CN101857846B - 一种红球菌及其菌剂与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开的红球菌(Rhodococcus sp.)BZ-9保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号CGMCC No.3695。本发明还公开了一种微生物菌剂,其活性成分为红球菌BZ-9。本发明提供的红球菌BZ-9及其菌剂对多种有毒有机物质具有高效降解性能,在有铬(VI)的条件下也有很高的降解能力,适用于焦化废水、制革废水、印染废水以及其它石油化工生产过程中产生的含有苯酚和吡啶等有毒有机物质的有机废水的处理。
Description
技术领域
本发明涉及一种红球菌,还涉及利用该红球菌生产的微生物菌剂,以及所述红球菌及其菌剂在含铬(VI)工业废水中降解有毒有机物质与废水处理上的应用。
背景技术
吡啶、苯酚及其衍生物是重要的化工原料,也是焦化废水、印染废水、制革废水等工业废水的主要成分,研究发现这些化合物对人类和环境生物均具有较大的危害。铬(VI)的存在,不但会对人、环境产生直接危害,还会抑制环境生物去除有机污染物的能力,一般的生物治理很难使含有上述成分的废水的出水达标排放。微生物因具有强大的降解功能和较强的适应性,而经常被用做环境污染修复的重要工具。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种对有毒有机物质具有降解作用以及对工业废水具有较好处理效果的红球菌。
本发明的目的之二是提供一种利用上述红球菌生产的微生物菌剂。
本发明的目的之三是提供上述红球菌和菌剂在含有铬(VI)的条件下或不含有铬(VI)的条件下对有毒有机物质降解上的应用,以及在含铬(VI)工业废水处理上的应用。
本发明通过如下技术方案实现:
本发明提供的红球菌(Rhodococcus sp.)BZ-9,以下简称为红球菌BZ-9,已于2010年3月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.3695。
本发明的红球菌BZ-9的形态特征:菌体为短杆状。
本发明的红球菌BZ-9的生理生化特征:革兰氏染色阳性菌(革兰氏染色阳性);脲酶、接触酶阳性,氧化酶、VP反应和甲基红反应阴性;在LB固体培养基(成分如下:酵母膏5g/L,蛋白胨10g/L,NaCl 10g/L,pH7.0-7.2)上生长3天后,菌落大小约2-3mm,浅橘黄色,菌落凸起,边缘不规则,菌落表面干燥、粗糙,不透明。
本发明还公开了利用上述红球菌BZ-9生产的微生物菌剂,其活性成分为红球菌BZ-9菌体。
所述微生物菌剂的制备方法如下所述:
生产菌剂的工艺为:斜面种—摇瓶种—种子罐—生产罐—产品,所述产品的包装剂型为液体菌剂或固体吸附菌剂。
所述菌剂的制备具体可采用如下步骤:
1、斜面种:将菌株BZ-9(原种)在培养皿上活化,并测定降解性能,接种于试管斜面上备用。
2、摇瓶种:将试管种接种于200ml肉汤培养基(培养基成分为:牛肉膏0.3克、蛋白胨1.0克、NaCl 0.5克、水100毫升,pH 7.0~7.2)中,恒温振荡培养至对数生长期,准备接种种子罐。
3、种子罐:配制发酵培养基(培养基成分为:葡萄糖0.8%、(NH4)2 SO41%、K2HPO4 0.2%、MgSO4 0.05%、NaCl 0.01%、CaCO3 0.3%、酵母膏0.02%,其余为水,pH值7.2-7.5),将400L发酵培养基加入500L种子罐,121℃高压湿热灭菌,冷却至33℃后,将摇瓶菌种按10%(体积百分含量)的接种量接种入种子罐,培养至对数生长期,搅拌速度为220转/分,无菌空气通入量为1∶0.8(体积比)。
4、生产罐:生产罐(生产罐容量5吨)所用培养基成分与发酵培养基相同(投料量4.5吨),投料后的生产罐在1.1kg/cm2的压力下,121℃高压湿热灭菌,灭菌后冷却至35℃以下,通无菌空气保持无菌状态备用;将到达对数期的种子液按10%(体积百分含量)的接种量接入生产罐,接种后的生产罐温度控制在30-35℃,生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1∶(0.6-1.2)(体积比),搅拌速度为180-240转/分(可优选为240转/分),整个工艺流程培养时间为48-60小时;发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上。
