CN101466844A - 用于产生淀粉水解物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于产生淀粉水解物和任选的发酵产物，如乙醇的方法。

Description

用于产生淀粉水解物的方法
对序列列表的引用
本申请包含计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过引用并入本文。
发明领域
本发明涉及用于产生淀粉水解物(例如用于发酵方法)的改进的方法。
发明背景
本发明涉及在低于粉碎的含淀粉材料的起始凝胶化温度的温度，从粉碎的含淀粉材料(如颗粒状淀粉)中产生发酵产物的方法。
谷物、谷类或植物的块茎包含淀粉。淀粉以微观颗粒的形式存在，其在室温不溶于水。当将水性的淀粉浆料加热时，颗粒膨胀并最终胀破，将淀粉分子分散到所述溶液中。在此“凝胶化”处理过程中，粘度有显著的提高。由于在通常的工业方法中固体水平为约30-40％，因此必须使淀粉变稀薄或“液化”以使其能被处理。此粘度的降低通常通过酶法降解在称为液化的方法中完成。在液化过程中，通过alpha-淀粉酶将长链淀粉降解为葡萄糖单元的较小的分枝的和线状的链(糊精)。
常规的酶的液化方法可以作为三步热浆法(three-step hot slurry)进行。将浆料加热至80-85℃并添加热稳定的α-淀粉酶以开始液化。然后将浆料在105-125℃喷射蒸煮(jet-cooked)以完成浆料的凝胶化，冷却至60-95℃，并通常添加额外的α-淀粉酶以终结水解。液化方法通常在pH5-6进行。
在糖化期间，将来自液化的糊精进一步水解以产生可以被发酵生物体(如酵母)代谢的低分子的糖DP1-3。水解通常使用葡糖淀粉酶完成，可选择地或者除葡糖淀粉酶外，可以使用α-葡萄糖苷酶和/或酸性α-淀粉酶。全部的糖化步骤通常持续多至72小时，然而，普遍的是仅在高于50℃的温度进行例如，40-90分钟的预糖化，然后是在称为同时糖化和发酵(SSF)的方法中在发酵期间完全糖化。
使用加入醪(mash)的发酵生物(如酵母)进行发酵。然后回收发酵产物。对于乙醇，例如燃料乙醇、饮用乙醇或工业乙醇，发酵在通常约32℃的温度进行通常35-60小时。当发酵产物是啤酒时，发酵在通常约14℃的温度进行通常多至8天。
发酵后，可以将醪例如用作啤酒，或蒸馏以回收乙醇。可将乙醇用作例如燃料乙醇、饮用乙醇和/或工业乙醇。
从上述讨论显然的是，常规方法中的淀粉水解由于在各个步骤期间不同的温度要求，是非常消耗能量的。几个专利申请通过提供将颗粒状淀粉转化为乙醇而无消耗能量的凝胶化步骤的方法解决了该问题。
美国专利No.4,316,956和WO 2004/113551提供了将颗粒状淀粉转化为乙醇的发酵方法。
申请WO 2005/003311和PCT/US05/46725提供了用于将颗粒状淀粉转化为可发酵糖(例如，用于乙醇生产)的真菌α-淀粉酶。
申请PCT/DK2005/000819提供了用于将颗粒状淀粉转化为可发酵糖(例如，用于乙醇生产)的细菌α-淀粉酶。
本发明的目的是提供用于转化粉碎的含淀粉材料(如颗粒状淀粉)的改进的方法。
发明内容
本发明提供了用于从含淀粉材料产生淀粉水解物而不将所述含淀粉材料凝胶化的方法。可将淀粉水解物用作例如甜味剂或用于产生发酵产物，如乙醇。本发明人令人惊讶地发现，通过将包含碳水化合物结合模块的细菌α-淀粉酶的作用与包含碳水化合物结合模块的真菌α-淀粉酶的作用组合，与使用增加量的包含碳水化合物结合模块的细菌α-淀粉酶或增加量的包含碳水化合物结合模块的真菌α-淀粉酶相比，实现了产率(yield)的增加。
因此在第一个方面，本发明提供了一种方法，其包括用如下物质糖化颗粒状淀粉：a)葡糖淀粉酶，b)包含碳水化合物结合模块(CBM)的细菌α-淀粉酶和c)包含CBM的真菌α-淀粉酶，以产生淀粉水解物。
在优选的实施方案中，将第一方面的淀粉水解物进一步与发酵生物体接触以产生发酵产物，优选乙醇。优选地，糖化和发酵同时进行。
在另一方面，本发明提供了包含碳水化合物结合模块的细菌α-淀粉酶和包含碳水化合物结合模块的真菌α-淀粉酶的作用的组合物。在优选的实施方案中，组合物进一步包含葡糖淀粉酶。优选地，真菌酸性α-淀粉酶活性(AFAU)对葡糖淀粉酶活性(AGU)之间的比率(AFAU每AGU)是至少0.1，特别是至少0.16，如0.12-0.50或甚至更高的范围。
发明详述
在糖化含淀粉材料(如颗粒状淀粉)的浆料前，制备具有20-55wt.-％干固体，优选25-40wt.-％干固体，更优选30-35％干固体的含淀粉材料。浆料可以包括水和/或工艺水(process waters)，例如釜馏物(stillage)(倒流(backset))、洗涤水、蒸发器冷凝物或馏出液、来自蒸馏的侧流汽提器(side stripper)水或其它发酵产品工厂的工艺水。由于本发明的方法在低于凝胶化温度的温度进行因而不发生明显的粘性增加，因此如果需要可以使用高水平的釜馏物。在一个实施方案中，含水的浆料包含约1至约70vol.-％釜馏物，优选15-60％vol.-％釜馏物，尤其约30至50vol.-％釜馏物。
为了使粉碎的含淀粉材料暴露更多的表面。在一个实施方案中，粒度为0.05-3.0mm，或粉碎的含淀粉材料的至少30％适于通过(fit through)具有0.05至3.0mm筛网的筛子。在进行本发明的方法后，含淀粉材料的干固体或含淀粉材料的淀粉的至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或优选至少99％转化为可溶的淀粉水解物。
本发明的方法在低于起始凝胶化温度的温度进行。在优选的实施方案中，本方法作为同时糖化和发酵方法来进行。在这样的优选实施方案中，方法通常在28℃-36℃，如29℃-35℃，如30℃-34℃，如大约32℃进行。根据本发明，可以在发酵过程中向上或向下调节温度。
在一个实施方案中，进行同时糖化和发酵使糖水平(如葡萄糖水平)保持在低水平，如约3wt.-％以下或低于(below)约3wt.-％，优选低于约2wt.-％，更优选低于约1wt.-％，更优选低于约0.5％，或甚至更优选低于0.1wt.-％。可通过简单采用调节量的酶和发酵生物体来实现这样低水平的糖。本领域的技术人员可以容易地确定使用多少量的酶和发酵生物体。也可以选择酶和发酵生物体的采用量以维持发酵培养物中低浓度的麦芽糖。例如，可控制麦芽糖水平低于约0.5wt.-％或低于约0.2wt.-％。
本发明的方法可在3-7，优选3.5至6，或更优选4至5的范围的pH进行。
可根据本发明使用任何合适的包含颗粒状淀粉的含淀粉起始材料。适用于本发明方法的含淀粉起始材料的实例包括块茎、根、茎、全谷物(wholegrain)、玉米、穗轴(cobs)、小麦、大麦、黑麦、买罗高粱、西米、木薯(cassava)、木薯(tapioca)、高粱、稻豌豆、豆或谷类、含糖原料，如糖蜜、果实材料、糖、藤茎/甘蔗(cane)或糖甜菜、马铃薯，和含纤维素材料，如木材或植物残余物。包括蜡质和非蜡质(waxy and non-waxy)型的玉米和大麦。
术语“颗粒状淀粉”表示生的未烹制的淀粉，即，以其天然形式存在于谷类(cereal)、块茎或谷物(grain)中的淀粉。淀粉作为不溶于水的微小颗粒形成于植物细胞中。当置于冷水中时，淀粉颗粒可吸收少量的液体并膨胀。在多至50℃至75℃的温度该膨胀可为可逆的。然而，在更高的温度称为“凝胶化”的不可逆膨胀开始。将要处理的颗粒状淀粉可以是高度精炼的淀粉质量，优选至少90％，至少95％，至少97％或至少99.5％纯，或者其可为包含粉碎的全谷物的较粗制含淀粉材料，所述粉碎的全谷物包括非淀粉级分例如胚残余物(germ residue)和纤维。
