ES2336846T3 - Procesos para la produccion de un hidrolizado de almidon. - Google Patents
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Abstract
Un proceso que comprende la sacarificación de un almidón granular con: a) una glucoamilasa, b) una alfa-amilasa bacteriana que comprende un módulo de unión de carbohidratos (CBM), y c) una alfa-amilasa fúngica que comprende un CBM, para producir un hidrolizado de almidón.
Description
Procesos para la producción de un hidrolizado de
almidón.
La presente invención relata un proceso mejorado
para la producción de un hidrolizado del almidón, p. ej. para el uso
en un proceso de fermentación.
La presente invención relata procesos para la
producción de un producto de fermentación a partir de almidón
granular.
Los granos, cereales o tubérculos de plantas
contienen almidón. El almidón está en forma de gránulos
microscópicos insolubles en agua a temperatura ambiente. Cuando una
mezcla acuosa de almidón se calienta, los gránulos se hinchan y
eventualmente estallan, dispersando las moléculas de almidón dentro
de la solución. Durante este proceso de gelatinización, se da un
aumento espectacular de viscosidad. Debido a que el nivel de sólidos
en un proceso típico industrial es aproximadamente el
30-40%, el almidón se tiene que diluir o
"licuar" para que se pueda manipular. Esta reducción de
viscosidad generalmente se logra por degradación enzimática en un
proceso denominado licuefacción. Durante la licuefacción, el almidón
de cadena larga se degrada en ramas menores y cadenas lineales de
unidades de glucosa (dextrinas) por una
alfa-amilasa.
Un proceso convencional de licuefacción
enzimática se puede llevar a cabo como un proceso de mezcla caliente
de tres fases. La mezcla se calienta hasta entre
80-85ºC y se añade alfa-amilasa
termoestable para iniciar la licuefacción. La mezcla se cocina
entonces a chorro de vapor a una temperatura de entre
105-125ºC para completar la gelatinización de la
mezcla, enfriada a 60-95ºC y, generalmente, se añade
alfa-amilasa adicional para finalizar la hidrólisis.
El proceso de licuefacción se lleva a cabo generalmente a pH entre 5
y 6.
Durante la sacarificación, las dextrinas de la
licuefacción se hidrolizan aún más para producir azúcares de
molécula baja DP_{1-3}, que se pueden metabolizar
por un organismo fermentador, tal como levadura. La hidrólisis se
lleva a cabo típicamente utilizando glucoamilasa, alternativamente o
además de glucoamilasas, se pueden utilizar
alfa-glucosidasas y/o alfa-amilasas
ácidas. Una fase completa de sacarificación dura típicamente hasta
72 horas, no obstante, es común hacer solamente una
presacarificacíón de, p. ej., 40-90 minutos a
una temperatura superior a 50ºC, seguida de una sacarificación
completa durante la fermentación en un proceso conocido como
sacarificación y fermentación simultánea (SFS).
La fermentación se lleva a cabo utilizando un
organismo fermentador, tal como levadura, que se añade a la masa.
Después se recupera el producto de fermentación. Para el etanol,
p. ej. el etanol combustible, potable o industrial, la
fermentación se lleva a cabo, típicamente durante
35-60 horas a una temperatura típicamente de
alrededor de 32ºC. Cuando el producto de la fermentación es cerveza,
la fermentación se lleva a cabo, típicamente durante un periodo de
hasta 8 días a una temperatura típicamente de alrededor de 14ºC.
Tras la fermentación, la masa se puede utilizar,
p. ej., como una cerveza, o destilada para recuperar etanol.
El etanol se puede utilizar como, p. ej., etanol combustible,
etanol potable, y/o etanol industrial.
Parecerá por la discusión anterior que la
hidrólisis de almidón en un proceso convencional es de un consumo
energético muy elevado debido a los diferentes requisitos de
temperatura durante las diferentes fases. Varias solicitudes de
patente abordan la cuestión proporcionando procesos para la
conversión de almidón granular en etanol sin la fase de
gelatinización de tan elevado consumo energético.
Las patentes estadounidenses nº. 4.316.956 y WO
2004/113551 proporcionan procesos de fermentación para la conversión
de almidón granular a etanol.
Las solicitudes WO 2005/003311 y PCT/US05/46725
proporcionan alfa-amilasas fúngicas útiles para la
conversión de almidón granular en azúcares fermentables, p. ej. para
la producción de etanol.
La solicitud PCT/DK2005/000819 proporciona
alfa-amilasas bacterianas útiles para la conversión
de almidón granular en azúcares fermentables, p. ej., para la
producción de etanol.
El objetivo de la presente invención es
proporcionar procesos mejorados para la conversión de materiales que
contienen almidón blanqueado, tal como el almidón granular.
La presente divulgación proporciona procesos
para producir un hidrolizado de almidón a partir de material que
contiene almidón sin la gelatinización de dicho material que
contiene almidón. El hidrolizado de almidón se puede utilizar, p.
ej. como un edulcorante o en la producción de un producto de
fermentación, tal como el etanol. Sorprendentemente los inventores
han descubierto que al combinar la acción de una
alfa-amilasa bacteriana que comprende un módulo de
unión de carbohidratos y la acción de una
alfa-amilasa fúngica que comprende un módulo de
unión de carbohidratos se consigue un aumento en el rendimiento en
comparación con el uso de una cantidad aumentada de una
alfa-amilasa bacteriana que comprende un módulo de
unión de carbohidratos o de una cantidad aumentada de una
alfa-amilasa fúngica que comprende un módulo de
unión de carbohidratos.
Por lo tanto en un primer aspecto, la invención
proporciona un proceso que comprende la sacarificación de un almidón
granular con: a) una glucoamilasa, b) una
alfa-amilasa bacteriana que comprende un módulo de
unión de carbohidratos (CBM), y, c) una alfa-amilasa
fúngica que comprende un CBM, para producir un hidrolizado de
almidón.
En una versión preferible el hidrolizado de
almidón del primer aspecto se pone más en contacto con un organismo
de fermentación para producir un producto de fermentación,
preferiblemente etanol. Preferiblemente la sacarificación y la
fermentación se llevan a cabo simultáneamente.
En un segundo aspecto, la invención proporciona
composiciones de una alfa-amilasa bacteriana que
comprende un módulo de unión de carbohidratos y la acción de una
alfa-amilasa fúngica que comprende un módulo de
unión de carbohidratos.
Antes de la sacarificación se prepara una mezcla
de material con contenido de almidón, tal como almidón granular, con
un 20-55% en peso de sólidos secos, preferiblemente
un 25-40% en peso de sólidos secos, más
preferiblemente un 30-35% de sólidos secos de
material con contenido de almidón. La mezcla puede incluir agua y/o
aguas de proceso, tales como residuos de elaboración (restos), agua
de lavado, condensado o destilado del evaporador, agua del extractor
lateral de la destilación, u otra agua de proceso de la planta de
productos de fermentación. Debido a que el proceso se lleva a cabo
por debajo de la temperatura de gelatinización y por tanto no tiene
lugar ningún aumento significativo de la viscosidad, se pueden
utilizar niveles altos de residuos de elaboración si se desea. La
mezcla acuosa puede contener desde aproximadamente un 1% hasta
aproximadamente un 70% en volumen de residuos de elaboración,
preferiblemente 15-60% en volumen de residuos de
elaboración, especialmente desde aproximadamente un 30% a un 50% en
volumen de residuos de elaboración.
