片段，包括侧翼DNA序列和选择标记基因能够被作为单一线性片段而被去除。

宿主细胞的转化、表达和培养——

[0121]将DNA构建物或载体导入到宿主细胞包括技术，例如转化；电穿孔；核显微注射；转导；转染(例如，脂转染介导的和DEAE-Dextrin介导的转染)；与磷酸钙DNA沉淀物温育；用DNA包被微粒进行的高速轰击；以及原生质体融合。

普通转化技术在本领域中是已知的(参见，例如上文Ausubel et al.，(1987)，第9章；以及上文Sambrook(1989)，和Campbell et al.，(1989)Curr.Genet.16：53-56)。异源蛋白在木霉属中的表达被描述在USP 6,022,725；美国专利6,268,328；Harkki et al.(1991)；Enzyme Microb.Technol.13：227-233；Harkki et al.，(1989)Bio Technol.7：596-603；EP 244,234；EP 215,594；以及Nevalainen et al.，″The Molecular Biologyof Trichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous andHeterologous Genes″，in MOLECULAR INDUSTRIAL MYCOLOGY，Eds.Leong andBerka，Marcel Dekker Inc.，NY(1992)pp.129-148。对于曲霉属菌株的转化，还参考Cao et al.，(2000)Sci.9：991-1001、EP 238023以及Yelton et al.(1984)Proceedings.Natl.Acad.Sci.USA 81：1470-1474。

[0122]优选地，用载体系统构建遗传上稳定的转化体，从而编码asAA的核酸被稳定整合进宿主菌株染色体中。然后，通过已知技术纯化转化体。

[0123]在一个非限制性例子中，在含有乙酰胺的固体培养基上，通过它们更快的生长速率和形成具有平滑而非粗糙的轮廓的圆形菌落，从不稳定转化体区分出含有amds标记的稳定转化体。另外，在一些情况下，通过使转化体生长在固体非选择性培养基(即，缺乏乙酰胺的培养基)上、从该培养基收获孢子，并测定这些孢子随后在含乙酰胺的选择培养基上萌发和生长的百分比，进行进一步的稳定性试验。替代地，本领域中已知的其它方法可以被用来选择转化体。

[0124]在一个具体的实施方式中，用于转化的木霉属某种(Trichoderma sp.)的制备过程包括从真菌菌丝体制备原生质体。(参见Campbell et al.，(1989)Curr.Genet.16：53-56)。在一些实施方式中，菌丝体得自萌发的营养孢子。菌丝体用酶处理，该酶消化细胞壁产生原生质体。然后，原生质体，在悬浮培养基中，在渗透稳定剂存在下得到保护。这些稳定剂包括山梨醇、甘露醇、氯化钾、硫酸镁和类似物。通常，这些稳定剂的浓度在0.8M至1.2M之间变化。优选的是，在悬浮培养基中使用约1.2M山梨醇溶液。

[0125]DNA被吸收进宿主木霉菌菌株取决于钙离子浓度。通常，约10mM CaCl₂至50mM CaCl₂之间的浓度被用在吸收溶液中。在吸收溶液中除了需要钙离子外，通常包括的其它化合物是缓冲体系，例如TE缓冲液(10mM Tris，pH7.4；1mMEDTA)或10mM MOPS，pH6.0缓冲液(吗啡啉丙磺酸)和聚乙二醇(PEG)。据认为，聚乙二醇起着融合细胞膜的作用，从而允许培养基中的内容物被输送至木霉菌菌株的细胞质中以及质粒DNA被转移到核。该融合经常使得多拷贝质粒DNA能够整合进宿主染色体。

[0126]通常，含有木霉菌原生质体或细胞的悬浮液被用于转化，所述原生质体或细胞已经在10⁵至10⁷/mL，优选2×10⁶/mL的密度下经过透性处理。将100μL体积的、在适宜溶液(例如1.2M山梨醇；50mM CaCl₂)中的这些原生质体或细胞与期望的DNA混合。通常，高浓度的PEG被加入到吸收溶液。0.1至1体积的25％PEG 4000可以被加入到原生质体悬浮液。然而，优选的是将约0.25体积加入到原生质体悬浮液中。添加剂例如二甲亚砜、肝素、亚精胺、氯化钾和类似物也可以被加入到吸收溶液并帮助转化。对于其它真菌宿主细胞，相似的步骤也是可以利用的。(参见，例如美国专利6,022,725和6,268,328，两者都被引入作为参考)。

[0127]一般而言，该混合物随后在大约0℃下温育10至30分钟。然后，另外的PEG被加入到混合物，以进一步提高对期望基因或DNA序列的吸收。25％PEG4000通常以转化混合物之体积的5至15倍的体积被加入；然而，更多或更少的体积都可以是适合的。25％PEG 4000优选以转化混合物之体积的10倍体积被加入。在加入PEG之后，然后在加入山梨醇和CaCl₂溶液之前，将转化混合物或者在室温下或者在冰上温育。然后，原生质体悬浮液被进一步加入到生长培养基的熔融等分试样中。当该生长培养基含有生长选择(例如乙酰胺或抗生素)时，该生长培养基仅允许转化体生长。

[0128]一般而言，细胞在含有生理盐和养分的标准培养基中培养(参见，例如Pourquie，J.et al.，BIOCHEMISTRY AND GENETICS OF CELLULOSEDEGRADATION，eds.Aubert，J.P.et al.，Academic Press，pp.71-86，1988和Ilmen，M.et al.，(1997)Appl.Environ.Microbiol.63：1298-1306)。也发现普通商业上制备的培养基(例如酵母麦芽提取物(Yeast Malt Extract(YM))培养液、Luria Bertani(LB)培养液和沙氏葡萄糖(Sabouraud Dextrose)(SD)培养液)在本发明中有用。

[0129]培养条件也是标准的，(例如，在振荡培养或发酵罐中，在适宜的培养基中，于大约28℃，温育培养物直至获得asAA表达的期望水平)。对于一种给定的丝状真菌，优选的培养条件在本领域中是已知的；并可以在科学文献中和/或从真菌来源处，例如American Type Culture Collection(美国模式培养物保藏中心)和FungalGenetics Stock Center(美国堪萨斯州医学中心真菌遗传学库中心)查找到。

[0130]在建立起真菌生长后，细胞被暴露于有效导致或允许本文所定义的asAA表达的条件中。在具有GSH活性的asAA编码序列受诱导型启动子调控的情况下，诱导剂(例如糖、金属盐或抗菌剂)被以诱导asAA表达的有效浓度加入到培养基。

asAA活性的鉴定——

[0131]为了评价用编码本发明所涉及的asaA之异源多核苷酸转化的细胞系表达具有GSH活性的asAA，可以在蛋白质水平、RNA水平或通过使用特别针对α淀粉酶活性和/或产生的功能生物学鉴定法而进行试验。通常，所使用的试验包括：RNA印迹法、斑点印迹法(DNA或RNA分析)、RT-PCR(反转录酶聚合酶链式反应)或原位杂交，使用适当标记的探针(基于核酸编码序列)以及常规DNA印迹法和放射自显影。

[0132]另外，具有GSH活性的asAA的产生和/或表达可以在样品中直接测量，例如，通过直接测量培养基中的还原糖例如葡萄糖的试验和通过测量葡糖淀粉酶活性、表达和/或产量的试验进行。对测量GSH活性有用的底物包括颗粒淀粉底物。例如，葡萄糖浓度可以通过任何方便的方法被测量，例如通过使用葡萄糖试剂盒No 15-UV(Sigma Chemical Co.)或仪器例如Technicon Autoanalyzer进行测量。还参考可从Instrumentation Lab.(Lexington，MA)通过商业渠道获得的葡萄糖氧化酶试剂盒和葡萄糖己糖试剂盒。

[0133]另外，基因表达可以通过免疫学方法评价，例如对细胞的免疫组织化学染色；组织切片；或组织培养基的免疫测定，例如通过蛋白质印迹或ELISA进行评价。此类免疫测定可以被用于定性或定量评价asAA的表达。此类方法的细节对于本领域技术人员而言是已知的，并且用于实践这类方法的许多试剂是商业可得的。

[0134]α淀粉酶活性可以通过使用DNS法被测定，如在Miller，G.L.(1959)Anal.Chem.31：426-428中所描述。葡糖淀粉酶活性可以通过3，5-二硝基水杨酸(3，5-dinitrosalicylic acid(DNS))法被测定(参见，Goto et al.，(1994)Biosci.Biotechnol.Biochem.58：49-54)。

[0135]在本发明的一些实施方式中，由木霉属或曲霉属宿主表达的具有GSH活性的asAA为：每升1克蛋白质以上(g/L)、2g/L以上、5g/L以上、10g/L以上、20g/L以上、25g/L以上、30g/L以上、50g/L以上，以及也可以是培养基的100g/L以上。

纯化asAA的方法——

[0136]通常，细胞培养中产生的asaA(包括n-asAA或r-asAA)被分泌到培养基中，并且可以被纯化或分离，例如通过从细胞培养的培养基中除去不需要的组分而被纯化或分离。在一些情况下，AsaA可以以细胞形式被产生，这使得从细胞裂解液回收成为必要。在这样的情况下，使用本领域技术人员常规采用的技术，从酶被产生的细胞中纯化酶。例子包括，但不限于，亲和层析(Tilbeurgh et al.，(1984)FEBS Lett.16：215)；离子交换色谱法(Goyal et al.，(1991)Biores.Technol.36：37；Fliess et al.，(1983)Eur.J.Appl.Microbiol.Biotechnol.17：314；Bhikhabhai et et al.，(1984)J.Appl.Biochem.6：336；和Ellouz et al.，(1987)Chromatography396：307)，包括使用具有高分辩能力的物质的离子交换(Medve et al.，(1998)J.Chromatography A808：153)；疏水相互作用色谱(Tomaz and Queiroz，(1999)J.Chromatography A865：123)；两相分配(Brumbauer，et al.，(1999)Bioseparation 7：287)；乙醇沉淀；反相HPLC；硅胶上或阳离子交换树脂例如DEAE上进行的色谱；层析聚焦；SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)；硫酸铵沉淀和凝胶过滤，使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤。

发酵——

[0137]在本发明的一些实施方式中，表达异源asAA的真菌细胞在分批发酵或连续发酵条件下生长。典型的分批发酵是封闭的系统，其中培养基的组成成分在发酵开始时被设定，并且在发酵过程中不经受人为改变。因此，在发酵开始时，用期望的生物体(一种或多种)接种培养基。在此方法中，在不向系统加入任何成分的情况下，允许发酵发生。典型地，依据碳源的加入，分批发酵可称为“分批”，并且经常努力控制因素例如pH和氧浓度。分批系统的代谢物和生物物质组成持续变化，直至发酵停止的时刻。在分批培养物中，细胞由迟缓期进入到高速生长的对数期，最终达到生长速率降低或停止的稳定期。如果不处理，处于稳定期的细胞最终死亡。通常，处于对数期的细胞负责大量产生终产物。

[0138]在标准分批体系中的变化是“喂料-分批发酵(fed-batch fermentation)”系统，该系统也在本发明中有用。在典型的分批系统的这种变化中，随着发酵的进程，底物以一定增量加入。当分解代谢物阻遏倾向于抑制细胞代谢和期望在培养基中具有限量的底物时，喂料-分批系统是有用的。测量喂料-分批系统中的实际底物浓度是困难的，因此，根据可测量的因素例如pH、溶解的氧和废气例如CO₂分压的变化进行估计。分批和喂料-分批发酵在本领域中是常见和熟知的。

[0139]连续发酵是开放系统，其中确定的发酵培养基被连续加入到生物反应器中，同时移出等量的条件培养基(conditioned medium)，以进行发酵。连续发酵通常使培养物维持在恒定的高密度，其中细胞主要处于对数生长期。

