CN109072267A - 改善的颗粒状淀粉转化酶和方法 - Google Patents

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Abstract

描述了涉及颗粒状淀粉‑转化葡糖淀粉酶和α‑淀粉酶的方法和组合物。所述酶可用于在处于或低于不溶性颗粒状淀粉的糊化温度进行颗粒状淀粉的酶促淀粉水解。

Description

改善的颗粒状淀粉转化酶和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年12月21日提交的国际申请号PCT/CN2015/098120的权益，该国际申请通过引用以其全文结合在此。
技术领域
本方法和组合物涉及颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶和α-淀粉酶。所述酶可用于在处于或低于不溶性颗粒状淀粉的糊化温度进行颗粒状淀粉的酶促淀粉水解。
背景技术
不溶性颗粒状淀粉向葡萄糖或其他的可溶性糖类如糊精的转化常常是为获得最终产物，例如糖类甜味剂、特制糖浆、酶、蛋白质、醇(例如，乙醇、丁醇)、有机酸(乳酸、琥珀酸、柠檬酸)和专业生物化学品例如氨基酸、(赖氨酸、谷氨酸钠)和1-3丙二醇的重要的大规模工艺的一部分。淀粉颗粒的部分结晶性质赋予了冷水中的不溶性。淀粉颗粒在水中的增溶作用需要巨大量的热能来破坏结晶结构。用于溶解颗粒的水越多，加热水所需的能量就越多。如果需要从最终产物中蒸发水，还需要更多的能量。
在淀粉-水混合物中的淀粉的增溶作用可以通过直接或间接加热系统，例如通过蒸汽注入的直接加热(参见，例如，Starch Chemistry and Technology[淀粉化学与技术]，编辑：R.L.Whistler等人，第2版，1984Academic Press Inc.[学术出版社有限公司]，佛罗里达州奥兰多；和Starch Conversion Technology[淀粉转化技术]，编辑：G.M.A.VanBeynum等人，Food Science and Technology Series[食品科学与技术丛书]，MarcelDekker Inc.[马塞尔德克尔公司]，纽约州)进行。典型的常规淀粉液化系统在高压下将含水的淀粉浆料输送到直接蒸汽注入煮浆锅中，该直接蒸汽注入煮浆锅将浆料温度从约35℃-40℃提高到107℃-110℃。该浆料通常含有热稳定的α淀粉酶，在这种情况下，调节pH以有利于α-淀粉酶。产生自湿磨的颗粒状淀粉浆料通常具有40％至42％的干固体含量。在加热至糊化温度以上之前，通常将浓度稀释至32％至35％的干固体。没有该稀释，高温喷射蒸煮过程中的黏度可能会很高，以至于单元操作系统不能处理浆料。
已经描述了上述常规方法的替代性方案，其中通过不在糊化温度以上加热颗粒状淀粉浆料避免了过大的黏度的问题(参见，例如，US7,618,795和US 20050136525)。相反地，该颗粒状淀粉通过在糊化温度以下酶法水解来溶解。据报道，此类的“低温”系统(也称为“无蒸煮”或“冷蒸煮”)能够处理比常规系统更高浓度的干固体(例如，高至45％)。然而，无蒸煮系统具有以下缺点：为了基本上完全溶解，需要在中等升高的温度进行相对较长的约24小时或更长时间的孵育。较长时间的孵育本身与高能量成本有关。
由于处理颗粒状淀粉的规模很大，因此即使看起来很小的效率改善也可以具有很大的经济优势。然而，转化过程已经被广泛分析以鉴定和实施这些改善(参见例如，Martin和Brumm于“Starch Hydrolysis Products:Worldwide Technology,production andapplications[淀粉水解产品：全球技术、生产和应用]”的第45-77页，纽约，VCHPublishers,Inc.[VCH出版社]1992和Luenser,Dev.in Ind.Microbiol.[工业微生物学发展]24.79-96(1993))。
发明内容
本方法和组合物涉及颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶和α-淀粉酶。所述酶可用于在处于或低于不溶性颗粒状淀粉的糊化温度进行颗粒状淀粉的酶促淀粉水解。
在一个方面，提供了一种用于处理颗粒状淀粉的方法，该方法包括：使包含颗粒状淀粉的浆料与颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶和颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶在处于或低于颗粒状淀粉的糊化温度的温度接触，以产生可通过发酵生物体发酵的糖类，其中：(a)所述颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶包含与SEQ ID NO:22具有至少85％氨基酸序列同一性或与其活性片段具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且所述颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶包含与SEQ ID NO:18、16、4、13、8、3、7、19、17、5或12中的任一个具有至少85％氨基酸序列同一性或与其活性片段具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；(b)所述颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶包含与SEQ ID NO:18、13、16、20、8、19或4中的任一个具有至少85％氨基酸序列同一性或与其活性片段具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；(c)所述颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶包含与SEQ ID NO:28具有至少85％氨基酸序列同一性或与其活性片段具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且所述颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶包含与SEQ ID NO:18、8、16或13中任一个具有至少85％氨基酸序列同一性或与其活性片段具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；(d)所述颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶包含与SEQ ID NO:34具有至少85％氨基酸序列同一性或与其活性片段具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且所述颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶包含与SEQ ID NO:18、16或7中的任一个具有至少85％氨基酸序列同一性或与其活性片段具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；(e)所述颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶包含与SEQ ID NO:16、3、18或7中的任一个具有至少85％氨基酸序列同一性或与其活性片段具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；(f)所述颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶包含与SEQ ID NO:30具有至少85％氨基酸序列同一性或与其活性片段具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且所述颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶包含与SEQ ID NO:16、18、7、17、8或13中任一个具有至少85％氨基酸序列同一性或与其活性片段具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；(g)所述颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶包含与SEQ ID NO:18具有至少85％氨基酸序列同一性或与其活性片段具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；和/或(h)所述颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶包含与SEQ ID NO:21具有至少85％氨基酸序列同一性或与其活性片段具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且所述颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶包含与SEQ ID NO:16具有至少85％氨基酸序列同一性或与其活性片段具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且其中使该浆料与该颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶和该颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶接触与使相同的浆料与来自里氏木霉(Trichoderma reesei)的、具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的葡糖淀粉酶(TrGA)和来自白曲霉(Aspergillus kawachii)的、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的α-淀粉酶(AkAA)接触相比导致增加的葡萄糖释放。
1.在如段落1所述的方法的一些实施例中，使该浆料与该颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶和该颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶接触与使相同的浆料与来自里氏木霉的、具有SEQ IDNO:1的氨基酸序列的葡糖淀粉酶(TrGA)和来自白曲霉的、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的α-淀粉酶(AkAA)接触相比导致增加的淀粉转化。
2.在如段落1或2所述的方法的一些实施例中，使该浆料与该颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶和该颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶接触与使相同的浆料与来自里氏木霉的、具有SEQID NO:1的氨基酸序列的葡糖淀粉酶(TrGA)和来自白曲霉的、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的α-淀粉酶(AkAA)接触相比导致增加的葡萄糖释放。
3.在如前述段落中任一个所述的方法的一些实施例中，使该浆料与该颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶和该颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶接触与使相同的浆料与来自里氏木霉的、具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的葡糖淀粉酶(TrGA)和来自白曲霉的、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的α-淀粉酶(AkAA)接触相比导致增加的总葡萄糖当量。
4.在如段落4所述的方法的一些实施例中，该增加的总葡萄糖当量与通过使相同的浆料与来自里氏木霉的、具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的葡糖淀粉酶(TrGA)和来自白曲霉的、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的α-淀粉酶(AkAA)接触产生的量相比高至少5％，以及优选地高至少10％。
5.在如前述段落中的任一个所述的方法的一些实施例中，该方法导致葡萄糖、麦芽糖、寡糖或其混合物任选地以糖浆形式的产生。
6.在一些实施例中，如前述段落中的任一个所述的方法进一步包括使糖类与发酵生物体接触以产生发酵终产物；其中接触与使相同的浆料与来自里氏木霉的、具有SEQ IDNO:1的氨基酸序列的葡糖淀粉酶(TrGA)和来自白曲霉的、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的α-淀粉酶(AkAA)接触相比导致发酵终产物的生产增加。
7.在如段落7所述的方法的一些实施例中，该发酵终产物是乙醇。
8.在如段落7所述的方法的一些实施例中，该发酵终产物是非乙醇生物化学品。
9.在如段落1-9中任一个所述的方法的一些实施例中，同时添加该颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶和该颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶。
10.在如段落7-9中任一个所述的方法的某些实施例中，同时添加该颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶和/或该颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶以及该发酵生物体。
11.在如段落1-11中任一个所述的方法的一些实施例中，该颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶和/或该颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶由发酵生物体产生。
12.在一些实施例中，如前述段落中的任一个所述的方法进一步包括向浆料中添加另外的酶。