A fin de exponer más superficie del material con
contenido de almidón, se muele. En una versión, el tamaño de la
partícula es de entre 0.05-3.0 mm, o al menos un 30%
del material molido con contenido de almidón pasa a través de un
tamiz con una pantalla de 0.05 a 3.0 mm. Después de someterse a tal
proceso al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos
un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos
un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos
un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, o preferiblemente al menos
un 99% de los sólidos secos del material con contenido de almidón o
del almidón del material con contenido de almidón se convierte en un
hidrolizado del almidón soluble.
El proceso de la presente divulgación se lleva a
cabo a una temperatura inferior a la temperatura inicial de la
gelatinización. El proceso se puede llevar a cabo como un proceso de
sacarificación y fermentación simultáneas. En tal caso el proceso se
lleva a cabo normalmente a una temperatura de entre 28ºC y 36ºC, tal
como de entre 29ºC y 35ºC, tal como de entre 30ºC y 34ºC, tal como a
aproximadamente 32ºC. La temperatura se puede ajustar hacia arriba o
hacia abajo durante la fermentación.
La sacarificación y fermentación simultáneas se
pueden llevar a cabo de modo que el nivel de azúcar, así como el
nivel de glucosa, se mantiene a un nivel bajo tal como por debajo de
aproximadamente un 3% en peso, preferiblemente por debajo de
aproximadamente un 2% en peso, más preferible por debajo de
aproximadamente un 1% en peso, incluso más preferible por debajo de
aproximadamente un 0.5%, o incluso más preferible por debajo de
aproximadamente un 0.1% en peso. Tales niveles bajos de azúcar se
pueden lograr simplemente empleando cantidades ajustadas de enzimas
y organismos de fermentación. Un experto en la técnica puede
determinar fácilmente las cantidades de enzimas y organismo de
fermentación a utilizar. Las cantidades empleadas de enzimas y
organismos de fermentación también se pueden seleccionar para
mantener concentraciones bajas de maltosa en el caldo de
fermentación. Por ejemplo, el nivel de maltosa se puede mantener por
debajo de aproximadamente un 0.5% en peso o por debajo de
aproximadamente un 0.2% en peso.
El proceso de la presente divulgación se puede
llevar a cabo a un pH en el rango de entre 3 y 7, preferiblemente de
3.5 a 6, o más preferiblemente de 4 a 5.
Se puede utilizar cualquier materia prima con
contenido de almidón adecuada que comprenda almidón granular:
ejemplos de materias primas con contenido de almidón, adecuados para
el uso en los procesos de la presente invención, incluyen
tubérculos, raíces, tallos, granos enteros, maíces, mazorcas, trigo,
cebada, centeno, milo, sagú, mandioca, tapioca, sorgo, guisantes de
arroz, alubias, o cereales, materias primas con contenido de
azúcares, tales como melazas, materiales de fruta, azúcar, caña o
remolacha azucarera, patatas, y materiales con contenido de
celulosa, tales como los residuos de la madera o planta. Se
contemplan ambos tipos cerosos y no cerosos de maíz y cebada.
El término "almidón granular" se refiere a
almidón crudo sin procesar, es decir, almidón en su forma natural en
cereales, tubérculos o granos. El almidón se forma dentro de células
vegetales como diminutos gránulos insolubles en agua. Cuando se
introducen en agua fría, los gránulos de almidón pueden absorber una
pequeña cantidad del líquido e hincharse. A temperaturas de hasta
50ºC a 75ºC el hinchamiento puede ser reversible. No obstante, a
temperaturas más altas comienza un hinchamiento irreversible
denominado "gelatinización". El almidón granular a procesar
puede ser un almidón de calidad altamente refinado, preferiblemente
de al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 97% o al menos un
99.5% puro o puede ser un material con contenido de almidón más
crudo comprendiendo grano entero molido incluyendo fracciones no
amiláceas tales como los residuos de germen y fibras.
La materia prima conteniendo de almidón, tal
como el grano entero, se muele a fin de abrir la estructura y
permitir su posterior procesamiento. Se prefieren dos procesos de
molienda: la molienda húmeda y la seca. En la molienda seca se usan
y muelen granos enteros. La molienda húmeda da una buena separación
de germen y harina (gránulos de almidón y proteína) y se aplica a
menudo en lugares donde el hidrolizado de almidón se usa en la
producción de jarabes. Tanto la molienda seca como la húmeda se
conocen bien en la técnica de procesamiento del almidón y se
contemplan igualmente para el proceso de la presente divulgación. El
tamaño de la partícula después de la molienda puede ser de entre
0.05 y 3.0 mm, o de modo que al menos un 30%, preferiblemente al
menos un 50%, más preferiblemente al menos un 70%, incluso más
preferiblemente al menos un 90% del material molido con conteniendo
almidón pase a través de un tamiz con una pantalla de 0.05 a 3.0 mm
y preferiblemente con una pantalla de 0.1-0.5
mm.
El término "temperatura inicial de
gelatinización" se refiere a la temperatura más baja en la que
comienza la gelatinización del almidón. El almidón que se calienta
en agua comienza a gelatinizarse a entre 50ºC y 75ºC; la temperatura
exacta de gelatinización depende del almidón en concreto, y la puede
determinar fácilmente el experto artesano. Así, la temperatura de
gelatinización inicial puede variar según las especies de planta, a
la variedad particular de las especies de la planta así como con las
condiciones de crecimiento. En el contexto de la presente
divulgación la temperatura inicial de gelatinización de un
determinado material con contenido de almidón es la temperatura a la
que se pierde la birrefringencia en un 5% de los gránulos de almidón
al utilizar el método que descrito por Gorinstein. S. y Lii. C.,
Starch/Stärke, vol. 44 (12) págs. 461-466
(1992).
El término "hidrolizado de almidón" se
refiere a los productos solubles de la degradación de los procesos
de hidrólisis de la invención. La hidrólisis del almidón puede
comprender mono-, di-, y oligosacáridos, tales como glucosa,
maltosa, maltodextrinas, ciclodextrinas y cualquier mezcla de éstas.
Preferiblemente al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%,
al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%,
al menos un 97% o al menos un 98% de los sólidos secos del almidón
granular se convierten en un hidrolizado del almidón soluble.
El término "producto de fermentación" se
refiere a un producto producido por un proceso que incluye una fase
de fermentación que usa un organismo de fermentación. Productos de
fermentación que se contemplan según la presente divulgación
incluyen alcoholes (p. ej., etanol, metanol, butanol); ácidos
orgánicos (p. ej., ácido cítrico, ácido acético, ácido
itacónico, ácido láctico, ácido glucónico); cetonas (p. ej.,
acetona); aminoácidos (p. ej., ácido glutámico); gases (p.
ej., H_{2} y CO_{2}); antibióticos (p. ej.,
penicilina y tetraciclina); enzimas; vitaminas (p. ej.,
riboflavina, B_{12}, beta-caroteno); y hormonas.