[0140]连续发酵允许调节影响细胞生长和/或终产物浓度的一种因素或任意数量的因素。例如，在一个实施方式中，限制性营养物例如碳源或氮源被维持在固定的速率，所有其它参数允许调节。在其它系统中，影响生长的许多因素可以持续改变，而由培养基浊度测量的细胞浓度保持恒定。连续系统努力保持稳态生长条件。因此，由于培养基的排除导致的细胞损失必须依据发酵中的细胞生长速率进行平衡。调节营养物和生长因素以进行连续发酵工艺的方法以及使产物形成速率最大化的技术是工业微生物领域熟知的。

植物表达——

[0141]在一些实施方式中，编码本发明涉及的asAA的多核苷酸可以在植物宿主中被转化和表达。本文中所使用的宿主植物包括特定的植物部分和其子代。植物部分包括茎、叶、根和种子，以及还包括特定的组织，例如但不限于胚芽和胚乳。宿主植物可以是双子叶植物，例如大豆、烟草、番茄、马铃薯、甜菜或单子叶植物例如禾谷植物(如玉米、大麦、小麦、高梁、水稻和类似的禾谷植物)。

[0142]用于植物转化的DNA构建物可以通过本领域中熟知的方法构建而成。DNA构建物将包括感兴趣的asAA基因的编码区和任选包括启动子序列和选择标记，所述感兴趣的asAA基因被可操作性地连接到在植物中表达所需要的调控序列上。调控序列包括启动子和终止子序列。

[0143]对启动子的选择取决于表达是否将是组成型、诱导型或组织特异性或是否在特定的发育阶段(参见Tague et al.，Plant Physiol.(1988)，86：506)。对于组成型表达，下面的启动子可能是有用的，35S CaMV、19S CaMV、Adh、胭脂氨酸合成酶(Nos)、蔗糖合成酶、cab、PepCase、水稻肌动蛋白(例如Actl)(McElroy et al.，(1990)Plant Cell 2：163)、α-tublin和玉米泛蛋白1(maize ubiquitin 1)(Christensen et al.，(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632)。

[0144]诱导型启动子是仅在植物被暴露于一些特定的外部刺激时才启动转录的启动子。诱导型启动子的例子包括化学诱导和创伤诱导启动子，例如PR启动子(如PR-1、PR-2、PR-3以及特别是烟草PR-1a启动子(USP 5,614,395))或噬菌体T7启动子。创伤诱导启动子包括蛋白酶抑制剂的启动子(例如多酚氧化酶、LAD和TD的启动子)和马铃薯pin2的启动子(Xu et al.，(1993)Plant Mol.Biol 22：573-588)。

[0145]组织特异性启动子例如胚乳启动子包括zmGBS，玉米颗粒结合型淀粉合成酶基因启动子；ZmZ27，玉米醇溶蛋白基因启动子；osGT1，水稻谷蛋白1基因启动子以及PR5，水稻谷醇溶蛋白基因启动子(Russell et al.，(1997)Transgenic Res.6：157-168)。诱导型、组成型和组织特异型植物启动子对于本领域普通技术人员是熟知的。

[0146]增强子序列经常被整合进植物转化载体，以增强基因表达。增强子可以包括，例如，内含子序列例如玉米adh1基因的内含子。

[0147]选择标记是容易获得的并且在本领域中已知的。可以使用例如bar-bialaphos或EPSPS-草甘膦选择系统(White et al.，(1990)Nucl.Acids Res.18：1062)、hph潮霉素磷酸转移酶(Bloching et al.，Mol.Cell Biol.4：2929-2931)、和nptll卡那霉素抗性基因(Messing et al.，(1982)Gene 19：259-268和Bevan et al.，(1983)Nature304：184-187)。

[0148]用在DNA构建物和/或表达载体的多种转录终止子是可得的。合适的终止子序列包括那些已知在植物中起作用的终止子，例如但不限于35S CaMV终止子、tml终止子、胭脂氨酸合成酶(Nos)终止子和pes rbcS E9终止子。

[0149]根据传统的已知技术，DNA构建物或表达载体可以被整合进宿主植物或植物部分。这些技术中的一些技术对于双子叶植物优选包括根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的基因转移，对于单子叶植物优选包括微粒轰击、PEG介导的原生质体转化、电穿孔，以及还包括农杆菌感染。(参考USP6,803,499、USP 6,777,589、Potrykus et al.，(1985)Mol.Gen.Genet 199：169-177、Potrykus(1990)Biotechnol 8：535、Klein et al.，(1987)Nature 327：70-73、Shimamoto etal.，(1989)Nature 338：274、Fromm et al.，(1990)Biotechnol.8：833-839)。许多适合与这些转化系统一起使用的载体是可得的。(参见McElroy et al.(1991)Mol.Gen.Genet.231：150-160)。基因表达可以通过本领域已知的方法以及本领域所描述的测量真菌表达的方法测量。

组合物——

[0150]根据本发明特别有用的酶组合物是颗粒淀粉水解酶组合物，其包括与SEQID NO：3具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％和99％序列同一性的asAA。在一些实施方式中，asAA得自asAA并且特别是白曲霉酸稳定性α淀粉酶在木霉属或曲霉属宿主中的异源表达。本发明的另一个特别有用的酶组合物是包括与SEQ ID NO：9具有至少97％、98％和99％序列同一性的截短型asAA的颗粒淀粉水解酶组合物。

[0151]在进一步的实施方式中，根据本发明的酶组合物将包括具有GSH活性的asAA酶的组合，其包括a)与SEQ ID NO：3具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％和99％的序列同一性的具有GSH活性的完整型asAA；和b)具有GSH活性的截短型asAA。在一些实施方式中，具有GSH活性的截短型asAA将是与SEQ ID NO：9具有至少96％、97％、98％和99％的序列同一性的序列。

[0152]在一些实施方式中，具有GSH活性的完整型asAA的量与在酶组合物中具有GSH活性的asAA的总量相比，至少为约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％和98％。在其它实施方式中，在根据本发明的酶组合物中，具有GSH活性的完整型asAA与具有GSH活性的截短型asAA的比率将是约10％至90％、20％至80％、30％至70％、35％至65％、40％至60％、45％至55％、50％至50％、55％至45％、60％至40％、65％至35％、70％至30％、80％至20％和90％至10％(完整型比截短型)。在一些优选的实施方式中，完整型和截短型的比率将在约40％至60％和约60％至40％之间。

[0153]在一些实施方式中，asAA可作为无细胞滤液被获得(例如其中asAA从培养基中被分离得到)，而在其它实施方式中，asAA可从含有真菌宿主细胞的培养基中获得，所述真菌宿主细胞表达和分泌含有GSH活性的asAA。在进一步的方面，本发明包括含有从木霉属细胞产生的具有颗粒淀粉水解活性的酸稳定性α蛋白酶(asAA)的发酵或培养基，所述木霉属细胞包括编码与SEQ ID NO：3有至少90％序列同一性的asAA的异源多核苷酸。

[0154]如本领域的技术人员所理解地，用在组合物中的具有GSH活性的asAA的量和本发明的方法将取决于asAA的酶活性。在一些实施方式中，存在于酶组合物的asAA的范围为每gds为0.01至40 SSU/gds；0.01至30SSU/gds；0.01至20SSU/gds；0.01至15.0SSU/gds和0.01至10SSU/gds。

[0155]根据本发明另一个特别有用的酶组合物是如上公开的颗粒淀粉水解酶组合物，其另外包含葡糖淀粉酶。

[0156]在本发明的组合物和方法中有用的葡糖淀粉酶(GA)(E.C.3.2.1.3)可以是野生型或者是遗传修饰的葡糖淀粉酶，其包括变种和杂种葡糖淀粉酶。一般来说，葡糖淀粉酶可以源自细菌、植物和真菌来源。在本发明的组合物和方法中有用的优选葡糖淀粉酶是由几种丝状真菌菌株和酵母菌株产生的。具体而言，从曲霉属和木霉属菌株分泌的葡糖淀粉酶在商业上是重要的。这些葡糖淀粉酶的来源包括：黑曲霉G1和G2葡糖淀粉酶及其变体(Boel et al.，(1984)EMBO J.3：1097-1102；WO92/00381；WO 00/04136和USP 6,352,851)；泡盛曲霉葡糖淀粉酶(WO 84/02921)；米曲霉葡糖淀粉酶及其变体(Hata et al.，(1991)Agric.Biol.Chem.55：941-949)以及Aspergillus shirousami(参见Chen et al.，(1996)Prot.Eng.9：499-505；Chen et al.(1995)Prot.Eng.8：575-582；和Chen et al.，(1994)Biochem J.302：275-281)。葡糖淀粉酶还得自踝节菌属(Talaromyces)的菌株例如源自T.emersonii、T.leycettanus、T.duponti和嗜热踝节菌(T.thermophilus)的那些菌株(WO 99/28488；USP No.RE：32,153；和USP No.4,587,215)；根霉属的菌株例如雪白根霉(R.niveus)和米根霉(R.oryzae)；毛霉属(Mucor)菌株；木霉属菌株，例如里氏木霉和绿色木霉；以及腐质霉属菌株，例如灰腐质霉(参见Boel et al.，(1984)EMBO J.3：1097-1102；WO 92/00381；WO00/04136；Chen et al.，(1996)Prot.Eng.9：499-505；Taylor et al.，(1978)CarbohydrateRes.61：301-308；US专利4,514,496；US专利4,092,434；以及Jensen et al.，(1988)Can.J.Microbiol.34：218-223)。在本发明中有用的其它葡糖淀粉酶包括得自罗氏阿太菌(Athelia rolfsii)的那些葡糖淀粉酶及其变体(WO 04/111218)。

[0157]商业上使用的具有葡糖淀粉酶活性的酶，例如是从黑曲霉产生的酶(来自Genencor International Inc.，商品名为DISTILLASE、OPTIDEX L-400和G ZYMEG990 4X)或根霉属的种产生的酶(来自Shin Nihon Chemicals，Japan，商品名为CU.CONC)。也可以是商业消化酶，商品名为GLUCZYME，来自AmanoPharmaceuticals，Japan(Takahashi et al.，(1985)J.Biochem.98：663-671)。另外的酶包括根霉属某种(Rhizopus sp.)的3种形式的葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)，即“Gluc1”(MW74,000)、“Gluc2”(MW 58,600)和“Gluc3”(MW 61,400)”。发现Gluc1在本发明中特别有用。

[0158]一些GA酶也是颗粒淀粉水解酶(一种或多种)GSHE(参见，例如Tosi etal.，(1993)Can.J.Microbiol.39：846-855)。这些GA-GSHEs不仅具有葡糖淀粉酶活性，而且能够水解颗粒(粗)淀粉。GA-GSHEs已经从真菌细胞中回收得到，尤其已经从丝状真菌细胞例如腐质属某种(Humicola sp.)、曲霉属某种(Aspergillussp.)、木霉属某种(Trichoderma sp.)以及根酶属某种(Rhizopus sp.)中回收得到。米根霉GA-GSHE已经被描述在Ashikari et al.，(1986)Agric.Biol.Chem.50：957-964和USP 4,863,864中。也可参考雪白根霉。灰腐质酶GA-GSHE被描述于Allison etal.，(1992)Curr.Genet.21：225-229；Tosi et al.，(1993)Can.J.Microbiol.39：846-852；Campos et al.，(1995)App.And Environ.Microbiol.61：2436-2438和欧洲专利171218。编码该酶的基因在本领域中也称为为“gla1”。泡盛曲霉河内变种(Aspergillusawamori var.kawachi)GA-GSHE被描述在Hayashida et al，(1989)Agric.Biol.Chem53：923-929。Aspergillus shirousami GA-GSHE由Shibuya et al.，(1990)Agric.Biol.Chem.54：1905-1914描述。用于本发明的一种具体的酶制剂包括从Biocon India，Ltd，India可获得的以名称“M1”出售的酶制剂。

[0159]在一些优选的实施方式中，葡糖淀粉酶是源自木霉属的GA-GSHE，特征在于具有SEQ ID NO：11的蛋白质序列或与SEQ ID NO：11具有至少70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％和99％的序列同一性的序列。

