CN101481673B - 吡啶降解菌及其复合菌剂、制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了吡啶降解菌及其复合菌剂、制备方法和应用。新分离的菌株吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinovora)KT-J002 CGMCC No.2789和纤维单胞菌(Cellulomonas sp)KT-J007 CGMCC No.2788不仅可以有效的降解高浓度吡啶，而且还对苯、苯酚、二甲苯、喹啉、氰化物等有毒物质具有耐受性或降解能力，它们和脱氮副球菌(Paracoccusdenitrificans)W12 CGMCC No.1673、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)ATCC 49442和成晶节杆菌(Arthrobacter crystallopoietes)ATCC 15481组成的复合菌剂用于环境污染的治理，可有效降解吡啶，特别适用于焦化废水的生物处理。

Description

吡啶降解菌及其复合菌剂、制备方法和应用
技术领域
本发明涉及有机物降解菌株、微生物复合菌剂及其制备方法与应用，特别是涉及吡啶降解微生物和它们的复合菌剂，菌剂的制备方法和在生物强化处理中的应用。
背景技术
受启于地球“自净”过程的生物治理具有成本低、二次污染轻、环境相容性好等优势，生物治理技术现已成为污染治理技术中的首选方案之一，如现已产生良好效果的可用于污水/废水处理的活性污泥法、氧化沟法等。决定生化处理工艺成功、有效、适用的因素，除了工艺条件和操作管理外，用于污染物降解、转化等过程的功能微生物群体的作用也是十分重要的。因此，对特种微生物的分离、筛选，功能基因的分离、提取，以及借此构建各种环境工程菌已成为环境科学、生命科学中的研究热点。
应运而生的生物强化技术(Bioaugmentation，简称BA技术)、基因强化技术(Gene-Enhanced-Technology，简称GET技术)是向污染体系中投加人工培育的功能菌株/菌群，导入功能基因，以增强体系中目标底物的降解、转化。美国、日本、英国等一些国外的科研机构，现已成功开发出商品化的环境生物制剂，其中著名的有日本的EM制剂和美国的AM制剂。
吡啶是化工产业中广泛使用的化合物，用作化学合成单体，因此是一种常见的有毒污染物，是焦化废水、农药废水等工业废水的特征污染因子。近年来，吡啶作为非常重要的化工合成单体，目前市场调查表明，全球吡啶需求坚挺，因此，外商争相在中国建厂，如世界著名的Nepera公司与Reilly工业公司，分别在北京、南京已经建成或正在筹建吡啶的生产厂。据此推测，在不久的将来，吡啶的有机污染以及在吡啶的生产、应用、销售过程中造成的相关泄漏、污染的处理等问题，可能会显得越来越突出与严重。另外，随着除草剂用量的增大，其生产合成工业的迅速发展，尤其是免耕/减耕等非耕农业技术的提倡，百草枯因其独特的化学特性，如1)速效；2)只对植物地上部分有效，对根及根茎无效；3)与土壤迅速结合失去活性，使其生产、使用与销售均呈持续上升趋势。在美国百草枯的销售量每年约增加5-10％。百草枯是吡啶的主要衍生物之一，约占吡啶用量的30％。因此，对该污染物的生物降解的系统研究是十分必要的。
虽然，关于吡啶的生物降解的研究早在20世纪70年代就有相关报道，但是，由于吡啶本身属于难降解有机杂环化合物，自然界中很难找到对其可以有效降解的微生物，故至今各国仍将吡啶作为污染体系中的难降解有机化合物加以重点研究和处理，希望找到一些有效的微生物对其加以控制，从而保证各种排放的工业废水中吡啶含量不至于对环境造成污染。
从受吡啶污染的土壤或者活性污泥体系中分离已经进化出吡啶降解能力的微生物菌株，对其进行详细研究，最终利用各种微生物的优势特性(如脱氮能力、耐受或降解多种难降解有机物)组成一个高效复合菌剂，用于处理特种工业污染废水，如焦化废水、农药废水将是一个具有巨大应用潜力和市场前景的污染控制技术，也必将会对我国严重的污染情况的解决提供更加切实有效的治理方案。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供能有效降解有机污染物吡啶的新菌株，以用于环境污染的治理。
本发明所提供的吡啶降解新菌株是：吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinovora)KT-J002和纤维单胞菌(Cellulomonas sp)KT-J007。
吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinovora)KT-J002分离自农药厂污水长期浸泡的土壤，于2008年12月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC，地址在中科院微生物所)，保藏编号为CGMCC No.2789。
纤维单胞菌(Cellulomonas sp)KT-J007分离自钢厂综合废水排污口处污泥，于2008年12月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC，地址在中科院微生物所)，保藏编号为CGMCC No.2788。