13.在另一方面，提供了一种组合物，其包含颗粒状淀粉转化α-淀粉酶和颗粒状淀粉转化葡糖淀粉酶，其中：(a)所述颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶包含与SEQ ID NO:22具有至少85％氨基酸序列同一性或与其活性片段具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且所述颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶包含与SEQ ID NO:18、16、4、13、8、3、7、19、17、5或12中的任一个具有至少85％氨基酸序列同一性或与其活性片段具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；(b)所述颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶包含与SEQ ID NO:18、13、16、20、8、19或4中的任一个具有至少85％氨基酸序列同一性或与其活性片段具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；(c)所述颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶包含与SEQ ID NO:28具有至少85％氨基酸序列同一性或与其活性片段具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且所述颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶包含与SEQ ID NO:18、8、16或13中任一个具有至少85％氨基酸序列同一性或与其活性片段具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；(d)所述颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶包含与SEQ ID NO:34具有至少85％氨基酸序列同一性或与其活性片段具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且所述颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶包含与SEQ ID NO:18、16或7中的任一个具有至少85％氨基酸序列同一性或与其活性片段具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；(e)所述颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶包含与SEQ ID NO:16、3、18或7中的任一个具有至少85％氨基酸序列同一性或与其活性片段具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；(f)所述颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶包含与SEQ ID NO:30具有至少85％氨基酸序列同一性或与其活性片段具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且所述颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶包含与SEQ IDNO:16、18、7、17、8或13中任一个具有至少85％氨基酸序列同一性或与其活性片段具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；(g)所述颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶包含与SEQ IDNO:18具有至少85％氨基酸序列同一性或与其活性片段具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；和/或(h)所述颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶包含与SEQ ID NO:21具有至少85％氨基酸序列同一性或与其活性片段具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且所述颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶包含与SEQ ID NO:16具有至少85％氨基酸序列同一性或与其活性片段具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且其中使该浆料与该颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶和该颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶接触与使相同的浆料与来自里氏木霉的、具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的葡糖淀粉酶(TrGA)和来自白曲霉的、具有的SEQ IDNO:2的氨基酸序列的α-淀粉酶(AkAA)接触相比导致增加的淀粉转化、增加的葡萄糖释放和/或增加的总葡萄糖当量的产生。
14.在如段落14所述的组合物的一些实施例中，该颗粒状淀粉转化α-淀粉酶和该颗粒状淀粉转化葡糖淀粉酶与使相同的浆料与来自里氏木霉的、具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的葡糖淀粉酶(TrGA)和来自白曲霉的、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的α-淀粉酶(AkAA)接触相比能够具有高至少5％和优选地高至少10％的增加的总葡萄糖当量的产生。
15.在如段落14或15所述的组合物的一些实施例中，该颗粒状淀粉转化α-淀粉酶和该颗粒状淀粉转化葡糖淀粉酶与发酵生物体组合与使相同的浆料与来自里氏木霉的、具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的葡糖淀粉酶(TrGA)和来自白曲霉的、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的α-淀粉酶(AkAA)接触相比能够使发酵终产物的生产增加。
16.在另一方面，提供了一种发酵生物体，其能够产生如段落14-16中的任一个所述的组合物。
根据本说明书，组合物和方法的这些和其他方面和实施例将是显而易见的。
发明详述
定义
在详细描述组合物和方法之前，定义了如下的术语和缩写。
除非另有定义，所用的所有技术和科学术语具有其在相关科学领域的普通含义。Singleton,等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology[微生物学和分子生物学词典]，第2版，John Wiley and Sons[约翰·威利父子出版公司]，纽约(1994)，以及Hale和Markham，Harper Collins Dictionary of Biology[哈伯科林斯生物学词典]，Harper Perennial[哈珀永久出版社]，纽约州(1991)提供了描述本发明的许多术语的普通含义。
“淀粉”是指由葡萄糖单元组成的多糖，其以储存颗粒形式广泛存在于植物组织中，由直链淀粉和支链淀粉组成，具有式(C6H10O5)x，其中X是任何数字。特别地，该术语是指任何基于植物的材料，例如像，谷粒、谷物、草、块茎和根以及更具体地小麦、大麦、玉米、黑麦、稻、高粱、豆类、木薯、粟、马铃薯、甘薯和树薯。
“颗粒状淀粉”是指未经糊化的未蒸煮过的(生的)淀粉。
术语“颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶”是指葡糖淀粉酶，使用本实例中描述的测定其具有与来自里氏木霉的、具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的葡糖淀粉酶(TrGA)相比对颗粒状淀粉的增加的活性。
术语“颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶”是指α-淀粉酶，使用本实例中描述的测定其具有与来自白曲霉的、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的α-淀粉酶(AkAA)相比对颗粒状淀粉的增加的活性。
术语“相同葡糖淀粉酶”和“相同α-淀粉酶”参考用于比较目的的酶是指等同浓度和比活性的相同的酶(基于氨基酸序列)，使得在条件中的其他变化的影响可以通过实验评估。
“淀粉糊化”意指淀粉分子的增溶以形成黏性悬浮液。
“糊化温度”是含淀粉底物开始糊化的最低温度。糊化的确切温度取决于具体的淀粉，并且可能取决于例如植物物种以及环境和生长条件的因素而变化。可根据本文所述的方法使用的大量的颗粒状淀粉的初始淀粉糊化温度范围包括大麦(52℃-59℃)、小麦(58℃-64℃)、黑麦(57℃-70℃)、玉米(62℃-72℃)、高直链淀粉玉米(67℃-80℃)、稻(68℃-77℃)、高粱(68℃-77℃)、马铃薯(58℃-68℃)、树薯(59℃-69℃)和甘薯(58℃-72℃)(Swinkels，于STARCH CONVERSION TECHNOLOGY[淀粉转化技术]，第32-38页，编辑VanBeynum等人，(1985)Marcel Dekker Inc.[马塞尔德克尔公司]纽约和The AlcoholTextbook[醇教科书]第3版增补A Reference for the Beverage,Fuel and IndustrialAlcohol Industries[饮料、燃料和工业酒精行业参考]，编辑Jacques等人，(1999)Nottingham University Press[诺丁汉大学出版社]，英国)。糊化涉及结晶区的熔化、分子的水合以及颗粒的不可逆溶胀。对于给定的颗粒，糊化温度发生在一定范围内，因为结晶区的大小和/或分子有序性或结晶完整性不同。STARCH HYDROLYSIS PRODUCTS WorldwideTechnology,Production,and Applications[淀粉水解产物：世界技术、生产和应用](编辑/Shenck和Hebeda，VCH Publishers,Inc[VCH出版社]，纽约，1992)于第26页。
“DE”或“右旋糖当量”是总还原糖的浓度的行业标准，并且以按干重计的D-葡萄糖％来表示。非水解的颗粒状淀粉的DE几乎为0，而D-葡萄糖的DE为100。
“葡萄糖糖浆”是指含有葡萄糖固体的水性组合物。葡萄糖糖浆具有大于20的DE。一些葡萄糖糖浆含有不超过21％的水和以右旋糖计算不少于25％的还原糖。一些葡萄糖糖浆包括至少90％的D-葡萄糖或至少95％的D-葡萄糖。有时术语葡萄糖和葡萄糖糖浆可互换使用。
“淀粉的水解”是以添加水分子来切割淀粉中的糖苷键。
“浆料”是水中包含不溶性淀粉颗粒的水性混合物。
术语“总糖含量”是指包括单糖、寡糖和多糖的淀粉组合物中存在的总可溶性糖含量。
术语“干固体”(ds)是指溶解于水的干固体、分散于水中的干固体或二者的组合。因此干固体包括颗粒状淀粉及其水解产物，包括葡萄糖。
“干固体”含量是指相对于其中分散和/或溶解干固体的水的以重量百分比计溶解的和分散的干固体的百分比。淀粉的初始干固体含量为以含水量折算的颗粒状淀粉的重量除以颗粒状淀粉的重量加上水的重量。后续的干固体含量可由针对任何添加或损失的水和化学增益而调整的初始含量确定。后续的溶解干固体含量可由如下所示的折射率测量。
术语“高DS”是指具有干固体含量大于38％(wt/wt)的水性淀粉浆料。
“干物质淀粉”是指底物例如淀粉浆料的干淀粉含量，并且可通过从底物质量中扣除任何非淀粉组分如蛋白质、纤维和水的贡献来确定。例如，如果颗粒状淀粉浆料具有20％(wt/wt)的水含量和1％(wt/wt)的蛋白质含量，则100kg的颗粒状淀粉具有79kg的干淀粉含量。干物质淀粉可用于确定要使用的酶单位数量。
“折射率干物质”(RIDS)是在已知DE、在受控温度测定淀粉溶液的折射率，然后使用适当的关系，例如玉米提炼协会关键数据表(Critical Data Tables of the CornRefiners Association)，将RI转换为干物质。
“聚合度(DP)”是指给定的糖类中脱水吡喃葡萄糖单元的数目(n)。DP1的实例是单糖，例如葡萄糖和果糖。DP2的实例是二糖，例如麦芽糖和蔗糖。DP4+(>DP3)表示聚合度大于3的聚合物。
术语“接触”是指将参考组分(包括但不限于酶、底物和发酵生物体)充分靠近放置以影响预期结果，例如所述酶作用于底物上或发酵生物体发酵底物。本领域技术人员将认识到混合溶液可以引起“接触”。
术语“发酵生物体”是指适用于产生期望的发酵终产物(EOF)的任何生物体，包括细菌和真菌(包括丝状真菌和酵母)。
术语“发酵终产物(EOF)”、或简称“发酵产物”是由发酵生物体产生的任何碳源衍生的分子产物，即，能够发酵可发酵糖的生物体，并且包括但不限于，代谢物，例如柠檬酸、乳酸、琥珀酸、乙酸、谷氨酸钠、葡糖酸、葡萄糖酸钠、葡萄糖酸钙、葡萄糖酸钾、衣康酸和其他的羰酸、葡萄糖酸-δ-内酯、异抗坏血酸钠、谷氨酸、色氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸和其他的氨基酸、Ω-3脂肪酸、异戊二烯、1,3-丙二醇、乙醇、甲醇、丙醇、丁醇、其他的醇类和其他的生物化学品和生物材料。
“酶活性”是指酶对其底物的作用。
“α-淀粉酶(E.C.分类3.2.1.1)”是催化α-1,4-糖苷键水解的酶。这些酶也被描述成在含有1,4-α-联结的D-葡萄糖单位的多糖中催化1,4-α-D-糖苷键的外切水解或内切水解的酶。用于描述这些酶的另一术语是糖原酶。示例性的酶包括α-1,4-葡聚糖4-葡聚糖水解酶葡聚糖水解酶(alpha-1,4-glucan 4-glucanohydrase glucanohydrolase)。
“葡糖淀粉酶”是指淀粉葡糖苷酶类的酶(EC.3.2.1.3、葡糖淀粉酶、α-1,4-D-葡聚糖葡聚糖水解酶)，该酶从淀粉的非还原末端连续移除葡萄糖单元。所述酶可同时水解淀粉的直链和支链糖苷键，即直链淀粉和支链淀粉。所述酶还水解α-1,6键和α-1,3键，但速率比水解α-1,4键慢得多。
“支链淀粉酶”也称为脱支酶(E.C.3.2.1.41、支链淀粉6-葡聚糖水解酶)，能够水解支链淀粉分子中的α-1,6-糖苷键。
“产率”是指所需一种或多种最终产物(如葡萄糖)的量与起始颗粒状淀粉的干重的百分比。
短语“同时糖化和发酵(SSF)”是指发酵终产物的生产中的一种方法，在该方法中微生物(例如产生乙醇的微生物)和至少一种酶(例如一种或多种葡糖淀粉酶)在相同的方法步骤中存在。SSF包括在相同的反应容器中同时将淀粉底物(颗粒状、液化的或溶解的)水解为糖类(包括葡萄糖)和将糖类发酵为醇类或其他的生物化学品或生物材料。
序列同一性可以通过使用算法，例如Wisconsin Genetics Software PackageRelease 7.0[威斯康辛遗传软件包版本7.0]中的BESTFIT、FASTA和TFASTA,GeneticsComputer Group[遗传学计算机集团]，575Science Dr.,Madison,WI[威斯康星州麦迪逊市科学道575]，使用默认间隙参数或通过检验以及最佳比对(即导致比较窗口上的序列相似性的最高百分比)比对序列来测定。序列同一性的百分比通过在较短序列的长度上比较两个最佳比对的序列(如果长度不相等)，确定两个序列中出现相同残基的位置数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以不计算间隙的匹配和不匹配位置的总数目，并将结果乘以100得到序列同一性的百分比来计算。除非另有说明，否则本文使用的百分比氨基酸序列同一性是使用具有默认参数的CLUSTAL W算法计算的。参见Thompson等人，(1994)Nucleic Acids Res.[核酸研究]22:4673-4680。CLUSTAL W算法的默认参数是：