[0160]在其它优选的实施方式中，葡糖淀粉酶是源自曲霉属的GA-GSHE，特征在于具有SEQ ID NO：13的蛋白质序列或与SEQ ID NO：13具有至少70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％和99％的序列同一性的序列。

[0161]在一个实施方式中，GA-GSHE酶可以源自灰腐质霉的菌株，特别是灰腐质霉高温变种的菌株(参见，美国专利4,618,579)。在一些优选的实施方式中，灰腐质霉GA-GSHE酶从包括ATCC 16453、NRRL(USDA Northern Regional ResearchLaboratory，Peoria，ILL)15219、NRRL 15220、NRRL 15221、NRRL 15222、NRRL15223、NRRL 15224和NRRL 15225的真菌以及其基因改造菌株中回收。这些种产生免疫学上相同的葡糖淀粉酶酶制剂(参见EP 0 171 218)。

[0162]在其它优选的实施方式中，灰腐质霉GA-GSHE可以具有SEQ ID NO：12的蛋白质序列或与SEQ ID NO：12具有至少70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％和99％的序列同一性的序列。

[0163]在酶组合物中有用的葡糖淀粉酶的量是在0.001至10.0GAU/gds、也在0.01至10.0GAU/gds以及也在0.1至10.0GAU/gds的范围内。GA-GSHE制剂的活性可以根据葡糖淀粉酶的活性被定义。

[0164]在一些实施方中，酶组合物将包括与SEQ ID NO：3具有至少85％、90％、95％、98％和99％的序列同一性的asAA和葡糖淀粉酶，其中asAA得自asAA的异源表达，尤其是白曲霉asAA在木霉属和青霉属中的异源表达。该葡糖淀粉酶可以是未被遗传修饰的酶或该酶可以是变种或杂种GA。在其它实施方式中，酶组合物将包括葡糖淀粉酶、完整型asAA和如上所定义的截短型asAA的组合。在一些优选的实施方式中，GA得自曲霉属菌株，例如DISTILLASE_。在其它实施方式中，GA得自根霉属、木霉属或腐质霉属菌株。更具体地，在一些实施方式中，asAA酶组合物将与葡糖淀粉酶组合，该葡糖淀粉酶包括与序列SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：12或SEQ ID NO：13具有至少90％、93％、95％、96％、97％、98％和99％的序列同一性的氨基酸序列。

[0165]尽管不意欲于限制本发明，其它特别优选的酶组合物包括下面的组合：a)得自黑曲霉的葡糖淀粉酶和与SEQ ID NO：3具有至少95％的序列同一性的具有GSH活性的asAA；b)得自黑曲霉的葡糖淀粉酶和与SEQ ID NO：9具有至少96％的序列同一性的具有GSH活性的asAA；c)得自黑曲霉的葡糖淀粉酶、与SEQ IDNO：3具有至少95％的序列同一性的具有GSH活性的asAA、和与SEQ ID NO：9具有至少96％的序列同一性的asAA；d)本发明包含的asAA酶组合物和含有与SEQ ID NO：11有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的葡糖淀粉酶；e)本发明包含的asAA酶组合物和含有与SEQ ID NO：12有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的葡糖淀粉酶；和f)本发明包含的asAA酶组合物和含有与SEQ ID NO：13有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的葡糖淀粉酶。

[0166]一些特别有用的酶组合物包括与SEQ ID NO：3有至少95％的序列同一性的asAA和具有0.1至10GAU/gds的GA的混合物。另一个特别有用的酶组合物包括与SEQ ID NO：3有至少98％的序列同一性的asAA和具有0.1至10GAU/gds的GA的混合物。仍然另一个特别有用的酶组合物包括与SEQ ID NO：9有至少98％的序列同一性的asAA和具有0.1至10GAU/gds的GA的混合物。

[0167]在一些实施方式中，具有GSH活性(SSU)的asAA与GA活性(GAU)的比率在40∶1至1∶40的范围内、还在30∶1至1∶30的范围内、还在20∶1至1∶20的范围内和15∶1至1∶15的范围内。在进一步的实施方式中，该比率(SSU比GAU)将在约20∶1至1∶10的范围内；约10∶1至1∶10；约10∶1至1∶5；约5∶1至1∶5；约4∶1至1∶4；约3∶1至1∶3；约2∶1至1∶4以及还在约2∶1至1∶2的范围内。在一些优选的实施方式中，SSU与GAU的比率将在约4∶1至2∶1之间。

[0168]在其它实施方式中，具有GSH活性的asAA和GA以这样的比率存在：当在相同的条件下以相同的水平被供给时，该比率使得对底物中的颗粒淀粉的水解大于这些酶的相加结果。在一些情况下，水解将增加至少1.0倍、增加至少1.5倍、增加至少2.0倍、以及还增加至少3.0倍。本发明的组合物所包含的成分的精确量将取决于酶的组合。

[0169]通常，具有GSH活性的asAA以每克淤浆干固体约0.01至15.0SSU的量与颗粒淀粉底物的淤浆混合。在一些实施方式中，具有GSH活性的asAA以每克淤浆干固体约0.01至10.0SSU、约0.01至5.0SSU、约0.05至10.0SSU、约0.05至5.0SSU、约0.1至10.0SSU、约0.1至5.0SSU、约0.1至2.0SSU、约0.25至2.5SSU、约0.5至5.0SSU、约0.5至2.5SSU以及也以约0.5至1.5SSU的量被加入。

[0170]如本领域人员所理解，用在本发明的方法和组合物中的葡糖淀粉酶的数量取决于该葡糖淀粉酶的酶活性。通常，每克(ds)被调节到20-45％干固体的淤浆中可以加入0.001至10.0GAU的量的葡糖淀粉酶。在一些实施方式中，葡糖淀粉酶以每克(ds)淤浆0.01至10GAU之间、0.01至5.0GAU之间、0.05至5.0GAU之间、0.1至10.0GAU之间、0.1至5.0GAU之间、0.1至2.0GAU之间、0.25至1.5GAU之间的葡糖淀粉酶的量被加入。在一个优选的实施方式中，葡糖淀粉酶的剂量范围为从0.1至2.0GAU/g(ds)淤浆。

[0171]附加的酶可以被包括在本发明所涉及的组合物和方法中。这些在本发明中发现有用的附加的酶包括脱支酶，例如支链淀粉酶(E.C.3.2.1.41)和异淀粉酶(E.C.3.2.1.68)。这类酶水解α-1，6-糖苷键。因此，在淀粉水解期间，脱支酶从淀粉的非还原端连续除去葡萄糖单元。可以用在本发明的组合物中的另一个酶是β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)。这些是外部作用产麦芽糖淀粉酶(exo-acting maltogenicamylases)，其催化直链淀粉、支链淀粉和相关的葡萄糖聚合物中的1，4-α-糖苷键的水解。这些酶中的一些，特征在于具有从4.5至7.0的最适pH范围和从40℃至65℃的最适温度范围。商业β淀粉酶可获自例如Genencor International Inc.的SPEMZYME BBA和OPTIMALT。

[0172]附加的酶可以包括α淀粉酶，其特征可以在于或不在于具有GSH活性。α淀粉酶的例子既包括细菌和真菌α淀粉酶又包括其变体。具体的非限制性的例子包括：来自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)的α淀粉酶和其变种或杂种(USP 5,093,257；USP 6,093,562；USP 5,736,499；USP 5,958,739；USP6,436,888；USP 6,867,031；WO 96/39528；WO 96/23874和WO 05/001064)。商业可得的α淀粉酶是SPEZYME FRED和SPEZYME ETHYL(Genencor InternationalInc.)。也发现环糊精葡聚糖转移酶(cyclodextrin glucanotransferases(CGTases))(E.C.2.4.1.19)及其变体可用在本发明中(USP 5,278,059；USP 5,545,587和WO05/003337)。

[0173]可以被使用的进一步的附加酶是蛋白酶，例如真菌和细菌的蛋白酶。真菌蛋白酶包括：例如得自曲霉属、木霉属、毛酶属和根霉属的那些蛋白酶，例如黑曲霉、泡盛曲霉、米曲霉和米赫毛霉(M.miehei)。其它酶包括但不限于纤维素酶，例如内切葡聚糖酶；半纤维素酶，例如甘露聚糖酶；脂肪酶(例如E.C.3.1.1.3)、葡糖氧化酶；果胶酶；木聚糖酶、转葡糖苷酶和α-1，6-葡糖苷酶(例如E.C.3.2.1.20)和角质酶(cutinases)(例如E.C.3.1.1.74)。

[0174]被包括在本发明的方法中的这些酶的有效量可以被本领域技术人员容易地确定。

[0175]在一些实施方式中，抗菌素可以被加入到本发明的组合物和发酵培养基中。抗菌素是杀死或抑制微生物生长的化合物。

[0176]包括根据本发明的asAA的酶组合物，可以包括：用于淀粉转化特别是颗粒淀粉转化的组合物；清洗组合物(cleaning compositions)；用于纸和纸浆生产的组合物；酿造组合物；烘烤组合物(baking compositions)；用于增甜剂的组合物以及类似物。

[0177]在一个优选的实施方式中，在一个优选的实施方式中，包括本发明的asAA和任选地asAA与葡糖淀粉酶之组合的酶组合物将被用于产生醇。在一些实施方式中，使用本发明的组合物，至少8％、 10％、 12％、 14％、16％和18％的乙醇被生产。

[0178]在一些实施方式中，乙醇将在同步糖化发酵期间被产生。在一些实施方式中，酶组合物将同时与颗粒淀粉底物的淤浆和乙醇产生微生物组合，并且混合物在单一步骤中被发酵。该淤浆可以具有约10-50％ds；约10-45％ds；约15-40％ds；约20-40％ds；约25-40％ds；或约25-35％ds。

[0179]颗粒淀粉底物可以得自任何植物部分，包括茎、谷粒、根和块茎。特别优选的植物来源包括玉米、小麦、黑麦、高梁、水稻、黍、大麦、木薯(cassava)、豆科植物例如豆类(bean)和豌豆、马铃薯、甘薯、香蕉、甘蔗和木薯(tapioca)。

[0180]特别考虑的淀粉底物是玉米淀粉和小麦淀粉。来自谷粒的淀粉可以是磨碎的或完整的，包括玉米固体物(corn solids)，例如玉米仁(kernels)、麸(brans)和/或玉米穗(cobs)。此外，谷粒可以被分级(fractionated)(例如，对于玉米，分级为胚乳、胚芽或纤维(麸)；以及对于小麦，分级为谷蛋白(gluten)、淀粉A和B)。淀粉可以是经过淀粉精制工艺的高度精制的生淀粉(highly refined raw starch)或原料(feedstock)。本领域的一般技术人员将熟知可以利用的方法，这些方法可以被用于制备在本发明所涉及的方法中所使用的颗粒淀粉底物。这些方法中的一些包括使用锤磨机和辊式粉碎机对整谷粒进行干法磨粉，以及包括湿磨法。

[0181]在一些实施方式中，经过磨碎的谷粒之至少80％、70％、60％、50％、40％、30％将通过0.5mm的筛。在其它实施方式中，细小的颗粒大小是优选的；并因此，磨碎了的谷粒之至少80％、85％、90％和95％将通过0.5mm的筛。仍然在其它实施方式中，磨碎了的谷粒可以是粗糙颗粒；在这些情况下至少90％的磨碎谷粒将通过1.0mm、1.5mm或2.0mm的筛，但仅仅约少于5％、10％和15％将通过0.5mm的筛。

[0182]各种各样的淀粉是商业上可得的。例如，玉米淀粉可以从Cerestar、Sigma和Katayama Chemical Industry Co.(Japan)获得；小麦淀粉可以从Sigma获得；甘薯淀粉可以从Wako Pure Chemical Industry Co.(Japan)获得；以及马铃薯淀粉可以从Nakaari Chemical Pharmaceutical Co.(Japan)获得。

[0183]多篇参考文献已经报道了在谷粒中发现的淀粉的数量，并且查阅了TheAlcohol Textbook，3^rd Ed.K.Jacques et al.，Eds.1999，Nottingham University Press。例如，玉米含有约60-68％的淀粉；大麦含有约55-65％的淀粉；黍含有约75-80％的淀粉；小麦含有约60-65％的淀粉；以及精白米(polished rice)含有约70-72％的淀粉。