5、产品:发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。
本发明提供的红球菌BZ-9及其菌剂对工业废水中的有毒有害物质及铬(VI)具有较强的抗性和适应性,具有较广的降解谱,能够降解吡啶、3-羟基吡啶、苯酚等化合物,能使吡啶、苯酚的降解率达到95%以上,3-羟基吡啶的降解率达到50%以上,特别是在含铬(VI)的条件下,对吡啶、3-羟基吡啶、苯酚也具有较好的降解效果。本发明的微生物菌剂为新型的芳香族有机污染物降解菌剂,具有生产使用成本低、使用方便、较广的降解谱、去除效果好的优点,可以使制革废水等废水中的苯酚的降解率达到95%以上。本发明提供的菌株和菌剂可用于降解工业废水中的有机有毒成分处理,适用于现代工业废水如焦化废水、制革废水、印染废水等含铬(VI)(或不含铬)废水以及其它石油化工生产过程中产生的含有苯酚、3-羟基吡啶和吡啶的有机废水的处理,可以保证工业废水中的苯酚和吡啶等有机物残留含量符合废水排放标准。本发明成功地解决了工业废水处理过程中的苯酚及其衍生物或其它杂环化合物去除效果不高的问题,降低了生产和使用过程中的工作量,降低了生产和使用成本,对于保护生态环境,保护人民的身体健康具有重要的意义。
保藏信息
本发明提供的红球菌(Rhodococcus sp.)BZ-9,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏编号为CGMCC No.3695,保藏日期为2010年3月26日。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实验均设置三次重复,结果取平均值。以下实施例中的“%”,如无特殊说明,均为质量百分含量。
降解率=(1-反应结束时化合物的量/反应起始时化合物的量)×100%。
基础盐液体培养基中各个有机物的浓度测定方法:取0.5ml液体,加入等体积的甲醇(充分振荡,使化合物溶解),用0.22μm的微孔滤膜过滤后使用配备有紫外检测器的高效液相色谱进行检测;检测条件如下;色谱柱,C18反相柱(4.6mm×150mm,5阳);流动相,甲醇∶水=5∶2(体积比);流速为0.7ml/min;上样量为20μl;各化合物的检测(定量)波长:吡啶,257nm;3-羟基吡啶,276nm;苯酚,271nm。浓度定量采用外标法。
焦化废水(或制革废水)中苯酚和吡啶的浓度测定方法:取0.5ml液体,加入等体积的甲醇(充分振荡),用0.22μm的微孔滤膜过滤后使用配备有紫外检测器的高效液相色谱进行检测;检测条件如下;色谱柱,C18反相柱(4.6mm×150mm,5μm);流动相,甲醇与水的初始体积比为2∶5,在15min内匀速调整为5∶2,维持2min后调整到初始比;流速为0.7ml/min;上样量为20μl;各化合物的检测(定量)波长如下:苯酚,271nm;吡啶,257nm。浓度定量采用外标法。
制革废水中的铬(VI)浓度测定采用二苯碳酰二肼分光光度法(GB 7467-87)。
实施例1:红球菌BZ-9的获得及鉴定
一、红球菌BZ-9的获得
取2009年12月从山东滨州制革厂废水中取得的活性污泥2g加入到含有吡啶、苯酚的基础盐液体培养基中培养7天,稀释后在含吡啶、苯酚的基础盐液体培养基平板上涂布,再培养7天后,挑取单菌落划线纯化后保存。
基础盐液体培养基成分:NaCl 1.0g、NH4NO3 1.0g、K2HPO4 1.5g、KH2PO4 0.5g和MgSO4·7H2O 0.2g,用水定容至1L,pH为7.0左右。
二、红球菌BZ-9的鉴定
(1)形态特征:菌体为短杆状。
(2)生理生化特征:革兰氏染色阳性菌(革兰氏染色阳性);脲酶、接触酶阳性,氧化酶、VP反应和甲基红反应阴性;在LB固体培养基上生长3天后,菌落大小约2-3mm,浅橘黄色,菌落凸起,边缘不规则,菌落表面干燥、粗糙,不透明。
(3)16S rDNA序列鉴定
采用如下引物:8F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′),1492(5′-TACCTTGTTA CGACTT-3′),进行PCR扩增,从菌株BZ-9中扩增到16S rDNA基因片段,将所获得16S rDNA克隆到pGEM T-easy载体后送北京诺塞基因组研究中心有限公司测序。16S rDNA的部分序列见序列表,与GenBank中的序列比对发现,BZ-9的16S rDNA序列与Rhodococcus属部分菌株序列的同源性高于99%.