术语“包含”及其同源词以其包含的含义使用；即相当于术语“包括”及其相应的同源词。
数值范围包括限定范围的数值在内。还列出了一些优选的子范围，但在任何情况下，对范围的引用包括由范围内包括的整数定义的所有子范围。
术语“总葡萄糖当量”是指在一个过程(例如发酵过程)中计算淀粉转化的方式，以便可以比较不同过程中的淀粉转化。比较过程可能是困难的，因为中间产物和最终产物紧挨着副产物形成。例如，在乙醇发酵过程中，将淀粉转化为糊精，将糊精转化为葡萄糖，并通过酵母将葡萄糖发酵成乙醇。酵母还将葡萄糖转化为甘油作为主要副产物，并且该过程中存在的细菌可以在生产乙酸和乳酸的同时转化葡萄糖。葡萄糖当量是这样的一种方式，其中所有这些可溶性组分(其可以通过例如HPLC来测量)在数学上换算为葡萄糖，从而它们可以相加起来并形成所有可溶性组分的葡萄糖当量。例如，1摩尔二糖例如麦芽糖(摩尔量为342.30g/mol)被换算为2摩尔葡萄糖(摩尔量为180.02g/mol)。麦芽糖的数学换算则为(2x180.02)/342.30＝1.052，并且每克/升的麦芽糖与此1.052相乘以换算为麦芽糖的葡萄糖当量。本领域技术人员将能够为发酵过程中的其他主要组分做到这一点。对于DPn，选择了平均聚合度为10。以这样的方式计算了乙醇、甘油、乙酸、乳酸、琥珀酸、DP1、DP2、DP3和DPn的葡萄糖当量并且将其相加以形成了该方法的总葡萄糖当量。由于仅测量可溶性组分，其中类似量的淀粉被转化的过程将示出类似的“总葡萄糖当量”值。如果更多的淀粉被溶解，总葡萄糖当量的增加是可见的。
颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶和α-淀粉酶
已经描述了低温淀粉水解方法(也称为“无蒸煮”或“冷蒸煮”方法)(参见例如US7,618,795和US 20050136525)。在冷蒸煮的方法中，颗粒状淀粉通过酶法水解以处于或低于糊化温度溶解。这种低温方法代表了具有某些优点(例如避免了通过将颗粒状淀粉加热至糊化温度以上而产生的高淀粉浆料黏度以及这种加热的高操作成本)的常规淀粉水解的替代性方法。
由于冷蒸煮方法不需要喷射式煮浆锅，它可以在最初设计使用如甘蔗等原料的乙醇生产设备中进行。这允许这样的生产设备利用例如玉米或甘蔗，这取决于当时哪一个更便宜或更可用。这些设备可以受益于使用分离装置在引入设备之前去除不可发酵的玉米材料，以避免污染没有设计成处理这种材料的设备。分离可以通过离心、过滤或其他的常规方法进行。预期安装分离装置的成本将实质上低于安装喷射式煮浆锅的成本。
然而，冷蒸煮系统具有以下缺点：为了基本上完全溶解，需要在中等升高的温度进行相对较长的约24小时或更长的孵育。较长的孵育本身与高能量成本和降低的通量相关联，并且在适度升高的温度较长的孵育时间可能导致污染。
本发明的组合物和方法基于以下观察：某些葡糖淀粉酶(GA)和α-淀粉酶(AA)在颗粒状淀粉上示出了高度的活性。这些观察是基于使用当前商业基准作为参考在粗淀粉水解测定中对大量GA和AA的广泛经验测试。由于测试的大量的酶，本文中仅描述了比基准酶表现更好的GA和AA，即，里氏木霉葡糖淀粉酶(TrGA)(SEQ ID NO:1)和白曲霉α-淀粉酶(AkAA)(SEQ ID NO:2)。
示出了TrGA和AkAA的氨基酸序列，如以下：
来自里氏木霉的SEQ ID NO:1(TrGA)
SVDDFISTETPIALNNLLCNVGPDGCRAFGTSAGAVIASPSTIDPDYYYMWTRDSALVFKNLIDRFTETYDAGLQRRIEQYITAQVTLQGLSNPSGSLADGSGLGEPKFELTLKPFTGNWGRPQRDGPALRAIALIGYSKWLINNNYQSTVSNVIWPIVRNDLNYVAQYWNQTGFDLWEEVNGSSFFTVANQHRALVEGATLAATLGQSGSAYSSVAPQVLCFLQRFWVSSGGYVDSNINTNEGRTGKDVNSVLTSIHTFDPNLGCDAGTFQPCSDKALSNLKVVVDSFRSIYGVNKGIPAGAAVAIGRYAEDVYYNGNPWYLATFAAAEQLYDAIYVWKKTGSITVTATSLAFFQELVPGVTAGTYSSSSSTFTNIINAVSTYADGFLSEAAKYVPADGSLAEQFDRNSGTPLSALHLTWSYASFLTATARRAGIVPPSWANSSASTIPSTCSGASVVGSYSRPTATSFPPSQTPKPGVPSGTPYTPLPCATPTSVAVTFHELVSTQFGQTVKVAGNAAALGNWSTSAAVALDAVNYADNHPLWIGTVNLEAGDVVEYKYINVGQDGSVTWESDPNHTYTVPAVACVTQVVKEDTWQS
来自白曲霉的SEQ ID NO:2(AkAA)
LSAAEWRTQSIYFLLTDRFGRTDNSTTATCNTGDQIYCGGSWQGIINHLDYIQGMGFTAIWISPITEQLPQDTSDGEAYHGYWQQKIYNVNSNFGTADDLKSLSDALHARGMYLMVDVVPNHMGYAGNGNDVDYSVFDPFDSSSYFHPYCLITDWDNLTMVQDCWEGDTIVSLPDLNTTETAVRTIWYDWVADLVSNYSVDGLRIDSVEEVEPDFFPGYQEAAGVYCVGEVDNGNPALDCPYQKYLDGVLNYPIYWQLLYAFESSSGSISNLYNMIKSVASDCSDPTLLGNFIENHDNPRFASYTSDYSQAKNVLSYIFLSDGIPIVYAGEEQHYSGGDVPYNREATWLSGYDTSAELYTWIATTNAIRKLAISADSDYITYANDPIYTDSNTIAMRKGTSGSQIITVLSNKGSSGSSYTLTLSGSGYTSGTKLIEAYTCTSVTVDSNGDIPVPMASGLPRVLLPASVVDSSSLCGGSGNTTTTTTAATSTSKATTSSSSSSAAATTSSSCTATSTTLPITFEELVTTTYGEEVYLSGSISQLGEWDTSDAVKLSADDYTSSNPEWSVTVSLPVGTTFEYKFIKVDEGGSVTWESDPNREYTVPECGSGSGETVVDTWR
下表列出了与AkAA组合更好的GA，或与不同AA混合表现更好的GA：
示出了氨基酸序列，如以下：
SEQ ID NO:3；来自土曲霉的GA-1805(AteGA1)
APQLAPRATTSLDAWLASETTVALDGILDNVGSSGAYAKSAKSGIVIASPSTSDPDYYYTWTRDAALTVKALIDLFRNGETSLQTVIMEYISSQAYLQTVSNPSGSLSTGGLAEPKYYVDETAYTGSWGRPQRDGPALRATAMIDFGNWLIDNGYSTYASSIVWPIVRNDLSYVAQYWNQTGYDLWEEVNGSSFFTIAVQHRALVEGSTFASKVGASCSWCDSQAPQVLCFLQRFWTGSYIMANFGGGRSGKDANTVLGSIHTFDPNAGCDDTTFQPCSPRALANHKVYTDSFRSIYSINSGISSGKAVAVGRYPEDSYYNGNPWFLTTLAAAEQLYDAIYQWQKIGSITITDVSLAFFKDLYSSAAVGTYASSSSAFTSIVSAVKTYADGYMSIVQTHAMTNGSLSEQFGKSDGFSLSARDLTWSYAALLTANLRRNSVVPPSWGETTATSVPSVCSATSATGTYSTATNTAWPSTLTSGTGATTTTSKATSSSTTTTSSASSTTVECVVPTAVAVTFDEVATTTYGENVYVVGSISQLGSWDTSKAVALSASKYTSSNNLWYVTVTLPAGTTFQYKFIRVSSSGSVTWESDPNRSYTVPSACGTSTAVVNTTWR
SEQ ID NO:4；来自烟曲霉菌的GA-2040(AfuHT3)
APQLSARATGSLDSWLGTETTVALNGILANIGADGAYAKSAKPGIIIASPSTSEPDYYYTWTRDAALVTKVLVDLFRNGNLGLQKVITEYVNSQAYLQTVSNPSGGLASGGLAEPKYNVDMTAFTGAWGRPQRDGPALRATALIDFGNWLIDNGYSSYAVNNIWPIVRNDLSYVSQYWSQSGFDLWEEVNSMSFFTVAVQHRALVEGSTFAKRVGASCSWCDSQAPQILCYMQSFWTGSYINANTGGGRSGKDANTVLASIHTFDPEAGCDDTTFQPCSPRALANHKVYTDSFRSVYAINSGIPQGAAVSAGRYPEDVYYNGNPWFLTTLAAAEQLYDAIYQWKKIGSISITSTSLAFFKDIYSSAAVGTYASSTSTFTDIINAVKTYADGYVSIVQAHAMNNGSLSEQFDKSSGLSLSARDLTWSYAAFLTANMRRNGVVPAPWGAASANSVPSSCSMGSATGTYSTATATSWPSTLTSGSPGSTTTVGTTTSTTSGTAAETACATPTAVAVTFNEIATTTYGENVYIVGSISELGNWDTSKAVALSASKYTSSNNLWY VSVTLPAGTTFEYKYIRKESDGSIVWESDPNRSYTVPAACGVSTATENDTWQ
SEQ ID NO:5；来自费氏新萨托菌的GA-2331(NfiGA1)
APQLSPRATGSLDSWLATESTVSLNGILANIGADGAYAKSAKPGIIIASPSTSDPDYYYTWTRDAALVTKVLVDLFRNGNLGLQKVITEYVNSQAYLQTVSTPSGGLSSGGLAEPKYNVDMTAFTGAWGRPQRDGPALRATALIDFGNWLIDNGYSSYAVNNIWPIVRNDLSYVSQYWSQSGFDLWEEVNSMSFFTVAVQHRALVEGSTFAKRVGASCSWCDSQAPQILCYMQSFWTGSYINANTGGGRSGKDANTVLASIHTFDPEAGCDDTTFQPCSPRALANHKVYTDSFRSVYAINSGIPQGVAVSAGRYPEDVYYNGNPWFLTTLAAAEQLYDAIYQWKKIGSISITSTSLAFFKDIYSSVAVGTYASSSSTFTAIIDAVKTYADGYVSIVEAHAMTNGSLSEQFDKSSGMSLSARDLTWSYAALLTANMRRNGVVPAPWGAASANSVPSSCSMGSATGTYSTATATSWPSTLTSGSPSDTTSGTTPGTTTTTSACTTPTSVAVTFDEIATTTYGENVYIIGSISQLGSWDTSKAVPLSSSKYTSSNNLWYVTINLPAGTTFEYKYIRKESDGSIEWESDPNRSYTVPSACGVSTATEKDTWR
SEQ ID NO:6；来自费氏新萨托菌(Neosartorya fischeri)的GA-2437(AfuGA2)
APQLSARATGSLDSWLGTETTVALNGILANIGADGAYAKSAKPGIIIASPSTSEPDYYYTWTRDAALVTKVLVDLFRNGNLGLQKVITEYVNSQAYLQTVSNPSGGLASGGLAEPKYNVDMTAFTGAWGRPQRDGPALRATALIDFGNWLIDNGYSSYAVNNIWPIVRNDLSYVSQYWSQSGFDLWEEVNSMSFFTVAVQHRALVEGSTFAKRVGASCSWCDSQAPQILCYMQSFWTGSYINANTGGGRSGKDANTVLASIHTFDPEAGCDDTTFQPCSPRALANHKVYTDSFRSVYAINSGIPQGAAVSAGRYPEDVYYNGNPWFLTTLAAAEQLYDAIYQWKKIGSISITSTSLAFFKDIYSSAAVGTYASSTSTFTDIINAVKTYADGYVSIVQAHAMNNGSLSEQFDKSSGLSLSARDLTWSYAAFLTANMRRNGVVPAPWGAASANSVPSSCSMGSATGTYSTATATSWPSTLTSGSPGSTTTVGTTTSTTSGTATETACATPTAVAVTFNEIATTTYGENVYIVGSISELGNWDTSKAVALSASKYTSSNNLWYVSVTLPAGTTFEYKYIRKESDGSIVWESDPNRSYTVPAACGVSTATENDTWR
SEQ ID NO:7；来自的马尔尼菲青霉菌的GA-2439(PmaGA1)
APQFSPRATVGLDAWLASETTFSLNGILANIGSSGAYSASAKPGVVIASPSTNNPNYYYTWTRDSALTLKVLIDLFGNGNLSLQTVIEEYINAQAYLQTVSNPSGDLSSGAGLAEPKYNVDMSPFTGGWGRPQRDGPALRAIALIEFGNWLIDNGYSSYAVNNIWPIVRNDLSYVSQYWSQSGFDLWEEVNSMSFFTVANQHRALVQGSTFAARVGASCSWCDSQAPQILCYMQTFWTGSYINANTGGGRSGKDSNTVLTTIHTFDPEATCDDVTFQPCSPRALANHKVYTDSFRSIYGVNSGIAQGVAVSVGRYPEDSYYGGNPWFLSNLAAAEQLYDAIYQWNKIGSITITSTSLAFFKDVYSSAAVGTYASGSTAFTSIISAVKTYADGYVSIVQGHAAANGSLSEQFDRNSGVEISARDLTWSYAALLTANLRRNGVMPPSWGAASANSVPSSCSMGSATGTYSTPTATAWPSTLTSATGIPVTTSATASVTKATSATSTTTSATTCTTPTSVAVTFDEIATTTYGENVFIVGSISQLGSWDTSKAIALSASQYTSSNHLWFATLSLPAGTTFQYKYIRKESNGSIVWESDPNRSYTVPSGCGVSTATENDTWR
SEQ ID NO:8；来自柄篮状菌的GA-2441(TstGA2)
APGLSPRASTSLDAWLATETTVSLSGILANIGADGAYSKSAKPGVVIASPSTDNPNYYYTWTRDSALTLKVLIDLFRNGNLGLQTVIEEYVNAQAYLQTVSNPSGDLSSGAGLAEPKFNVDMSAFTGSWGRPQRDGPALRAIALIDFGNWLIENGYTSLAANNIWPIVRNDLSYVAQYWSQSGFDLWEEVNSMSFFTVANQHRSLVEGSTFAAKVGASCSWCDSQAPQILCYMQTFWTGSYMNANTGGGRSGKDANTVLTSIATFDPEATCDDVTFQPCSPRALANHKVYTDSFRSVYGLNSGIAEGVAVAVGRYPEDSYYNGNPWFLSNLAAAEQLYDAIYQWNKIGSITITSTSLAFFKDVYSSAAVGTYASGSSAFTSIINAVKTYADGYISVVQSHAMNNGSLSEQFDKNTGAELSARDLTWSYAALLTANMRRNGVVPPSWGAASATSIPSSCTTGSAIGTYSTPTATSWPSTLTSGTGSPGSTTSATGSVSTSVSATTTSAGSCTTPTSVAVTFDEIATTSYGENVYIVGSISQLGSWNTANAIALSASKYTTSNNLWYVTINLPAGTTFQYKYIRKESDGTVKWESDPNRSYTVPSACGVSTATENDTWR