[0184]在一些实施方式中，颗粒淀粉底物被浆化(通常使用水)并且淤浆包括i)约10％到约55％的干固体含量(ds)；ii)约15％到约50％的干固体含量；iii)约20％到约45％的干固体含量；iv)约25％到约45％的干固体含量；v)约30％到约45％的干固体含量；vi)约30％到约40％的干固体含量；以及vii)约30％到约35％的干固体含量。使颗粒淀粉淤浆与根据本发明的酶组合物在颗粒淀粉底物中的淀粉糊化温度以下的温度中接触，以产生葡萄糖。

[0185]根据本发明的方法所使用的精确温度，取决于所使用的具体淀粉底物。通常的淀粉糊化温度范围公开在Swinkels，STARCH CONVERSION TECHNOLOGY第32-38页，eds Van Beynum et al.，(1985)Marcel Dekker Inc.，NY和THEALCOHOL TEXTBOOK，A REFERENCE FOR THE BEVERAGE，FUEL ANDINDUSTRIAL ALCOHOL INDUSTRIES，3rd Ed.，eds Jacques et al.，1999，Nottingham University Press，UK。在一些实施方式中，本发明包含的方法将在至少约10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃和65℃的温度中进行。在其它实施方式中，该温度将在约25-65℃、约30-65℃、约35-65℃、约40-65℃和约45-65℃之间。在其它实施方式中，该温度将在约25-45℃、约25-40℃和约30-35℃之间。在优选的实施方式中，淀粉底物未曾经受用以液化的热条件。

[0186]在一些实施方式中，本发明包括的方法将在pH3.0至7.0之间、pH3.0至6.0之间、pH3.0至5.0之间、3.5至6.0之间、pH3.5至5.0之间和pH3.5至4.5之间的pH范围内进行。

[0187]在一些实施方式中，该方法的停留时间为约2至300小时，但更通常地2至120小时。在一些实施方式中，该方法被进行约5至100小时。在其它实施方式中，该方法被进行约5至80小时。仍然在其它实施方式中，该方法被进行至少约5小时但100小时以下。在其它实施方式中，该步骤被进行至少约10小时但100小时以下。

[0188]在一些实施方式中，颗粒淀粉的干固体之至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、94％、95％、96％、97％、98％和99％被水解。在一些实施方式中，颗粒淀粉底物被完全水解。在一些实施方式中，在100小时中，颗粒淀粉的至少90％被水解。在某些实施方式中，在24小时内，至少90％的颗粒淀粉底物被水解。在其它实施方式中，在24小时内，至少95％的颗粒淀粉底物被水解。

[0189]葡萄糖的产量(总的增溶的干固体的百分数)可以至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％和98％。在一些实施方式中，葡萄糖可以被用于产生高果糖糖浆。在优选实施方式中，葡萄糖被连续产生并基本上所有葡萄糖都被用在该方法中，以产生终产物，例如乙醇和副产品如DDGS。(参考MOLECULAR STRUCTURE AND FUNCTION OF FOOD CARBOHYDRATE，ED.G.G.BIRCH ET AL，APPLIED SCIENCE PUBLISHERS，LONDON)。葡萄糖也可以用于发酵产生其它终产物，包括，但不限于：有机酸、酶、甘油、氨基酸、抗坏血酸中间体以及其它复合化合物，例如激素和抗生素。

                              实验

[0190]提供下面的实施例以展示和进一步示例性说明本发明的某些优选的实施方式和方面，并不被解释为限制本发明的范围。实际上，预期的是，这些教导将用于进一步优化本文中描述的方法系统。

[0191]在随后的公开和试验部分，使用了下面的缩写：

[0192]具有GSH活性的asAA(具有颗粒淀粉水解活性的酸稳定性α淀粉酶)；asaA(具有颗粒淀粉水解活性的酸稳定性α淀粉酶，如SEQ ID NO：3中所说明，并且其得自asAA在白曲霉中的内源性表达)；Tr-asaA(白曲霉酸稳定性α淀粉酶在里氏木霉宿主中的表达)；AkAA(具有SEQ ID NO：3的酸稳定性α淀粉酶并且有时与asaA互换使用)；GA(葡糖淀粉酶)：HGA(包括SEQ ID NO：12的序列的灰腐质霉GA)；TrGA(包括SEQ ID NO：11的序列的木霉属GA)；wt％(重量百分比)；℃(摄氏度)；rpm(转/每分钟)；H₂O(水)；dH₂O(去离子水)；d1H₂O(去离子水，Milli-Q过滤)；aa(氨基酸)；bp(碱基对)；kb(千碱基对)；kD(千道尔顿)；g或gm(克)；μg(微克)；mg(毫克)；μL(微升)；ml和mL(毫升)；mm(毫米)；μm(微米)；M(体积摩尔浓度)；mM(体积毫摩尔浓度)；μM(体积微摩尔浓度)；U(单位)；V(伏特)；MW(分子量)；sec(秒)；min(s)(分钟/数分钟)；hr(s)(小时/数小时)；PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)；DO(溶解氧)；邻苯二甲酸盐缓冲液(于水中的邻苯二甲酸钠，20mM，pH5.0)；PBS(磷酸盐缓冲盐水[150mM NaCl，10mM磷酸钠缓冲液，pH7.2])；SDS(十二烷基磺酸钠)；Tris(三羟甲基氨基甲烷)；w/v(重量体积比)；w/w(重量比)；v/v(体积比)；Genencor (Genencor International，Inc.，Palo Alto，CA)；DDGS(含固体干酒糟)；MT(公吨)；和EtOH(乙醇)。

[0193]下面的试验和方法被用于下面提供的实施例中：

葡糖淀粉酶试验：使用熟知的试验测量葡糖淀粉酶活性，该试验基于葡糖淀粉酶催化对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(p-nitrophenyl-alpha-D-glucopyranoside(PNPG))水解成葡萄糖和对硝基苯酚的能力。在碱性pH中，硝基苯酚形成与葡糖淀粉酶活性成比例的黄颜色，并且在400nm下被监测，并与酶标准品比较，计量为GAU。

[0194]1个“葡糖淀粉酶活性单位(Glucoamylase Activity Unit)”(GAU)被定义为产生1克还原糖所需的酶的量，计算为在pH4.2、于60℃，每小时由可溶性淀粉(4％ds)产生的葡萄糖。

[0195] 酸稳定性α淀粉酶活性(acid-stable alpha amylase activity)的测量是基于：在pH4.5于50℃中，通过酶样品的等分试样水解可溶性马铃薯淀粉底物(4％ds)的程度。使用DNS法测量还原酶含量，如Miller，G.L.(1959)Anal.Chem.31：426-428所描述。1单位的酶活力(SSU，可溶性淀粉单位(soluble starch unit))相当于：在具体的温育条件中，每分钟释放1mg葡萄糖的还原能力。

总淀粉含量的测定：酶-酶淀粉液化和糖化方法(双酶法)被用于测定总淀粉含量。在典型的分析中，2g干样品被放入100ml科耳劳奇瓶(Kohlraucsh flask)中，并且加入45ml pH7.0的MOPS缓冲液。该淤浆被充分搅拌30分钟。加入1.0mlSPEZYME FRED(1∶50稀释于水中)，并加热到沸腾，持续3-5分钟。该瓶被置于加压釜中，维持在121℃中，达15分钟。在热压处理后，该瓶被置于95℃水浴中，加入1ml的1∶50稀释的SPEZYME FRED，并温育45分钟。调节pH到pH4.2，而温度被降到60℃。随后加入20ml醋酸盐缓冲液，pH4.2。通过加入1.0ml的1∶100稀释的OPTIDEX L-400(来自Genencor International Inc.的葡糖淀粉酶)进行糖化，并于60℃持续温育18小时。通过于95℃加热10分钟，终止酶反应。使用葡萄糖作为标准物，利用HPLC分析测定总糖组成。从总糖中减去在室温下未经酶处理之样品的水抽提物中的可溶性淀粉水解产物。

残留淀粉碘试验：将发酵醪(beer)(发酵液)样品在2ml塑料离心管中离心。倾去上清液，将含有沉淀的管置于冰浴中。将几滴0.025 N碘溶液(0.1N碘，来自VWR目录号VW3207-1，稀释4×)被加到该沉淀中，并混合。阳性(+)淀粉显示的颜色范围是蓝色到紫色，并且颜色强度与淀粉浓度成正比。阴性结果(-)保持淡黄色。

总蛋白分析：使用Kieldhal法(American Assoc.Cereal Chemists(AACC)，(1983)，Methods 22B60 8th Ed.St Paul，MN)，测定样品配制液中的总氮(N)。蛋白质含量由6.25×总氮计算出。

乙醇和糖类测定：

[0196]使用HPLC法测定样品中乙醇和碳水化合物组成，如在此所述：

a)将1.5mL Eppendorf离心管装满发酵罐发酵醪，并在冰上冷却10分钟；

b)该样品管在Eppendorf台式离心机(Eppendorftable top centrifuge)中离心1分钟；

c)将0.5mL上清液样品转移到含0.05mL的Kill溶液(1.1N H₂SO₄)的试管中，并允许静置5分钟；

d)将5.0mL水加入到试管样品中，然后通过0.45μm尼龙针头过滤器(NylonSyringe Filter)过滤到HPLC瓶中；和

e)在HPLC上运行。

HPLC条件：

[0197]

a)乙醇系统：

柱：Phenomenex Rezex Organic Acid Column(RHM-单糖)

#00H-0132-KO(等同于Bio-Rad 87H)

柱温：60℃

流动相：0.01N H₂SO₄

流速：0.6mL/min

检测器：RI

注射体积：20μL

[0198]

b)糖类系统：

柱：Phenomenex Rezex Carbohydrate(RCM-单糖)#00H-0130-KO(等同于Bio-Rad 87H)

柱温：70℃

流动相：纳米纯DI H₂O

流速：0.8mL/min

检测器：RI

注射体积：10μL(3％DS材料)

[0199]该柱基于糖类的分子量分离，这些糖类被称为DP1(单糖)；DP2(二糖)；DP3(三糖)和DP+4(聚合度大于3的寡糖)。

如下制备用在实施例7-16中的asaA。在表达asaA的里氏木霉(根据实施例2和3制备)的发酵结束时，通过离心分离生物量，并且使用10,000分子量截留超滤膜(cut-off ultrafiltration membrane)浓缩澄清的培养物滤液。使用该具有90SSU/g的超滤浓缩液。

如下制备用在实施例7-16中黑曲霉葡糖淀粉酶：使用如在USP 3,249,514中描述的经选择的黑曲霉菌株。发酵之后，使用包括过滤和离心在内的常规分离方法，分离真菌菌丝体。通过在5℃中进行超滤，浓缩该澄清的滤液，达到规定的活力。

                         实施例1

[0200]克隆白曲霉酸稳定性α淀粉酶基因。

[0201]从白曲霉菌丝体过夜培养物中提取基因组DNA。根据制造商关于真菌的指示，使用FastDNA Kit(QbioGene，Carlsbad，CA)SPIN^TM方案。就匀浆化过程而言，将样品在FastPrep Instrument上，以速度4.0处理30秒。依据A.Kaneko，et al.(Kaneko et al.，(1996)，J.Ferm Bioeng 81：292-298)的asaA序列，设计PCR引物。正向引物包含用于定向克隆入pENTR/D载体(Invitrogen)的基序。

[0202]α6引物的序列是CACCATGAGAGTGTCGACTTCAAG(SEQ ID NO.6)，而Akaa3引物的序列是CTACCTCCACGTATCAACCAC(SEQ ID NO.7)。