将含淀粉的原料(如全谷物)粉碎以使其结构打开并允许进一步加工。根据本发明优选两种粉碎方法：湿磨和干磨。在干磨中将全谷粒(whole kernel)磨碎并使用。湿磨提供胚和粗粉(淀粉颗粒和蛋白)的良好分离，并常常应用于将淀粉水解物用于产生糖浆的场合(location)。干磨和湿磨都是淀粉加工领域中所熟知的并且等同地预期用于本发明的方法。在一个实施方案中，粉碎后的粒度为0.05-3.0mm，或因而粉碎的含淀粉材料的至少30％，优选至少50％，更优选至少70％，甚至更优选至少90％适于通过具有0.05至3.0mm筛网，优选具有0.1-0.5mm筛网的筛子。
术语“起始凝胶化温度”表示淀粉凝胶化开始的最低温度。在水中加热的淀粉在50℃-75℃开始凝胶化；确切的凝胶化温度依赖于特定的淀粉，并且可以由技术人员容易地确定。因此，起始凝胶化温度可以根据植物物种，植物物种的特定变种以及生长条件而变化。在本发明的上下文中，给出的含淀粉材料的起始凝胶化温度是使用由Gorinstein.S.和Lii.C.，Starch/Vol.44(12)pp.461-466(1992)所描述的方法，5％的淀粉颗粒的双折射丧失时的温度。
将术语“淀粉水解物”理解为本发明的水解方法的可溶性降解产物。淀粉水解可包含单-、二-和寡糖，如葡萄糖、麦芽糖、麦芽糊精、环糊精和这些物质的任意混合物。优选地，颗粒淀粉干固体的至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％或至少98％转化为可溶性淀粉水解物。
术语“发酵产物”表示使用发酵生物体通过包括发酵步骤的方法所产生的产物。根据本发明预期的发酵产物包括醇类(例如，乙醇、甲醇、丁醇)；有机酸(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸)；酮类(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，H2和CO2)；抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶类；维生素(例如，核黄素、B12、β-胡萝卜素)；和激素。在优选的实施方案中，发酵产物是乙醇，例如，燃料乙醇；饮用乙醇(即，可饮用中性酒精(potable neutral spirit))；或工业乙醇或用于可消耗醇工业(例如，啤酒和酒(wine))、乳品工业(例如，发酵奶产品)、皮革工业和烟草工业的产物。优选的啤酒种类包含淡色啤酒(ale)、烈啤酒(stout)、钵尔透黑啤酒(porter)、陈贮啤酒(lager)、苦啤酒(bitter)、麦芽酒(malt liquor)、happoushu、高醇啤酒、低醇啤酒、低卡路里啤酒或清淡啤酒(light beer)。所使用的优选发酵方法包括醇发酵方法，如本领域所熟知的。优选的发酵方法是厌氧发酵方法，如本领域所熟知的。
术语“发酵生物体”指任何生物体，包括细菌和真菌生物体，其适用于发酵方法且能够产生期望的发酵产物。特别合适的发酵生物体是能够使糖类(如葡萄糖或麦芽糖)直接或间接发酵(即，转化)为期望的发酵产物。发酵生物体的实例包括真菌生物体，如酵母。优选的酵母包括酵母属的菌种(Saccharomyces spp.)，且特别是酿酒酵母。商业可获得的酵母包括，例如，Red StarTM/Lesaffre Ethanol Red(可从Red Star/Lesaffre，USA获得)、FALI(可从Fleischmann’s Yeast，Burns Philp Food Inc.分部，USA获得)、SUPERSTART(可从Alltech获得)、GERT STRAND(可从Gert Strand AB，Sweden获得)和FERMIOL(可从DSM Specialties获得)。
包含CBM的真菌和细菌α-淀粉酶
根据本发明，将包含CBM的真菌α-淀粉酶和包含CBM的细菌α-淀粉酶应用于本发明的方法中。在优选的实施方案中，α-淀粉酶是酸性α-淀粉酶，例如，真菌酸性α-淀粉酶或细菌酸性α-淀粉酶。术语“酸性α-淀粉酶”表示以有效剂量添加的α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)在3至7，优选3.5至6，或更优选4-5范围的pH具有最佳活性。
包含CBM的细菌α-淀粉酶
将术语“包含CBM的细菌α-淀粉酶”理解为包含催化域和CBM的酶，所述催化域和所述CBM都源自细菌来源。包含CBM的细菌α-淀粉酶可以是野生型细菌酶、这样的野生型细菌酶的变体或杂合酶，其包含细菌α-淀粉酶催化域和细菌CBM。在本发明的优选实施方案中细菌α-淀粉酶催化域和/或细菌CBM源自芽孢杆菌属(Bacillus)或无氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)。
优选用于本发明的是任何包含CBM的细菌α-淀粉酶，包括杂合体和野生型，其中CBM具有如本文SEQ ID NO：1中氨基酸521-619所示的序列或者CBM具有与所述序列同源的序列。
还优选用于本发明的是任何包含CBM的细菌α-淀粉酶，包括杂合体和野生型，其中催化域具有如本文SEQ ID NO：1的氨基酸32-520所示的序列或者催化域具有与所述序列同源的序列。
在其它优选的实施方案中，包含CBM的细菌α-淀粉酶包含源自地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)或嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)的菌株的催化域，但是还可以源自其它芽孢杆菌菌种。预期的α-淀粉酶催化域的具体实例包括，与专利申请PCT/DK2005/000819(通过引用并入本文)中SEQ ID NO：35中所示来自地衣芽孢杆菌的淀粉酶(BLA)，SEQ ID NO：41中所示来自地衣芽孢杆菌变体LE429的淀粉酶，SEQ ID NO：36中所示来自嗜热脂肪芽孢杆菌的淀粉酶(BSG)，SEQ ID NO：37中所示来自解淀粉芽孢杆菌的淀粉酶(BAN)，SEQ IDNO：38中所示来自B.halodurance SP722的淀粉酶，SEQ ID NO：39中所示的淀粉酶SP690，SEQ ID：40中所示的淀粉酶AA560具有至少60％，至少70％，至少80％或甚至至少90％同一性的淀粉酶催化域。催化域还可以源自嗜糖假单胞菌(Pseudomonas saccharophilia)的淀粉酶，如来自WO 04/111217(通过引用并入本文)中作为SEQ ID NO：1公开的淀粉酶。