SEQ ID NO:9；来自蝗绿僵菌的GA-2442(MacGA1)
HRDDLHGFITKQKSISLHGVLANIGSDGSRAQGAAAGAVVASPSKSDPDYWYTWSRDSALTFKVLIELFIGGKKSLQPKIEQYITAQAHLQGVSNPSGGPDTGGLGEPKFHVNLTAFTGSWGRPQRDGPPLRATALTIYANWLIANGGQAEAANTVWPIIAKDLSYTVQYWNRTGFDLWEEINGSSFFTLSASFRALVEGATLAKALGKQCPDCETNAPRILCFLQSFWANGYIDSNINVNDGRTGKDVNSIISSIHTFDPAAACTDATFQPCSSRALANHKAVVDSFRTIYTVNKGRRPGRAAAVGRYSEDVYYNGNPWYLATMAAAEQMYAAVYQWREIGSITVDATSLPFFSDLIPNIAAGTYAKNSATFTSIIKAATAYGDDFVRVVKQYTPADGSLAEQYDRETGSPKSAVHLTWSYASFVGAVERRSGIVPPSWGEPNSNTVPKVCEAPPSCDSTMTFNVKVTTVPGESIYVVGSITELKNWSPADAVPLDASQYTPSNPLWSAKVTIPAGTNFEYKYIKKTSDGTVVWESDPNRSATSSTGCQSNGTLNDQWR
SEQ ID NO:10；来自裂褶菌的GA-2578(ScoGA1)
QTSAADAYVSAESPIAQAGILANIGPSGSKSHGAASGVIIASPSTSNPDYLYTWTRDAALVSRALVDEFIEGESSLQSVIDSYVSSQQKLQRVDNPSGSYTSGGLGEPKFNIDLTAFTGAWGRPQRDGPALRAITLITYGNHLLSSGNTSYVTDTIWPVVKADLDYVVSYWNQTGFDLWEEVSSSSFFTTAEQHTALRLGATFATAVGASASTYLTQADNVLCFLQSYWNSNGGYATANTGGGRSGIDANTVLTSIHTFDIEAGCDSVTFQPCSDRALSNLKVYVDSFRGLYSINPTGATDPILTGRYKEDVYYNGNPWYLTTFAVAEQLYDALNTWDKLGSLDVTSTSLAFFKQFDSSITAGTYASSTSEYATLTSAIRNWADGFLEVLADFTPADGGLTEQIDKSSGNPTSAADLTWSYASAITAFKARGGAIPASWGAAGLTVPATCSTGGGGGSGGDTVAVTLNVQATTVYGENIYVTGSVNQLANWSPDNAIALNADNYPTWSVTVNLPANTQIEYKYIRKNNGQVTWESDPNRSITTSASGSFTQNDTWR
SEQ ID NO:11；来自深绿木霉/深绿肉座菌的GA-2722(Tat GA2)
VPRLRESRHEFDIVKRSASSFLETEVPIALADLLCNIGSAGSCAAGANSGIVIASPSKTNPDYFYTWTRDSALVFKCIVDTFVNSYSASLQTEIENYINAQAIVQGISNPSGSLSNSGTGLGEPKFNVDETAFTGAWGRPQRDGPALRAIALITYSKWLINNGYQSTANSIVWPIIQNDISYVAQYWNQTGFDLWEEVNGSSFFTVANQHRALVEASALATSLGKSLPNASSQAAQALCFLQSFWSSSQGYIVANINQNNGRSGKDANTLLGSIHTFDPEGNCDASTFQPCSDRTLANHKVVVDSFRSIYTINNGIPAGTAAAVGRYPEDSYQGGNPWYLNTLAAAELLYDALYQWKRIGAITVTSTSLAFFKDLDSSITVGTYSSSSSTYTTLYNAVSNYADGFVNNVATYAPSNGSLAEQYNRNNGQPLSAYDLTWSYAALLTAAARRSGVVPYSWGETSASSVPSVCSYTSAVGSYSSASTGSWPPNQTPTDGSGSTTSKSTSVTVSSTSTSASSTAVATSPVTVTFDEIVTTIFGQTIKIAGNVPVLGNWNTNNAVALSADGYTSSNHLWNVGISFAPGTVIQYKYINVASNGDVTWEADPNHTYTVPATGATAVTVNNSWQS
SEQ ID NO:12；来自烟管菌的GA-3275(BadGA1)
QSSTVDAFIASESPIARTGLLANIGADGSKASGAKSGIVIASPSKSNPDYFYTWTRDAALVFKAIIDRYTSGEDTATRRQIDEYVSGQALLQQVSNPSGTVSTGGLAEPKYNVDMSAFTGGWGRPQRDGPALRATAIIAYANWLVANGNTSYVTSTLWPVLKLDLDYVRDNWNQTGFDLWEEINSSSFFTTAVQHRALREGNALAAKIGQTVSGYTTQADNVLCFLQSYWNPSGGFATSNTGGGRSGKDANSVLTSIHTFDAAAGCDALTFQPCSDRALSNHKVYVDSFRSIYSVNSGIASNAAVATGRYPEDSYYGGNPWYLTTLAAAEQLYDALTVWDAQGSLNVTSVSLAFFQQFAPTVTAGTYPASSATYGTLTAAIRAYADGFVAVVAKYTPSNGGLAEQYTRAGGTPTSAADLTWSYAAALTAFSAREGFTPASWGAKGLTAPAACNTNSGGGSGGGSGNTVAVTFNVQATTVWGENIYLTGSVDALQNWSPDNALLLSSANYPTWSITVNLPPSTAIQYKYIRKNNGAVTWESDPNMSITTPGSGSATLSDTWR
SEQ ID NO:13；来自灵芝属物种的GA-3280(GspGA1)
QSSADAYVASEASIAKAGLLANIGANGSKSEGAKAGIVVASPSTSNPDYLYTWTRDSSLVFKTVIDQFTTGEDTSLRGLIDEFTAAQSILQQTSNPSGSVSTGGLGEPKFNVDETAFTGAWGRPQRDGPALRATAIITYANWLLANGNGTSYVQNTLWPIIKLDLDYVENNWNQSTFDLWEEVNSSSFFTTAVQHRALREGVALASAIGQTSVVSGYSAQADNLLCFLQSYWNSGSGFVTANTGGGRSGRDANTVLTSIHTFDVEAGCDAVTFQPCSDKALSNLKVYVDAFRSIYGINSGIASNAAVATGRYPEDSYYNGNPWYLAVFAVAEQLYDALITWDELGSLNVTSTSLAFFQQFDSSVTAGTYDSSSSTYSTLTSGIKGFADGFLEVNSKYTPSTGALSEQFDKSSGSQLSASDLTWSYAAALTAFAARSGKTYASWGAAGLITTCGGSGGGGGGSGTVSVTFNVQATTVFGENIYITGSVDALQNWSPDNALILSAANYPIWSITVSLPASTVIEYKYIRKFNGQVTWESDPNDSITTPASGSYIENDTWR
SEQ ID NO:14；来自的变色栓菌的GA-3283(TveGA3)
QSSVADAYVASESSIAKAGVLANIGPSGSKSQGAKAGIVVASPSTTNPDYLFTWTRDTSLVFKALIDQLTSGEDPSLRGLVDMFTSSQAALQQVSNPSGTVSTGGLGEPKFNIDESAFTGAWGRPQRDGPALRSTAFISYANWLLDNGNTTYVTQTLWPVIKLDLDYVEANWNQTGFDLWEEVNSSSFFTTAVQHRALREGAAFATRIGQTSVVSGYTTQAANVLCFLQSYWNPSGGFVTANTGGGRSGRDANTVLTSIHTFDPAAGCDATTFQPCSDKALSNLKVYVDAFRSIYTINSGIAANAAVATGRYPEDSYQGGNPWYLATIAVAEQLYDALIVWDQLGSINVTTTSLPFFQQFSSTVTTGTFASTSATYTTLTTAVRNFADGFIAVNAQFTPSNGGLAEQFSRSNGQPVSAVDLTWSYAATLTAFHARAGLTYPGWGAAGLTVPAVCSTSGSGSGGGGAGTVAVTFNVQATTFFGENIYITGSVDALQNWSPDNALLLSSANYPIWSITVNLPASTSVQYKFIRKAPGELIWESDPNNQITTPASGTFTQSDTFR
SEQ ID NO:15；来自韧黑伞的GA-3294(HsuGA3)
QSSAVSSYLATESVIAKAGLLANIGPSGSKASGAVSGVVVAAPSTNPDYIFTWTRDSALVFKAIIDSFARGEDATLRTSIDQYVAAQKIQQQVSNPSGTVSSGGLGEPKFNVDLSAFTGAWGRPQRDGPALRATALISYGNSLISASNTSYVLANIWPLVKLDLDYVAANWNQTGFDLWEEVNSSSFFTTAVQHRALRQGAAFATALGQTASVAGYTTQAANVLCFLQSYWNPSQGYITANTGGGRSGKDANTALASIHTFDPTAGCDAATFQPCSDKALSSLKVYVDSFRSIYTVNSAVASPGAVATGRYPEDSYFGGNPWYLATMAVAEQLYDALIVWKAQGSLNVTSTSLAFFQQFSSAVTVGTYASTTATFTTLTTAIANQADGFVAIVQEFTPSTGSLSEQYSRSNGAQLSANDLTWSYASILTAVTARNGLAGDNWGAAGLVVPSSCSTSGTGSSSGGGSSGTVAVTFKVTATTTFGENIYLTGSDDALEDWSPTSTLILSAATYPVWSITVNLPASTALQYKYIRIFNGVTTWESDPNNAFTTVASGTQTLTDTWR
SEQ ID NO:16；来自地中海拟层孔菌的GA-3298(FmeGA1)
QTAVDSYVATESPIAKTNLLANIGASGSKSQGAKPGIVIASPSTTNPNYLFTWTRDSSLVFKTIIDQYTNGQDTSLRTLIDEFVSAEATLQQVSNPSGTVSTGGLGEPKFNIDETAFTGAWGRPQRDGPALRATAIINYANYLLANDNSSFVTNTLWPILQLDLDYVAQDWNQTTFDLWEEVDSTSFFTAAVQHRSLREGATLATKIGQTSVVSGYTTQAENILCFMQSFWNAGGNFMTANTGGGRSGKDANTVLASIHTFDSSAGCDAATFQPCSDRALANLKTYVDAFRSIYSINSGIASNAAVATGRYPEDVYFNGNPWYLTTLSVAEQLYDAITVWNAQGSLNVTSVSQPFFALFQSDIAVGTYASSSSTFTSLLSSIKSFADGFVSVVAKYTPSNGGLSEQYSKSDGTPTSAVDLTWSYAAALTAFAARDGFVPASWGAAGLTVPSTCSTSGSGPGSGGTVAVTFNVQATTVFGENIYITGSVDALQNWSPDNAIILSAANYPTWSVTINLPASTTIQYKYIRKFNGAVTWESDPNMQITTPSGGTFIENDVWR
SEQ ID NO:17；来自Punctularia strigosozonata的GA-3301(PstGA2)
QTASAAAYATTEAPIAKAGVLANIGPSGSKSQGAKAGIVIASPSTSNPDYLYTWTRDSSLVFKALIDQYTSGIDTTLRGAIDNFFNAEKILQQVSNPSGTVSTGGLGEPKFNIDETAFTGAWGRPQRDGPALRATALITYANYLYSTGNTTFVSNTLWPVIKLDLDYAANNWNQTTFDLWEEVSSSSFFTTAVQHRSLREGATLATKLGVTSSASTYTSAASSLLCFLQSYWNPAGGYITANTGGGRSGKDANTVLTSIHTFDPAAGCDAVTFQPCSDKALSNLKVYVDSFRSIYGINSGIASNAAVATGRYPEDTYYNGNPWYLTTLAVAEQLYDALIVWNARGSLNVTSTSLAFFQQFSSSVTTGTYPSTSTTFTTLTSAVKTFADGFVAVVAKYTPSSGALSEQFDKSSGSQLSAADLTWSYAAALTAFEARNGTTFASWGAAGLTTSCSSSGSGSGGGSGSSGSVPVNFQETATTVYGENIFIVGSISPLGNWDPNSAIALSAANYPNWQVSISLPASTTFQYKYIRKYNGAVTWESDPNRSFTTPSSGSYNENDTWR
SEQ ID NO:18；来自Phlebia brevispora Nakasone的GA-3317(PbrGA1)
QTNVNSYVASESAFAKAGLLANIGPSGSKSSGADPGIVIASPSTTNPDYLYTWVRDSSLVFKVLIDQYTTGVDTSLRTLIDEFVSAEAILQQVTNPSGSVTTGGLGEPKFNIDETAFTGSWGRPQRDGPALRSTAIITYANWLLDNGNTSYVTETLWPVLELDLNYVMNNWNQSTYDLWEEIDSSSFWTTAVQHRALRQGSALATRIGQTSMVSGYNTQAANVLCFLQSFWNPSGNYVTANTGGGRSGIDANTVLTSIHTFDPSAGCDATTFQPCSDKALANLKVYTDSFRSIYSVNTGIASNAAVATGRYPEDVYMGGNPWYLATMAAAEQLYDALSVWESQGSLTVTPTSLAFFQMFDSGVQAGTYASSSSTFSSLTSAIQSLADGFVAIHAEYTPSDGSLSEQFSRSNGSPTSAADLTWSYAAALTGFAARNGTQVASWGAAGLTVPATCQGSPGPTVSVTFNVDATTVWGENIYITGSVDALENWSTTTALLLSSANYPIWSITVSLPANTNIQYKYIRIDNGAVTWESDPNNSLTTPASGSYTVNDTWR
SEQ ID NO:19；来自Sarocladium zeae的GA-4686(SzeGA2)
RPGPAKVQLSTRAVGDFINSETPIALEQLLCNIGANGCNSAGVSSGLVIASPSKQDPDYWYTWTRDSALVFKSIVDRFTNSYDAGLQRHITDYIVAQARLQGVSNPSGGFSDGSGLAEPKYNVDGSAFTGAWGRPQRDGPALRAIAIMSYGEWLLDNSYTDTAKNIVWPVVRNDLEYVAQYWNQTGFDLWEEVRGSSFFTIASQHQALVQGYRFAARVGASGAHYQATAPSVLCFLQSFWNPSKGYIDSNINVNDGRTGLDANSILASIHTFDASIGCDSTTFQPCSDKALSNLKAVVDSFRFYNINNGIPKGTALAVGRYAEDVYYNGNPWYLNTLAAAEQLYDAVYVWKQQGSVTVTATSRAFFADLIPNIAVGTYQSGSSTYNSIIQAVSQYGDGFVNVVATYAQSNGSLAEQFSKQDGTPLSARDLTWSYASFLTAAARRAGVIPRPWSGGVEALPGTCSAVSFTGSYTSATATNFPASQTPVTGTGTATGTSPPTTSTTAQPPSTTTACAIAPQVTVNFVARVVTNYGDTVKLVGNVDKLGNWNPGSGVVFSASDYQANNPVWKGSVVLSAGQSIQYKYVKVLSDGTVKWEADPNRTYSVPRSCATAVTRSDTWQT