本发明提供的吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinovora)KT-J002 CGMCC No.2789可在普通细菌LB培养基及添加吡啶(1.96g/L)的无机盐筛选培养基上生长，菌落红色，圆形，光滑，较干燥。G+，细胞形态不规则。好氧，呼吸代谢，无气生菌丝。所述无机盐培养基为稍加修改的ATCC的1780号培养基：K2HPO4 0.61g/L，KH2PO4 0.39g/L，KCl 0.25g/L，MgSO4·7H2O 0.13g/L，微量元素液1.0ml/L；其中每1000ml微量元素液包括CaCl2·2H2O0.0004g，FeSO4·7H2O 0.04g，MnSO4·4H2O 0.04g，ZnSO4·7H2O 0.02g，CuSO4·5H2O 0.005g，CoCl2·6H2O 0.004g，NaCl 1.0g，Na2MoO4·2H2O 0.005g。
本发明提供的纤维单胞菌(Cellulomonas sp)KT-J007 CGMCC No.2788同样可以在上述两种培养基上生长，菌落淡黄色，光滑，湿润。G+，杆菌。兼性厌氧，化能异养菌，可呼吸代谢也可发酵，接触酶阳性。能分解纤维素。还原硝酸盐到亚硝酸盐。
吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinovora)KT-J002 CGMCC No.2789和纤维单胞菌(Cellulomonas sp)KT-J007 CGMCC No.2788均来自于受吡啶等杂环化合物污染的活性污泥或者土壤体系中，它们不仅可以有效的降解高浓度吡啶(最高可达2000mg/L)，而且还对苯、苯酚、二甲苯、喹啉、氰化物等有毒物质具有耐受性或降解能力。此外，吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinovora)KT-J002 CGMCC No.2789由于属于红球菌属，而该属菌株的基因组是目前报道的微生物基因组中容量最大的，且具有很强的突变能力，广泛的环境适应性，因而容易适应高浓度有机物污染的环境。纤维单胞菌(Cellulomonas sp)KT-J007则可以在无氧条件下有效地代谢含氮化合物。
本发明的第二个目的在于提供一种具有强吡啶降解能力的复合菌剂，以用于吡啶含量较高的工业废水的生物处理中。
具体而言，本发明提供的吡啶降解复合菌剂包括5种不同的微生物：脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCC No.1673，吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinovora)KT-J002 CGMCC No.2789，纤维单胞菌(Cellulomonas sp)KT-J007 CGMCC No.2788，藤黄微球菌(Micrococcus luteus)ATCC 49442和成晶节杆菌(Arthrobacter crystallopoietes)ATCC 15481。
除上述的吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinovora)KT-J002 CGMCC No.2789和纤维单胞菌(Cellulomonas sp)KT-J007 CGMCC No.2788外，其余的三个菌株中，脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12已在中国专利申请公开文本CN 1869199A中公开，该菌株于2006年04月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.1673，另外两株菌是选自保藏于美国模式菌种保藏中心(ATCC)的编号分别为49442和15481的藤黄微球菌(Micrococcus luteus)和成晶节杆菌(Arthrobactercrystallopoietes)。
脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCC No.1673可在普通细菌LB培养基及添加吡啶(1.96g/L)的上述无机盐筛选培养基上生长，菌落白色、呈圆形，边缘光滑，光学显微镜下观察其为G-短杆菌，单个或成对，不运动。好氧，呼吸代谢；当硝酸盐、亚硝酸盐或氧化氮存在时，能以它们为电子受体营厌氧生长。接触酶、氧化酶阳性。该菌株不仅可以有效的降解高浓度吡啶(最高可达2000mg/L)，而且还对苯、苯酚、二甲苯、喹啉、氰化物等有毒物质具有耐受性或降解能力，此外还可在无氧条件下有效地代谢含氮化合物。
藤黄微球菌(Micrococcus luteus)ATCC 49442和成晶节杆菌(Arthrobactercrystallopoietes)ATCC 15481则是已报道的研究较清楚的吡啶降解菌，它们可以矿化吡啶。