在本发明的实施方案中，包含CBM的细菌α-淀粉酶是包含催化域的酶，所述催化域与WO 99/19467(通过引用并入本文)中的SEQ ID NO：1、2或3中所示序列中任一个具有至少70％，优选至少80％，更优选至少85％，还更优选至少90％，如至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一性。芽孢杆菌属α-淀粉酶催化域还可以是变体和/或杂合体序列，特别是WO96/23873、WO 96/23874、WO 97/41213、WO 99/19467、WO 00/60059和WO02/10355(全部通过引用并入本文)中任一篇所述的。特别预期的α-淀粉酶变体公开于美国专利Nos.6,093,562，6,187,576和6,297,038(全部通过引用并入本文)并包括在WO 96/23873中公开的-参见例如，第20页，第1-10行(通过引用并入本文)-具有双缺失的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(BSGα-淀粉酶)变体，优选与WO 99/19467(通过引用并入本文)中公开的SEQ ID NO：7所列的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比，对应于δ(181-182)。甚至更优选的是芽孢杆菌属α-淀粉酶催化域，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，其具有对应于δ(181-182)的双缺失并与WO99/19467中公开的SEQ ID NO：3所列的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比进一步包含N193F取代(也表示为I181*+G182*+N193F)。
在特别优选的实施方案中，包含CBM的细菌α-淀粉酶是源自Anoxybacillus contaminans的菌株的野生型细菌α-淀粉酶。优选地，包含CBM的细菌α-淀粉酶具有本文SEQ ID NO：1所示的序列。还优选的是与本文SEQID NO：1具有至少70％同一性，例如至少80％或甚至至少90％的同一性，如至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％同一性的多肽。在其它的实施方案中，包含CBM的细菌α-淀粉酶是在PCT/DK2005/000819中作为SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14(通过引用并入本文)公开的杂合酶之一或者与这些序列之一同源的氨基酸序列。
可以以0.001至1.0mg/gDS，优选以0.01至0.5mg/g DS的量，更优选以0.02至0.2mg/g DS的量使用细菌α-淀粉酶。以AFAU测量，可以以0.01-10AFAU/gDS的量，以0.05-2.5AFAU/g DS的量，或更优选以0.1-1AFAU/g DS，如大约0.5AFAU/g DS的量使用细菌α-淀粉酶。
以KNU测量，可以以0.001-10KNU/g DS的量，以0.005-2KNU/g DS的量，或更优选以0.01-0.2KNU/g DS，如大约0.035KNU/g DS的量使用细菌α-淀粉酶。
包含CBM的真菌α-淀粉酶
将术语“包含CBM的真菌α-淀粉酶”理解为包含催化域和CBM的酶，所述催化域和所述CBM都源自真菌来源。包含CBM的真菌α-淀粉酶可以是野生型真菌酶、这样的野生型真菌酶的变体或杂合酶，其包含真菌α-淀粉酶催化域和真菌CBM。
在一个实施方案中，野生型酸性α-淀粉酶源自川地曲霉(Aspergilluskawachi)的菌株，特别是在WO2005/003311的SEQ ID NO：41中所示的多肽或同源序列，例如包含以下一个或多个取代的所述多肽的变体：G33A、I36K、S74A、D75Y、E77D、P120A、I153D、D154N、W155Y、D156E、N157D、L158Q、Q162E、E166L、T169N、I170T、E199K、E199L、D232L、N233D、N235D、L238Y、D239T、W256Y、Q257P、E331Q、S336A、D339K、D339N、V340D和Y342A。最优选的变体包含下列一个或多个取代：S74A、E166L、E199L、D339K和D156E。然而更优选的是具有多个取代S74A/E166L/E199L的变体。
在优选的实施方案中，包含CBM的真菌α-淀粉酶是杂合α-淀粉酶。真菌杂合酶，如本文所指，包括含有连接(即，共价连结)于包含碳水化合物结合模块(CBM)的氨基酸序列的真菌来源的α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)的氨基酸序列的种类，优选真菌来源的。
适用于本发明方法使用的杂合酶的真菌α-淀粉酶催化域包括源自曲霉属(Aspergillus)的菌株的酸性α-淀粉酶，如米曲霉(Aspergillus oryzae)和黑曲霉(Aspergillus niger)α-淀粉酶。优选的真菌α-淀粉酶是Fungamyl-样α-淀粉酶，其优选源自米曲霉的菌株。在本公开中，术语“Fungamyl-样α-淀粉酶”表示与WO 96/23874的SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列的成熟部分显示高同一性，即至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％同一性的α-淀粉酶。优选的杂合酶包含Fungamyl-样α-淀粉酶催化域和源自罗耳阿太菌(A.rolfsii)葡糖淀粉酶的CBM。
适用于本发明方法使用的杂合酶的另一个优选的酸性α-淀粉酶催化域源自黑曲霉菌株。在优选的实施方案中，酸性真菌α-淀粉酶是来自Swiss-prot/TeEMBL数据库中以原始登录号P56271作为“AMYA_ASPNG”公开的黑曲霉的酸性真菌α-淀粉酶，并在WO 89/01969(实施例3)中更详细地描述。也将酸性黑曲霉酸性α-淀粉酶表示为WO 2005/003311中的SEQ IDNO：8。优选的酸性α-淀粉酶淀粉酶催化域还包含所述酸性真菌淀粉酶的变体，其与WO 2005/003311中的SEQ ID NO：8具有至少70％同一性，如至少80％或至少90％同一性，如至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或甚至至少99％同一性。优选地，包含CBM的真菌α-淀粉酶是WO2005/003311中公开的变体JA01。
适用于本发明方法使用的杂合酶的另一个优选的酸性α-淀粉酶淀粉酶催化域是专利申请PCT/US05/46725(通过引用并入本文)中公开的任何α-淀粉酶催化域，且优选催化域源自其中公开的任何菌种，特别地选自由如下组成的组：细毛嗜热霉(Thermomyceslanuginosus)，特别是具有PCT/US05/46725(通过引用并入本文)的SEQ ID NO：14中氨基酸1-441的多肽；畸枝霉属的菌种(Malbranchea sp.)，特别是具有SEQ ID NO：18中氨基酸1-471的多肽；微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)，特别是具有SEQ ID NO：20中氨基酸1-450的多肽；Dichotomocladium hesseltinei，特别是具有SEQ ID NO：22中氨基酸1-445的多肽；韧革菌属的菌种(Stereum sp.)，特别是具有SEQ ID NO：26中氨基酸1-498的多肽；栓菌属的菌种(Trametes sp.)，特别是具有SEQ ID NO：28中氨基酸18-513的多肽；鲑贝革盖菌(Coriolus consors)，特别是具有SEQID NO：30中氨基酸1-507的多肽；刺杯毛孢属的菌种(Dinemasporium sp.)，特别是具有SEQ ID NO：32中氨基酸1-481的多肽；Cryptosporiopsis sp.，特别是具有SEQ ID NO：34中氨基酸1-495的多肽；色二孢属的菌种(Diplodiasp.)，特别是具有SEQ ID NO：38中氨基酸1-477的多肽；粘帚霉属的菌种(Gliocladium sp.)