[0203]通过凝胶提取法(gel extraction)(Gel Purification Kit，Qiagen)，分离2.36kbPCR产物；并根据Invitrogen Gateway系统方案，克隆入pENTR/D。然后，载体被转化进以化学方式所致感受态的Top 10大肠杆菌(Top 10 E.coli(Invitrogen))中，它具有卡那霉素选择。用限制性酶消化来自几个克隆的质粒DNA，以确认正确大小的插入物。对几个克隆中的α淀粉酶基因插入物进行测序(Sequetech，Mountain View，CA)(SEQ ID NO：1)。来自1个克隆的质粒DNA，pENTR/D_Akaa#11，被加入到带有pTrex3g/amdS目的载体的LR克隆酶反应(LRclonase_reaction)(Invitrogen Gateway系统)中。在LR克隆酶反应中进行的重组使来自pENTR/D载体的白曲霉asaA代替目的载体之CmR和ccdB基因。该重组在目的载体的cbhI启动子和终止子之间定向插入asaA。48bp和50bp的重组位点序列，分别保留在α淀粉酶的上游和下游。LR克隆酶反应的等分试样，被转化进化学感受态的Top 10 E.coli中，并在羧苄青霉素选择下过夜生长。对几个克隆中的质粒DNA进行限制性消化，以确认正确的插入物大小。为从细菌质粒中移出真菌表达盒，按照Stratagene QuickChange方案，将EcoRI位点3′加入到amdS基因上。确认整个真菌表达盒的序列。用EcoRI消化来自克隆pTrex3g_Akalpha#1(图4)的质粒DNA，以释放包括cbhI启动子：asaA：cbhI终止子：amdS的表达盒。使用标准技术通过琼脂糖提取方法，纯化该7.8kb的表达盒，并且转化入从公众可得的菌株QM6a衍生到的里氏木霉菌菌株中，如下面进一步描述。

                            实施例2

                    里氏木霉的生物射弹转化

[0204]里氏木霉孢子悬浮液被铺在直径～6cm的MABA转化板的中心处(150μl的5×10⁷-5×10⁸孢子/ml的悬浮液)。然后，该板在生物通风厨中被风干。将阻挡屏(Stopping screens)(BioRad 165-2336)和微载体固定器(macrocarrier holders)(BioRad 1652322)浸泡在70％的乙醇中，并风干。DriRite干燥剂被置于小培养皿(6cm Pyrex)中，并用Whatman滤纸覆盖。将该含有微载体(BioRad 165-2335)的微载体固定器平放于滤纸的上面，并将培养皿盖重新放回去。

[0205]通过将60mg钨M-10粒子(微载体，0.7微米，BioRad#1652266)加入到Eppendorf管中，制备钨粒子悬浮液。加入1ml乙醇(100％)。在乙醇溶液中使钨涡旋(votex)，并使其浸泡15分钟。以最大速度，短暂地微量离心Eppendorf管，以沉淀钨。轻轻倒出乙醇，并用无菌蒸馏水洗涤3次。在水洗涤液被第三次轻倒出后，钨被重悬在1ml无菌50％甘油中。至少每2周一次配制新鲜的钨。

[0206]对于每次转化，通过将25μl悬浮钨加入到1.5ml Eppenderf管而制备转化反应物。随后，依次连续加入0.5-5μl DNA(XbaI消化的表达盒)、25μl 2.5M CaCl2、10μl 0.1M亚精胺。该反应物被连续涡旋5-10分钟，使钨保持悬浮状态。然后，Eppendorf管被短暂地微量离心并被轻轻倒出液体。用200μl 70％的乙醇洗涤钨沉淀，短暂微量离心成沉淀并被倾去液体。用200μl 100％的乙醇洗涤沉淀，短暂微量离心成沉淀，并倒出液体。将钨沉淀重悬于24μl 100％的乙醇中。将Eppendorf管置于超声水浴中15秒，并将8μl等分试样转移到干燥过的微载体的中心处。该微载体被留置在干燥过的培养皿中，进行干燥。

[0207]He罐(He tank)被开启到1500psi。将1000psi可裂膜(可裂膜圆片(rupturediscs))(BioRad 165-2329)用在Model PDS-1000/He Biolistic Particle DeliverySystem(BioRad)中。当钨溶液变干时，阻挡屏和微载体固定器被插入PDS-1000中。将含有目标里氏木霉孢子的MABA板置于阻挡屏下6cm处。29英寸Hg的真空度被施加到室上，并保持该真空度。氦生物射弹粒子输送系统(He Biolistic ParticleDelivery System)射击。使该室通风；并且移出MABA板，以在28℃温育直至菌落出现(5天)。

[0208]对于该实施例2，配制下面的溶液，

改性amdS生物射弹琼脂

(Modified amdS Biolistic agar(MABA))            每升

部分I，在500ml dH₂O中制备

1000×盐                   1ml

高质量琼脂(Noble agar)     20g

PH达6.0，高压灭菌

部分II，在500ml dH₂O中制备

乙酰胺                     0.6g

CsCl                       1.68g

葡萄糖                     20g

KH₂PO₄                     15g

MgSO₄·7H₂O                0.6g

CaCl₂·2H₂O                0.6g

pH达4.5，0.2微米过滤除菌；放入150℃烘箱中温热，加到琼脂上，混合，

倒板。室温下保存。

1000×盐         每升

FeSO₄·7H₂O      5g

MnSO₄·H₂O       1.6g

ZnSO₄·7H₂O      1.4g

CoCl₂·6H₂O      1g

加到1L dH₂O

0.2微米过滤除菌

                            实施例3

[0209]里氏木霉的PEG介导的原生质体融合转化

[0210]将萌发孢子的菌丝体(于30℃，在Difco的马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextroseagar(PDA))上生长5天)的1-2cm²琼脂块(agar plug)，接种到处于250ml、4挡板摇瓶中的50ml YEG(含20g/L葡萄糖的5g/L酵母提取物)培养液中；并在200rpm和30-37℃下，温育16-20小时。通过将摇瓶内容物转移进50ml锥形管中并以2500rpm旋转10分钟，回收菌丝体。上清液被丢弃而菌丝体沉淀被转移到250ml、0.22mCA或PES的Corning过滤瓶中，该过滤瓶含有40ml过滤过的β-D葡聚糖酶溶液。该溶液在30℃、200rpm下被温育2小时，以产生原生质体。原生质体通过过滤收集，经过无菌Miracloth(CalBiochem，La Jolla，CA)，进入50ml锥形管中。通过以2000rpm离心5分钟，沉淀原生质体，并且丢弃上清液。用50ml1.2M山梨醇洗涤原生质体沉淀1次；离心(2000rpm，5分钟)并丢弃上清液。用25ml山梨醇/CaCl₂洗涤沉淀。使用血球计对原生质体进行计数，然后通过以2000rpm离心5分钟而形成沉淀。丢弃上清液，并将原生质体沉淀重悬于山梨醇/CaCl₂中，该山梨醇/CaCl₂的体积足以产生原生质体浓度为1.25×10⁸个/ml的原生质体溶液。

[0211]对于每一转化，20μg等分试样的表达载体DNA(体积不大于20μl)被转移到冰上的15ml锥形管中。原生质体悬浮液(200μl)和50μl PEG溶液被加到每一管中。这被缓慢混合并在冰上温育20分钟。PEG(2ml)溶液被加到每一转化管中并在室温下孵育5分钟。4ml山梨醇/CaCl₂溶液被加入到每一管中(总体积6.2ml)并被轻轻混合。然后，2ml转化混合物被加入到3个熔融(50℃)上层琼脂管中的每一个中。每一上层琼脂混合物被倒在单独的转化板上，并于30℃温育4至7天。

[0212]对于采用amdS选择的转化，使用乙酰胺/山梨醇板和上层琼脂。选择板与转化板相同，但不含山梨醇。通过转移分离的菌落到新鲜的含乙酰胺的选择培养基中，纯化推定的转化体。

如下配制培养基和溶液。

1)40mlβ-D-葡聚糖酶溶液——在40ml 1.2M山梨醇中，溶解600mgβ-D-葡聚糖酶(InterSpex Products Inc.，San Mateo，CA)和400mg MgSO₄·7H₂O。

2)200ml PEG混合物——在200ml dI H₂O中，溶解50g PEG 4000(BDHLaboratory Supplies Poole，England)和1.47g CaCl₂·2H₂O。每月新鲜配制。

3)山梨醇/CaCl₂溶液——在1.2M山梨醇中溶解50mM CaCl₂。

4)乙酰胺/山梨醇琼脂——

部分I——在200ml dl H₂O中溶解0.6g乙酰胺(Aldrich，99％升华)、1.68gCsCl、20g葡萄糖、20g KH₂PO₄、0.6g MgSO₄·7H₂O、0.6g CaCl₂·2H₂O、1ml1000×盐(参见下面)，pH调节到pH5.5，用d H₂O使体积达到300毫升，并过滤除菌。

部分II——20g高质量琼脂(Noble agar)和218g山梨醇被加到1L量筒中，用dl H₂O使体积达到700mls，并高压灭菌。

部分II被加到部分I，得到1L的最终体积。

5)1000×盐——混合5g FeSO₄·7H₂O、1.6g MnSO₄·H₂O、1.4g ZnSO₄·7H₂O、

1g CoCl₂·6H₂O，并用dIH₂O使体积达到1L。过滤除菌。

                        实施例4

[0213]黑曲霉的PEG介导的原生质体融合转化

[0214]从萌发孢子的黑曲霉板取出2cm²琼脂块，接种到50ml YEG(5g/L酵母提取物，含有20g/L葡萄糖)培养液中，其中该培养液处于250ml、4挡板摇瓶中。以200rpm，于30-37℃中，温育琼脂块16-20小时；菌丝体通过无菌Miracloth滤器被收集，并且用溶液A(SolutionA)洗涤。洗涤过的菌丝体被无菌转移到40ml原生质体化溶液(protoplasting solution)中，并在30℃、200rpm温育1-2小时，原生质体化进展被显微监测。原生质体化反应物通过无菌Miracloth被过滤到2个50ml无菌一次性离心管中，并用溶液B(Solution B)使每一管的体积达到45毫升。在2500rpm下离心原生质体5分钟，以获得沉淀，并丢弃上清液。用20ml体积的溶液B再洗涤沉淀2次。该沉淀被重悬在10ml溶液B中，并使用血球计对原生质体计数。原生质体被再次离心并丢弃上清液。原生质体被新重悬在溶液B中，以达到～1×10⁷个/100μl。在冰上，100μl原生质体溶液被加入到预冷的15ml管中，每一个转化一个管。10μg DNA以不超过10μl的体积加入。加入溶液C(Solution C)(12.5ul)，轻轻混合，并在冰上温育20分钟。

[0215]MMS上层琼脂(对于每一转化而言，做3管，每管10ml)被熔融并保持在55℃。从冰上移走原生质体；将溶液C(1ml)和溶液B(2ml)加入到每个管中并缓慢混合所述管。1ml原生质体混合物被加入到3个上层琼脂管中的每一个中，并将所述上层琼脂倒在MMS板上。对于每一转化，重复这一操作；并将板于30℃温育4-7天。

溶液A(每500ml)——0.44g K₂HPO₄、0.34g KH₂PO₄、48.156g无水MgSO₄(FW120.37)；以及加入dIH₂O到500ml的终体积，pH5.5。过滤除菌并在室温下储藏。

原生质体化溶液——在40ml溶液A中，溶解180单位的β-D-葡聚糖酶(InterSpexProducts，Inc)。0.2微米过滤器，过滤除菌。

溶液B(每500ml)——5ml 1M Tris，pH7.5；2.77g CaCl₂(FW 110.99)；109.32g山梨醇(FW 182.2；1.2M)；以及加入dIH₂O，达到500ml的最终体积。过滤除菌并在室温下储藏。

溶液C(每500ml)——250g PEG 4000；2.77g CaCl₂；5ml 1M Tris，pH7.5；加入dIH₂O，达到500ml的最终体积。过滤除菌。

MMS琼脂^*——在1L dIH₂O中溶解，6g/L NaNO₃；0.52g/L KCl；1.52g/L KH₂PO4；218.5g/L D-山梨醇；1ml/L痕量元素(参见下文)；10g/L琼脂(上层琼脂中的低熔点琼脂糖)。高压灭菌。灭菌后，无菌加入10ml 50％葡萄糖和1.25ml 20％MgSO₄·7H₂O。^*对于amdS选择，用0.59g/L乙酰胺和3.4g/LCsCl替代MMS中的硝酸盐。