SEQ ID NO:20；来自草酸青霉的GA-4688(PoxGA5)
APQLSPRATASLDAWLATETTFSLNGILNNIGASGAYAKSAKNGVVIASPSTSSPNYYYTWSRDSALTLKVLIDLFRNGNLDLQTVIEEYINAQATLQTVSNPSGDLSSGAGLGEPKFNVDLSAFTDGWGRPQRDGPALRAISLIEFGNWLIDNGYSSYAINNVWPIVRNDLSYVAQYWSQTGFDLWEEVNSMSFFTVASQHRSLVEGSAFAKRVGASCSWCDSQAPQILCYMQTFWTGSYMNANTGGGRSGKDANTVLASIHTFDPEATCDDITFQPCSPRALANHKVYTDSFRSVYSINSGIAQGVAVAVGRYPEDSYYNGNPWFLSNLAAAEQLYDAIYQWNKIGSITITSTSLAFFKDIYSSAAVGTYASGSSTFTAIISAVKTYADGYVSIVQAHSYTNGSLSEQYDKSTGLSLSARDLTWSYAALLTANMRRNGVVPPSWGASSANTVPSSCSMGSAAGTYATPTATSWPSTLTSGTPGSTTSTPATSTTSTTSTSACTTPTSVAVTFDEIATTTYGENVYIVGSISQLGSWNTANAIALSASQYTSSKHLWYVTINLPAGTTFQYKYIRKESDGSIVWESDPNRSYTVPATCGTTTATENDTWR
下表中列出了与TrGA组合表现更好或与不同GA混合表现更好的AA：
示出了氨基酸序列，如以下：
SEQ ID NO:21；来自棒曲霉的AA-1704(AcAA)
LTPAEWRGQSIYFLITDRFARTDGSTTAPCDLSQRAYCGGSWQGIIKQLDYIQGMGFTAIWITPITEQIPQDTAEGSAFHGYWQKDIYNVNSHFGTADDIRALSKALHDRGMYLMIDVVANHMGYNGPGASTDFSTFTPFNSASYFHSYCPINNYNDQSQVENCWLGDNTVALADLYTQHSDVRNIWYSWIKEIVGNYSADGLRIDTVKHVEKDFWTGYTQAAGVYTVGEVLDGDPAYTCPYQGYVDGVLNYPIYYPLLRAFESSSGSMGDLYNMINSVASDCKDPTVLGSFIENHDNPRFASYTKDMSQAKAVISYVILSDGIPIIYSGQEQHYSGGNDPYNREAIWLSGYSTTSELYKFIATTNKIRQLAISKDSSYLTSRNNPFYTDSNTIAMRKGSGGSQVITVLSNSGSNGGSYTLNLGNSGYSSGANLVEVYTCSSVTVGSDGKIPVPMASGLPRVLVPASWMSGSGLCGSSSTTTLVTATTTPTGSSSSTTLATAVTTPTGSCKTATTVPVVLEESVRTSYGENIFISGSIPQLGSWNPDKAVALSSSQYTSSNPLWAVTLDLPVGTSFEYKFLKKEQNGGVAWENDPNRSYTVPEACAGTSQKVDSSWR
SEQ ID NO:22；来自土曲霉的AA-1708(AtAA)
LTPAEWRSQSIYFLLTDRFGRTDNSTTAACDTSDRVYCGGSWQGIINQLDYIQGMGFTAIWITPVTGQFYENTGDGTSYHGYWQQDIYDLNYNYGTAQDLKNLANALHERGMYLMVDVVANHMGYDGAGNTVDYSVFNPFSSSSYFHPYCLISNYDNQTNVEDCWLGDTTVSLPDLDTTSTAVRNIWYDWVADLVANYSIDGLRVDTVKHVEKDFWPGYNSAAGVYCVGEVYSGDPAYTCPYQNYMDGVLNYPIYYQLLYAFESSSGSISDLYNMISSVASSCKDPTLLGNFIENHDNPRFASYTSDYSQAKNVITFIFLSDGIPIVYAGQEQHYSGGSDPANREATWLSGYSTSATLYTWIATTNQIRSLAISKDAGYVQAKNNPFYSDSNTIAMRKGTTAGAQVITVLSNKGASGSSYTLSLSGTGYSAGATLVETYTCTTVTVDSSGNLPVPMTSGLPRVFVPSSWVNGSALCNTECTAATSISVLFEELVTTTYGENIYLSGSISQLGSWNTASAVALSASQYTSSNPEWYVSVTLPVGTSFQYKFIKKGSDGSVVWESDPNRSYTVPAGCEGATVTVADTWR
SEQ ID NO:23；来自烟曲霉菌Af293的AA-2115(AfuAmy1)
LTPAEWRSQSIYFLLTDRFGREDNSTTAACDVTQRLYCGGSWQGIINHLDYIQGMGFTAIWITPVTEQFYENTGDGTSYHGYWQQNIHEVNANYGTAQDLRDLANALHARGMYLMVDVVANHMGYNGAGNSVNYGVFTPFDSATYFHPYCLITDYNNQTAVEDCWLGDTTVSLPDLDTTSTAVRSIWYDWVKGLVANYSIDGLRIDTVKHVEKDFWPGYNDAAGVYCVGEVFSGDPQYTCPYQNYLDGVLNYPIYYQLLYAFQSTSGSISNLYNMISSVASDCADPTLLGNFIENHDNPRFASYTSDYSQAKNVISFMFFSDGIPIVYAGQEQHYSGGADPANREAVWLSGYSTSATLYSWIASTNKIRKLAISKDSAYITSKNNPFYYDSNTLAMRKGSVAGSQVITVLSNKGSSGSSYTLSLSGTGYSAGATLVEMYTCTTLTVDSSGNLAVPMVSGLPRVFVPSSWVSGSGLCGDSISTTATAPSATTSATATRTACAAATAIPILFEELVTTTYGESIYLTGSISQLGNWDTSSAIALSASKYTSSNPEWYVTVTLPVGTSFEYKFVKKGSDGSIAWESDPNRSYTVPTGCAGTTVTVSDTWR
SEQ ID NO:24；来自费氏新萨托菌的AA-2205(NfiAmy1)
LTPAEWRSQSIYFLLTDRFGREDNSTTAACDVTQRLYCGGSWQGIINHLDYIQGMGFTAIWITPVTQQFYENTGDGTSYHGYWQQNIYEVNSNYGTAQDLRKLADALHARGMYLMVDVVANHMGYDGAGNSVDYSVFTPFDSSTYFHTYCLISDYNNQNNVEDCWLGDTTVSLPDLDTTNTAVRTIWYDWVKGLVANYSIDGLRIDTVKHVEKDFWPDYNDAAGVYCVGEVFSGDPSYTCPYQNYMDGVLNYPIYYQLLYAFQSTSGSISNLYNMISSVDSDCADPTLLGNFIENHDNPRFASYTSDYSQAKNVISFMFFSDGIPIVYAGQEQHYSGGADPANREAVWLSGYSTSATLYSWIASTNKIRKLAISKDSAYITSKNNPFYYDSNTLAMRKGSVAGSQVITVLSNKGSSGSSYTLSLSGTGYSAGATLVEMYTCTTLTVDSSGNLAVPMASGLPRVLVPSSWVSGSGLCGDSISTIATTTTSTTKTTTVATTTACASATALPILFEELVTTTYGETIYLTGSISQLGNWDTSSAIALSASKYTSSNPEWYATVTLPVGTSFQYKFFKKESDGSIVWESDPNRSYTVPAGCAGTTVTVSDTWR
SEQ ID NO:25；来自埃默森篮状菌的AA-2285(TemAmy1)
LTPAEWRKQSIYFLLTDRFGRADNSTTAACDVTERIYCGGSWQGIINHLDYIQGMGFTAIWISPVTEQLPQNTGEGEAYHGYWQQEIYTVNSNFGTSDDLLALSKALHDRGMYLMVDVVANHMGYDGDGDSVDYSVFNPFNSSSYFHPYCLITDYSNQTDVEDCWLGDTTVSLPDLNTTETVVRTIWYDWVADLVSNYSIDGLRIDTVKHVEKSFWPGYNSAAGVYCVGEVLDGDPSYTCPYQDYLDGVLNYPIYYQLLYAFESSSGSISNLYNMINSVASECSDPTLLGNFIENHDNPRFASYTSDYSLAKNVIAFIFFSDGIPIVYAGQEQHYNGGNDPYNREATWLSGYSTTAELYTFIATTNAIRSLAISVDSEYLTYKNDPFYYDSNTLAMRKGSDGLQVITVLSNLGADGSSYTLTLSGSGYSSGTELVEAYTCTTVTVDSNGDIPVPMESGLPRVFLPASSFSGSSLCSSSPSPTTTTSTSTSTTSTACTTATAVAVLFEELVTTTYGENVYLSGSISQLGDWNTDDAVALSAANYTSSNPLWYVTVTLPVGTSFEYKFIKKEENGDVEWESDPNRSYTVPTACTGATETIVDTWR
SEQ ID NO:26；来自绳状青霉的AA-2301(PfuAmy1)
LSAAEWRSQSIYFLLTDRFARTDGSTSAACDLSQRIQAYCGGSWQGIIDHLDYIQGMGFTAVWITPITKQMPQTTSEGTGFHGYWQQDIYSVNPNFGTADDIKALSKAIHDRGMYLMIDVVANHMGYNGAGSSTDFSVFNPFNSASYFHSYCSISDYNNQNQVENCWLGDDTVSLTDLNTQSDQVRTIWYSWVKDLVANYTVDGLRIDTVKHVEKDFWTGYSQAAGVYTLGEVLHGDPAYTCPYQGYVDGVFNYPIYYPLLNAFKSSSGSISSLVSMINSVSSDCKDPTLLGSFIENHDNPRFPSYTSDMSQAKSVIGYVFFADGIPTIYSGQEQHYAGANDPYNREAIWLSGYATDSELYKFIATANEIRKLAISKDSSYLTTRNNAFYTDSNTIAMRKGTSGSQVITVLSNSGSSGGSYTLNLNNHGYSSGAQLVELYTCASVQVDSSGNMPVPMASGLPRVLVPGSWATGSGLCGTSSGTPSKTTTLITTTSQVSSSTSSTCVAATSLPIAFTEKVTTSYGESVFITGSISQLGNWNAANAVALSASQYTSANPVWTVSLDLPVGTTFQYKYIKKEQDGSVVWESDPNRSYTVSSGCTGVKQAVSDSWR
SEQ ID NO:27；来自绳状青霉的AA-2303(PfuAmy3)
LTADEWRSQSIYFLLTDRFGLTSNSTTASCDVADGLYCGGSWQGVINHLDYIQGMGFTAIWITPVTENFEGDTSDGEAYHGYWQQNAYATNSHYGASSDLLKLSEALHARGMYLMVDIVVNNMAYDGAGTSVDYSIFNPFPSESYYHSYCLINYNTYNATDWDDCWEGDTIVSLPDLDTTQTYVKDTWNTWVKSFVANYSIDGLRIDSALHIQQDFFTAFEEAAGVYCIGELDYGDPAVVCPYQSVLSGVLNYPIYWQLLYAFESSSGSISNLYNMINTVKSDCADTSLLGNFIENHDNPRFAYYTSDYSEAKNVISFIFLTDGIPILYYGQEQHYSGGNIPLNREPLWTSDYSTDAQLYTYTKTSNAIRSLAIAKDSAYLTYQNYPIYQDSNTIAMRKGTTGLQLVTVLSNLGANGSSYTLTLSGSGYTSGTVVTELYTCTNVTVSSSGTIAVPMASGSPRAFLPWSSVSGSSLCNSVSSGCTAASTVAVTFEEVVTTTYGQEVYLTGSISQLGSWSTSSAVLLSAAQYTSSDPVWTVTVNLPAGESFEYKFIIVNSDGTVTWESDPNRSYTVPTGCQGLTATVDDTWR
SEQ ID NO:28；来自出芽短梗霉的AA-2506(ApuAmy1)
LTPAQWRSQSIYQVLTDRFARTDGSTTASCDVNKYCGGSFQGIIKKLDYIQQMGFTAIWISPVVKNIYSSGQDGDSYHGYWAQDIYQVNTNFGSAADLVSLSKALHDRGMYLMVDIVTNHMGYNGCGNCVDYSIYNPFNSQSYYHPFCLINYNDQTSVEQCWAGDNTVSLPDLRTEDSNVLSMWNTWIKQLVFNYTIDGLRIDSAKSVDKAFYQPFQQAASVYAVGEVYDGDPNYFCDYQNYLDGMLNYPTYYWITQAFQSTSGSISNLYNGINTMKSTCKDTTLLGSFMENHDVARFASLTSDYALAKNAIAFTMLADGIPIIYQGQEQHFSGSSVPNNREALWLSGYPTSSQLYPFIATVNKIRKQAIKQDTGYLTYKAYPVYSDASTIVMRKGTTGSQVIGVFTNKGSSGSSSFTLSSSASGFTAGQAVTDVLSCTSYTADSNGNIAININAGAPRVLYPTSKLTGSGLCSGSSSTSGTPTTIKTSAVSGGCSTPTAVAVTFTDKVTTQYGQTIKLAGSIPQLGSWNAANAVTLSSAGYTASNPVWSGTVNIPAGQAFSYKFIKVNSDGSVTWESDPNHSYTVPASCGVTTASVSNTWQG
SEQ ID NO:29；来自斯达氏油脂酵母的AA-2522(LstAmy1)
YILRRDCTTVTVLSSPESVTSSNHVQLASHEMCDSTLSASLYIYNDDYDKIVTLYYLTSSGTTGSVTASYSSSLSNNWELWSLSAPAADAVEITGASYVDSDASATYATSFDIPLTTTTTSSSSASATSTSSLTTTSSVSISVSVPTGTAANWRGRAIYQIVTDRFARTDGSTTYLCDVTDRVYCGGSYQGIINMLDYIQGMGFTAIWISPIVENIPDDTGYGYAYHGYWMKDIFALNTNFGTADDLIALATELHNRGMYLMVDIVVNHFAFSGSHADVDYSEYFPYSSQDYFHSFCWITDYSNQTNVEQCWLGDDTVPLVDVNTQLDTVKSEYQSWVQELIANYSIDGLRIDTVKHVQMDFWAPFQEAAGIYAVGEVFDGDPSYTCPYQENLDGVLNYPVYYPVVSAFESVSGSVSSLVDMIDTLKSECTDTTLLGSFLENQDNPRFPSYTSDESLIKNAIAFTMLSDGIPIIYYGQEQGLNGGNDPYNREALWLTGYSTTSTFYKYIASLNQIRNQAIYKDDTYLTYQNWVIYSDSTTIAMRKGFTGNQIITVLSNLGTSGSSYTLTLSNTGYTASSVVYEILTCTAVTVDSSGNLAVPMSSGLPKVFYQESQLVGSGICSM
SEQ ID NO:30；来自稻粳稻群体的AA-2676(OsaAmy2)