三、红球菌BZ-9的保藏
通过以上鉴定结果,确认上述菌株为来自于红球菌属(Rhodococcus sp.)的细菌,将其命名为BZ-9,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCC No.3695。
实施例2:红球菌BZ-9在含铬(VI)的基础盐液体培养基对不同化合物的降解
挑取红球菌BZ-9单菌落于3ml LB液体培养基中,30℃、165转/分振荡培养24小时,获得新鲜菌液。
在100ml溶液A(或溶液B或溶液C)中,接入2ml新鲜菌液,30℃摇床培养(170转/分),3天后(72小时)取样测定化合物的降解率。
溶液A的制备方法:将苯酚加入基础盐液体培养基中,苯酚的终浓度为100mg/L,添加铬(VI),使铬的终浓度为20mg/L。
溶液B的制备方法:将3-羟基吡啶加入基础盐液体培养基中,3-羟基吡啶的终浓度为100mg/L,添加铬(VI),使铬的终浓度为20mg/L。
溶液C的制备方法:将吡啶加入基础盐液体培养基中,吡啶的终浓度为100mg/L,添加铬(VI),使铬的终浓度为20mg/L。
降解结果见表1。
表1红球菌BZ-9对不同化合物的降解率
底物 | 苯酚 | 吡啶 | 3-羟基吡啶 |
降解率(%) | 100 | 100 | >50 |
实施例3:红球菌BZ-9在制革废水中对不同化合物的降解
挑取红球菌BZ-9单菌落于3ml LB液体培养基中,30℃、165转/分振荡培养24小时,获得新鲜菌液。
量取100ml含铬(VI)废水,其中铬(VI)浓度为2mg/l,检测其中苯酚浓度添加量。苯酚的浓度为100mg/L。
接入2ml新鲜菌液,混匀,置于30℃,165转/分的摇床培养,4天后(96小时)取样测定化合物的降解率。结果见表2。
表2红球菌BZ-9在制革废水中对不同化合物的去除
底物 | 苯酚 | 铬(VI)还原 |
降解率(%) | 100 | >75 |
实施例4:红球菌BZ-9在焦化废水中对不同化合物的降解
挑取红球菌BZ-9单菌落于3ml LB液体培养基中,30℃、165转/分振荡培养24小时,获得新鲜菌液。
量取100ml焦化废水,苯酚的浓度为400±10mg/L;添加吡啶使其浓度为100±5mg/L。
接入2ml新鲜菌液,混匀,置于30℃,165转/分的摇床培养,4天后(96小时)取样测定化合物的降解率。结果见表3。
表3红球菌BZ-9在焦化废水中对不同化合物的降解率
底物 | 苯酚 | 吡啶 |
降解率(%) | >99 | >90 |
由上实施例可见,本发明提供的红球菌BZ-9及其菌剂对工业废水中的有毒有害物质及铬(VI)具有较强的抗性和适应性,具有较广的降解谱,能够同时降解吡啶、3-羟基吡啶、苯酚等化合物,能使吡啶、苯酚的降解率达到95%以上,3-羟基吡啶的降解率达到50%以上。可以保证工业废水中的苯酚和吡啶等有机物残留含量符合废水排放标准。本发明成功地解决了在工业废水处理过程中的苯酚及其衍生物或其它杂环化合物去除效果不高的问题,降低了生产和使用过程中的工作量,降低了生产和使用成本,对于保护生态环境,保护人民的身体健康具有重要的意义。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,凡依本发明权利要求范围所做的均等变化与修饰,皆应属本发明权利要求的涵盖范围。
序列表
<110>深圳清华大学研究院
<120>一种红球菌及其菌剂与应用
<130>
<160>1
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1429
<212>DNA
<213>Rhodococcus sp.