痕量元素溶液

在250ml dIH₂O中溶解，

1g/LFeSO₄·7H₂O

8.8g/LZnSO₄·7H₂O

0.4g/LCuSO₄·5H₂O

0.15g/LMnSO₄·4H₂O

0.1g/LNa₂B₄O₇·10H₂O

50mg/L(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O

混合并加入0.2ml浓HCl以溶解。用dIH₂O使体积达到1L。过滤除菌。

                        实施例5

[0216]用asaA基因转化的里氏木霉的发酵和在里氏木霉克隆中的活性分析

[0217]一般地，遵照Foreman et al.(Foreman et al.(2003)J.Biol.Chem278：31988-31997)中所述的发酵方案进行。更具体地，对于每一个菌株，进行重复发酵，显示于图5A中。用1.5ml冷冻孢子悬浮液，接种0.8L含有5％葡萄糖的Vogels基本培养基(Davis et al.，(1970)METHODS IN ENZYMOLOGY 17A，第79-143页和Davis，Rowland，NEUROSPORA，CONTRIBUTIONS OF A MODELORGANISM，Oxford University Press，(2000))。48小时后，将每一培养物转移到处于14L Biolafitte发酵罐中的6.2L同样的培养基中。该发酵罐在每分钟8个标准升的气流下，于25℃以750 RPM运行。初始葡萄糖被消耗完后1小时时，25％(w/w)乳糖进料开始进行，并且以碳限制模式进料，以防止乳糖积聚。分别使用葡糖氧化酶测定试剂盒或含有加入以切割乳糖的β-半乳糖苷酶的葡糖己糖激酶测定试剂盒，监测葡萄糖和乳糖的浓度(Instrumentation Laboratory Co.，Lexington，MA)。

[0218]定期取样，以监测发酵进展。在International Equipment Company(NeedhamHeights，MA)医用离心机中，将收集的样品于50ml离心管中以3/4速度旋转。在具有MOPS(吗啡啉丙磺酸)SDS运行缓冲液(running bufier)和LDS样品缓冲液的还原条件下，使样品上清液进行4-12％BIS-TRIS SDS-PAGE凝胶试验(图5A)。

[0219]在另外的发酵中，样品上清液基本上如上所述进行操作。然而，获得完整型和截短型Tr-asaA的不同比例。图5B泳道2示出了50kD和90kD之间的3条主要带。使用本领域已知的修改方法(Hellman et al.，(1995)Anal.Biochem.224：451-455)消化凝胶上的3条带。提取肽，使用反相HPLC分离，并测定肽质量和质谱/质谱碎裂模式(ms/ms fragmentation pattern)。所得到的肽图谱确认了两条较低MW的带是截短型。一条带代表截短型asAA，其中截短发生在SEQ ID NO：3的氨基酸位置434和580之间；而第二条带代表截短型asAA，其中截短发生在SEQ ID NO：3的大约氨基酸位置581处。每条带表现出α淀粉酶和GSH活性。

                                  实施例6

[0220]具有GSH活性的天然和重组白曲霉酸稳定性α淀粉酶(asaA)的pH稳定性的比较

[0221]在pH4.5中，用20mM乙酸盐缓冲液，将如上所述重组产生的asaA(Tr-asaA)样品和天然asaA样品稀释到相等的蛋白质浓度。反应在pH3至7的pH水平中，于50℃下，在100mM柠檬酸/NaOH缓冲液中进行30分钟。在样品管中，将1.0mL反应物加到5mL 10％玉米淀粉(Cargill Foods，MN)中，该玉米淀粉在100mM、pH4.5的乙酸盐中。管于50℃中振荡20分钟。然后，加入0.5mL2.0％NaOH。管被旋转，并且使用二硝基水杨酸分析法(Dinito Salicylic Acid(DNS)Assay)(Goto et al.，(1994)，见上文)测定0.5ml上清液中的还原糖。结果描绘在图6中。r-asaA在pH3.9下表现出100％的残余活性。相比之下，n-asaA在pH4.5下表现出100％的残余活性。

                              实施例7

[0222]在未蒸煮过的整粒粉碎玉米粉(whole ground corn)底物的同步糖化发酵(SSF)期间，Tr-asaA浓度的效应

[0223]在来自无细胞培养物滤液的葡糖淀粉酶(GA)的两个水平(0.5和1.0GAU/g)中，评价Tr-asaA。制备百分之三十六的玉米面粉淤浆，其中含有干玉米浸渍液(drycorn steep)(占玉米面粉的2.5％)。用稀硫酸调节该淤浆的pH至4.8。淤浆的总干固体是33.85％。在含有100gm(克)醪液(mash)(淤浆)的125ml烧瓶中，进行发酵。加入期望水平的酶，然后加入3ml增殖的酵母淤浆，以起始发酵。通过将0.26gm(克)干Fali酵母加入到100gm(克)醪液中，制备酵母接种物，其中醪液中的GA活性为0.9GAU/g原材料固体。该淤浆被置于32℃的水浴中，并轻轻混合约17小时。在不同的时间间隔，取出发酵样品(发酵醪)，进行HPLC分析。72小时后，终止发酵；并在60℃干燥发酵醪，以获得含固体干酒糟(DDGS)。

[0224]测定DDGS中的淀粉含量，并且通过加入碘，抽样调查终止发酵后的发酵醪中的不溶性固体中的淀粉。在该研究中所使用的酶是黑曲霉GA。表1总结了乙醇水平、醪液固体的碘染色和DDGS的淀粉百分比。表1中所示结果证明了Tr-asaA通过葡糖淀粉酶增强了颗粒玉米淀粉的水解。

                            表1

[0225]在酵母发酵条件下，颗粒玉米淀粉转化成乙醇期间asaA的效应

GAGAU/gds	asaASSU/gds	％v/vEtOH24hr	％v/v EtOH50hr	％v/v EtOH72hr	％淀粉DDGS	碘
							0.5		7.7	11.4	13.7	27.4	+
0.5	0.25	9.2	14.7	16.9	7.7	+
							0.5	0.50	9.6	15.4	17.0	5.7	+/-
0.5	1.0	10.0	16.2	17.3	4.1	+/-
							0.5	2.0	10.9	16.5	17.5	2.8	-
0.5	3.0	11.2	16.8	17.5	1.6	-
							0.5	4.0	11.2	16.9	17.4	1.7	-
0.5	5.0	11.2	17.0	17.7	1.5	-
							1.0		9.3	14.4	16.2	13.0	+
1.0	0.25	11.6	17.1	17.8	3.6	+/-
							1.0	0.5	12.1	16.8	17.9	2.6	-
1.0	1.0	12.7	17.2	17.7	2.2	-
							1.0	2.0	12.7	17.6	17.8	1.6	-
1.0	3.0	12.9	17.5	17.8	1.1	-
							1.0	4.0	13.2	17.5	17.9	0.8	-
1.0	5.0	13.3	17.2	17.9	1.1	-
							2.0		11.2	15.5	16.9	9.6	+
3.0		11.4	15.9	17.2	5.8	+

                     实施例8

[0226]利用葡糖淀粉酶和α淀粉酶的颗粒淀粉底物的转化

[0227]在0.5GAU/gds的葡糖淀粉酶存在下，在同步糖化发酵条件下，将不同来源的商业α淀粉酶与Tr-asaA比较。使用在前所述的可溶淀粉底物(soluble starchsubstrate(SSU))法试验，测定商业α淀粉酶的活性。

表2

α淀粉酶	微生物菌株	SSU/ml
			Tr-assA	在里氏木霉中表达的白曲霉asAA	90
SPEZYME LTAA	解淀粉芽孢杆菌	2,759
			SPEZYME FRED	地衣芽孢杆菌**	4,842
SPEZYME Ethyl	嗜热脂肪芽孢杆菌**	22,082
			CLARASEL	米曲霉	23,087

^**表示重组菌

[0228]使用如实施例7所述的整粒磨碎玉米进行乙醇发酵。来自表2所列来源的α淀粉酶，以每克磨碎玉米1.0SSU的量加入，葡糖淀粉酶以0.5GAU/g的量加入。在发酵过程期间，取样并分析乙醇含量(图7)。在发酵之后，分离不溶性固体(DDGS)，并在pH5.0中测定玉米醪液中的残留淀粉含量。结果总结于表3中。

                         表3

                 平均(Ave)％v/v EtOH

GAU/gds	1.0SSU/gds的α淀粉酶	22小时	46小时	72小时	72小时，DDGS中残留淀粉百分比，％
						0.5	-	7.77	11.56	14.44	29.8
0.5	SPEZYME LTAA	7.72	11.56	14.78	30.8
						0.5	SPEZYME FRED	7.84	11.77	14.59	30.8
0.5	SPEZYME Ethyl	7.94	11.82	14.57	29.1
						0.5	CLARASEL	7.94	11.72	14.62	30.8
0.5	Tr-assA	9.57	15.75	18.44	9.0

[0229]表3中的结果清楚地显示出：在使用酵母的乙醇发酵条件下，Tr-asaA对于帮助葡糖淀粉酶水解颗粒淀粉是非常有效的。另外，如从该表中所观察到的，在使用本发明的酶组合时，发酵中所产生的乙醇百分比(18.44)较大，而DDGS中残留淀粉百分比(9.0)显著较低。

                               实施例9

[0230]使用Tr-asaA的乙醇发酵中，对整粒破碎小麦(全麦磨碎小麦粉(whole groundwheat))的评价

[0231]在36％的全麦磨碎小麦的淤浆中，加入干玉米浸渍液，加入量为2.5％——这基于全麦磨碎小麦的重量。在含有100gm醪液的125ml烧瓶中，进行发酵。用稀硫酸，将淤浆的pH调到4.8。醪液被稀释到33.85％ds的终浓度。

[0232]葡糖淀粉酶(0.5GAU/g磨碎小麦)和asaA(1.0SSU/g整粒磨碎小麦)被加到醪液中。随后加入3.0ml繁殖的酵母，以起动发酵。通过将0.26gm的干Fali酵母加入到100gm的醪液中，制备酵母接种物。在伴随温和搅拌的同时，于32℃水浴中进行发酵试验。在不同的时间间隔取出发酵液(发酵醪)的样品，离心，以对糖类组成和乙醇进行HPLC分析(表4)。