组成复合菌剂的5株微生物菌株均可在含有1000mg/L吡啶的LB培养基中生长、富集。30℃，200rpm的条件下，脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCC No.1673，培养22小时，吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinovora)KT-J002 CGMCC No.2789培养28小时，纤维单胞菌(Cellulomonas sp)KT-J007 CGMCC No.2788、藤黄微球菌(Micrococcusluteus)ATCC 49442和成晶节杆菌(Arthrobacter crystallopoietes)ATCC 15481培养34小时，活菌数均可达到109～1010cfu/ml，即可以实现生物量的高效富集。
本发明的第三个目的是提供一种上述复合菌剂的制备方法，以及其在含吡啶焦化废水的生物处理中的应用。
将5株菌分别于含有500～1500mg/L(优选1000mg/L)吡啶的LB培养基中生长、富集至各自的对数生长期，达到最大生物量，然后取一定体积菌液离心、生理盐水洗涤、收集菌体，按预定干重比混合即可得到所需复合菌剂。
上述菌剂中5株菌的干重比最优是W12∶KT-J002∶KT-J007∶ATCC49442∶ATCC15481＝1.26∶1.17∶1.30∶1.94∶0.08。
本发明的复合菌剂可在环境污染治理中加以应用，用于降解废水或土壤中的有机污染物，所述有机污染物包括吡啶、苯、苯酚、二甲苯、喹啉、氰化物等有毒物质，特别是能有效降解吡啶，尤其适用于含吡啶工业污染废水如焦化废水、农药废水的治理。
投加本发明的复合菌剂于焦化废水，30℃，250rpm，摇瓶振荡3天，结果显示吡啶和COD都得到很好的降解，达到排放标准。
所述焦化废水的pH为7.0-7.5，COD为1500～2000mg/L，吡啶含量为30～60mg/L。
组成本发明的复合菌剂的5株菌均能有效降解吡啶，且对苯、苯酚、二甲苯、喹啉、氰化物等有毒物质具有耐受性或降解能力，此外脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12CGMCC No.1673和纤维单胞菌(Cellulomonas sp)KT-J007可在无氧条件下有效地代谢含氮化合物，而吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinovora)KT-J002 CGMCC No.2789具有广泛的环境适应性，藤黄微球菌(Micrococcus luteus)ATCC49442和成晶节杆菌(Arthrobactercrystallopoietes)ATCC15481可以矿化吡啶。而众所周知，焦化废水治理的几个重要方面包括：1)有机污染物如苯酚、吡啶、喹啉等的生物降解；2)氨氮及其他含氮元素物质的脱除。因此，本发明提供的复合菌剂十分适合用于焦化废水生物处理，没有明显的延滞期，而且处理结束后，菌体经静置能很快絮凝沉降，上层水质比较清澈。
本发明的菌剂富集容易、成本低廉，生物量较高，制备方法简单，可以用于吡啶含量较高的焦化废水的处理，处理后废水COD可以达到排放标准，具有较大的应用潜力和市场价值。
生物材料的保藏
吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinovora)KT-J002于2008年12月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC，地址在北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.2789。
纤维单胞菌(Cellulomonas sp)KT-J007于2008年12月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC，地址在北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.2788。
附图说明
图1a是实施例3所测脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCC No.1673在富集培养基中的生长曲线；
图1b是实施例3所测吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinovora)KT-J002 CGMCC No.2789在富集培养基中的生长曲线；
图1c是实施例3所测纤维单胞菌(Cellulomonas sp)KT-J007 CGMCC No.2788在富集培养基中的生长曲线；
图1d是实施例3所测成晶节杆菌(Arthrobacter crystallopoietes)ATCC15481在富集培养基中的生长曲线；
图1e是实施例3所测藤黄微球菌(Micrococcus luteus)ATCC49442在富集培养基中的生长曲线。
图2a是实施例3所测脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCC No.1673，吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinovora)KT-J002 CGMCC No.2789，纤维单胞菌(Cellulomonas sp)KT-J007 CGMCC No.2788的吡啶降解曲线；