<400>1
gtggcggggg ggcgcgatac catgcagtcg acgatgaagc ccagcttgct gggtggatta 60
gtggcgaacg ggtgagtaac acgtgggtga tctgccctgc actctgggat aagcctggga 120
aactgggtct aataccggat atgacctcgg gatgcatgtt ctggggtgga aagtttttcg 180
gtgcaggatg agcccgcggc ctatcagctt gttggtgggg taatggccta ccaaggcgac 240
gacgggtagc cggcctgaga gggcgaccgg ccacactggg actgagacac ggcccagact 300
cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgc acaatgggcg caagcctgat gcagcgacgc 360
cgcgtgaggg atgacggcct tcgggttgta aacctctttc acccatgacg aagcgcaagt 420
gacggtagtg ggagaagaag caccggccaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag 480
ggtgcgagcg ttgtccggaa ttactgggcg taaagagctc gtaggcggtt tgtcgcgtcg 540
tctgtgaaat cccgcagctc aactgcgggc ttgcaggcga tacgggcaga ctcgagtact 600
gcaggggaga ctggaattcc tggtgtagcg gtgaaatgcg cagatatcag gaggaacacc 660
ggtggcgaag gcgggtctct gggcagtaac tgacgctgag gagcgaaagc gtgggtagcg 720
aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacggt gggcgctagg tgtgggtttc 780
cttccacggg atccgtgccg tagccaacgc attaagcgcc ccgcctgggg agtacggccg 840
caaggctaaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggcggagc atgtggatta 900
attcgatgca acgcgaagaa ccttacctgg gtttgacatg taccggacga ctgcagagat 960
gtggtttccc ttgtggccgg tagacaggtg gtgcatggct gtcgtcagct cgtgtcgtga 1020
gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttgtcc tgtgttgcca gcacgtgatg 1080
gtggggactc gcaggagact gccggggtca actcggagga aggtggggac gacgtcaagt 1140
catcatgccc cttatgtcca gggcttcaca catgctacaa tggtcggtac agagggctgc 1200
gataccgtga ggtggagcga atcccttaaa gccggtctca gttcggatcg gggtctgcaa 1260
ctcgaccccg tgaagtcgga gtcgctagta atcgcagatc agcaacgctg cggtgaatac 1320
gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca cgtcatgaaa gtcggtaaca cccgaagccg 1380
gtggcctaac cccttgtggg agggagccgt cgtatatgat cggcagtcg 1429
Claims (6)
1.一种红球菌(Rhodococcus sp.)BZ-9,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.3695。
2.利用权利要求1所述的红球菌BZ-9生产的微生物菌剂,其特征在于其活性成分为红球菌BZ-9菌体。
3.如权利要求1所述的红球菌BZ-9在降解有毒有机物质中的应用,其特征在于:所述有毒有机物质为苯酚或吡啶或3-羟基吡啶,所述有毒有机物质与铬VI共存或不与铬VI共存。
4.如权利要求1所述的红球菌BZ-9在废水处理中的应用,其特征在于:所述废水为焦化废水或含铬VI制革废水或印染废水。
5.如权利要求2所述的菌剂在降解有毒有机物质中的应用,其特征在于:所述有毒有机物质为苯酚或或吡啶3-羟基吡啶,所述有毒有机物质与铬VI共存或不与铬VI共存。
6.如权利要求2所述的菌剂在废水处理中的应用,其特征在于:所述废水为焦化废水或含铬VI的制革废水或印染废水。
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