                           表4

[0233]用于乙醇生产的酵母发酵中的全麦磨碎颗粒淀粉

GAGAU/gds	Tr-asaASSU/gds	小时	％w/vDP＞2	％w/vDP-2	％w/vDP-1	％w/v乳糖	％w/v甘油	％v/v乙醇
											0	0.98	0.97	2.00	0.22	0.12	0.00
0	0	24	1.33	0.00	0.02	1.09	0.15	2.42
									0	0	48	1.17	0.00	0.00	1.39	0.13	2.38
0	0	72	1.08	0.00	0.01	1.38	0.13	2.16
									0	0.1	24	1.30	0.00	0.02	1.06	0.16	4.49
0	0.1	48	1.16	0.00	0.02	1.51	0.16	2.28
									0	0.1	72	1.23	0.00	0.01	1.83	0.15	2.91
0	0.25	24	1.28	0.03	0.02	1.06	0.17	2.94
									0	0.25	48	1.05	0.00	0.02	1.41	0.15	2.73
0	0.25	72	1.24	0.00	0.03	1.92	0.17	3.06
									0	0 5	24	1.25	0.00	0.01	1.02	0.13	3.03
0	0.5	48	1.22	0.00	0.02	1.60	0.18	3.27
									0	0.5	72	1.26	0.00	0.03	1.90	0.18	3.24
0	0.75	24	1.29	0.03	0.02	1.06	0.16	3.21
									0	0.75	48	1.29	0.00	0.03	1.62	0.10	3.57
0	0.75	72	1.34	0.00	0.03	1.90	0.18	3.60
									0	1.0	24	1.29	0.04	0.02	1.04	0.16	3.43
0	1.0	48	1.32	0.04	0.01	1.55	0.18	4.02
									0	1.0	72	1.46	0.09	0.04	1.84	1.21	4.15
0.2	0	24	1.18	0.00	0.00	1.04	0.18	3.34
									0.2	0	48	1.16	0.00	0.02	1.67	0.19	4.14
0.2	0	72	1.16	0.0O	0.02	1.92	0.19	4.78
									0.2	0.1	24	1.20	0.00	0.03	1.05	0.20	3.64
0.2	0.1	48	1.12	0.00	0.02	1.59	0.20	4.60
									0.2	0.1	72	1.14	0.00	0.03	1.86	0.21	5.58
0.2	0.25	24	1.16	0.00	0.03	1.02	0.21	3.80
									0.2	0.25	48	1.14	0.00	0.03	1.57	0.22	5.13
0.2	0.25	72	1.06	0.03	0.03	1.71	0.21	5.90
									0.2	0.5	24	1.20	0.00	0.03	1.03	0.22	4.04
0.2	0.5	48	1.14	0.00	0.01	1.54	0.22	5.61
									0.2	0.5	72	1.13	0.03	0.04	1.74	0.23	6.65
0.2	0.75	24	1.16	0.00	0.03	1.03	0.22	4.13
									0.2	0.75	48	1.24	0.00	0.04	1.54	0.24	5.68
0.2	0.75	72	1.10	0.00	0.01	1.63	0.23	7.14
									0.2	1.0	24	1.00	0.00	0.03	0.96	0.17	4.14
0.2	1.0	48	1.16	0.00	0.04	1.50	0.25	5.90
									0.2	1.0	72	1.21	0.03	0.04	1.68	0.23	6.76
0.5	0	24	1.07	0.00	0.03	0.98	0.24	4.50
									0.5	0	48	1.01	0.00	0.02	1.41	0.25	6.29
0.5	0	72	1.10	0.03	0.15	1.55	0.25	7.49
									0.5	0.1	24	1.12	0.00	0.04	0.94	0.24	4.62
0.5	0.1	48	1.12	0.00	0.03	1.34	0.27	6.92
									0.5	0.1	72	1.09	0.03	0.03	1.46	0.27	8.45
0.5	0.25	24	1.17	0.00	0.05	0.97	0.27	5.01
									0.5	0.25	48	1.20	0.00	0.04	1.28	0.28	7.18
0.5	0.25	72	1.06	0.03	0.03	1.34	0.27	8.78
									0.5	0.5	24	1.16	0.00	0.05	0.91	0.26	5.29

0.5	0.5	48	1.11	0.00	0.04	1.18	0.28	7.71
									0.5	0.5	72	1.07	0.03	0.04	1.23	0.28	9.47
0.5	0.75	24	1.15	0.00	0.05	0.90	0.28	5.33
									0.5	0.75	48	1.11	0.03	0.06	1.16	0.30	8.08
0.5	0.75	72	1.06	0.04	0.05	1.17	0.30	9.91
									0.5	1.0	24	1.12	0.00	0.06	0.89	0.29	5.52
0.5	1.0	48	1.12	0.00	0.05	1.14	0.32	8.39

                      实施例10

[0234]底物处理对乙醇产量和含固体干酒糟(DDGS)组成的影响

[0235]对于燃料醇发酵，使用锤磨机，使整粒破碎玉米底物经受常规的干法磨粉工艺，以减小颗粒大小。制备3种不同的醪液。

[0236]处理1(Treatment 1(Trt 1))是高温处理，其包括根据现有技术方法程序，通过喷射蒸煮(jet cooking)，在pH5.6用3.5U/g SPEZYME ETHYL批式液化36％ds的玉米面粉淤浆，该玉米面粉的淤浆中含有0.9％的干玉米浸渍液(dry corn steep(DCS))。该淤浆被置于90℃浴中1.5小时，混合，然后冷却到30℃，用稀硫酸将pH调节到5.0。用水进一步稀释淤浆到32.71％ds。

[0237]处理2(Treatment 2(Trt 2))是低温处理。通过于60℃，用稀硫酸将pH调节到5.0，温育36％的、含有0.9％DCS的玉米面粉淤浆3小时而制备醪液。在温育之前，加入0.05GAU/g葡糖淀粉酶。

[0238]处理3(Treatment 3(Trt 3))是室温处理——在将玉米淤浆用于用0.5GAU葡糖淀粉酶/g玉米和1.0SSU/g玉米的Tr-asaA进行的发酵之前，在室温下获得玉米淤浆。

[0239]然后，对每一处理进行酵母发酵，如实施例7所述。

[0240]在发酵后，测定乙醇产量，并通过离心分离每一处理的不溶性固体，于60℃干燥，并且测定总糖类含量和氮含量。结果阐明在表5中，其中Trt 3是本发明所涉及的方法。

                                 表5

[0241]在使用酵母的乙醇发酵条件下，对整粒破碎玉米底物的不同处理的乙醇产量和DDGS组成的比较

玉米醪液处理	每公吨玉米的DDGS(KgsDDGS/MT玉米)，Kgs	DDGS中残留淀粉含量，％	DDGS中总蛋白，％	每公吨玉米的乙醇(乙醇L/MT玉米)，L
					Trt 1高温	326	4.8	27.5	402
Trt 2低温	299	3.8	29.5	429
					Trt 3无热处理GA+Tr-assA	274	3.5	31.6	438

[0242]如从表5示出的结果所观察到：根据本发明的方法(Trt 3)所处理的DDGS中的残留淀粉百分比，小于得自现有技术处理(Trt 1)或低温处理(Trt 2)的残留淀粉百分比。与Trt 1和Trt 2的4.8％或3.8％相比，Trt 3的值是3.5％。与现有技术处理(Trt 1)相比，根据本发明Trt 3的DDGS中的总蛋白含量和所产生的乙醇的量较高。

                               实施例11

[0243]颗粒玉米淀粉与纯化的白曲霉α淀粉酶和纯化的黑曲霉葡糖淀粉酶的温育酶纯化：

[0244]采用使用AKTA(Amersham Pharmacia，Biotech.，NJ)的制备型高压液相色谱(HPLC)法，纯化黑曲霉葡糖淀粉酶(GA)和白曲霉α淀粉酶(AkAA)，都被从培养物滤液纯化而来。在典型的试验中，使用离心柱(spin column)(Bio-Rad，CA)，用10mM MES缓冲液(pH5.75)使两个粗酶样品脱盐，以降低电导率。样品被带到2M NH₄SO₂中。上样到Q-Sepharose柱(Amersham，Biosciences，NJ)，并用20mM MES缓冲液(pH5.75)洗脱，使用1.5M KCl梯度。具有相应活性的部分被合并在一起并进行浓缩，用于进一步的实验。

颗粒玉米淀粉用纯化酶温育：

[0245]纯化酶制备物被加入到于0.1M乙酸盐缓冲液(pH4.5)中的4.0％颗粒玉米淀粉(Cargill，Minneapolis，MN)中，如下所述用于扫描电子显微镜(SEM)分析。

[0246]在32℃中温育0.5GAU/g玉米淀粉的纯化GA；1.0SSU/g淀粉的纯化AkAA；以及组合起来的GA与AkAA，并温和搅拌。在2、4和8小时的时间间隔时取出等分试样(0.75ml)，离心；并且通过上面实施例中所述的方法，测定可溶性糖。沉淀被重悬于蒸馏水(5ml)，并被离心。沉淀再次重悬于5ml无水乙醇(99％)中，搅拌以均匀混合并离心。醇处理的沉淀在管中被风干，并用于SEM分析。

SEM分析：

[0247]大约200μl干体积被转移到1.5ml Eppendorf管，并且加入0.8ml无水乙醇。组分被涡旋以制备淀粉颗粒的悬浮液。几滴悬浮液被置于刚清洁过的玻璃盖玻片上，并允许被风干。用碳粘合剂调整片(carbon adhesive tabs)将盖玻片安放在样品台(specimen stub)上，四周喷涂胶体银粘合剂(Electron Microscopy Sciences，Ft.Washington，PA)，并在ScanCoat Six Sputter Coater(Edwards High Vacuum Intl.Crawley，UK)上用薄层金涂覆。使用Quanta 200 FEG扫描电子显微镜(FEI Inc.，Hillsboro，Ore)，在1,000×和5,000×的仪器放大倍数下，在二级电子成像模式中，于5kv下进行扫描电子显微。从样品台上不同的区域获得8到10个图像。单独酶处理或组合酶处理对于颗粒玉米淀粉的影响，在图8和9中被予以例示性说明。

水解和显微检查：

[0248]图8例示性说明了还原糖(mg/ml还原当量)，其被测定为：作为用AkAA和GA进行的颗粒淀粉水解的结果，4小时后所释放出的葡萄糖。单独使用葡糖淀粉酶的颗粒淀粉的降解是4.9mg/ml；单独使用AkAA的颗粒淀粉的降解仅为0.3mg/ml。然而，使用GA和AkAA组合的颗粒淀粉降解是12.1mg/ml。酶被组合起来的降解值说明了协同相互作用，其显著大于这些酶的加和值。

[0249]使用扫描电子显微镜观察如本实施例所述处理的淀粉颗粒。如图9所示，用纯化的AkAA温育的玉米淀粉颗粒确实显示出较小的表面变化。这些表面变化被观察到是小的针刺小孔。用纯化的GA温育的玉米淀粉颗粒显示出许多小的清晰的深孔。显著地，用GA和AkAA的组合温育的玉米淀粉颗粒显示出大量宽而深的穿透性腔隙。另外，在用GA和AkAA的组合温育的颗粒中，观察到暴露出颗粒中心的层化结构的表面腐蚀。

                           实施例12

[0250]颗粒玉米淀粉淤浆的干固体百分含量对乙醇产量的影响

[0251]用水将玉米面粉制成淤浆，获得36％ds的醪液。在用硫酸将pH调节到4.5之前，将小量玉米浸渍液(占淤浆的0.2％)与400ppm(0.04％)脲一起加入到醪液中。淤浆的干固体含量从20％ds被调节至36％ds。在含有总量为100g醪液的125ml瓶中，进行发酵。酶被稀释，以便对每一种酶，使用0.5ml的恒定体积。用3ml酵母接种每一个瓶，其中酵母在使用前已繁殖17小时。酵母繁殖步骤涉及：将0.5％干Fali酵母加入到含0.5GAU/gGA和1.5SSU/gAkAA的25％ds醪液中；以及在32℃水浴中温育，同时温和混合。以约24小时的时间间隔，在60℃中干燥发酵醪的样品，以便获得DDGS。

                     表6

[0252]DS含量对在75小时时的乙醇产量和DDGS中残留淀粉的影响

％DS	GA(0.5GAU/gds)		AkAA(1.5SSU/g AkAA ds)+GA(0.5GAU/gds)
						EtOH百分比v/v，％	DDGS中残留淀粉百分比，％	EtOH百分比v/v，％	DDGS中残留淀粉百分比，％
20	9.86	2.28	10.15	1.37
					24	11.75	5.79	12.51	1.00
28	13.51	13.07	14.80	1.83
					32	15.38	18.06	17.47	3.78
36	16.39	29.37	18.07	13.36

[0253]除了在高固体下外(数据未示出)，几乎所有在发酵期间产生的葡萄糖(DP-1)都被转化成乙醇。对于每一个测试的％DS，AkAA增加了产生乙醇的速率和数量。在所有情况下，当AkAA与GA结合使用时，DDGS中的淀粉百分比下降；并且进一步地，当与未添加AkAA的DDGS中的淀粉百分比相比时，在来自具有高至36％的玉米淀粉底物的DDGS中发现的淀粉百分比被减半。图10显示，当玉米淤浆中％ds增加时，AkAA对乙醇产量的影响增加。这些结果证实了AkAA对水解颗粒淀粉尤其在高固体百分含量下具有正效应。

