CN107325981A - 一种快速筛选稳定高效苯酚降解嗜盐菌的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种快速筛选稳定高效苯酚降解嗜盐菌的方法，将采集的固体或液体样品在液体培养基中培养，富集菌体后取菌液于固体培养平板涂抹均匀后培养，获得平板单菌落；将单菌落再次在固体平板培养基上连续划线，培养，得到纯培养的嗜盐菌株，接入含有苯酚的液体培养基中培养；之后再取菌液接种于新的含有苯酚的液体培养基，如此反复5‑8次，可获得高效稳定的降解苯酚嗜盐菌菌株。本发明采用固液两步法，先分离筛选嗜盐菌，再筛选苯酚降解嗜盐菌，大大减少了筛选苯酚嗜盐降解菌的时间，克服了传统分离方法获得的苯酚降解嗜盐菌时间长且降解苯酚不稳定的缺陷。

Description

一种快速筛选稳定高效苯酚降解嗜盐菌的方法
技术领域
本发明涉及微生物分离技术领域，具体地说，涉及一种快速筛选稳定高效苯酚降解嗜盐菌的方法。
背景技术
苯酚及其衍生物对人和动植物的毒性很强，已被列入环境优先控制污染物名单。含酚废水主要来源于造纸、炼油、合成纤维、合成橡胶、农药等行业，是工业排放废水中主要的污染物。在这些含酚废水中除了含苯酚类污染物之外，往往还含有大量盐分而使之成为高盐含酚废水，这类废水排放到环境中会对土壤、地表水和地下水造成严重污染。由于高盐环境对微生物生长具有抑制和毒害作用，使得常规的生物降解技术在处理这类废水时存在瓶颈问题。嗜盐菌能直接用于去除高盐工业废水中的有机污染物而无需先降低废水盐度，因而逐渐受到人们的广泛关注。
目前，分离苯酚降解嗜盐菌菌株都是采用盐度和苯酚双选择压力下筛选或者是先筛选嗜盐菌，而后在有苯酚压力的条件下驯化。第一种方法，由于具有双重选择压力，因此菌的生长十分缓慢，较难在培养基上获得生长良好的单菌落，分离菌株的时间较长，且效果不佳；第二种方法，对获得嗜盐菌仅仅通过1-2次的苯酚降解驯化，即认为获得了苯酚降解嗜盐菌，但是通过1-2次的驯化过程，可能不仅不能获得高效的苯酚嗜盐降解菌，即使在1-2次有很好的苯酚降解效果，但是降解效果不具有稳定性，还可能遗漏具有高效降解苯酚的嗜盐菌。本方法针对目前技术的缺陷，提出分步筛选与多次驯化相结合的苯酚嗜盐菌的筛选方法，不仅能够快速的获得苯酚嗜盐降解菌，而且降解苯酚的能力高效且稳定。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速筛选稳定高效苯酚降解嗜盐菌的方法。
本发明的方法包括以下步骤：
(1)将采集的嗜盐菌在液体培养基中培养，富集菌体后取菌液于固体平板培养基涂抹均匀后培养，获得平板单菌落；
(2)将单菌落再次在固体平板培养基上连续划线，培养，得到纯培养的嗜盐菌株；
(3)将纯培养的嗜盐菌株接入含有苯酚的液体培养基中培养；之后再取菌液接种于新的含有苯酚的液体培养基，如此反复5-8次。
其中，步骤(1)的液体培养基其1L的配方为：10g MgSO4·7H2O、0.2g CaCl2·2H2O、2-5g KCl、1-2.5g胰蛋白胨、5-10g酵母提取物、NaCl 5％-20％、H2O补至1L,pH为7.2±0.3；步骤(1)的固体平板培养基其配方为：按质量体积比向上述液体培养基加入2％的琼脂。
步骤(1)液体培养基中培养条件为：20-40℃，100-300rpm；固体平板培养基培养条件为20-40℃。
本发明方法中，步骤(3)中所述的液体培养基其1L的配方为：NaCl 30-150g、Tris1.0-5.0g、KCl 0.5-4.0g、KNO3 0.3-3g、NH4Cl 1-5g、MgSO4·7H2O 10-40g、MnSO4·H2O 0.2-1.0g、CaCl2 0.2-1.0g、葡萄糖0.5-5g，H2O补至1L；含有苯酚的液体培养基，其制备方法为：向上述75-95ml液体培养基中加入0.05mol/L Na2HPO4 1-5ml、0.01mol/L FeSO4 1-5ml、10mg/mL酵母提取物1-5ml、10mg/mL胰蛋白胨1-5ml、10mg/mL苯酚1-5ml。