En una versión preferible el producto de fermentación es etanol,
p. ej., combustible de etanol; etanol potable, es decir,
licores neutral potables; o etanol industrial o productos que se
usan en la industria del alcohol consumible (p. ej., cerveza
y vino), industria láctea (p. ej., productos lácteos
fermentados), industria del cuero e industria de tabaco. Los tipos
de cerveza preferibles comprenden cerveza de cebada malteada,
cerveza negra, cerveza de malta tostada, lager, cerveza amarga,
cerveza de grano malteado, happoushu, cerveza con alto contenido de
alcohol, cerveza con bajo contenido de alcohol, cerveza baja en
calorías o cerveza light. Los procesos preferidos de fermentación
que se usan incluyen procesos de fermentación de alcohol, como bien
se conocen en la técnica. Los procesos preferidos de fermentación
son los procesos de fermentación anaeróbica, como bien se conocen en
la técnica.
El término "organismo de fermentación" se
refiere a cualquier organismo, incluyendo organismos bacterianos y
fúngicos, adecuados para el uso en un proceso de fermentación y
capaces de producir un producto de fermentación deseado. Los
organismos de fermentación especialmente adecuados son capaces de
fermentar, es decir, convertir azúcares, tales como la glucosa o la
maltosa, directa o indirectamente en el producto de fermentación
deseado. Ejemplos de organismos de fermentación incluyen organismos
fúngicos, tales como la levadura. La levadura preferible incluye
cepas de la Saccharomyces spp., y en particular la
Saccharomyces cerevisiae. Levaduras disponibles a nivel
comercial incluyen, p. ej., Red star^{TM}/Lesaffre Ethanol
Red (disponible de Red Star/Lesaffre, EEUU) FALI (disponible de
Fleischmann's Yeast, una división de Burns Philp Food Inc., EEUU),
SUPERSTART (disponible de Alltech), GERT STRAND (disponible de Gert
Strand AB, Suecia) y FERMIOL (disponible de especialidades DSM).
Según la invención una
alfa-amilasa fúngica que comprende un CBM y una
alfa-amilasa bacteriana que comprende un CBM se
aplican en el proceso de la invención. En una versión preferible la
alfa-amilasa es una alfa-amilasa
ácida, p. ej., alfa-amilasa de ácido fúngico
o alfa-amilasa de ácido bacteriano. El término
"alfa-amilasa ácida" se refiere a una
alfa-amilasa (E.C. 3.2.1.1) que añadida en una
cantidad eficaz tiene actividad óptima a un pH en el rango de 3 a 7,
preferiblemente de 3.5 a 6, o más preferiblemente de
4-5.
Por el término una
"alfa-amilasa bacteriana comprendiendo un CBM"
se refiere a una enzima que comprende un dominio catalítico y un
CBM, siendo dicho dominio catalítico y dicho CBM ambos derivados de
una fuente bacteriana. La alfa-amilasa bacteriana
comprendiendo un CBM puede ser una enzima bacteriana de tipo
salvaje, un variante de tal enzima bacteriana de tipo salvaje, o una
enzima híbrida comprendiendo un dominio catalítico de
alfa-amilasa bacteriana y un CBM bacteriano. El
dominio catalítico de alfa-amilasa bacteriana y/o el
CBM bacteriano se puede derivar del género Bacillus o del
género Anoxybacillus.
Se prefiere para la invención cualquier
alfa-amilasa bacteriana que comprenda un CBM, ambos
híbridos y de tipo salvaje, donde el CBM tiene la secuencia que se
muestra como los aminoácidos 521-619 en la SEC ID
nº:1 aquí o el CBM tiene una secuencia al menos un 70% homologa a
dicha secuencia.
También se prefiere para la invención cualquier
alfa-amilasa bacteriana que comprenda un CBM, ambos
híbridos y de tipo salvaje, donde el dominio catalítico tiene la
secuencia que se muestra como los aminoácidos 32-520
en la SEC ID nº: 1 aquí o el dominio catalítico tiene una secuencia
al menos un 70% homologa a dicha secuencia.
La alfa-amilasa bacteriana que
comprende un CBM puede comprender un dominio catalítico derivado de
una cepa de B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B.
subtilis o B. stearothermophilus, pero también puede
derivar de otro Bacillus sp. Ejemplos específicos de dominios
catalíticos de alfa-amilasa que se contemplan
incluyen un dominio catalítico de amilasa con al menos un 60%, al
menos un 70%, al menos un 80% o incluso al menos un 90% de identidad
con la amilasa de Bacillus licheniformis (BLA) que se muestra
en la SEC ID nº: 35, la variante LE429 de B. licheniformis
que se muestra en la SEC ID nº: 41, la amilasa de B.
stearothermophilus (BSG) que se muestra en la SEC ID nº: 36, la
amilasa de B. amyloliquefaciens (BAN) que se muestra en la
SEC ID nº: 37, la amilasa de B. halodurance SP722 que se
muestra en la SEC ID NO:38, la amilasa SP690 que se muestra en la
SEC ID nº: 39, la amilasa AA560 que se muestra en la secuencia ID:
40 en la solicitud de la patente PCT/DK2005/000819. El dominio
catalítico también se puede derivar de una amilasa de Pseudomonas
saccharofilia, tal como de la amilasa que se divulga como SEC ID
nº: 1 en WO 04/111217.
La alfa-amilasa bacteriana que
comprende un CBM puede ser una enzima que comprende un dominio
catalítico con un grado de identidad de al menos un 70%,
preferiblemente al menos un 80%, más preferiblemente al menos un
85%, incluso más preferiblemente al menos un 90%, tal como al menos
un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos
un 99% de identidad con cualquiera de las secuencias que se muestran
en la SEC ID nº: 1, 2 ó 3 en WO 99/19467. El dominio catalítico de
la alfa-amilasa Bacillus también puede ser
una secuencia variante y/o híbrida, especialmente una que se
describe en cualquiera de WO 96/23873, WO 96/23874, WO 97/41213, WO
99/19467, WO 00/60059, y WO 02/10355. Las variantes especificas de
alfa-amilasa que se contemplan se divulgan en las
patentes estadounidenses nº.: 6.093.562, 6.187.576, y 6.297.038 e
incluyen variantes de alfa-amilasa de Bacillus
stearothermophilus (BSG alfa-amilasa) con una
supresión doble divulgada en WO 96/23873 - véase p. ej., la
página 20, líneas 1-10, que preferiblemente
corresponden a la delta (181-182) que se compara con
la secuencia de aminoácidos de la alfa-amilasa BSG
de tipo salvaje que se expone en la SEC ID nº: 7 que se divulga en
WO 99/19467. Aún más preferibles son los dominios catalíticos de la
alfa-amilasa de Bacillus, especialmente la
alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus,
que tienen una supresión doble correspondiente a delta
(181-182) y además comprenden una sustitución de la
N193F (también denominada I181* + G182* + N193F) comparada con la
secuencia de amino ácidos de alfa-amilasa BSG de
tipo salvaje que se expone en SEC ID nº: 3 que se divulga en WO
99/19467.