，特别是具有SEQ ID NO：42中氨基酸1-449的多肽；丛赤壳属的菌种(Nectria sp.)，特别是具有SEQ ID NO：115中氨基酸1-442的多肽；镰孢属的菌种(Fusarium sp.)，特别是具有SEQ ID NO：4中氨基酸1-480的多肽；具有SEQ ID NO：6中氨基酸1-478的多肽；或具有SEQ ID NO：117中氨基酸1-441的多肽；橙色嗜热子囊菌(Thermoascus auranticus)，特别是具有SEQ ID NO：125中氨基酸1-477的多肽；雅致枝霉(Thamindium elegans)，特别是具有SEQ ID NO：131中氨基酸1-446的多肽；冠毛犁头霉(Absidiacristata)，特别是具有SEQ ID NO：157中氨基酸41-481的多肽；枝顶孢霉属的菌种(Acremonium sp.)特别是具有SEQ ID NO：159中氨基酸22-626的多肽；Coniochaeta sp.，特别是具有SEQ ID NO：161中氨基酸24-630的多肽；Meripilus giganteus，特别是具有SEQ ID NO：163中氨基酸27-602的多肽；青霉属的菌种(Penicillium sp.)，特别是具有SEQ ID NO：165中氨基酸21-643的多肽；淤泥链霉菌(Streptomyces limosus)，特别是具有SEQ ID NO：167中氨基酸29-566的多肽；Subulispora procurvata，特别是具有SEQ ID NO：169中氨基酸22-613的多肽；总状共头霉(Syncephalastrum racemosum)，特别是具有SEQ ID NO：171中氨基酸21-463的多肽；皱褶栓菌(Trametescurrugata)，特别是具有SEQ ID NO：173中氨基酸21-587的多肽；Trichophaeasaccata，特别是具有SEQ ID NO：175中氨基酸30-773的多肽；Valsariarubricosa，特别是具有SEQ ID NO：177中氨基酸22-586的多肽；Valsariaspartii，特别是具有SEQ ID NO：179中氨基酸20-582的多肽。还优选的是α-淀粉酶淀粉酶催化域，其具有与上述多肽同源的序列。
最优选地，杂合体包含专利申请PCT/US05/46725(通过引用并入本文)中公开的CBM，优选地CBM来自选自下组的葡糖淀粉酶：Pachykytosporapapayracea(SEQ ID NO：76)、环带栓菌(Trametes cingulata)(SEQ ID NO：78)、大白桩菇(Leucopaxillus gigantus)(SEQ ID NO：80)、罗耳阿太菌(Athelia rolfsii)(SEQ ID NO：92)、川地曲霉(SEQ ID NO：94)、黑曲霉(SEQ ID NO：96)或来自选自下组的α-淀粉酶：PCT/US05/46725(通过引用并入本文)中的Trichopheraea saccata(SEQ ID NO：52)、Subulispora provurvata(SEQ ID NO：82)、Valsariarubricosa(SEQ ID NO：84)、枝顶孢霉属的菌种(SEQ ID NO：86)、Meripilus giganteus(SEQ ID NO：88)、Anoxybacillus contaminans(SEQ ID NO：90)、Coniochaetasp.(SEQ ID NO：98)、Coniochaetasp.(SEQ ID NO：137)、皱褶栓菌(Trametes corrugata)(SEQ ID NO：139)、Valsariospartii(SEQ ID NO：141)和青霉属的菌种(SEQ ID NO：143)。还优选的是与上述序列中的任一个同源的序列。
还优选用于本发明的是专利申请PCT/US05/46725中公开的V001、V002、V003、V004、V005、V006、V007、V008、V009、V010、V011、V012、V013、V014、V015、V016、V017、V018、V019、V021、V022、V023、V024、V025、V026、V027、V028、V029、V030、V031、V032、V033、V034、V035、V036、V037、V038、V039、V040、V041、V042、V043、V047、V048、V049、V050、V051、V052、V054、V055、V057、V059、V060、V061、V063、V064、V065、V066、V067、V068和V069，并且通过引用并入本文。还优选的是与上述序列中的任一个同源的序列。
更优选的是包含CBM的真菌α-淀粉酶，其中真菌α-淀粉酶催化域是与SEQ ID NO：4的氨基酸13至450具有至少70％同源性的氨基酸序列，其优选来自微小根毛霉和/或真菌CBM是与SEQ ID NO：2的氨基酸488至595具有至少70％同源性的氨基酸序列，优选源自黑曲霉的菌株的序列，优选源自黑曲霉葡糖淀粉酶的序列。
最优选地，包含CBM的真菌α-淀粉酶是PCT/US05/46725中公开的杂合体V039，其包含来自微小根毛霉α-淀粉酶的CD和来自黑曲霉葡糖淀粉酶的接头和CBM，并具有如本文SEQ ID NO：2中氨基酸13-595所示的序列。
可以以0.001至1.0mg/g DS的量，优选以0.01至0.5mg/g DS的量，更优选以0.02至0.2mg/g DS的量使用真菌α-淀粉酶。以AFAU测量，可以以0.01-10AFAU/g DS的量，以0.05-2.5AFAU/g DS的量，或更优选以0.1-1AFAU/g DS，如大约0.5AFAU/g DS的量使用真菌α-淀粉酶。
葡糖淀粉酶
术语“葡糖淀粉酶活性”表示葡聚糖1，4-α-葡萄糖苷酶，其连续从链的非-还原末端水解末端1，4-连接的α-D-葡萄糖残基，释放β-D-葡萄糖，其属于EC 3.2.1.3酶类。
用于本发明方法的葡糖淀粉酶可以具有PCT/US05/46724的SEQ IDNO：2中公开的氨基酸序列，并在本文显示为SEQ ID NO：3或与SEQ ID NO：3具有至少70％、优选至少75％、或至少80％、或至少85％、或90％、或至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或甚至至少99％同一性。葡糖淀粉酶可以优选源自环带栓菌。
可选择地，用于本发明方法的葡糖淀粉酶可以具有PCT/US05/01147作为SEQ ID NO：2的氨基酸残基1至561显示的氨基酸序列，或与所述SEQ IDNO：2(氨基酸残基1至561)具有至少70％、优选至少75％、或至少80％、或至少85％、或90％、或至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或甚至至少99％同一性的氨基酸序列。葡糖淀粉酶可以优选源自罗耳阿太菌。
还优选的是WO 99/28448中公开的源自Talaromyces emersonii的葡糖淀粉酶和Boel等，(1984)，EMBO J.3(5)p.1097-1102中公开的源自黑曲霉的葡糖淀粉酶。黑曲霉葡糖淀粉酶可从Novozymes A/S作为Sprizyme PlusTM和Sprizyme FuelTM获得。