本发明方法中，步骤(3)的培养条件为20-40℃，100-300rpm。
优选地，步骤(3)的培养条件为28℃，150rpm。
本发明提供了上述快速筛选稳定高效苯酚降解嗜盐菌的方法在环境保护中的应用。
本发明提供了上述快速筛选稳定高效苯酚降解嗜盐菌的方法，筛选得到能够降解苯酚的嗜盐菌。
本发明提供了上述方法筛选得到的能够降解苯酚的嗜盐菌在处理工业废水中的应用。
本发明提供了上述方法筛选得到的能够降解苯酚的嗜盐菌在环境保护中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明采用固液两步法，先分离筛选嗜盐菌，再筛选苯酚降解嗜盐菌，大大减少了筛选嗜盐菌的时间，快速筛选得到苯酚降解嗜盐菌，克服了传统分离方法获得的苯酚降解嗜盐菌时间长且降解苯酚不稳定的缺陷。本发明方法筛选得到的菌株对苯酚的降解率分别为66.2％和78.9％，显示出高效稳定的苯酚降解效果。
附图说明
图1为菌株A7在氯化钠浓度为100g/L、不同初始苯酚浓度的液体培养基中的生长与苯酚降解情况图。
图2为菌株A16在初始质量浓度200mg/L的苯酚、氯化钠浓度为100g/L的液体培养基中随时间的生长与苯酚降解曲线图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1 快速筛选稳定高效苯酚降解嗜盐菌的方法
a、将采集到的固体样品(盐湖淤泥、海底淤泥、高盐废水处理污泥等)1-5g或500ml的液体样品(盐湖水、海水、高盐废水等)过滤物，溶于10-50ml液体培养基(10g MgSO4·7H2O、0.2g CaCl2·2H2O、2-5g KCl、2.5g胰蛋白胨、10g酵母提取物、NaCl 15％、蒸馏水添加至1000ml。调节pH为7.2左右，121℃灭菌15min)，室温下，转速80-160rpm振荡30-120分钟，取出静置20-40分钟，用移液器吸取100μL，均匀涂布在固体培养基的培养平板上(上述液体培养基加2％琼脂得)，置于28℃恒温培养箱中进行静置培养。
b、直到培长出可见菌落时，用接种环挑取单个菌落，在平板固体培养基表面上连续划线；
c、如此反复划线培养，直至获得纯培养嗜盐菌菌株。
d、挑取纯培养的单个菌落，转接于含有苯酚的液体培养基中，在28℃、150rpm的恒温摇床中进行培养，菌液至浑浊；
本步骤中的液体培养基1L配方为NaCl 100g、Tris 2g、KCl 2g、KNO3 1g、NH4Cl 5g、MgSO4·7H2O 24g、MnSO4·H2O 0.688g、CaCl20.12g、葡萄糖1g，蒸馏水添加至1000ml。100ml上述液体培养基中加入灭过菌的0.05mol/L Na2HPO4 2ml、0.01mol/L FeSO4 2ml、10mg/mL酵母提取物2ml、10mg/mL胰蛋白胨2ml、10mg/mL苯酚2ml(换算后为200mg/L苯酚溶液)。
e、用移液器吸取200μL菌液转接于步骤d所述的含有苯酚的液体培养基中，如此反复5-8次，获得稳定高效的降解苯酚的嗜盐菌。
通过上述方法首先分别获得10株嗜盐菌，而后进过8次苯酚选择压力驯化，分别获得A16和A7菌株具有高效稳定的苯酚降解效率。选取最终平均降解率在60％以上的菌株，置于0-4℃保存一周，活化2次，在初始苯酚浓度为200mg/L、氯化钠浓度为100g/L的培养基中进行降解苯酚的试验，结果表明，其中A16和A7菌株对苯酚的降解率均达到了75％以上，显示出高效稳定的苯酚降解效果。
菌株A7在氯化钠浓度为100g/L、不同初始苯酚浓度的液体培养基中的生长与苯酚降解情况如图1所示。由图1可以看出。随着苯酚浓度的增大，菌株生物量是先增大后减小，当苯酚浓度为200mg/L时，其生物量达到最大值，当浓度超过200mg/L并且逐渐增大时，生物量下降明显。菌株A7对苯酚的降解效率也是先增大后减小，当浓度为200mg/L附近时，A7菌的降解效率达到最大，当浓度持续增大时，降解效率逐渐减少。