Una alfa-amilasa bacteriana que
comprende un CBM particularmente preferible es un tipo salvaje de
alfa-amilasa bacteriana que deriva de una cepa de
Anoxibacillus contaminans. Preferiblemente la
alfa-amilasa bacteriana que comprende un CBM tiene
la secuencia que se muestra aquí en la SEC ID nº: 1. También son
preferibles los polipéptidos que tienen al menos un 70% de
identidad, así como al menos un 80% o incluso al menos un 90% de
identidad, así como al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un
97%, al menos un 98%, o al menos un 99% de identidad con la SEC ID
nº: 1. De forma alternativa la alfa-amilasa
bacteriana que comprende un CBM es una de las enzimas híbridas que
se divulga en PCT/DK2005/000819 como la SEC ID nº: 4, la SEC ID nº:
6, la SEC ID nº: 8, la SEC ID nº: 10, la SEC ID nº: 12, la SEC ID
nº: 14 o una secuencia de aminoácidos homologa a cualquiera de estas
secuencias.
La alfa-amilasa bacteriana se
puede utilizar en una cantidad de 0.001 a 1.0 mg/g de DS,
preferiblemente en una cantidad de 0.01 a 0.5 mg/g de DS, más
preferiblemente en una cantidad de 0.02 a 0.2 mg/g de DS. Medida en
AFAU la alfa amilasa bacteriana se puede utilizar en una cantidad de
0.01-10 AFAU/g de DS, en una cantidad de
0.05-2.5 AFAU/g de DS, o más preferiblemente en una
cantidad de 0.1-1 AFAU/g de DS, así como de
aproximadamente 0.5 AFAU/g de DS.
Medida en KNU la alfa-amilasa
bacteriana se puede utilizar en una cantidad de
0.001-10 KNU/g de DS, en una cantidad de
0.005-2 KNU/g en DS, o más preferiblemente en una
cantidad de 0.01-0.2 KNU/g de DS, así como de
aproximadamente 0.035 KNU/g de DS.
Con el término una
"alfa-amilasa fúngica que comprende un CBM" se
entiende una enzima que comprende un dominio catalítico y un CBM,
derivando ambos, dicho dominio catalítico y dicho CBM, de una fuente
fúngica. La alfa-amilasa fúngica que comprende un
CBM puede ser una enzima fúngica de tipo salvaje, una variante de
tal enzima fúngica de tipo salvaje, o una enzima híbrida que
comprende un dominio catalítico de alfa-amilasa
fúngica y un CBM fúngico.
El tipo salvaje de alfa-amilasa
ácida se puede derivar de una cepa de Aspergillus kawachi, en
particular el polipéptido que se muestra en la SEC ID nº: 41 en WO
2005/003311 o en secuencias homologas, p. ej. variantes de
dicho polipéptido que comprenden una o más de las sustituciones
G33A, I36K, S74A, D75i, E77D, P120A, I153D, D154N, W155i, D156E,
N157D, L158Q, Q162E, E166L, T169N, I170T, E199K, E199L, D232L,
N233D, N235D, L238Í, D239T, W256Í, Q257P, E331Q, S336A, D339K,
D339N, V340D, y Y342A. Las variantes más preferidas comprenden una o
más de las siguientes sustituciones; S74A, E166L, E199L, D339K, y
D156E. Es aún más preferible la variante que tiene las sustituciones
múltiples S74A/E166L/E199L.
La alfa-amilasa fúngica que
comprende un CBM puede ser una alfa-amilasa híbrida.
Las enzimas fúngicas híbridas, como aquí se denominan, incluyen
especies que comprenden una secuencia de aminoácidos de una enzima
de la alfa-amilasa (EC 3.2.1.1) de origen fúngico
ligado (es decir, unidos de manera covalente) a una secuencia de
aminoácidos que comprende un módulo de unión de carbohidratos (CBM),
preferiblemente de origen fúngico.
Dominios catalíticos de
alfa-amilasas fúngicas adecuados para el uso en una
enzima híbrida para el uso en el proceso de la presente divulgación
incluyen alfa-amilasas ácidas derivadas de una cepa
del género Aspergillus, tales como, Aspergillus oryzae
y alfa-amilasas de Aspergillus Niger. Una
alfa-amilasa fúngica preferida es una
alfa-amilasa de tipo Fungamyl que se deriva
preferiblemente de una cepa de Aspergillus oryzae. En la
presente divulgación, el término "alfa-amilasa de
tipo Fungamyl" se refiere a una alfa-amilasa que
muestra una alta identidad, es decir de al menos un 70%, al menos un
75%, al menos un 80%, al menos un 85% al menos un 90%, al menos un
95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un
99% o incluso un 100% de identidad con la parte madura de la
secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID nº: 10 en WO
96/23874. Una enzima híbrida preferida comprende un dominio
catalítico de alfa-amilasa de tipo Fungamyl y un CBM
que deriva de la A. rolfsii glucoamilasa.
Otro dominio catalítico ácido de
alfa-amilasa preferido adecuado para el uso en una
enzima híbrida para el uso en el proceso de la presente divulgación
se deriva de una cepa de Aspergillus Niger. Una
alfa-amilasa fúngica ácida preferida es la de A.
Niger que se divulga como "AMYA_ASPNG" en la base de datos
Swiss-prot/TeEMBL bajo la adhesión primaria nº.
P56271 y que se describe en más detalle en WO 89/01969 (Ejemplo 3).
La alfa-amilasa ácida del ácido Aspergillus
Niger también se muestra como la SEC ID nº: 8 en WO 2005/003311.
Dominios catalíticos de amilasas de alfa-amilasa
ácida preferidos también comprenden variantes de dicha amilasa
fúngica ácida con al menos un 70% de identidad, así como al menos un
80% o al menos un 90% de identidad, así como al menos un 95%, al
menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, o incluso al menos
un 99% de identidad con la SEC ID nº: 8 en WO 2005/003311.
Preferiblemente la alfa-amilasa fúngica que
comprende un CBM es la variante JA01 que se divulga en WO
2005/003311.