可以以0.01至2.0mg/g DS的量，优选以0.05至1.0mg/g DS的量，更优选以0.1至0.5mg/g DS的量使用葡糖淀粉酶。以AGU测量，可以以0.01-10AGU/gDS的量，以0.05-2.5AGU/g DS的量，或更优选以0.1-1AGU/g DS，如约0.5AGU/g DS的量使用葡糖淀粉酶。
蛋白酶
根据本发明的方法，可以在糖化和/或发酵期间还提供蛋白酶。
在优选的实施方案中，蛋白酶是微生物来源的酸性蛋白酶，优选真菌或细菌来源的。
合适的蛋白酶包括微生物蛋白酶，如真菌和细菌蛋白酶。优选的蛋白酶是酸性蛋白酶，即，蛋白酶，其特征为在酸性条件(低于pH7，优选3.5至6，或更优选4至5)下水解蛋白的能力。
期望的酸性真菌蛋白酶包括源自如下的真菌蛋白酶：曲霉属、毛霉属(Mucor)、根霉属(Rhizopus)、念珠菌属(Candida)、革盖菌属(Coriolus)、内座壳属(Endothia)、Enthomophtra、耙菌属(Irpex)、青霉属(Penicillium)、小核菌属(Sclerotium)和球拟酵母属(Torulopsis)的真菌蛋白酶。特别期望的是源自黑曲霉(参见例如，Koaze等，(1964)，Agr.Biol.Chem.Japan，28，216)、斋藤曲霉(Aspergillus saitoi)(参见例如，Yoshida，(1954)J.Agr.Chem.Soc.Japan，28，66)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)(Hayashida等，(1977)Agric.Biol.Chem.，42(5)，927-933)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)(WO95/02044)或米曲霉(Aspergillus oryzae)，如pepA蛋白酶；以及来自微小毛霉(Mucorpusillus)或米黑毛霉(Mucormiehei)的酸性蛋白酶。
期望的还有中性或碱性蛋白酶，如源自芽孢杆菌属的菌株的蛋白酶。特别预期用于本发明的蛋白酶源自解淀粉芽孢杆菌并具有可在Swissprot作为 登录号P06832获得的序列。还期望的是与可在Swissprot作为登录号P06832获得的氨基酸序列具有至少90％同一性，如至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或特别是至少99％的同一性的蛋白酶。
进一步期望的是与WO 2003/048353中作为SEQ.ID.NO：1公开的氨基酸序列具有至少90％同一性，如至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或特别是至少99％的同一性的蛋白酶。
还期望的是木瓜蛋白酶-样蛋白酶，如E.C.3.4.22.*(半胱氨酸蛋白酶)之内的蛋白酶，如EC 3.4.22.2(木瓜蛋白酶)、EC 3.4.22.6(木瓜凝乳蛋白酶(chymopapain))、EC 3.4.22.7(萝蘼蛋白酶(asclepain))、EC 3.4.22.14(actinidain)、EC 3.4.22.15(组织蛋白酶(cathepsin)L)、EC 3.4.22.25(甘氨酰内肽酶(glycyl endopeptidase))和EC 3.4.22.30(caricain)。
可以以0.1-1000AU/kgdm，优选1-100AU/kg DS和最优选5-25AU/kgDS的量添加蛋白酶。
其它成分
在糖化和/或发酵期间可以提供其它成分以增加本发明方法的有效性。例如，营养物(例如发酵生物体微量营养物)、抗生素、盐(例如锌盐或镁盐)、其它酶如肌醇六磷酸酶、纤维素酶、半纤维素酶、外切和内切葡聚糖酶以及木聚糖酶。
发酵产物的回收
在发酵后可任选地回收发酵产物，如乙醇。可以通过任何常规方式(例如蒸馏)来进行回收。
本文中描述和要求保护的本发明不局限于本文公开的具体实施方案的范围，因为这些实施方案意欲作为本发明的几个方面的说明。任何等同的实施方案意欲在本发明的范围之内。实际上，从前面的说明，除本文显示和描述的那些之外，本发明的各种修饰对于本领域的那些技术人员是显而易见的。这些修饰也意欲落入所附权利要求的范围内。在冲突的情况下，以包括定义的本公开为准。
本文引用了各种参考文件，其公开内容通过引用整体并入。
材料与方法
葡糖淀粉酶：
酸性细菌α-淀粉酶(ABAA)源自Anoxybacillus contaminans并具有SEQ IDNO：1中所示的序列。
酸性真菌α-淀粉酶(AFAA)包含微小根毛霉α-淀粉酶催化域和黑曲霉葡糖淀粉酶接头和CBM并具有SEQ ID NO：2中所示的序列。
源自黑曲霉的葡糖淀粉酶在Boel等，(1984)，EMBO J.3(5)p.1097-1102中公开并且可从Novozymes A/S获得。
葡糖淀粉酶源自环带栓菌并且具有SEQ ID NO：3中所示的序列。
酵母：Red StarTM可以从Red Star/Lesaffre，USA获得。
同源性/同一性
在本发明的上下文中，多肽“同一性”指两个氨基酸序列之间的同一性程度。可通过本领域已知的计算机程序，如GCG程序包(Program Manual forthe Wisconsin Package，8版，1994年8月，Genetics Computer Group，575 ScienceDrive，Madison，Wisconsin，USA 53711)(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)Journal of Molecular Biology，48，443-453)中提供的GAP合适地确定同一性。使用多肽序列比较的下列设置：GAP产生罚分为3.0和GAP延伸罚分为0.1。术语“同源序列”用于表征与已知序列具有至少70％、优选至少75％、或至少80％、或至少85％、或90％、或至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或甚至至少99％同一性的序列。用于同源性确定的氨基酸序列的相关部分是成熟多肽，即没有信号肽。
α-淀粉酶活性(KNU)
可使用马铃薯淀粉作为底物来确定淀粉分解活性。该方法基于改性马铃薯淀粉通过酶的分解，并通过将淀粉/酶溶液的样品与碘溶液混合来跟踪反应。起初，形成蓝黑色，但是在淀粉分解过程中，蓝色变弱并逐渐变为红褐色，其与有色的玻璃标准物相比。
将一个Kilo Novo α-淀粉酶单位(KNU)定义为在标准条件下(即在37℃+/-0.05；0.0003 M Ca2+；和pH5.6)将5260mg淀粉干物质Merck Amylumsolubile糊精化的酶量。
更详细描述该分析方法的文件夹EB-SM-0009.02/01可根据向NovozymesA/S，Denmark要求而获得，所述文件夹通过引用并入本文。
酸性α-淀粉酶活性
当根据本发明使用时，任何酸性α-淀粉酶的活性可以以AFAU(酸性真菌α-淀粉酶单位)测量。可选择地，酸性α-淀粉酶的活性可以以AAU(酸性α-淀粉酶单位)测量。
酸性α-淀粉酶单位(AAU)
可以以AAU(酸性α-淀粉酶单位)测量酸性α-淀粉酶活性，这是一种绝对(absolute)方法。一个酸性淀粉酶单位(AAU)是在标准化的条件下，每小时将1g淀粉(100％干物质)转化为产物的酶量，所述产物在与已知强度(strength)的碘溶液反应后在620nm处具有与颜色参照之一等同的发射(transmission)。
标准条件/反应条件：
底物：         可溶性淀粉浓度约20g DS/L.