图2b是实施例3所测成晶节杆菌(Arthrobacter crystallopoietes)ATCC 15481和藤黄微球菌(Micrococcus luteus)ATCC 49442的吡啶降解曲线。
图3a是实施例3所测脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCC No.1673和吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinovora)KT-J002 CGMCC No.2789在不同的吡啶初始浓度下生长3天的生物量；
图3b是实施例3所测脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCC No.1673和吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinovora)KT-J002 CGMCC No.2789在不同的吡啶初始浓度下吡啶降解率的比较。
图4是实施例4中5株菌两两组合吡啶降解实验结果。
图5是实施例4中吡啶混菌降解实验结果。
图6是实施例4中最优组合复合菌剂降解吡啶最适温度考查结果。
图7是实施例4中最优组合复合菌剂降解吡啶最适转速考查结果。
图8是实施例4中最优组合复合菌剂在最适条件下吡啶降解曲线。
图9是实施例5中复合菌剂在焦化废水中的吡啶降解曲线。
具体实施方式
下述实验方法如无特别说明均为常规方法，所有培养基中的溶剂均为水。
修改的ATCC的1780号降解培养基(简称1780改)：K2HPO4 0.61g/L，KH2PO4 0.39g/L，KCl 0.25g/L，MgSO4·7H2O 0.13g/L，微量元素液1.0ml/L，其中每1000ml微量元素液包括CaCl2·2H2O 0.0004g，FeSO4·7H2O 0.04g，MnSO4·4H2O 0.04g，ZnSO4·7H2O 0.02g，CuSO4·5H2O 0.005g，CoCl2·6H2O 0.004g，NaCl 1.0g，Na2MoO4·2H2O 0.005g。
吡啶的检测方法采用高效液相色谱(HPLC)法：
样品处理：在好氧降解过程中，每隔一定时间取样，水样在8000rpm下离心10min，上清经0.45μm滤膜过滤后用于吡啶的HPLC定量分析。
色谱仪为岛津LC-20A，色谱柱为大连依利特C18反向柱，250mm×4.6mm，粒度为5μm；流动相为70％(v/v)甲醇水溶液，流动相流速为1.0ml/min。测定波长254nm，保留时间3.3min。
COD检测方法：
COD检测仪：CM-05A多功能水质测定仪(北京双晖京承电子产品公司)，操作方法参照仪器说明书。
实施例1、吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinovora)KT-J002 CGMCC No.2789和纤维单胞菌(Cellulomonas sp)KT-J007CGMCC No.2788的分离、纯化和鉴定
吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinovora)KT-J002分离自湖北沙隆达农药厂经污水长期浸泡的土壤。具体富集、分离、纯化过程如下：
将采集的样品接种到含有吡啶、喹啉、苯酚和氰化物等混合底物的1780改选择性培养基(各底物的浓度分别为吡啶1000mg/L、喹啉100mg/L、苯酚200mg/L、氰化物100mg/L)，30℃，180rpm下振荡培养一周，然后以10％的接种量接种至新鲜的富集培养基中继续振荡，待培养液混浊后，同样再以10％的接种量接种至新鲜的富集培养基中继续振荡，直至培养液再次混浊后，将富集液稀释涂布到含吡啶(浓度为1000mg/L)的固体1780改分离培养基上，30℃，恒温培养，直至长出明显可见的菌落。挑取单菌落在同样的固体平板上划线纯化，通过吡啶降解实验复筛，最终得到降解效率最高的纯菌株。对获得的菌株进行形态观察、生理生化鉴定和16SrRNA基因测序鉴定，结果表明菌体可在普通细菌LB培养基及无机盐加吡啶(1.96g/L吡啶)筛选培养基上生长，菌落红色，圆形，光滑，较干燥。G+，细胞形态不规则。好氧，呼吸代谢，无气生菌丝。最后经16SrRNA基因的部分序列的比对分析，将该菌株鉴定为吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinovora)。该菌株被命名为吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinovora)KT-J002，并已于2008年12月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.2789。
纤维单胞菌(Cellulomonas sp)KT-J007分离自青海省西宁钢厂综合废水排污口处污泥。具体富集、分离、纯化过程同吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinovora)KT-J002。对获得的菌株进行形态观察、生理生化鉴定和16SrRNA基因测序鉴定，结果表明菌体可在普通细菌LB培养基及无机盐加吡啶(1.96g/L吡啶)筛选培养基上生长，菌落淡黄色，光滑，湿润。G+，杆菌。兼性厌氧，化能异养菌，可呼吸代谢也可发酵，接触酶阳性。能分解纤维素。还原硝酸盐到亚硝酸盐。最后经16srRNA基因的部分序列的比对分析，将该菌株鉴定为纤维单胞菌(Cellulomonas sp)。该菌株被命名为纤维单胞菌(Cellulomonas sp)KT-J007，并已于2008年12月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.2788。