Otros dominios catalíticos de amilasas de
alfa-amilasa ácida preferidos adecuados para el uso
en una enzima híbrida para el uso en el proceso de la presente
divulgación son cualquier dominio catalítico de
alfa-amilasa que se divulga en la solicitud de
patente PCT/US05/46725, y preferiblemente el dominio catalítico
derivado de cualquiera de las especies que se divulgan en ella, y en
particular seleccionado del grupo que consiste en Termomyces
lanuginosus; en particular un polipéptido que tenga los
aminoácidos 1-441 en la SEC ID nº: 14,
Malbranchea sp.; en particular un polipéptido que tenga los
aminoácidos 1-471 en la SEC ID nº: 18, Rhizomucor
pusillus; en particular un polipéptido que tenga los aminoácidos
1-450 en la SEC ID nº: 20, Dichotomocladium
hesseltiner, en particular un polipéptido que tenga los
aminoácidos 1-445 en la SEC ID nº: 22, Stereum
sp.; en particular un polipéptido que tenga los aminoácidos
1-498 en la SEC ID nº: 26, Trametes sp.; en
particular un polipéptido que tenga los aminoácidos
18-513 en la SEC ID nº: 28, Coriolus consors;
en particular un polipéptido que tenga los aminoácidos
1-507 en la SEC ID nº: 30, Dinemasporíum sp.;
en particular un polipéptido que tenga los aminoácidos
1-481 en la SEC ID nº: 32, Criptosporiopsis
sp:, en particular un polipéptido que tenga los aminoácidos
1-495 en la SEC ID nº: 34, Diplodia sp.; en
particular un polipéptido que tenga los aminoácidos
1-477 en la SEC ID nº: 38, Gliocladium sp.;
en particular un polipéptido que tenga los aminoácidos
1-449 en la SEC ID nº: 42, Nectria sp:, en
particular un polipéptido que tenga los aminoácidos
1-442 en la SEC ID nº: 115, Fusaríum sp:, en
particular un polipéptido que tenga los aminoácidos
1-480 en la SEC ID NO: 4, un polipéptido que tenga
los aminoácidos 1-478 en la SEC ID NO: 6, o un
polipéptido que tenga los aminoácidos 1-441 en la
SEC ID nº: 117, Termoascus auranticus; en particular un
polipéptido que tenga los aminoácidos 1-477 en la
SEC ID nº: 125, Tamindium elegans; en particular un
polipéptido que tenga los aminoácidos 1-446 en la
SEC ID nº: 131, Cristata de absidia; en particular un
polipéptido que tenga los aminoácidos 41-481 en la
SEC ID nº: 157, Acremonium sp.; en particular un polipéptido
que tenga los aminoácidos 22-626 en la SEC ID nº:
159, Coniochaeta sp.; en particular un polipéptido que tenga
los aminoácidos 24-630 en la SEC ID nº: 161,
Meripilus giganteus; en particular un polipéptido que tenga
los aminoácidos 27-602 en la SEC ID nº: 163,
Penicillium sp.; en particular un polipéptido que tenga los
aminoácidos 21-643 en la SEC ID nº: 165,
Streptomyces limosus; en particular un polipéptido que tenga
los aminoácidos 29-566 en la SEC ID nº: 167,
Subulispora procurvata; en particular un polipéptido que
tenga los aminoácidos 22-613 en la SEC ID nº: 169,
Sincefalastrum racemosum, en particular un polipéptido que
tenga los aminoácidos 21-463 en la SEC ID nº: 171,
currugata Trametes; en particular un polipéptido que tenga
los aminoácidoss 21-587 en la SEC ID nº: 173,
Trichofaea saccata; en particular un polipéptido que tenga
los aminoácidos 30-773 en la SEC ID nº: 175,
Rubricosa de valsaria; en particular un polipéptido que tenga
los aminoácidos 22-586 en la SEC ID nº: 177 y
Valsaria spartii; en particular un polipéptido que tenga los
aminoácidos 20-582 en la SEC ID nº: 179 en
PCT/US05/46725. También son preferibles los dominios catalíticos de
amilasas de alfa-amilasa que tienen una secuencia
homologa a los citados polipéptidos.
De la manera más preferible un híbrido comprende
un CBM divulgado en la solicitud de patente PCT/US05/46725, siendo
el CBM preferiblemente de una glucoamilasa seleccionada del grupo
que consiste en Papayracea Pachykytospora (SEC ID nº: 76),
Trametes cingulata (SEC ID nº: 78), Leucopaxillus
gigantus (SEC ID nº: 80), Atelia rolfsii (SEC ID nº: 92),
Aspergillus kawachii (SEC ID nº: 94), Aspergillus
Niger (SEC ID nº: 96) o de una alfa-amilasa
seleccionada del grupo que consiste en Trichoferaea saccata
(SEC ID nº: 52), Subulispora provurvata (SEC ID nº: 82),
Rubricosa de valsaria (SEC ID nº: 84), Acremonium sp.
(SEC ID nº: 86), Meripilus giganteus (SEC ID nº: 88),
Bacillus flavotermus (Anoxibacillus contaminans)
(secuencia ID Nº: 90), Coniochaeta sp. (SEC ID nº: 98),
Coniochaeta sp. (SEC ID nº: 137), Trametes corrugata
(SEC ID nº: 139), Valsario spartii (SEC ID nº: 141) y
Penicillium sp. (SEC ID nº: 143) en PCT/US05/46725. También
son preferibles las secuencias homologas a cualquiera de las
secuencias citadas.
También son preferibles para la presente
divulgación cualquiera de los polipéptidos V001; V002; V003; V004;
V005; V006; V007; V008; V009; V010; V011; V012; V013; V014; V015;
V016; V017; V018; V019; V021; V022; V023; V024; V025; V026; V027;
V028; V029; V030; V031; V032; V033; V034; V035; V036; V037; V038;
V039; V040; V041; V042; V043; V047; V048; V049; V050; V051; V052;
V054; V055; V057; V059; V060; V061; V063; V064; V065; V066; V067;
V068 y V069 citados en la solicitud de patente PCT/US05/46725.
También son preferibles las secuencias homologas a cualquiera de las
secuencias citadas.
Son más preferibles una
alfa-amilasa fúngica que comprende un CBM donde el
CBM fúngico es una secuencia de aminoácidos con al menos un 70% de
homología con los aminoácidos 488 a 595 en la SEC ID nº: 2,
preferiblemente una secuencia derivada de la cepa de Aspergillus
Niger, preferiblemente una secuencia derivada de la glucoamilasa
de Aspergillus niger.
De la manera más preferible la
alfa-amilasa fúngica que comprende un CBM es la V039
híbrida citada en PCT/
US05/46725 que comprende el CD de la alfa-amilasa de Rhizomucor pusillus y el CBM y enlazador de la glucoamilasa de Aspergillus Niger y teniendo la secuencia mostrada como los aminoácidos 13-595 en la SEC ID nº: 2 aquí.
US05/46725 que comprende el CD de la alfa-amilasa de Rhizomucor pusillus y el CBM y enlazador de la glucoamilasa de Aspergillus Niger y teniendo la secuencia mostrada como los aminoácidos 13-595 en la SEC ID nº: 2 aquí.
La alfa-amilasa fúngica se puede
utilizar en cantidades de 0.001 a 1.0 mg/g de DS, preferiblemente en
una cantidad de 0.01 a 0.5 mg/g de DS, más preferiblemente en una
cantidad de 0.02 a 0.2 mg/g de DS. Medido en AFAU la
alfa-amilasa fúngica se puede utilizar en una
cantidad de 0.01-10 AFAU/g de DS, en una cantidad de
0.05-2.5 AFAU/g de DS, o más preferiblemente en una
cantidad de 0.1-1 AFAU/g de DS, así como
aproximadamente 0.5 AFAU/g de DS.
