CN101805713B

CN101805713B - 一株棒杆菌菌株及其应用

Info

Publication number: CN101805713B
Application number: CN2010101084491A
Authority: CN
Inventors: 吴晓磊; 孙纪全; 汤岳琴; 刘伟强; 赵晶晶; 郭鹏
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2010-02-05
Filing date: 2010-02-05
Publication date: 2012-03-21
Anticipated expiration: 2030-02-05
Also published as: CN101805713A

Abstract

本发明公开了一株棒杆菌菌株及其应用。本发明提供的菌株为棒杆菌(Corynebacterium sp.)SG-20 CGMCC No.3557。本发明提供的菌剂，活性成分为棒杆菌(Corynebacterium sp.)SG-20 CGMCC No.3557。本发明提供的菌株有较广的降解谱，对多种有毒化合物的降解率达到90％以上。本发明的菌剂具有生产使用成本低、使用方便、较广的降解谱、去除效果好的优点。本发明提供的菌株和菌剂适用于制革和印染过程所产生的含铬废水、以及其它石油化工过程中产生废水中苯酚、对氯酚等有机污染物和铬(VI)的生物处理，可以保证废水中的苯酚、对氯苯酚等有机物和铬(VI)含量符合废水排放标准。本发明成功地解决了含铬有机废水处理过程中的苯酚和对氯酚等化合物去除效果不高的问题，降低了生产和使用过程中的工作量，降低了生产和使用成本，对于保护生态环境，保护人民的身体健康具有重要的意义。

Description

一株棒杆菌菌株及其应用

技术领域

本发明涉及一株棒杆菌菌株及其应用。

背景技术

苯酚、对氯酚、苯及其衍生物是重要的化工原料，研究发现这些化合物对人类和环境生物均具有较大的危害。铬(VI)是许多化工废水的重要成份，铬(VI)对人体具有明显的毒害作用，铬的存在对废水中有机污染物的生物去除作用具有明显地抑制。一般的生物治理很难使含有上述成分的废水的出水达标排放。微生物因具有强大的降解功能和较强的适应性，而经常被用做环境污染修复的重要工具。

发明内容

本发明的目的是提供一株棒杆菌菌株及其应用。

本发明提供的棒杆菌(Corynebacterium sp.)，名称为SG-20，属于棒杆菌属(Corynebacterium)，分离自废水处理装置中，已于2009年12月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.3557。

本发明还保护一种菌剂，它的活性成分为棒杆菌(Corynebacterium sp.)SG-20CGMCC No.3557。

所述菌株和/或所述菌剂在降解有毒物质中的应用也属于本发明的保护范围；所述有毒物质为苯酚、邻苯二酚和对氯苯酚中的至少一种。

所述菌株和/或所述菌剂在去除铬(VI)中的应用也属于本发明的保护范围

所述铬(VI)，又称六价铬。

本发明还保护一种降解有毒物质的方法，是所述菌株和/或所述菌剂降解有毒物质；所述有毒物质为苯酚、邻苯二酚和对氯苯酚中的至少一种。

所述废水具体可为制革和印染过程所产生的含铬废水、以及其它石油化工过程中产生废水等。

本发明同时保护一种处理废水的方法，是将所述菌株和/或所述菌剂加入所述废水中。

生产菌剂的工艺为：斜面种-摇瓶种-种子罐-生产罐-产品(包装剂型为液体菌剂或固体吸附菌剂)。

用所述菌株制备所述菌剂具体可采用如下步骤：

1、将菌株SG-20(原种)在培养皿上活化，并测定降解性能，接种于试管斜面上备用。

2、将试管种接种于1000ml摇瓶(含200ml肉汤培养基)中，恒温振荡培养至对数期，准备接种种子罐。

3、配制发酵培养基(葡萄糖0.8％、(NH₄)₂SO₄1％、K₂HPO₄0.2％、MgSO₄0.05％、NaCl 0.01％、CaCO₃0.3％、酵母膏0.02％，pH值7.2-7.5)，将400升发酵培养基加入500L种子罐，121℃高压湿热灭菌，冷却至33℃后，将摇瓶菌种按10％(体积百分含量)的接种量接种入种子罐，培养至对数生长期，搅拌速度为220转/分，无菌空气通入量为1∶0.8(体积比)。

4、生产罐(生产罐容量5吨)所用培养基成分与发酵培养基相同(投料量4.5吨)，投料后的生产罐1.1kg/cm²的压力下，121℃高压湿热灭菌，灭菌后冷却至35℃以下，通无菌空气保持无菌状态备用；将到达对数期的种子液按10％(体积百分含量)的接种量接入生产罐，接种后的生产罐温度控制在30-35℃，生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1∶(0.6-1.2)，搅拌速度为180-240转/分(如240转/分)，整个工艺流程培养时间为48-60小时；发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上。