实施例2、复合菌剂的5株菌对污染物的降解谱
1780改培养基作为基本培养基(其中当添加苯、苯酚、甲苯、二甲苯时，同时向培养基中加入1.0g/L的NH4NO3作为氮源)，以表1所示的有机污染物作为唯一添加的能源、碳源或氮源，采用固体培养的方式，在30℃、静置培养一周，观察菌落形成的情况。对苯、苯酚、甲苯、二甲苯、吡啶、氰化物、喹啉、咪唑等化合物的测试结果如表1所示。结果表明，5株菌的降解谱还是比较宽的，可以利用多种有机污染物生长，尤其是对吡啶具有较高的降解活性。
表15株菌对有机污染物的降解利用情况
Figure G2009100766679D00081
注：表中“+”表示菌体在相应的污染物平板上生长，“+”越多表示菌长得越好；“-”表示菌体在相应的污染物平板上不长；“√”表示菌体在相应的污染物平板上生长旺盛，污染物对菌没有任何作用。
实施例3、5株菌单独降解单一吡啶基质的特性
1)5株菌在富集培养基中的生长曲线的测定
为了确定降解实验时所用菌体在富集培养基中的最佳菌龄及接菌量，我们绘制了5株菌在富集培养基含1000mg/L吡啶的LB中的生长曲线。生长条件为：从斜面挑一环菌体接于装有40ml培养基的300ml三角瓶中，30℃，200rpm振荡培养，隔一定时间取样，测菌体OD600和干重，结果如图1a-1e。由图可知，脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12CGMCC No.1673大约在10h开始进入对数期，22h达到对数中后期，34h开始进入稳定期，故选择22h为最适菌龄，此时菌体干重为84.6mg；吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinovora)KT-J002 CGMCC No.2789大约在16h进入对数期，28h达到对数中后期，37h开始进入稳定期，故选择28h为最适菌龄，此时菌体干重为61.1mg；纤维单胞菌(Cellulomonas sp)KT-J007 CGMCC No.2788大约在11h进入对数期，34h达到对数中后期，43h开始进入稳定期，故选择34h为最适菌龄，此时菌体干重为100.2mg；藤黄微球菌(Micrococcus luteus)ATCC49442大约在18h进入对数期，33h～53h达到对数中后期(其中有一个二次生长的过程，推测为利用吡啶的阶段)，70h开始进入稳定期，故选择34h为最适菌龄，此时菌体干重为84mg；成晶节杆菌(Arthrobacter crystallopoietes)ATCC15481大约在12h进入对数期，34h达到对数中后期，43h开始进入稳定期，故选择34h为最适菌龄，此时菌体干重为91.7mg。
2)纯菌降解实验
菌体在富集培养基中生长至最适菌龄，4000rpm、10min，离心、洗涤、收集，然后接于降解培养基(1780改)中，吡啶初始浓度为400mg/L左右，每隔一定时间取样，测定吡啶残留浓度，绘制出降解曲线，结果见图2a-2b。由图可见，除纤维单胞菌(Cellulomonassp)KT-J007 CGMCC No.2788以外，其余4株菌均可以在20h内将吡啶降解完全，纤维单胞菌(Cellulomonas sp)KT-J007 CGMCC No.2788的降解速率稍慢，需要67h降解完全。从5株菌的降解实验来看，脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCC No.1673和吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinovora)KT-J002 CGMCC No.2789对吡啶的降解能力应该是最强的，故我们考查了这两株菌对不同浓度吡啶的耐受性及降解能力(图3a-3b)。结果表明，当吡啶浓度达到2000mg/L时，吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinovora)KT-J002CGMCC No.2789的生长已经受到抑制，而脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12CGMCC No.1673则可以耐受3000mg/L的吡啶，而且两株菌都可以以吡啶为唯一碳源、能源和氮源生长，吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinovora)KT-J002 CGMCC No.2789可以在3天内将1000mg/L的吡啶降解完全，脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCCNo.1673则可在3天内完全降解3000mg/L的吡啶。
实施例4、复合菌剂的制备及其对单一吡啶基质的降解
1)菌体间的拮抗实验