El término "actividad glucoamilasa" se
refiere a un glucano
1,4-alfa-glucosidasa que hidroliza
residuos de alfa-d-glucosa ligados
al terminal 1,4 sucesivamente a partir de extremidades no reducidas
de las cadenas con liberación de
beta-d-glucosa de la Clase
Enzimática EC 3.2.1.3.
La glucoamilasa que se utiliza en un proceso de
la presente divulgación puede tener la secuencia de aminoácidos que
se divulga en la SEC ID nº: 2 en PCT/US05/46724, y que se muestra
aquí como la SEC ID nº: 3 o una secuencia de aminoácidos que es al
menos un 70%, preferiblemente al menos un 75%, o al menos un 80%, o
al menos un 85%, o un 90%, o al menos un 95%, al menos un 96%, al
menos un 97%, al menos un 98% o incluso al menos un 99% idéntica a
la SEC ID nº: 3. La glucoamilasa se puede derivar preferiblemente de
Trametes cingulata.
Alternativamente la glucoamilasa que se utiliza
en el presente proceso puede tener la secuencia de aminoácidos que
se muestra PCT/US05/01147 como los residuos aminoácidos 1 a 561 en
la SEC ID nº: 2, o una secuencia de aminoácidos que es al menos un
70%, preferiblemente al menos un 75%, o al menos un 80%, o al menos
un 85%, o un 90%, o al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un
97%, al menos un 98% o incluso al menos un 99% idéntica a dicha SEC
ID nº: 2 (residuos aminoácidos 1 a 561). La glucoamilasa puede
derivar preferiblemente de Athelia rolfsii.
También son preferibles, las glucoamilasas
derivadas de Talaromyces emersonii divulgadas en WO 99/28448
y las glucoamilasas derivadas de Aspergillus Niger divulgadas
en Boel et al. (1984), EMBO J. 3 (5) p.
1097-1102. La glucoamilasa Aspergillus Niger
está disponible a partir de Novozymes A/S como Sprizyme Plus^{TM}
y Sprizyme Fuel^{TM}.
La glucoamilasa se puede utilizar en una
cantidad de 0.01 a 2.0 mg/g de DS, preferiblemente en una cantidad
de 0.05 a 1.0 mg/g de DS, más preferiblemente en una cantidad de 0.1
a 0.5 mg/g en DS. Medida en AGU la glucoamilasa se puede utilizar en
una cantidad de 0.01-10 AGU/g de DS, en una cantidad
de 0.05-2.5 AGU/g de DS, o más preferiblemente en
una cantidad de 0.1-1 AGU/g de DS, así como
aproximadamente de 0.5 AGU/g de DS.
Según el proceso de la presente divulgación una
proteasa también puede estar presente durante la sacarificación y/o
fermentación.
En una versión preferible la proteasa es una
proteasa ácida de origen microbiano, preferiblemente de origen
fúngico o bacteriano.
Las proteasas adecuadas incluyen proteasas
microbianas, tales como proteasas fúngicas y bacterianas. Son
proteasas preferibles las proteasas ácidas, es decir, las proteasas
caracterizadas por la capacidad de hidrolizar proteínas bajo
condiciones ácidas por debajo de pH 7, preferiblemente de 3.5 a 6, o
más preferiblemente de 4 a 5.
Las proteasas fúngicas ácidas que se contemplan
incluyen proteasas fúngicas derivadas de Aspergillus, Mucor,
Rhizopus, Candida, Coriolus, Endothia, Enthomophtra, Irpex,
Penicillium, Sclerotiumand Torulopsis. Se contemplan
especialmente las proteasas que derivan de Aspergillus Niger
(véase, p. ej., Koaze et al., (1964), Agr. Biol. Chem. Japan,
28, 216), Aspergillus saitoi (véase, e.g., Yoshida, (1954) J.
Agr. Chem. Soc. Japan, 28, 66), Aspergillus awamori
(Hayashida et al., (1977) Agric. Biol. Chem., 42(5),
927-933, Aspergillus aculeatus (WO 95/02044
), o Aspergillus oryzae, así como la protease pepA; y las
proteasas acidas de Mucor pusillus o Mucor miehei.
También se contemplan proteasas neutrales o
alcalinas, tales como una proteasa derivada de una cepa de
Bacillus. Una proteasa particular que se contempla para la
presente divulgación se deriva de Bacillus amyloliquefaciens
y tiene la secuencia que se puede obtener en Swissprot como el
registro nº P06832. También se contemplan las proteasas que
tienen al menos 90% de identidad a la secuencia de aminoácidos
obtenible en Swissprot como el registro nº. P06832 así como
al menos un 92%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%,
al menos un 98%, o particularmente al menos un 99% de identidad.
Además se contemplan las proteasas que tienen al
menos un 90% de identidad con la secuencia de aminoácidos divulgada
como la SEC. ID. Nº:1 en la WO 2003/048353 así como al menos un 92%,
al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%,
o particularmente al menos un 99% de identidad.
También se contemplan proteasas tipo papaína
tales como las proteasas dentro de E.C. 3.4.22.* (proteasa de
cisteína), así como EC 3.4.22.2 (papaína), EC 3.4.22.6
(quimopapaína), EC 3.4.22.7 (asclepaína), EC 3.4.22.14
(actinídaína), EC 3.4.22.15 (L catepsina), EC 3.4.22.25
(glicil-endopeptidasa ) y EC 3.4.22.30
(caricaína).
Se pueden añadir proteasas en las cantidades de
0.1-1000 AU/kg de dm, preferiblemente
1-100 AU/kg de DS y de la forma más preferible
5-25 AU/kg de DS.
Pueden haber presentes ingredientes adicionales
durante la sacarificación y/o fermentación para aumentar la eficacia
del proceso de la presente divulgación. Por ejemplo, nutrientes (p.
ej. micronutrientes del organismo de fermentación), antibióticos,
sales (p. ej., zinc o sales de magnesio), otras enzimas tales como
la fitasa, celulasa, hemicelulasa, exo- y
endo-glucanasa, y xilanasas.
El producto de fermentación, tal como etanol,
opcionalmente se puede recuperar después de la fermentación. La
recuperación se puede llevar a cabo de cualquier manera convencional
tal como, p. ej., por destilación.
Glucoamilasas:
Alfa-amilasa ácida bacteriana
(ABAA) derivada de Anoxybacillus contaminans y teniendo la
secuencia que se muestra en la SEC ID Nº:1.
Alfa-amilasa fúngica ácida
(AFAA) comprendiendo el dominio catalítico de la
alfa-amilasa de Rhizomucor pusillus y el
enlazador de glucoamilasa de Aspergillus Niger y CBM y
teniendo la secuencia que se muestra en la SEC ID Nº:2.
Glucoamilasa derivada de Aspergillus
Niger que se divulga en Boel et al. (1984), EMBO J. 3 (5)
p. 1097-1102 y disponibles través de Novozymes
A/S.
Glucoamilasa derivada de Trametes
cingulata y teniendo la secuencia que se muestra en la SEC ID
Nº: 3.
Levadura: Red Star^{TM} disponible a
través de Red Star/Lesaffre, EEUU.