DKILFQGFNWESWRQSGGWYNLLMGKVDDIVAAGVTHVWLPPPSHSVSTQGYMPGRLYDLDASRYGTSMELKSLISALHGKGIQAIADVVINHRCADYKDSRGIYCIFEGGTPDGRLDWGPHMICRDDTQFSDGTGNLDTGADFAAAPDIDHLNGVVQRELTDWLLWLKSDEVGFDAWRLDFARGYSPEVAKVYIEGTTPVGLAVAELWDSMAYGGDGKPEYNQDAHRQALVDWVDRVGGTASAGMVFDFTTKGIMNTAVEGELWRLIDQQGKAPGVIGWWPAKAVTFVDNHDTGSTQQMWPFPSDKVMQGYAYILTHPGNPCIFYDHFFDWGLKEQIAALVAVRQRNGVTATSSLKIMLHDADAYVAEIDGKVVMKIGSRYDVSSLIPPGFHLAAHGNGYAVWEKSAAAAADHRTSSSASL
SEQ ID NO:31；来自棘孢曲霉的AA-2940(AacAmy2)
AEWRTQSIYFLLTDRFGRTDNSTTATCNTGDQVYCGGTWQGIINHLDYIQGMGFTAVWISPVTEQLSANTADGESYHGYWQQKIYSLNSNFGTADDLKALSAALHERDMYLMVDVVPNHMGYAGSGDSVDYSVFDAFDSSSYFHSYCLITDWDDIDQVRTCWEGDTIVSLPDLYTTQSDVRTIWYDWIEQLVANYSIDGLRIDSALEVEPDFFTGYVSAAGVYSVGEIFNGDPATACPYQGYLDGVLNYPIYFQLLYAFESSSGSISDLYNMINSVASDCSDPTLLGNFIENHDNARFAYYTSDYSQAKNVLSFLFLSDGIPIVYAGEEQHYSGSGVPYNREATWLSGYSTTAELYQWIATTNAIRKLAISLDSNYITYKNNPFYTDSNTIAMRKGSDNLQVITILSNRGSSSSSYTLTLTGTGYAAGTTLIEAYTCTTLTVSSSGSIAVPMASGLPRVYLPASSVNKGSLCGGGTSATTATTTTTLKTTTTTTSTKTTTTSCTATTTSLPITFIELVTTTYGEEIYLTGSIAALGNWATTASGRIALSAANYSASYPEWSATVSVPVGTSFEYKFFKVGTDGSTITWESDPNRVYTVTATACAGATATVVDSWR
SEQ ID NO:32；来自嗜热篮状菌的AA-3238(TleAmy1)
LAPAEWRKQSIYFLLTDRFGRTDNSTTATCNVSDRVYCGGSWQGIINHLDYIQGMGFTAVWISPVTEQLPQDTGDGAAYHGYWQQRIYELNANFGTESDLKALATALHDRGMYLMLDVVANHMGYAGAGNTVDYSVFDPFDSSSYFHPYCLISDYSNQTNVEDCWLGDTTVSLPDLNTTETAVQNIWYNWVAGLVANYSVDGLRIDTVKHVQKPFWPGYNKAAGVYCVGEVLNGDPSYTCDYQNYLDAVLNYPIYFQLLYAFESSSGSIANLYNMINSVASVCVDPTLLGNFIENHDNPRFAYYTSDYSQAKNVIAYIFLADGIPIVYAGQEQHYSGGNDPYNREATWLSGYSTSAELYTFIATTNQIRKLAISRDSNYLTSRNNPFYYDSNTLAMRKGSSGSQVITVLSNLGSSGSSYTLTLSNTGYSSGTSLTELHTCTSVTVDSSGNIAVPMASGSPRVLVPSSWINGSGLCSGSGTTGCTAATSVPVLFEETVTTTYGENIFISGSISQLGDWDTSQAVALSASQYTASDPLWEVTIDLPVGTSFEYKFIKVEPSGTVVWESDPNRQYTVPTACTGTTETVVATWR
SEQ ID NO:33；来自金黄色嗜热子囊菌的AA-3239(TauAmy1)
ATPAQWRSRSVYFLLTDRFARSDGSTTAACDTSARLDYIQGMGFTAIWISPVTEQLPQDTGDGTAYHGYWQQDIYSLNPNFGTADDLRALADALHARGMYLMVDVVANHMGYAGPGNSVDYSVFNPFNKQEYFHPYCEITNYDDQSNVEDCWLGDTIVSLPDLNTTRSDVEDIWYSWVRALVSNYSVDGLRIDTVKHVQKDFWPGYNDAAGVYCVGEVFDGDPSYTCDYQNYLDGVLNYPMYYPLLRAFSSTSGSISDLYNMINTVKAQCADSTLLGTFVENHDVPRFASYTSDIALAKNAIAFTILSDGIPIIYAGQEQHYSGGNDPANREAVWLSGYSTTSELYQFIAVSNQIRNYAIYVDEGYLTYKAWPIYQDSHTLAIRKGFDGNQVITVLSNLGSSGSSYTLSLSGTGYAAGQQVTEIYSCTDVTADSNGNIAVSMGGGLPKAFFPTAKLAGSGICWKSEQ ID NO:34；来自耐盐短杆菌菌株XFB-BI的AA-3937(BhaAmy3)
GPAAANAETQNTSNELTAPSIKSGTILHAWNWSFNTLKHNMKDIHDAGYTAIQTSPINQVKEGNQGNKSMSNWYWLYQPTSYQIGNRYLGTEQEFKEMCAAAEEYGVKVIVDAVINHTTSDYAAISNEIKSIPNWTHGNTQIKNWSDRWDVTQNSLLGLYDWNTQNTQVQSYLKRFLERALNDGADGFRYDAAKHIELPDDGNYGSQFWPNITNTSAEFQYGEILQDSASRDAAYANYMNVTASNYGHSIRSALKNRNLSVSNISHYASEVSADKLVTWVESHDTYANDEEESTWMSDDDIRLGWAVIASRSGSTPLFFSRPEGGGNGVRFPGKSQIGDRGSALFEDQAITAVNRFHNVMDGQPEELSNPNGNNQIFMNQRGSHGVVLANAGSSSVTINTSTKLPDGRYDNKAGNGSFQVTDGKLTGTINARSVAVLYSDDIANAPHVFLENVKTGVTHSFNDQLTITLRADANTTKAVYQINNGQETVFKDGDQLTIGKGDPFGTTYTITLTGTNSDGVTRTQEYSFVKREPSAAKTIGYQNPNHWGQVNAYIYKHDGGRALELTGSWPGKAMIKNADGIYTLTLPADTDTTNAKVIFNNGSAQVPGQNQPGFDYVQNGLYNDSGLSGSLPH
下表中列出了比TrGA/AkAA表现更好的GA/AA组合：
在一些实施例中，该组合物和方法包括颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶或其活性片段，其包含与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19或SEQID NO:20具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，该组合物和方法包括颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶或其活性片段，其包含与SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQID NO:32、SEQ ID NO:33、或SEQ ID NO:34具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述组合物和方法包括颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶，其具有与SEQ ID NO:22或其活性片段具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且包括颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶，其与SEQ ID NO:18、16、4、13、8、3、7、19、17、5或12中任一个或其活性片段具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％氨基酸序列同一性。
在一些实施例中，所述组合物和方法包括颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶，其具有与SEQ ID NO:32或其活性片段具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且包括颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶，其与SEQ ID NO:18、13、16、20、8、19、或4中的任一个或其活性片段具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％氨基酸序列同一性。
在一些实施例中，所述组合物和方法包括颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶，其具有与SEQ ID NO:25或其活性片段具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且包括颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶，其与SEQ ID NO:18、8、16、或13中的任一个或其活性片段具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％氨基酸序列同一性。
在一些实施例中，所述组合物和方法包括颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶，其具有与SEQ ID NO:29或其活性片段具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且包括颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶，其与SEQ ID NO:18、16、或7中的任一个或其活性片段具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％氨基酸序列同一性。
在一些实施例中，所述组合物和方法包括颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶，其具有与SEQ ID NO:33或其活性片段具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且包括颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶，其与SEQ ID NO:16、3、18、或7中的任一个或其活性片段具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％氨基酸序列同一性。
在一些实施例中，所述组合物和方法包括颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶，其具有与SEQ ID NO:27或其活性片段具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且包括颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶，其与SEQ ID NO:16、18、7、17、8、或13中任一个或其活性片段具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％氨基酸序列同一性。
在一些实施例中，所述组合物和方法包括颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶，其具有与SEQ ID NO:31或其活性片段具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且包括颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶，其与SEQ ID NO:18或其活性片段具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％氨基酸序列。
在一些实施例中，所述组合物和方法包括颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶，其具有与SEQ ID NO:21或其活性片段具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且包括颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶，其与SEQ ID NO:16或其活性片段具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％氨基酸序列。
在一些实施例中，该组合物和方法包括如本文所述的多种颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶。
在一些实施例中，该组合物和方法进一步包括其他的酶，例如其他的α-淀粉酶和葡糖淀粉酶，包括其他的颗粒状淀粉水解酶。在一些实施例中，该添加酶选自纤维素酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、植酸酶、蛋白酶、海藻糖酶和短梗霉多糖酶。
在一些实施例中，该颗粒状淀粉具有5％-60％、10％-50％、15％-45％、15％-30％、20％-45％、20％-30％和还有25％-40％之间的DS。与葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶的接触步骤是在3.0至7.0、3.0至6.5、3至5.5、3.5至4.5、3.5至7.0、3.5至6.5、4.0至6.0或4.5至5.5的pH范围进行的。该浆料以处于或低于颗粒状淀粉的淀粉糊化温度保持接触。在一些实施例中，该温度保持在45℃和70℃之间；在其他的实施例中，该温度保持在50℃和70℃之间、55℃和70℃之间、60℃和70℃之间、60℃和65℃之间、55℃和65℃之间以及55℃和68℃之间。在进一步的实施例中，该温度是至少45℃、48℃、50℃、53℃、55℃、58℃、60℃、63℃、65℃和68℃。在其他的实施例中，该温度是不大于65℃、68℃、70℃、73℃、75℃和80℃。
根据本文的方法可以使用的许多颗粒状淀粉的初始淀粉糊化温度范围可以包括但不限于：大麦(52℃至59℃)、小麦(58℃至64℃)、黑麦(57℃至70℃)、玉米(62℃至72℃)、高直链淀粉玉米(67℃至80℃)、稻(68℃至77℃)、高粱(68℃至77℃)、马铃薯(58℃至68℃)、树薯/木薯(59℃至69℃)和甘薯(58℃至72℃)。(J.J.M.Swinkels于StarchConversion Technology[淀粉转化技术]，编辑：Van Beynum等人，(1985)，第32页-第38页，Marcel Dekker Inc.[马塞尔德克尔公司]纽约和The Alcohol Textbook[醇教科书]第3版A Reference for the Beverage,Fuel and Industrial Alcohol Industries[饮料、燃料和工业酒精行业参考]，编辑：Jacques等人，(1999)Nottingham University Press[诺丁汉大学出版社]，英国)。