缓冲液：       柠檬酸盐，约0.13M，pH＝4.2
碘溶液：       40.176g碘化钾+0.088g碘/L
自来水         15°-20°dH(德国硬度(German degree hardness))
pH：           4.2
温育温度：     30℃
反应时间：        11分钟
波长：            620nm
酶浓度：          0.13-0.19AAU/mL
酶工作范围：      0.13-0.19AAU/mL
淀粉应为Lintner淀粉，其为在实验室中用作比色指示剂的稀糊淀粉(thin-boiling starch)。通过将天然淀粉用稀盐酸处理，使其保持与碘生成蓝色的能力，从而获得Lintner淀粉。进一步细节可以在欧洲专利No.140410中找到，其公开通过引用并入本文。
酸性α-淀粉酶活性(AFAU)
可以以AFAU(酸性真菌α-淀粉酶单位)测量酸性α-淀粉酶活性，其相对于酶标准物确定。将1FAU定义为在下述标准条件下每小时降解5.260mg淀粉干物质的酶量。
酸性α-淀粉酶，一种内切-α-淀粉酶(1，4-α-D-葡聚糖-葡聚糖水解酶，E.C.3.2.1.1)，水解淀粉分子内部区中的α-1，4-糖苷键以形成不同链长的糊精和寡糖。与碘形成的颜色的强度与淀粉浓度成正比。使用反向比色法在特定的分析条件下测定淀粉浓度的减少作为淀粉酶活性。
Figure A200780021874D00191
λ＝590nm
蓝/紫 t＝23秒 脱色
标准条件/反应条件：
底物：      可溶性淀粉约0.17g/L
缓冲液：    柠檬酸盐，约0.03M
碘(I2)：    0.03g/L
CaCl2：     1.85mM
pH：        2.50±0.05
温育温度：  40℃
反应时间：  23秒
波长：      590nm
酶浓度：    0.025AFAU/mL
酶工作范围：0.01-0.04AFAU/mL
更详细描述该分析方法的文件夹EB-SM-0259.02/01可根据向NovozymesA/S，Denmark要求而获得，所述文件夹通过引用并入本文。
葡糖淀粉酶活性
可以以AGI单位测量或以淀粉葡萄糖苷酶单位(AGU)测量葡糖淀粉酶活性。
葡糖淀粉酶活性(AGI)
葡糖淀粉酶(等同于淀粉葡萄糖苷酶)将淀粉转化为葡萄糖。在此通过用于活性测定的葡萄糖氧化酶方法来确定确定葡萄糖的量。该方法在AmericanAssociation of Cereal Chemists，2000；ISBN：1-891127-12-8中，于“Approvedmethods of the American Association of Cereal Chemists”.Vol.1-2AACC中的76-11节“淀粉-葡糖淀粉酶方法及用葡萄糖氧化酶进行葡萄糖的后续测量”中描述。
一个葡糖淀粉酶单位(AGI)是在该方法的标准条件下每分钟形成1微摩葡萄糖的酶量。
标准条件/反应条件：
底物：                可溶性淀粉，浓度约16g干物质/L.
缓冲液：              乙酸盐，约0.04M，pH＝4.3
pH：                  4.3
温育温度：            60℃
反应时间：            15分钟
反应的终止：          NaOH至约0.2g/L的浓度(pH～9)
酶浓度：              0.15-0.55AAU/mL.