En el contexto de la presente invención
"identidad" polipéptida se refiere al grado de identidad entre
dos secuencias de aminoácidos. La identidad se puede determinar
adecuadamente mediante programas informáticos conocidos en la
técnica, tales como, GAP proporcionado en el paquete del programa
GCG (manual del programa para el paquete Wisconsin, versión 8,
agosto 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison,
Wisconsin, EEUU 53711) (Needleman, S.B. y Wunsch, C.D., (1970),
Journal of Molecular Biology, 48, 443-453. Se
utilizan los siguientes ajustes para la comparación de secuencia
polipéptidas: penalización de creación GAP de 3.0 y penalización de
extensión GAP de 0.1. El término "secuencia homóloga" se
utiliza para caracterizar una secuencia que tiene una secuencia de
aminoácidos que es al menos un 70%, preferiblemente al menos un 75%,
o al menos un 80%, o al menos un 85%, o un 90%, o al menos un 95%,
al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o incluso al menos
un 99% idéntica a una secuencia conocida. La parte pertinente de la
secuencia de aminoácidos para la determinación de la homología es el
polipéptido maduro, es decir, sin el péptido señal.
La actividad amilolítica se puede determinar
utilizando almidón de patata como sustrato. Este método se basa en
la descomposición de almidón de patata modificado por la enzima, y
la reacción se sigue al mezclar muestras del almidón/solución
enzimática con una solución de yodina. Inicialmente, se forma un
color azul negruzco, pero durante la descomposición del almidón el
color azul se debilita y gradualmente se convierte en un marrón
rojizo, que se compara con un estándar de vidrio de color.
Una Unidad Kilo Novo de
alfa-amilasa (KNU) se refiere a la cantidad de
enzima que, bajo condiciones estándar (es decir, a 37ºC +/- 0.05,
0.0003 M Ca^{2+}; y pH 5.6) dextriniza 5260 mg de sustancia seca
de almidón Merck Amilum soluble.
Una carpeta
EB-SM-0009.02/01 que describe
este método analítico en más detalle está disponible bajo pedido de
Novozymes A/S, Dinamarca.
Cuando se utiliza la actividad de cualquier
alfa-amilasa ácida según la presente invención se
puede medir en AFAU (unidades de la alfa-amilasa
fúngica ácida). Alternativamente la actividad de la
alfa-amilasa ácida se puede medir en AAU (unidades
de la alfa-amilasa ácida).
La actividad de la alfa-amilasa
ácida se puede medir en AAU (unidades de la
alfa-amilasa ácida), que es un método absoluto. Una
unidad de amilasa ácida (AAU) es la cantidad de enzima que convierte
1g de almidón (100% de materia seca) por hora bajo condiciones
estandarizadas en un producto que tiene una transmisión a 620 nm
después de la reacción con una solución de yodina de fuerza conocida
igual a la de una referencia de color.
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El almidón debe ser almidón Lintner, que es un
almidón de ebullición fina que se utiliza en el laboratorio como
indicador colorimétrico. El almidón Lintner se obtiene mediante un
tratamiento con ácido clorhídrico diluido de almidón nativo de modo
que éste conserve la capacidad de volverse de color azul con yodina.
Se pueden encontrar detalles adicionales en la Patente Europea nº.
140410.
La actividad de la alfa-amilasa
ácida se puede medir en AFAU (unidades de
alfa-amilasa fúngica ácida), que se determinan en
relación a un estándar enzimático. 1 FAU se refiere a la cantidad de
enzima que degrada 5.260 mg de materia seca de almidón por hora bajo
las condiciones estándar que se citan abajo.
La alfa-amilasa ácida, una
endo-alfa-amilasa
(1,4-alfa-D-glucano-glucanohydrolasa,
E.C. 3,2,1,1) hidroliza enlaces
alfa-1,4-glicosídicos en las
regiones internas de la molécula de almidón para formar dextrinas y
oligosacáridos con diferentes longitudes de cadena. La intensidad
del color formado con yodina es directamente proporcional a la
concentración de almidón. La actividad amilasa se determina
utilizando colorimetría inversa como reducción en la concentración
de almidón bajo las condiciones de análisis especificadas.
Una carpeta
EB-SM-0259.02/01 que describe
este método analítico en más detalle está disponible bajo pedido a
Novozymes A/S, Dinamarca.
La actividad glucoamilasa se puede medir en
unidades AGI o en unidades de amiloglucosidasa (AGU).
La glucoamilasa (equivalente a la
amiloglucosidasa) convierte almidón en glucosa. La cantidad de
glucosa se determina aquí por el método
glucosa-oxidasa para la determinación de la
actividad. El método descrito en la sección 76-11 de
Starch-Glucoamylase Method with Subsequent
Measurement of Glucose with Glucose Oxidase (Método de
almidón-glucoamilasa con posterior medición de
glucosa con glucosa-oxidasa) en "Approved methods
of the American Association of Cereal Chemists",
Vol.1-2 AACC, de la American Association of Cereal
Chemists (Asociación Americana de Farmacéuticos del Cereal, (2000);
ISBN:
1-891127-12-8.
Una unidad de glucoamilasa (AGI) es la cantidad
de enzima que formará 1 micromol de glucosa por minuto bajo las
condiciones estándar del método.
El almidón debería ser almidón Lintner, que es
un almidón de ebullición fina que se utiliza en el laboratorio como
indicador colorimétrico. El almidón Lintner se obtiene por
tratamiento con ácido clorhídrico diluido de almidón nativo de modo
que conserve la capacidad de colorear azul con yodina.
La unidad de glucoamilasa Novo (AGU) se refiere
a la cantidad de enzima, que hidroliza 1 micromol de maltosa por
minuto bajo las condiciones estándar 37ºC, pH 4.3, sustrato: maltosa
23.2 mM, tampón: acetato 0.1 m, tiempo de reacción 5 minutos.
Se puede utilizar un sistema autoanalizador. Se
añade mutarotasa al reactivo de glucosa deshidrogenasa de modo que
cualquier aIfa-d-glucosa presente se
convierte en beta-d-glucosa. La
glucosa dehidrogenasa reacciona específicamente con
beta-D-glucosa en la reacción que se
cita arriba, formando NADH que se determina utilizando un fotómetro
a 340 nm como una medida de la concentración de glucosa
original.
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Una carpeta
(EB-SM-0131.02/01) que
describe este método analítico en más detalle está disponible bajo
pedido a Novozymes A/S, Dinamarca.
La actividad proteolítica se puede determinar
con hemoglobina desnaturalizada como sustrato. En el método de la
hemoglobina de Anson para la determinación de actividad proteolítica
se digiere hemoglobina desnaturalizada, y la hemoglobina sin digerir
se precipita con ácido tricloroacético (ATC). La cantidad de
producto soluble ATC se determina con reactivo de fenol, que da un
color azul con tirosina y triptófano.