在接触步骤中，可以使浆料与本发明的酶接触持续5分钟至48小时的时间段；并且还可以持续5分钟至24小时的时间段。在一些实施例中，该时间段是15分钟和12小时之间、15分钟和6小时之间、15分钟和4小时之间以及还有30分钟和2小时之间。总乙醇发酵时间通常需要30小时-70小时，例如，40小时-70小时、30小时-60小时、50小时-70小时、30小时-50小时或相似的小时。
在接触步骤中，25％-90％或更多的颗粒状淀粉被溶解以产生包含糊精、寡糖和更小的糖(像葡萄糖)的糖类。在一些实施例中，大于20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％和90％的颗粒状淀粉被溶解。
在如上所述将颗粒状淀粉与α-淀粉酶和葡糖淀粉酶接触一段时间之后，获得了可溶性淀粉底物(醪液)，其包含大于10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、90％、95％和97％的葡萄糖。
在导致产生包含葡萄糖的醪液的接触步骤之后，该醪液通常经受用发酵微生物的发酵(例如产生乙醇的微生物)。发酵可以与接触步骤同时进行，在接触步骤期间产生的葡萄糖可以立即通过发酵微生物转化成最终产物。在这种情况下，在醪液中聚集的该葡萄糖的量将会低更多，因为它迅速转化成了发酵终产物。
在一些实施例中，该发酵生物体是酵母菌，任选地是重组酵母菌。酵母菌的实例包括但不限于：酵母菌属物种、念珠菌属物种、毕赤酵母属物种、德克酵母属物种、汉森氏酵母属物种、南极酵母菌属物种(Pseudozyma sp.)、类酵母属(Sacharromycodes)物种、接合酵母属物种、囊酵母属物种、伊萨酵母属物种、拟威尔酵母属物种和酒香酵母属物种。具体的酵母菌包括但不限于：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、戴尔有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)、布鲁塞尔酒香酵母(Brettanomyces bruxellensis)、拜耳接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)、汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)和鲁氏结合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)。
在一些实施例中，该发酵生物体是丝状真菌，任选地是重组的丝状真菌。丝状真菌的实例包括但不限于：木霉属物种、曲霉属物种、青霉属物种、和毁丝霉属物种(例如来自Dyadic的C1)。
在一些实施例中，该发酵生物体是细菌，任选地是重组细菌。优选的细菌发酵生物体包括埃希氏杆菌属物种、发酵单胞菌属物种、芽孢杆菌属物种、棒状杆菌属物种、短杆菌属物种、链霉菌属物种和克雷伯氏菌属物种。在一些实施例中，该细菌能够生产醇，例如乙醇、丁醇、甲醇、丙醇等。
例如，能够承受较高温度的产生乙醇微生物的改良的菌株在本领域中是已知的并且可以使用。参见Liu等人(2011)Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao[生物工程学报]27(7):1049-56。酵母菌的商业来源包括ETHANOL(LeSaffre[乐斯福公司])；(Lallemand[拉勒曼德公司])；RED(Red Star[红星公司])；(DSM Specialties[帝斯曼配料部])和(Alltech[阿尔泰克公司])。
在一些实施例中，该发酵生物体表达以下的酶，例如本文描述的颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶和/或转化α-淀粉酶、其他的葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶或淀粉降解酶，例如支链淀粉酶和/或海藻糖酶。其他的酶包括植酸酶、纤维素酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、木糖还原酶、木糖醇脱氢酶、蛋白酶以及等等。
本颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶和α-淀粉酶的用途不限于具体的发酵终产物(EOF)的生产。在一些实施例中，该EOF可以是但不限于：代谢物，例如柠檬酸、乳酸、琥珀酸、乙酸、谷氨酸钠、葡糖酸、葡萄糖酸钠、葡萄糖酸钙、葡萄糖酸钾、衣康酸和其他的羰酸、葡萄糖酸-δ-内酯、异抗坏血酸钠、谷氨酸、色氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸和其他的氨基酸、Ω-3脂肪酸、异戊二烯、1,3-丙二醇、乙醇、甲醇、丙醇、丁醇、其他的醇、和其他的生物化学品和生物材料。
在将醪液经受发酵之前，将该醪液进一步暴露于包含例如逆流和/或玉米浆的水溶液并且调节至pH的范围为pH 3.0至6.0；pH 3.5至5.5或pH 4.0至5.5。在本发明的这个实施例中，可以稀释该醪液的％DS。例如，在接触步骤中该稀释的醪液的DS可以是在5％至35％之间、5％至30％之间、5％至25％之间、5％至20％之间、5％至20％之间、5％至15％之间和5％至10％之间，小于浆料的％DS。在一个非限制性实例中，如果在接触步骤中，浆料的％DS是约32％并且该醪液被进一步暴露于稀释水溶液中，该稀释水溶液稀释5％至10％之间的DS，该将要发酵的醪液的DS将会在22％和27％之间。在一些具体的实施例中，如果该接触浆料的DS是在30％至35％之间，该稀释的浆料的DS将为约20％至30％。
在一个具体的实施例中，包含至少10％葡萄糖的醪液然后使用上文所述的发酵微生物经受了发酵过程。这些发酵过程描述于：The Alcohol Textbook[醇教科书]第3版，AReference for the Beverage,Fuel and Industrial Alcohol Industries[饮料、燃料和工业酒精行业参考]，编辑Jacques等人，(1999)Nottingham University Press[诺丁汉大学出版社]，英国。
在一些实施例中，使颗粒状淀粉与α-淀粉酶和葡糖淀粉酶接触与通过发酵微生物的发酵同时进行。在该过程中，葡萄糖含量(或其他的可发酵糖的含量)保持很低，因为其通过如上所述的发酵微生物同时转化成了最终产物。
如上所述，可以使用本组合物和方法产生的一种EOF产物是醇产物，例如乙醇。根据该方法产生的最终产物可以从发酵培养基中分离和/或纯化。分离和纯化方法是已知的，例如通过使培养基经受萃取、蒸馏和柱色谱。
在进一步的实施例中，该醪液可以在发酵的任何时间分离，但优选地在发酵结束时分离，并且甚至更优选地在通过蒸馏例如通过离心分离成液相和固相除去最终产物乙醇之后分离。该醇可以通过例如蒸馏等方法回收，并可以通过分子筛脱水或超滤进一步纯化。
在一些实施例中，乙醇的产量将会是大于按体积计8％、10％、12％、14％、16％和18％。根据本发明的方法获得的乙醇可以用作燃料乙醇、可饮用的乙醇或工业乙醇。
除了EOF产物以外，该颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶和α-淀粉酶可以在发酵副产物如干酒糟(DDG)和干酒糟加可溶物(DDGS)的生产或品质方面提供优势，发酵副产物可用作动物饲料或用于其他应用。
实例
实例1
GA/AA共混物在同步糖化和发酵中的评估
将大量的葡糖淀粉酶(GA)和α-淀粉酶(AA)作为酶共混物组合进行测试，用于使用玉米粉底物在同时糖化和发酵中使用。
下表列出了使用的GA：
下表列出了使用的AA：
对于分析，通过将50％/50％的自来水/软化水添加到玉米粉底物(Azure农场有机玉米粉(FL131)-Azure standard公司，美国俄勒冈州杜夫(Dufur))中制备29.4％干固体(wt/wt)的浆料。如设定的，用H2SO4调节pH值，并且然后添加尿素至最终浓度为500ppm。最后，添加0.001％w/w FERMGEN 2.5xTM蛋白酶(杜邦公司)和0.1％w/w活性干酵母(Fermentis[弗曼迪斯公司]，法国-Ethanol Red)。将包括蛋白酶和酵母菌的底物分开放进SSF容器中，并同样地向每个容器中添加选定的GA/AA酶共混物(0.107mg/g ds的GA和0.016mg/g ds的AA)。将容器在32℃孵育，并在三个不同时间点(即24h、48h和96h)采集样品以使用HPLC分析糖、甘油和乙醇含量。
对于实例2和3，用于模型系统筛选的底物是在50mM乙酸钠缓冲液中的1％(w/w)玉米淀粉(西格玛公司(Sigma)，目录号S4126)。将α-淀粉酶和葡糖淀粉酶以与STARGENTM 002的相同的蛋白质比率(即，AkAA:TrGA＝1:6.6)组合。对于α-淀粉酶(AA)筛选，将里氏木霉葡糖淀粉酶(TrGA；SEQ ID NO:1)用作葡糖淀粉酶组分，并将白曲霉α-淀粉酶(AkAA)(SEQ IDNO:2)用作基准AA。对于葡糖淀粉酶筛选，使用AkAA作为AA组分，并且TrGA是基准GA。通过向150μL的底物中添加10μL的葡糖淀粉酶和10μL的α-淀粉酶来开始反应，其中对于GA和AA，最终剂量分别为10ppm和1.5ppm。孵育在iEMS(32℃；900rpm)中分别进行6h、20h和28h。为了淬灭反应，添加50μL的0.5M NaOH并剧烈混合。然后将板用BioRad密封件密封并以2500rpm离心3min。对于HPLC分析，使用5mM H2SO4将上清液稀释10倍。过滤稀释的上清液，并将20μL溶液注入配备有折射率检测器的Agilent 1200系列HPLC中。所使用的分离柱是具有Phenomenex Rezex ROA有机酸保护柱(目录号03B-0138-K0)的Phenomenex Rezex-RFQFast Fruit柱(目录号00D-0223-K0)。流动相为5mM H2SO4，并且在85℃流速为1.0mL/min。释放的葡萄糖量用于计算对基准AkAA/TrGA组合的性能指数(PI)比率。
对于实例4，HPLC(Agilent Technologies 1200系列)运行条件如下。将PHENOMENEX REZEXTM RFQ-快速酸H+(8％)柱保存在80℃。溶剂为0.01N H2SO4，等度流速为1.0ml/min。注入体积是10μl。运行时间为5.3min。使用折射率检测来检测DP4+、DP3、DP2、DP1、甘油和乙醇。使用适当的校准标准来定量存在的组分。
在所有情况下，相对于参考共混物的性能指数(PI)相对于葡萄糖释放和/或乙醇产量进行计算。等于参考共混物的性能被指定为1.0的PI。在任何分析时间点或pH具有大于1.0的PI的共混物在以下实例的表中列出并且表示相对于当前组合和方法的改善。除非另外指明，否则本文中使用的所有测量均为重量/重量(wt/wt；w/w)。
实例2
使用不同的GA获得的结果
如实例1中所述，在白曲霉α-淀粉酶(AkAA；SEQ ID NO:2)共混物中单独测试了许多不同的GA。测量在pH 3.5和4.5孵育6h、20h和28h后的葡萄糖释放量并将该释放量除以里氏木霉葡糖淀粉酶(TrGA；SEQ ID NO:1)和AkAA的参考组合释放的葡萄糖浓度。PI值大于1.0的GA结果如下表所示。18GA在与AkAA组合时表现出对TrGA的优异的性能，在某些情况下显著地提高了两倍。
实例3
使用不同的AA获得的结果
如实例1所述，在TrGA共混物中单独测试了许多不同的AA。测量在pH 3.5和4.5孵育6h、20h和28h后释放的葡萄糖的量，并将其除以由TrGA和AkAA的参考组合释放的葡萄糖。PI值大于1.0的AA结果如下表所示。当与TrGA组合时，十九个表现出对AkAA的优异的性能，虽然改善不如在实例2中使用不同的GA的情况下显著。
实例4
鉴定高性能GA/AA共混物
如实例1所述测试了许多不同的AA/GA共混物。测量在pH 3.5孵育24h、48h和96h后乙醇的浓度，将该浓度平均并除以TrGA和AkAA参照组合产生的乙醇浓度。
下表中列出了PI大于1.0的共混物。
在本文中引用的所有专利和出版物，包括在此类专利和出版物中公开的所有序列，都通过引用出于所有目的以其全文清楚地结合在此。只要商标名称中涉及的产品随时间而变化，则具有自申请的有效申请日期起从制造商处获得的相关产品文献(包括网站)中描述的特征的产品是预期的。出于所有目的，这些产品文献也通过引用整体结合。本文提供的标题并不是对本发明的不同方面或实施例的限制，可以通过作为一个整体参考本说明书来获得这些方面与实施例。尽管已经描述了优选的方法和材料，与在本文中所述的那些类似或等效的任何方法和材料可用于本发明的实践或测试。除非从上下文另外可见，否则可以将任何实施例、方面、步骤、特征、要素或限制与任何其他组合使用。

Claims (17)

1.一种用于处理颗粒状淀粉的方法，其包括：
使包含颗粒状淀粉的浆料与颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶和颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶在处于或低于所述颗粒状淀粉的糊化温度的温度接触，以产生可通过发酵生物体发酵的糖类，其中：
(a)所述颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶包含与SEQ ID NO:22具有至少85％氨基酸序列同一性或与其活性片段具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且所述颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶包含与SEQ ID NO:18、16、4、13、8、3、7、19、17、5或12中的任一个具有至少85％氨基酸序列同一性或与其活性片段具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；
(b)所述颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶包含与SEQ ID NO:18、13、16、20、8、19或4中的任一个具有至少85％氨基酸序列同一性或与其活性片段具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；
(c)所述颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶包含与SEQ ID NO:28具有至少85％氨基酸序列同一性或与其活性片段具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且所述颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶包含与SEQ ID NO:18、8、16或13中任一个具有至少85％氨基酸序列同一性或与其活性片段具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；