为了摸索出5株菌用于混合处理吡啶污染体系的一个最佳配比组合，以便用于生物强化技术处理吡啶污染废水，我们首先做了5株菌两两等比例组合对吡啶的降解实验，降解方法同纯菌降解实验，即采用单一基质条件降解，降解培养基为1780改，吡啶初始浓度为400mg/L左右，结果如图4所示。图4中，A、B、C、D、E分别代表菌株W12，KT-J002，KT-J007、ATCC49442和ATCC15481，0d代表初始时，2d代表降解2天后，横坐标未标出了10种组合降解2天后的吡啶浓度，因为除了对照，其他所有样品组合2天后都未检测到吡啶。可以看出，所有的组合情况下400mg/L的吡啶在2天内都被降解完全，虽然可能由于降解持续的时间有些长而没看出不同组合的差别，但是可以肯定的是5株菌两两之间没有拮抗和抑制作用，这样下步可以直接用5株菌采用不同的组合配比进行实验。
2)不同菌株间最优比例组合实验
为了确定5株菌降解吡啶的最佳组合配比，我们试图设计一个5因素3水平的BBD实验进行优化。为此，先做一个不同菌株间等比例(干重比)组合降解吡啶的预实验。分为3种组合：3株菌等比例，包括W12、KT-J002和ATCC49442；4株菌等比例组合，包括W12、KT-J002、ATCC49442和ATCC15481；5株菌等比例组合，包括W12、KT-J002、KT-J007、ATCC49442和ATCC15481。同时加一个W12的单菌降解做对照，降解方法同纯菌降解实验，即采用单一基质条件降解，降解培养基为1780改，吡啶初始浓度为1300mg/L左右。实验结果表明，5株菌等比例混合的情况下降解能力最强，但是不论哪种组合都可以将1300mg/L左右的吡啶在20h内完全降解，如图5所示。于是，在此基础上我们选择12h为BBD实验的降解时间，来比较不同组合下对吡啶的降解情况，同样采用单一基质条件进行降解。使用design expert 7.1设计软件进行实验设计和结果分析。其中因素A、B、C、D、E分别代表菌株W12、KT-J002、KT-J007、ATCC49442和ATCC15481，表中的不同比例组合都是菌体的干重比，3个水平：0、1、2。
表2.优化最佳菌株组合的BBD实验设计
  实验编号   因素A   因素B   因素C   因素D   因素E   响应值
  1   1.00   0.00   1.00   2.00   1.00   80.32
  2   0.00   2.00   1.00   1.00   1.00   42.09
  3   1.00   1.00   1.00   1.00   1.00   75.52
  4   2.00   0.00   1.00   1.00   1.00   65.91
  5   1.00   2.00   2.00   1.00   1.00   73.88
  6   2.00   1.00   1.00   0.00   1.00   58.5
  7   1.00   1.00   0.00   1.00   0.00   56.51
  8   2.00   1.00   1.00   1.00   0.00   57.27
  9   1.00   1.00   2.00   1.00   2.00   69.68
  10   1.00   1.00   1.00   1.00   1.00   79.48
  11   1.00   1.00   1.00   0.00   2.00   76.31
  12   1.00   1.00   0.00   0.00   1.00   51.44
  13   1.00   1.00   1.00   1.00   1.00   66.06
  14   1.00   1.00   1.00   2.00   0.00   89.07
  15   1.00   1.00   1.00   1.00   1.00   75.01
  16   0.00   1.00   1.00   2.00   1.00   36.68
  17   1.00   1.00   0.00   2.00   1.00   56.95
  18   0.00   1.00   2.00   1.00   1.00   40.76
  19   1.00   1.00   2.00   0.00   1.00   67.98
  20   2.00   1.00   1.00   1.00   2.00   82.41
  21   1.00   0.00   0.00   1.00   1.00   49.93
  22   1.00   1.00   0.00   1.00   2.00   59.3
  23   2.00   1.00   2.00   1.00   1.00   62.59
  24   1.00   0.00   1.00   0.00   1.00   68.71
  25   0.00   1.00   1.00   0.00   1.00   32.97
  26   0.00   0.00   1.00   1.00   1.00   24.33
  27   1.00   1.00   2.00   2.00   1.00   86.76
  28   2.00   2.00   1.00   1.00   1.00   81.66