淀粉应该是Linter淀粉，这是在实验室中用作比色指示剂的稀糊淀粉。将天然淀粉用稀盐酸处理，使其保持与碘生成蓝色的能力，从而获得Lintner淀粉。
葡糖淀粉酶活性(AGU)
将Novo葡糖淀粉酶单位(AGU)定义为在标准条件下每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶量，所述标准条件为37℃、pH 4.3，底物：麦芽糖23.2mM，缓冲液：乙酸盐0.1M，反应时间为5分钟。
可以使用自动分析系统。向葡萄糖脱氢酶试剂中加入变旋酶(mutarotase)，从而将存在的任何α-D-葡萄糖转化成β-D-葡萄糖。在上述反应中，葡萄糖脱氢酶特异性地与β-D-葡萄糖反应形成NADH，使用光度计在340nm处测定形成的NADH，作为测定起始葡萄糖浓度的量度。
AMG温育：
底物：                  麦芽糖23.2mM
缓冲液：                乙酸盐0.1M
pH：                    4.30±0.05
温育温度：              37℃±1
反应时间：              5分钟
酶工作范围：            0.5-4.0AGU/mL
显色反应：
GlucDH：                430U/L
变旋酶：                9U/L
NAD：                   0.21mM
缓冲液：                磷酸盐0.12M；0.15M NaCl
pH：                    7.60±0.05
温育温度：              37℃±1
反应时间：              5分钟
波长：                  340nm
更详细描述这种分析方法的文件夹(EB-SM-0131.02/01)可根据向Novozymes A/S，Denmark要求而获得，所述文件夹通过引用并入本文。
蛋白水解活性(AU)
可以用变性血红蛋白作为底物来确定蛋白水解活性。在用于确定蛋白水解活性的Anson-Hemoglobin方法中，消化变性的血红蛋白，并用三氯乙酸(TCA)沉淀未消化的血红蛋白。用酚试剂确定TCA可溶产物的量，所述酚试剂与酪氨酸和色氨酸显蓝色。
将一个Anson单位(AU)定义为在标准条件(即25℃、pH 7.5和10分钟反应时间)下以初始速率消化血红蛋白，使得每分钟释放一定量的TCA可溶产物的酶量，所述可溶产物与酚试剂给出与一毫当量(milliequivalent)酪氨酸相同的颜色。
更详细描述这种分析方法的文件夹AF4/5可根据向Novozymes A/S，Denmark要求而获得，所述文件夹通过引用并入本文。
实施例1：
从194.44g粉碎的玉米(corn)(90％小于0.5mm)，305.56g 37mM NaOAc，0.025％叠氮化钠，20mM CaCl2，pH 4.5制备35％DS浆料。用5N NaOH将pH调节至4.5并将浆料在室温搅拌温育一小时。对于每个反应将5g浆料加入20ml管，并在添加酶之前将管在32℃温育一小时。在每个管中添加适量的酶，如表1所示，加盖并立即涡旋。将管在32℃温育并在0.5、1、2、3和4小时时涡旋。在4小时处通过添加50micrL 40％H2SO4终止反应。每个反应重复进行三次。样本制备包括将上清液离心并将其通过0.45微米滤器过滤。将等待HPLC分析的样本保存于4℃。HPLC结果在下面表1中显示。
Figure A200780021874D00221
实施例2
将磨碎的玉米410g(90％小于0.5mm)与590g自来水(tap water)、3.0mL 1g/L青霉素和1g尿素混合。用5N NaOH将pH调节至4.5。DS水平确定为35％。对于每个反应将5g此浆料加入20ml管中。根据表2或3在每个管中添加适量的酶，接着添加200microL酵母增殖物/5g发酵物，然后在32℃温育。每个处理进行9次重复发酵。在24小时、48小时和70小时时间点选择3个重复进行分析。将管在24、48和70小时时涡旋。时间点分析包括管称重和为HPLC准备样本。HPLC准备包括通过添加50microL 40％H2SO4终止反应、离心和通过0.45um滤器过滤。将等待HPLC分析的样本保存在4℃。HPLC结果在表2中显示。
Figure A200780021874D00231
序列表
<110>诺维信公司(NOVOZYMES A/S)
<120>用于产生淀粉水解物的方法
<130>10908.204-WO
<160>3
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>619
<212>PRT
<213>Anoxybacillus contaminans
<220>
<221>信号
<222>(1)..(31)
<220>
<221>CD
<222>(32)..(520)
<220>
<221>CBD
<222>(521)..(619)
<400>1
Figure A200780021874D00241
Figure A200780021874D00251
<210>2
<211>595
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>杂化蛋白
<220>
<221>信号
<222>(1)..(12)
<220>
<221>CD
<222>(13)..(450)
<220>
<221>接头
<222>(451)..(487)
<220>
<221>CBD
<222>(488)..(595)
<400>2
Figure A200780021874D00262
Figure A200780021874D00271
Figure A200780021874D00281
<210>3
<211>574
<212>PRT
<213>环带栓菌(Trametes cingulata)
<220>
<221>成熟肽(mat_eptide)
<222>(19)..(574)
<400>3
Figure A200780021874D00282
Figure A200780021874D00291

Claims (31)

1.一种方法，其包括使用如下物质将颗粒状淀粉糖化：
a)葡糖淀粉酶，
b)包含碳水化合物结合模块(CBM)的细菌α-淀粉酶，和，
c)包含CBM的真菌α-淀粉酶，
以产生淀粉水解物。
2.权利要求1的方法，还包括将所述淀粉水解物与发酵生物体接触以产生发酵产物。
3.权利要求1或2中任一项的方法，其中糖化和发酵同时进行。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中在发酵后回收所述发酵产物。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述发酵产物是醇，优选乙醇，尤其是燃料乙醇，可饮用乙醇和/或工业乙醇。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述包含CBM的真菌α-淀粉酶和/或包含CBM的细菌α-淀粉酶是酸性真菌α-淀粉酶和/或酸性细菌α-淀粉酶。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述包含CBM的真菌α-淀粉酶和/或包含CBM的细菌α-淀粉酶是包含CBM的野生型酶或野生型酶的遗传修饰的变体。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述包含CBM的真菌α-淀粉酶源自川地曲霉的菌株。
9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述包含CBM的细菌α-淀粉酶源自黄热芽孢杆菌的菌株。
10.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述包含CBM的真菌α-淀粉酶和/或包含CBM的细菌α-淀粉酶是杂合酶，优选包含α-淀粉酶催化域(CD)和碳水化合物结合模块(CBM)和任选的接头的杂合酶。
11.权利要求1-10中任一项的方法，其中所述真菌α-淀粉酶催化域是与SEQ ID NO：4的13至450位氨基酸具有至少70％同源性的氨基酸序列，优选源自微小根毛霉。
12.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述真菌CBM是与SEQ IDNO：2的488至595位氨基酸具有至少70％同源性的氨基酸序列，优选源自黑曲霉的菌株的序列，优选源自黑曲霉淀粉葡萄糖苷酶的序列。
13.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述包含CBM的真菌α-淀粉酶是与SEQ ID NO：2的13至595位的氨基酸具有至少70％同源性的氨基酸序列。
14.权利要求1-13中任一项的方法，其中所述细菌α-淀粉酶催化域是与SEQ ID NO：1的32至520位的氨基酸具有至少70％同源性的氨基酸序列。
15.权利要求1-14中任一项的方法，其中所述细菌α-淀粉酶催化域和/或CBM源自黄热芽孢杆菌。
16.权利要求1-15中任一项的方法，其中所述细菌CBM是与SEQ IDNO：1的521至619位氨基酸具有至少70％同源性的氨基酸序列。
17.权利要求1-16中任一项的方法，其中所述葡糖淀粉酶源自罗耳阿太菌(Althea rolfsii)、环带栓菌或黑曲霉。
18.权利要求1-17中任一项的方法，其中所述方法在存在蛋白酶或肌醇六磷酸酶的条件下进行。
19.权利要求1-18中任一项的方法，其中所述含淀粉的材料从块茎、根、茎、果实或全谷物中获得。
20.权利要求1-19中任一项的方法，其中所述含淀粉的材料从谷类中获得。
21.权利要求1-20中任一项的方法，其中所述含淀粉的材料从玉米、穗轴、小麦、大麦、黑麦、买罗高粱、西米、木薯(cassava)、树薯、木薯(tapioca)、高梁、稻或马铃薯中获得。
22.权利要求1-21中任一项的方法，其中所述方法在3-7，优选3.5-6或更优选4-5的pH进行。
23.权利要求1-22中任一项的方法，其中干固体含量(DS)为20-55wt.-％，优选25-40wt.-％，更优选30-35wt.-％的范围。
24.权利要求1-23中任一项的方法，其中在糖化和发酵期间将糖浓度保持在约3wt.％以下或低于约3wt.％的水平。
25.权利要求1-24中任一项的方法，其中通过将含淀粉材料粉碎至0.1-0.5mm的粒度来制备粉碎的含淀粉材料。
26.权利要求1-25中任一项的方法，其中所述粉碎的含淀粉材料是通过干磨或湿磨获得的颗粒状淀粉。
27.权利要求1-26中任一项的方法，其中所述粉碎的含淀粉材料是全谷物。