菌株A16在初始质量浓度200mg/L的苯酚、氯化钠浓度为100g/L的液体培养基中随时间的生长与苯酚降解曲线如图2所示。由图2可知，该菌在很短的停滞期(4-6h)后就进入了对数期，在此期间细菌数量随时间几乎呈线性增长，并在接种32h后进入稳定期，此时细菌的生物量OD600基本稳定在1.2-1.3之间。在停滞期内，苯酚含量下降缓慢，表明该菌株在培养初期对苯酚的降解率很低，随后在对数期内苯酚含量对细菌数量增加而迅速下降，在稳定期内苯酚含量继续下降，直到42h的对数期，苯酚含量下降放缓，其浓度降至50mg/L左右。结果表明，菌株A16具有高盐条件下生长周期短、苯酚降解速率高一级降解能力强等特点，在高盐有机污水处理中极具潜力。
因此，在后续苯酚压力筛选过程中，从实验数据可以看出(表1、表2)，当在筛选1-2次时，并未表现出很强的苯酚降解特性，而是随着筛选次数的增加，具有稳定苯酚降解能力的菌株是逐渐上升的趋势，而对苯酚降解不稳定的那些菌株，其降解效率忽高忽低，不具有稳定性。因此判定是否对苯酚降解具有稳定性的一个重要标准是在每次的筛选中对苯酚降解率是否稳定且呈现上升的趋势。
表1
表2
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种快速筛选稳定高效苯酚降解嗜盐菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将采集的嗜盐菌在液体培养基中培养，富集菌体后取菌液于固体平板培养基涂抹均匀后培养，获得平板单菌落；
(2)将单菌落再次在固体平板培养基上连续划线，培养，得到纯培养的嗜盐菌株；
(3)将纯培养的嗜盐菌株接入含有苯酚的液体培养基中培养；之后再取菌液接种于新的含有苯酚的液体培养基，如此反复5-8次。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)的液体培养基其1L的配方为：10gMgSO4·7H2O、0.2g CaCl2·2H2O、2-5g KCl、1-2.5g胰蛋白胨、5-10g酵母提取物、NaCl 5％-20％、H2O补至1L,pH为7.2±0.3；步骤(1)的固体平板培养基其配方为：按质量体积比向上述液体培养基加入2％的琼脂。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)液体培养基中培养条件为：20-40℃，100-300rpm；固体平板培养基培养条件为20-40℃。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的液体培养基其1L的配方为：NaCl 30-150g、Tris 1.0-5.0g、KCl 0.5-4.0g、KNO3 0.3-3g、NH4Cl 1-5g、MgSO4·7H2O 10-40g、MnSO4·H2O 0.2-1.0g、CaCl2 0.2-1.0g、葡萄糖0.5-5g，H2O补至1L；含有苯酚的液体培养基，其制备方法为：向上述75-95ml液体培养基中加入0.05mol/L Na2HPO4 1-5ml、0.01mol/L FeSO4 1-5ml、10mg/mL酵母提取物1-5ml、10mg/mL胰蛋白胨1-5ml、10mg/mL苯酚1-5ml。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)的培养条件为20-40℃，100-300rpm。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)的培养条件为28℃，150rpm。
7.权利要求1-6任一所述的方法在环境保护中的应用。
8.权利要求1-6任一所述的方法筛选得到的能够降解苯酚的嗜盐菌。
9.权利要求8所述的能够降解苯酚的嗜盐菌在处理工业废水中的应用。
10.权利要求8所述的能够降解苯酚的嗜盐菌在环境保护中的应用。
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