  29   0.00   1.00   1.00   1.00   0.00   36.29
  30   1.00   0.00   1.00   1.00   2.00   72.26
  31   1.00   0.00   2.00   1.00   1.00   54.48
  32   1.00   2.00   1.00   1.00   0.00   84.17
  33   2.00   1.00   0.00   1.00   1.00   55.94
  34   2.00   1.00   1.00   2.00   1.00   74.87
  35   1.00   2.00   1.00   0.00   1.00   75.17
  36   1.00   1.00   1.00   1.00   1.00   73
  37   0.00   1.00   0.00   1.00   1.00   39.73
  38   0.00   1.00   1.00   1.00   2.00   39.94
  39   1.00   2.00   1.00   1.00   2.00   77.41
  40   1.00   1.00   1.00   2.00   2.00   75.99
  41   1.00   1.00   2.00   1.00   0.00   72.49
  42   1.00   1.00   1.00   1.00   1.00   81.08
  43   1.00   2.00   1.00   2.00   1.00   71.55
  44   1.00   0.00   1.00   1.00   0.00   81.62
  45   1.00   2.00   0.00   1.00   1.00   77.9
  46   1.00   1.00   1.00   0.00   0.00   55.43
结果分析如下：
表3菌株最佳组合的实验最适模型的分析
  Source   Sum ofSquares   Degree offreedom   Mean square   F value   p value
  Model   46.60   20   2.33   8.87   ＜0.0001
  A-A   18.58   1   18.58   70.77   ＜0.0001
  B-B   2.08   1   2.08   7.91   0.0094
  C-C   1.61   1   1.61   6.15   0.0203
  D-D   1.69   1   1.69   6.43   0.0178
  E-E   0.14   1   0.14   0.52   0.4761
  AB   0.10   1   0.10   0.39   0.5398
  AC   0.031   1   0.031   0.12   0.7349
  AD   0.12   1   0.12   0.45   0.5071
  AE   0.37   1   0.37   1.40   0.2471
  BC   0.074   1   0.074   0.28   0.5991
  BD   0.20   1   0.20   0.74   0.3964
  BE   6.215×10-003   1   6.215×10-003   0.024   0.8790
  CD   0.12   1   0.12   0.46   0.5038
  CE   0.031   1   0.031   0.12   0.7356
  DE   1.01   1   1.01   3.85   0.0610
  A2   17.00   1   17.00   64.75   ＜0.0001
  B2   1.529×10-003   1   1.529×10-003   5.822×10-003   0.9398
  C2   2.32   1   2.32   8.83   0.0065
  D2   0.12   1   0.12   0.45   0.5083
  E2   0.011   1   0.011   0.041   0.8410
  Residual   6.56   25   0.26
  Lack of Fit   6.08   20   0.30   3.16   0.1029
  Pure Error   0.48   5   0.096
  Cor Total   53.17   45
通过上表的分析，认为5个因素的显著性关系为A＞B＞D＞C，因素E不太显著。其中A2也是最显著的。根据结果计算出的模拟数学方程如下：
Sqrt(R1)＝+4.14844+3.46440A+0.86399B+1.31102C+0.93531D+0.26950E-0.15926AB+0.087724AC+0.17244AD+0.30365AE-0.13642BC-0.22108BD+0.039416BE+0.17379CD-0.087497CE-0.50272DE-1.39564A2-0.013234B2-0.51550C2-0.11642D2+0.035160E2