28.权利要求1-27中任一项的方法，其中在发酵期间的温度为28℃-36℃，例如29℃-35℃，例如30℃-34℃，例如大约32℃。
29.适合糖化颗粒状淀粉的组合物，所述组合物包含含有碳水化合物结合模块(CBM)的细菌α-淀粉酶，以及含有CBM的真菌α-淀粉酶。
30.权利要求29的组合物，其还包含葡糖淀粉酶。
31.权利要求29或30中任一项的组合物，其还包含一种或多种选自下组的酶：蛋白酶、肌醇六磷酸酶、纤维素酶、半纤维素酶、外切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶，和木聚糖酶。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102894199A (zh) * 2011-07-29 2013-01-30 上海新农饲料有限公司 乳猪饲料组合物和含有该猪饲料组合物的饲料及其方法
CN103298359A (zh) * 2010-11-08 2013-09-11 诺维信公司 具有葡糖淀粉酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
CN103298932A (zh) * 2010-11-08 2013-09-11 诺维信公司 具有葡糖淀粉酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
CN103314025A (zh) * 2010-10-29 2013-09-18 路博润高级材料公司 水性阳离子聚氨酯分散体
CN109072267A (zh) * 2015-12-21 2018-12-21 丹尼斯科美国公司 改善的颗粒状淀粉转化酶和方法

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100489108C (zh) * 2008-01-04 2009-05-20 中粮集团有限公司 采用薯类原料制备乙醇的方法
CN101960015A (zh) * 2008-03-11 2011-01-26 丹尼斯科美国公司 在糖化过程中的葡糖淀粉酶和布丘氏菌植酸酶
BRPI0912291A2 (pt) * 2008-05-29 2015-08-04 Danisco Us Inc Processo para produção de coproduto e álcool a partir de sorgo em grão
WO2010124206A1 (en) 2009-04-24 2010-10-28 Novozymes North America, Inc. Antistaling process for flat bread
EP2507372B1 (en) 2009-11-30 2015-02-25 Novozymes A/S Polypeptides having glucoamylase activity and polynucleotides encoding same
CN102869770B (zh) * 2009-11-30 2015-12-16 诺维信公司 具有葡糖淀粉酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
CA2782036C (en) 2009-12-01 2019-01-15 Novozymes A/S Polypeptides having glucoamylase activity and polynucleotides encoding same
MX338068B (es) 2010-04-14 2016-04-01 Novozymes As Polipeptidos que tienen actividad de glucoamilasa y polinucleotidos que codifican los mismos.
WO2011154529A1 (en) * 2010-06-11 2011-12-15 Novozymes A/S Enzymatic flour correction
CN102020856B (zh) * 2010-11-15 2012-06-27 中国地质大学（武汉） 一种酶法回收魔芋飞粉中葡甘聚糖和蛋白质的方法
ES2656556T3 (es) 2011-09-06 2018-02-27 Novozymes A/S Variantes de glucoamilasa y polinucleótidos que codifican las mismas
DK2766476T3 (en) 2011-10-11 2017-08-28 Novozymes As GLUCOAMYLASE VARIETIES AND POLYNUCLEOTIDES CODING THEM
CA2861678C (en) 2011-10-11 2021-02-16 Novozymes North America, Inc. Processes for producing fermentation products
US9334516B2 (en) 2013-03-14 2016-05-10 Abengoa Bioenergy New Technologies, Inc. Method for adding enzymes to obtain high ethanol yield from cereal mash
CA2905303C (en) * 2013-04-05 2021-05-18 Novozymes A/S Method of producing a baked product with alpha-amylase, lipase and phospholipase
WO2014177541A2 (en) 2013-04-30 2014-11-06 Novozymes A/S Glucoamylase variants and polynucleotides encoding same
DK2992092T3 (en) 2013-04-30 2018-06-25 Novozymes As GLUCOAMYLASE VARIETIES AND POLYNUCLEOTIDES CODING THEM
US10450551B2 (en) 2013-08-30 2019-10-22 Novozymes A/S Enzyme composition and uses thereof
BE1022042B1 (nl) * 2014-09-29 2016-02-08 Puratos Nv Verbeterde cakebeslagsoorten
CN106795505A (zh) 2014-10-23 2017-05-31 诺维信公司 葡糖淀粉酶变体和编码它们的多核苷酸
CA3240979A1 (en) * 2021-12-16 2023-06-22 Robert I. Christensen Production of clean starch hydrolysates

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4316956A (en) 1980-02-06 1982-02-23 Novo Industri A/S Fermentation process
EP1641932B1 (en) 2003-06-25 2011-05-25 Novozymes A/S Process for the hydrolysis of starch
WO2005003311A2 (en) 2003-06-25 2005-01-13 Novozymes A/S Enzymes for starch processing
WO2005069840A2 (en) * 2004-01-16 2005-08-04 Novozymes North America, Inc Processes for producing a fermentation product
CA2592083C (en) 2004-12-22 2017-02-21 Novozymes A/S Hybrid enzymes consisting of an endo-amylase first amino acid sequence and a carbohydrate-binding module as second amino acid sequence
DK2365068T3 (en) 2004-12-22 2017-05-15 Novozymes As ENZYMER FOR PROCESSING STARCH

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103314025A (zh) * 2010-10-29 2013-09-18 路博润高级材料公司 水性阳离子聚氨酯分散体
CN103298359A (zh) * 2010-11-08 2013-09-11 诺维信公司 具有葡糖淀粉酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
CN103298932A (zh) * 2010-11-08 2013-09-11 诺维信公司 具有葡糖淀粉酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
CN103298359B (zh) * 2010-11-08 2016-01-06 诺维信公司 具有葡糖淀粉酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
CN103298932B (zh) * 2010-11-08 2016-08-10 诺维信公司 具有葡糖淀粉酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
CN102894199A (zh) * 2011-07-29 2013-01-30 上海新农饲料有限公司 乳猪饲料组合物和含有该猪饲料组合物的饲料及其方法
CN109072267A (zh) * 2015-12-21 2018-12-21 丹尼斯科美国公司 改善的颗粒状淀粉转化酶和方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2007144424A3 (en) 2008-02-14
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ES2336846T3 (es) 2010-04-16

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