Una unidad Anson (AU) se refiere a la cantidad
de enzima que bajo condiciones estándar (es decir, 25ºC, pH 7.5 y 10
min. de tiempo de reacción) digiere hemoglobina a un ritmo inicial
tal que se libera por minuto una cantidad de producto soluble ATC
que da el mismo color con reactivo de fenol que con un
milliequivalente de tirosina.
Una carpeta AF 4/5 que describe el método
analítico en más detalle está disponible bajo pedido a Novozymes
A/S, Dinamarca.
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Se preparó una mezcla al 35% de DS a partir de
194.44 g de maíz molido (un 90% menos que 0.5 mm), 305.56 g de 37 mM
de NaOAc, un 0.025% azida sódica, 20 mM de CaCl_{2}, a pH 4.5. El
pH se ajustó a 4.5 con 5N de NaOH y la mezcla se incubó con
agitación a temperatura ambiente durante una hora. Para cada
reacción se añadieron 5 g de mezcla en un frasco de 20 ml, y los
frascos se incubaron a 32ºC durante una hora antes de la
dosificación de enzima. Cada frasco se dosificó con la cantidad
apropiada de enzima como se muestra en Tabla 1, se cubrió y se
removió inmediatamente. Los frascos se incubaron a 32ºC y se
removieron tras 0.5, 1, 2, 3, y 4 horas. Las reacciones se
detuvieron a las 4 horas por adición de 50 micrL de un 40% de
H_{2}SO_{4}. Se llevaron a cabo tres repeticiones para cada
reacción. La preparación de la muestras consistió en centrifugar y
filtrar el sobrenadante a través de un filtro de 0.45 micro metros.
Las muestras pendientes del análisis HPLC se almacenaron a 4ºC. Los
resultados de HPLC se muestran en la Tabla 1 abajo.
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Maíz molido, 410 g de (un 90% menos de 0.5 mM)
se mezcló 590 g de agua corriente, 3.0 ml 1 g/l penicilina y 1 g de
urea. El pH se ajustó a 4.5 con 5N de NaOH. El nivel de DS se
determinó al 35%. Se añadieron 5 g de esta mezcla en un frasco de 20
ml por cada reacción. Cada frasco se dosificó con la cantidad
apropiada de enzima según las Tablas 2 o 3, seguido por la adición
de 200 microL de propagado de levadura/5 g de fermentación antes de
la incubación a 32ºC. Se llevaron a cabo 9 fermentaciones replicadas
de cada tratamiento. Se seleccionaron tres réplicas para los puntos
temporales del análisis de 24 horas, 48 horas y 70 horas. Los
frascos se removieron a las 24, 48 y 70 horas. El análisis en puntos
temporales consistió en pesar los frascos y preparar la muestra para
HPLC. La preparación para HPLC consistió en parar la reacción
mediante la adición de 50 microL de un 40% de H_{2}SO_{4},
centrifugar, y filtrar a través de un filtro de 0.45 um. Las
muestras pendientes de análisis HPLC se almacenaron a 4ºC. Los
resultados de HPLC se muestran en la Tabla 2.
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Esta lista de documentos citados por el
solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información
del lector y no forma parte del documento de patente europea. La
misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin
embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u
omisiones.
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<120> 10908
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<130> 10908.204-WO
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<160> 3
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<170> Versión de patentIn 3.4
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<210> 1
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<211> 619
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<212> PRT
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<213> Anoxibacillus contaminans
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<220>
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<221> señal
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<222> (1)..(31)
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<220>
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<221> CD
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<222> (32)..(520)
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<220>
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<221> CBD
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<222> (521)..(619)
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 1
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
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<210> 2
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<211> 595
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<212> PRT
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<213> artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> proteína híbrida
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<220>
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<221> SEÑAL
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<222> (1)..(12)
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CD
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (13)..(450)
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Enlazador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (451)..(487)
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CBD
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (488)..(595)
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<400> 2
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\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 3
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<211> 574
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<212> PRT
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<213> Trametes cingulata
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat_peptide
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (19)..(574)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
Claims (14)
1. Un proceso que comprende la sacarificación de
un almidón granular con:
- a)
- una glucoamilasa,
- b)
- una alfa-amilasa bacteriana que comprende un módulo de unión de carbohidratos (CBM), y
- c)
- una alfa-amilasa fúngica que comprende un CBM,
para producir un hidrolizado de almidón.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El proceso de la reivindicación 1,
comprendiendo además poner en contacto el hidrolizado de almidón con
un organismo de fermentación para producir un producto de
fermentación.
3. El proceso de la reivindicación 2, donde la
sacarificación y la fermentación se llevan a cabo
simultáneamente.
4. El proceso de cualquiera de las
reivindicaciones 2 ó 3, donde el producto de fermentación se
recupera después de la fermentación.
5. El proceso de cualquiera de las
reivindicaciones 2-4, donde el producto de
fermentación es un alcohol, preferiblemente etanol, especialmente
etanol combustible, etanol potable y/o etanol industrial.
6. El proceso de cualquiera de las
reivindicaciones 1-5, donde la
alfa-amilasa fúngica que comprende un CBM y/o la
alfa-amilasa bacteriana que comprende un CBM es una
alfa-amilasa fúngica ácida y/o una
alfa-amilasa bacteriana ácida.
7. El proceso de cualquiera de las
reivindicaciones 1-6, donde la
alfa-amilasa fúngica que comprende un CBM y/o la
alfa-amilasa bacteriana que comprende un CBM es una
enzima de tipo salvaje o una variante genéticamente modificada de
una enzima de tipo salvaje que comprende un CBM.
8. El proceso de cualquiera de las
reivindicaciones 1-7, donde la
alfa-amilasa fúngica que comprende un CBM y/o la
alfa-amilasa bacteriana que comprende un CBM es una
enzima híbrida, preferiblemente una enzima híbrida que comprende un
dominio catalítico de alfa-amilasa (CD) y un CBM y
opcionalmente un enlazador.
9. El proceso de cualquiera de las
reivindicaciones 1-8, donde el CBM fúngico es una
secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70% de homología con
los aminoácidos 488 a 595 en la SEC ID Nº:2.
10. El proceso de cualquiera de las
reivindicaciones 1-9, donde la
alfa-amilasa fúngica que comprende un CBM es una
secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70% de homología con
los aminoácidos 13 a 595 en la SEC ID Nº:2.
11. El proceso de cualquiera de las
reivindicaciones 1-10, donde el dominio catalítico
de la alfa-amilasa bacteriana es una secuencia de
aminoácidos que tiene al menos un 70% de homología con los
aminoácidos 32 a 520 en la SEC ID Nº:1.
12. El proceso de cualquiera de las
reivindicaciones 1-11, donde el dominio catalítico
de la alfa-amilasa bacteriana y/o el CBM está
derivado de Bacillus flavotermus.
13. El proceso de cualquiera de las
reivindicaciones 1-12, donde el CBM bacteriano es
una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70% de homología
con los aminoácidos 521 a 619 en la SEC ID Nº:1.
14. Una composición adecuada para la
sacarificación de un almidón granular, comprendiendo dicha
composición una alfa-amilasa bacteriana que
comprende un CBM, y una alfa-amilasa fúngica que
comprende un CBM.
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