模拟后，计算出的最佳组合及响应值如下：A∶B∶C∶D∶E＝1.26∶1.17∶1.30∶1.94∶0.08，R1＝90.80％。
3)应用最优组合配比考查复合菌剂降解吡啶的最适温度和转速
按照模拟出的最优组合配比组成的复合菌剂进行降解吡啶最适温度的考查，降解方法同纯菌降解实验，即采用单一基质条件降解，降解培养基为1780改，吡啶初始浓度为1300mg/L左右，降解时间定为12h，结果如图6、7所示。由图可知，复合菌剂降解吡啶的最适温度为30℃，这与每个单菌生长的温度是一致的；复合菌剂降解吡啶的最适转速为250rpm，可见复合菌剂对吡啶的降解要求严格的好氧，且溶氧量很高。
4)复合菌剂的吡啶降解曲线的测定
按照已优化的最适组合配比、最适降解温度和转速，测定了复合菌剂降解吡啶的动力学过程，降解方法同纯菌降解实验，即采用单一基质条件降解，降解培养基为1780改，吡啶初始浓度为1300mg/L左右，结果如图8。复合菌剂在最适条件下可以将1300mg/L左右的吡啶在18h内几乎降解完全，降解过程几乎没有延滞期，即不存在底物抑制情况。
实施例5、复合菌剂投加实际焦化废水处理实验
按照已确定的最适富集条件和最佳配比组合富集并投加复合菌剂于工业焦化废水，以不投加菌剂的废水样品作为对照。在最适条件下，以500ml摇瓶为反应器，振荡处理。结果20小时内菌体即可将焦化废水中的吡啶全部降解完全，如图9所示，而对照中的吡啶几乎没有太大降低。经3天左右，投加菌剂的样品将废水的COD从1680mg/L降至100mg/L左右，达到可以排放的国家标准(200mg/L)以下，而对照的COD同样没有明显的降解。由此可见，虽然在焦化废水中复合菌剂降解40mg/L吡啶所需时间同样将近20小时，与单一组分降解实验相比要慢不少(单一组分条件下降解1300mg/L左右的吡啶也需要20小时)，这可能因为焦化废水的复杂的有机成分和固有微生物对菌剂有一定影响，但是总体来说，这些成分对菌剂的处理活性影响不大，因为复合菌剂降解吡啶同样没有明显的延滞期，而且复合菌剂最终也可以利用废水中的其它有机成分使COD降低。而对于未接菌的对照样品，3天内废水中的固有微生物并没有产生任何降解作用，吡啶和COD都没有明显变化。处理结束后，还发现接菌的样品静置20min左右菌体很快絮凝沉降，上层水质比较清澈。因此，复合菌剂在用于焦化废水的实际生物处理中有着巨大的潜力和应用前景。

Claims (8)

1.吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinovora)KT-J002，其保藏号为CGMCC No.2789。
2.保藏号为CGMCC No.2789的吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinovora)KT-J002在治理环境污染中的应用。
3.一种吡啶降解复合菌剂，包括下述5种微生物：保藏号为CGMCC No.1673的脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12，保藏号为CGMCC No.2789的吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinovora)KT-J002，保藏号为CGMCC No.2788的纤维单胞菌(Cellulomonas sp)KT-J007，保藏号为ATCC 49442的藤黄微球菌(Micrococcus luteus)和保藏号为ATCC 15481的成晶节杆菌(Arthrobacter crystallopoietes)。
4.如权利要求3所述的复合菌剂，其特征在于：所述菌剂中5种菌的干重比是W12∶KT-J002∶KT-J007∶ATCC49442∶ATCC15481＝1.26∶1.17∶1.30∶1.94∶0.08。
5.权利要求3所述复合菌剂的制备方法，是将保藏号为CGMCC No.1673的脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12，保藏号为CGMCC No.2789的吡啶红球菌(Rhodococcuspyridinovora)KT-J002，保藏号为CGMCC No.2788的纤维单胞菌(Cellulomonas sp)KT-J007，保藏号为ATCC 49442的藤黄微球菌(Micrococcus luteus)和保藏号为ATCC15481的成晶节杆菌(Arthrobacter crystallopoietes)分别于含有500～1500mg/L吡啶的LB培养基中生长、富集至各自的对数生长期，在达到对数中后期时取菌液离心、洗涤、收集菌体，按5种菌预定干重比混合。
6.权利要求3所述复合菌剂在治理环境污染中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述复合菌剂用于处理含吡啶的焦化废水。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述焦化废水pH为7.0-7.5，COD为1500～2000mg/L，吡啶含量为30～60mg/L。
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