(d)所述颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶包含与SEQ ID NO:34具有至少85％氨基酸序列同一性或与其活性片段具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且所述颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶包含与SEQ ID NO:18、16或7中的任一个具有至少85％氨基酸序列同一性或与其活性片段具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；
(e)所述颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶包含与SEQ ID NO:16、3、18或7中的任一个具有至少85％氨基酸序列同一性或与其活性片段具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；
(f)所述颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶包含与SEQ ID NO:30具有至少85％氨基酸序列同一性或与其活性片段具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且所述颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶包含与SEQ ID NO:16、18、7、17、8或13中任一个具有至少85％氨基酸序列同一性或与其活性片段具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；
(g)所述颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶包含与SEQ ID NO:18具有至少85％氨基酸序列同一性或与其活性片段具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；和/或
(h)所述颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶包含与SEQ ID NO:21具有至少85％氨基酸序列同一性或与其活性片段具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且所述颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶包含与SEQ ID NO:16具有至少85％氨基酸序列同一性或与其活性片段具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且
其中使所述浆料与所述颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶和所述颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶接触与使相同的浆料与来自里氏木霉(Trichoderma reesei)的、具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的葡糖淀粉酶(TrGA)和来自白曲霉(Aspergillus kawachii)的、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的α-淀粉酶(AkAA)接触相比导致增加的葡萄糖释放。
2.如权利要求1所述的方法，其中使所述浆料与所述颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶和所述颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶接触与使相同的浆料与来自里氏木霉的、具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的葡糖淀粉酶(TrGA)和来自白曲霉的、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的α-淀粉酶(AkAA)接触相比导致增加的淀粉转化。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中使所述浆料与所述颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶和所述颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶接触与使相同的浆料与来自里氏木霉的、具有SEQ IDNO:1的氨基酸序列的葡糖淀粉酶(TrGA)和来自白曲霉的、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的α-淀粉酶(AkAA)接触相比导致增加的葡萄糖释放。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中使所述浆料与所述颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶和所述颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶接触与使相同的浆料与来自里氏木霉的、具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的葡糖淀粉酶(TrGA)和来自白曲霉的、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的α-淀粉酶(AkAA)接触相比导致增加的总葡萄糖当量。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述增加的总葡萄糖当量与通过使相同的浆料与来自里氏木霉的、具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的葡糖淀粉酶(TrGA)和来自白曲霉的、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的α-淀粉酶(AkAA)接触产生的量相比高至少5％，以及优选地高至少10％。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法导致葡萄糖、麦芽糖、寡糖或其混合物任选地以糖浆形式的产生。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括使所述糖类与发酵生物体接触以产生发酵终产物；其中接触与使相同的浆料与来自里氏木霉的、具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的葡糖淀粉酶(TrGA)和来自白曲霉的、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的α-淀粉酶(AkAA)接触相比导致发酵终产物的生产增加。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述发酵终产物是乙醇。
9.如权利要求7所述的方法，其中所述发酵终产物是非乙醇生物化学品。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中同时添加所述颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶和所述颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶。
11.如权利要求7-9中任一项所述的方法，其中同时添加所述颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶和/或所述颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶以及所述发酵生物体。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶和/或所述颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶由发酵生物体产生。
13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括向所述浆料中添加另外的酶。
14.一种组合物，其包含颗粒状淀粉转化α-淀粉酶和颗粒状淀粉转化葡糖淀粉酶，其中：
(a)所述颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶包含与SEQ ID NO:22具有至少85％氨基酸序列同一性或与其活性片段具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且所述颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶包含与SEQ ID NO:18、16、4、13、8、3、7、19、17、5或12中的任一个具有至少85％氨基酸序列同一性或与其活性片段具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；
(b)所述颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶包含与SEQ ID NO:18、13、16、20、8、19或4中的任一个具有至少85％氨基酸序列同一性或与其活性片段具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；
(c)所述颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶包含与SEQ ID NO:28具有至少85％氨基酸序列同一性或与其活性片段具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且所述颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶包含与SEQ ID NO:18、8、16或13中任一个具有至少85％氨基酸序列同一性或与其活性片段具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；
(d)所述颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶包含与SEQ ID NO:34具有至少85％氨基酸序列同一性或与其活性片段具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且所述颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶包含与SEQ ID NO:18、16或7中的任一个具有至少85％氨基酸序列同一性或与其活性片段具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；
(e)所述颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶包含与SEQ ID NO:16、3、18或7中的任一个具有至少85％氨基酸序列同一性或与其活性片段具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；
(f)所述颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶包含与SEQ ID NO:30具有至少85％氨基酸序列同一性或与其活性片段具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且所述颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶包含与SEQ ID NO:16、18、7、17、8或13中任一个具有至少85％氨基酸序列同一性或与其活性片段具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；
(g)所述颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶包含与SEQ ID NO:18具有至少85％氨基酸序列同一性或与其活性片段具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；和/或
(h)所述颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶包含与SEQ ID NO:21具有至少85％氨基酸序列同一性或与其活性片段具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且所述颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶包含与SEQ ID NO:16具有至少85％氨基酸序列同一性或与其活性片段具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且
其中使所述浆料与所述颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶和所述颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶接触与使相同的浆料与来自里氏木霉的、具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的葡糖淀粉酶(TrGA)和来自白曲霉的、具有的SEQ ID NO:2的氨基酸序列的α-淀粉酶(AkAA)接触相比导致增加的淀粉转化、增加的葡萄糖释放和/或增加的总葡萄糖当量的产生。
15.如权利要求14所述的组合物，其中所述颗粒状淀粉转化α-淀粉酶和所述颗粒状淀粉转化葡糖淀粉酶与使相同的浆料与来自里氏木霉的、具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的葡糖淀粉酶(TrGA)和来自白曲霉的、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的α-淀粉酶(AkAA)接触相比能够具有高至少5％和优选地高至少10％的增加的总葡萄糖当量的产生。
16.如权利要求14或15所述的组合物，其中所述颗粒状淀粉转化α-淀粉酶和所述颗粒状淀粉转化葡糖淀粉酶与发酵生物体组合与使相同的浆料与来自里氏木霉的、具有SEQ IDNO:1的氨基酸序列的葡糖淀粉酶(TrGA)和来自白曲霉的、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的α-淀粉酶(AkAA)接触相比能够使发酵终产物的生产增加。
17.一种发酵生物体，其能够产生如权利要求14-16中任一项所述的组合物。
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