                         实施例13

[0254]在DI H₂O中，制备33％的玉米面粉(Azure Standard Farms)淤浆，400ppm脲被加入其中。调节pH到5.0。在含有100g醪液的125ml瓶中进行发酵，并且进行下面的处理。

A)黑曲霉GA和AkAA以1.0GAU/g和3.0SSU/gds掺混；

B)HGA-GSHE在1.0GAU/gds；

C)HGA-GSHE在1.0GAU/gds和AkAA在3.0SSU/gds；

D)HGA-GSHE在2.0GAU/gds和

E)HGA-GSHE在2.0GAU/gds和AkAA在3.0SSU/gds。

[0255]这些酶被稀释，使得0.5ml被加入到每一瓶中。在通过加入1.0ml酵母淤浆来接种发酵罐之前，制备Fali干酵母在水中的3％淤浆，并在32℃水浴中混合1小时。瓶被置于32℃水浴中，并且温和混合醪液。在发酵期间，移取样品，进行HPLC分析。在72小时之后终止发酵，并于62℃干燥发酵醪，获得DDGS。通过双酶法测定DDGS的淀粉含量。

                             表7

处理	取样的Hr	％w/v乳酸	％v/v乙醇	总％v/v乙醇	％淀粉DDGS
						A	22	0.07	10.69	10.77
A	46	0.08	18.02	18.07
						A	72	0.00	18.35	18.45	3.73
B	22	0.07	7.61	7.63
						B	46	0.10	11.27	11.30
B	72	0.00	13.19	13.19	44.66
						C	22	0.05	10.22	10.24
C	46	0.06	17.48	17.53
						C	72	0.00	18.37	18.37	5.44
D	22	0.06	8.23	8.27
						D	46	0.08	12.39	12.42
D	72	0.00	14.10	14.10	39.91
						E	22	0.04	12.85	12.92
E	46	0.06	18.02	18.13
						E	72	0.00	18.41	18.41	4.51

                              实施例14

[0256]在DI H₂O中制备33％的玉米面粉(Azure Standard Farms)淤浆，400ppm脲被加入其中。用5N H₂SO₄调节pH到4.5。在含有100g醪液的125ml烧中，进行发酵。稀释如下所示的酶，使得0.5ml被加入到每一瓶中。在通过加入1.0ml酵母淤浆来接种发酵罐之前，制备Fali干酵母在水中的3％淤浆，并在32℃水浴中混合1小时。瓶被置于32℃水浴中，并且温和混合醪液。在发酵期间，移取样品，进行HPLC分析。在72小时之后终止发酵，并于62℃干燥发酵醪，获得DDGS。通过双酶法测定DDGS的淀粉含量。

[0257]对于下面的表8，酶处理是2.25SSU AkAA和0.75GAU/gds的黑曲霉GA-DISTILLASE(AkAA/AnGA)；2.25SSU AkAA和0.72GAU/gHGA(AkAA/HGA)以及2.25SSU AkAA和1.6GAU/gTrGA(AkAA/TrGA)。

                             表8

样品时间(小时)	乙醇百分比(v/v)，％AkAA/AnGA	乙醇百分比(v/v)，％AkAA/TrGA	乙醇百分比(v/v)，％AkAA/HGA
				17	7.28	8.2	7.84
24	9.01	10.2	9.73
				48	14.07	14.89	14.28
72	15.85	16.39	16.11

                        实施例15

[0258]在DI H₂O中制备33％的玉米面粉(Azure Standard Farms)淤浆，400ppm脲被加入其中。用5N H₂SO₄调节pH到4.5。在含有100g醪液的125ml烧中，进行发酵。稀释如下所示的酶，使得0.5ml被加入到每一瓶中。在通过加入1.0ml酵母淤浆来接种发酵罐之前，制备Fali干酵母在水中的3％淤浆，并在32℃水浴中混合1小时。瓶被置于32℃水浴中，并且温和混合醪液。在发酵期间，在22.5、46和71小时时移取样品，进行HPLC分析。在71小时之后终止发酵。黑曲霉葡糖淀粉酶以0.5GAU/g被加入到所有瓶中。另外，AkAA酶处理包括：a)完整型AkAA和b)图5B的截短型AkAA酶，它们被合并在一起(参见实施例5)；在固定的AkAA剂量水平1.5SSU/gds下，以完整型比截短型的不同比率进行试验。

[0259]增加完整型AkAA与截短型AkAA的比率得到增加的乙醇产率。在发酵结束时(71小时)，乙醇产率的差别没在22.5小时时或46小时时显著。如在图11所观察到，在71小时时，具有截短型AkAA所发生的乙醇产率，比无AkAA的对照组要高。完整型AkAA的量从占总量的0％逐渐提高至50％，导致乙醇产率增加。

                      实施例16

[0260]支链淀粉酶与葡糖淀粉酶和AkAA的组合产生的乙醇产率

[0261]制备36％的玉米面粉淤浆，并将干玉米浸渍液以玉米重量的2.5％被加入其中。调节淤浆的pH到4.8。通过将100gm醪液放置在125ml瓶中，在不经任何进一步处理的下，淤浆被用于发酵。期望量的酶被加入到每一烧中，如表9所示，然后，烧瓶中接种3ml的增殖17小时的酵母。每一条件被重复试验两次。

[0262]所用的酶是：来自无细胞培养滤液的黑曲霉葡糖淀粉酶(GA)，其中所述无细胞培养滤液通过在旋转蒸发仪中蒸发被浓缩到683GAU/gm酶；5540SSU/ml酶的AkAA；和作为Optimax L-100提供的支链淀粉酶。

[0263]烧瓶被置于30℃水浴中，并用磁性搅拌棒温和搅拌。在不同的时刻，移出发酵醪样品，进行HPLC分析。

[0264]在72小时后，发酵被终止。于60℃干燥一部分发酵醪，获得DDGS。然后测定DDGSs的淀粉含量。

                                 表9

GA-GAU/gds	AkAASSU/gds	支链淀粉酶ASPU/g	乙醇％v/v22小时	乙醇％v/v46小时	乙醇％v/v72小时	在72小时下，DDGS中的淀粉百分比，％
							0.5	1.0	0.0	10.73	16.80	19.16	4.02
0.5	1.0	0.5	11.15	17.52	19.20	3.53

0.5	1.0	1.0	11.38	17.63	19.10	4.67
							0.5	1.0	2.0	11.63	18.15	19.46	4.15

[0265]如从表9观察到，支链淀粉酶提高了发酵速度，并稍微增加了乙醇。然而，支链淀粉酶似乎对72小时时的终乙醇产率无影响。另外，对于DP＞2、DP-2、DP-1，测量了％w/v，乳酸和甘油数据未示出。

Claims (34)

1.酶组合物，包括酸稳定性α淀粉酶(asAA)和葡糖淀粉酶，所述酸稳定性α淀粉酶具有颗粒淀粉水解(GSH)活性、并与SEQ ID NO：3的序列具有至少90％的序列同一性。

2.权利要求1所述的酶组合物，其中所述asAA与SEQ ID NO：3的序列具有至少95％的序列同一性。

3.权利要求1所述的酶组合物，其中所述asAA与SEQ ID NO：3的序列具有至少99％的序列同一性。

4.权利要求1所述的酶组合物，其中所述asAA具有SEQ ID NO：3的序列。

5.权利要求1所述的酶组合物，其中所述葡糖淀粉酶得自丝状真菌。

6.权利要求5所述的酶组合物，其中所述丝状真菌是曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、腐质霉属(Humicola)和根霉属(Rhizopus)。

7.权利要求6所述的酶组合物，其中所述曲霉属是黑曲霉(A.niger)。

8.权利要求6所述的酶组合物，其中所述丝状真菌是木霉属。

9.权利要求1所述的酶组合物，其中所述葡糖淀粉酶具有GSH活性。

10.权利要求1所述的酶组合物，其中，在所述酶组合物中，asAA与葡糖淀粉酶活性的比率(SSU∶GAU)是10∶1至1∶10。

11.权利要求1所述的酶组合物，进一步包括截短型asAA，所述截短型asAA包括SEQ ID NO：3的氨基酸序列的至少65％，并与其具有至少95％的序列同一性。

12.权利要求1所述的酶组合物，进一步包括选自蛋白酶、纤维素酶、支链淀粉酶、α淀粉酶及其组合的酶。

13.权利要求1所述的酶组合物，其中所述asAA得自宿主细胞中的异源表达。

14.权利要求13所述的酶组合物，其中所述宿主细胞是丝状真菌宿主细胞。

15.权利要求14所述的酶组合物，其中所述丝状真菌宿主细胞是木霉属细胞。

16.酶组合物，包括具有颗粒淀粉水解(GSH)活性并与SEQ ID NO：9的序列有至少96％序列同一性的酸稳定性α淀粉酶(asAA)。

17.权利要求16所述的酶组合物，进一步包括葡糖淀粉酶。

18.权利要求16所述的酶组合物，进一步包括具有颗粒淀粉水解(GSH)活性并与SEQ ID NO：3的序列具有至少85％序列同一性的酸稳定性α淀粉酶(asAA)。

19.权利要求17所述的酶组合物，进一步包括具有颗粒淀粉水解(GSH)活性并与SEQ ID NO：3的序列具有至少85％序列同一性的酸稳定性α淀粉酶(asAA)。

20.权利要求16所述的酶组合物，其中所述asAA得自丝状真菌宿主细胞中的异源表达。

21.权利要求20所述的酶组合物，其中所述宿主细胞是木霉属细胞。

22.酶组合物，包括具有颗粒淀粉水解(GSH)活性并与SEQ ID NO：3的序列具有至少90％序列同一性的酸稳定性α淀粉酶(asAA)。

23.水解颗粒淀粉的方法，包括使含有颗粒淀粉的底物与权利要求1所述的酶组合物在所述底物中的颗粒淀粉的糊化温度以下的温度中接触，并获得水解的淀粉，其中所述底物的干固体的至少60％被水解。

24.权利要求23所述的方法，其中所述底物得自玉米、小麦、高梁、大麦、黑麦或其组合。

25.权利要求24所述的方法，其中所述底物是玉米。

26.权利要求23所述的方法，其中所述温度在35℃至65℃之间。

27.提高包括葡糖淀粉酶的组合物的颗粒淀粉水解活性的方法，包括

将：(a).具有颗粒淀粉水解(GSH)活性的、并与SEQ ID NO：3的序列有至少90％序列同一性的酸稳定性α淀粉酶(asAA)，(b).具有颗粒淀粉水解(GSH)活性的、并与SEQ ID NO：9的序列有至少96％序列同一性的酸稳定性α淀粉酶(asAA)，或(c).a)和b)的组合，与包括葡糖淀粉酶的组合物进行组合；和

与在相同的条件下，在包括所述葡糖淀粉酶的组合物中的颗粒淀粉的水解相比，获得颗粒淀粉水解的增加。

28.权利要求27所述的方法，其中所述葡糖淀粉酶得自曲霉属、木霉属、根霉属或腐质霉属的菌株。

29.权利要求27所述的方法，其中所述水解的淀粉的至少90％是葡萄糖。

30.具有α淀粉酶活性和颗粒淀粉水解活性的多肽，包括与SEQ ID NO：9具有至少97％序列同一性的氨基酸序列。

31.在丝状真菌宿主细胞中产生具有颗粒淀粉水解(GSH)活性的酸稳定性α淀粉酶的方法，包括

a)用DNA构建物转化丝状真菌宿主细胞，所述DNA构建物包括在所述丝状真菌宿主细胞中具有转录活性的启动子，所述启动子可操作性连接到异源多核苷酸，所述异源多核苷酸编码具有GSH活性并与SEQ ID NO：3有至少90％序列同一性的asaA，

b)在合适的培养基中培养所述转化的丝状真菌宿主细胞，使得表达所述asAA和

c)产生所述asAA。

32.权利要求31所述的方法，进一步包括回收所产尘的asAA。

33.权利要求31所述方法，其中所述丝状真菌宿主细胞是木霉属细胞。

34.权利要求33所述方法，其中所述木霉属细胞是里氏木霉细胞。

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