5、发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。

本发明提供的菌株SG-20对铬和其它的有毒有害物质具有较强的抗性，可以在废水中长时间起作用，具有较广的降解谱，能够同时降解苯酚、对氯苯酚和邻苯二酚等化合物，降解率达到90％以上，并且可以还原铬(VI)，达到除铬(VI)的效果。本发明的菌剂具有生产使用成本低、使用方便、较广的降解谱、去除效果好的优点。本发明提供的菌株和菌剂可用于降解废水中的有机有毒成分和去除铬(VI)，适用于制革和印染过程所产生的含铬废水、以及其它石油化工过程中产生废水中苯酚、对氯酚等有机污染物和铬(VI)的生物处理，可以保证废水中的苯酚、对氯苯酚等有机物和铬(VI)含量符合废水排放标准。本发明成功地解决了含铬有机废水处理过程中的苯酚和对氯苯酚等化合物去除效果不高的问题，降低了生产和使用过程中的工作量，降低了生产和使用成本，对于保护生态环境，保护人民的身体健康具有重要的意义。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实验均设置三次重复，结果取平均值。以下实施例中的“％”，如无特殊说明，均为质量百分含量。

基础盐培养基中各个有机物的浓度测定方法：取0.5ml液体，加入等体积的甲醇(充分振荡，使化合物溶解)，用0.22μm的微孔滤膜过滤后使用配备有紫外检测器的高效液相色谱进行检测；检测条件如下：色谱柱，C18反相柱(4.6mm×150mm，5μm)；流动相，甲醇∶水＝5∶2，体积比；流速为0.7ml/min；上样量为20μl；各化合物的检测(定量)波长：苯酚，271nm；邻苯二酚，275nm；对氯苯酚，281nm。浓度定量采用外标法。

制革废水中苯酚和甲酚(间甲基苯酚、邻甲基苯酚、对甲基苯酚)的浓度测定方法：取0.5ml液体，加入等体积的甲醇(充分振荡)，用0.22μm的微孔滤膜过滤后使用配备有紫外检测器的高效液相色谱进行检测；检测条件如下；色谱柱，C18反相柱(4.6mm×150mm，5μm)；流动相，甲醇∶水，初始体积比为2∶5，在15min内匀速调整为5∶2，维持2min后调整到初始比；流速为0.7ml/min；上样量为20μl；各化合物的检测(定量)波长如下：苯酚，271nm；甲酚，276nm。浓度定量采用外标法。

制革废水中的铬(VI)浓度测定采用二苯碳酰二肼分光光度法(GB 7467-87)。

实施例1、菌株SG-20的获得和鉴定

一、菌株SG-20的获得

2008年8月从广东韶关取焦化废水活性污泥2g加入到含有苯酚的基础盐培养基中培养7天后，稀释后在含苯酚的基础盐培养基平板上涂布，培养7天后，挑取单菌落划线纯化后保存。

二、菌株SG-20的鉴定

形态特征：菌体为杆状。

生理生化特征：主要生物学特性为G⁺，革兰氏染色阳性菌；过氧化氢酶反应和葡萄糖发酵产酸阳性；硝酸盐还原、明胶水解、亚硝酸还原反应、甲基红反应、氧化酶、V.P.反应、吲哚反应为阴性；利用柠檬酸和丙酸盐，不能利用酒石酸，不能水解淀粉，可以在2％氯化钠中生长并降解苯酚。

分子鉴定结果：16S rDNA的部分序列见序列表的序列1。

三、菌株SG-20的保藏

通过以上鉴定结果，确认菌株SG-20为来自于棒杆菌属(Corynebacterium)的新菌，将其命名为SG-20，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.3557。

实施例2、菌株SG-20在基础盐液体培养基中对不同化合物的降解率

实施例2、菌株在基础盐液体培养基中对不同化合物的降解率

基础盐液体培养基：将1.0g NaCl、1.0g NH₄NO₃、1.5g K₂HPO₄、0.5g KH₂PO₄和0.2g MgSO₄·7H₂O用水定容至1L。

挑取SG-20单菌落于3ml LB液体培养基中，30℃、165转/分振荡培养24小时，获得新鲜菌液。在100ml溶液A(或溶液B或溶液C)中，接入5ml新鲜菌液，30℃摇床培养(165转/分)，3天后(72小时)取样测定化合物的降解率。结果见表1。

溶液A的制备方法：将苯酚和铬(VI)加入基础盐液体培养基中，苯酚的终浓度为100mg/L，铬(VI)的终浓度为1mg/L。

溶液B的制备方法：将邻苯二酚和铬(VI)加入基础盐液体培养基中，邻苯二酚的终浓度为100mg/L，铬(VI)的终浓度为1mg/L。

溶液C的制备方法：将对氯苯酚和铬(VI)加入基础盐液体培养基中，对氯苯酚的终浓度为100mg/L，铬(VI)的终浓度为1mg/L。

结果见表1。

表1菌株SG-20在基础盐液体培养基中对不同化合物的降解率(3天)

底物	苯酚	邻苯二酚	对氯苯酚
				降解率(％)	100	100	＞90

实施例3、菌株SG-20在制革废水中对苯酚的降解率和对铬(VI)的去除率

挑取SG-20单菌落于3ml LB液体培养基中，30℃、165转/分振荡培养24小时，获得新鲜菌液。量取100ml制革废水，检测其中铬(VI)的浓度(初始浓度)。铬的初始浓度约2mg/L。在制革废水中加入苯酚，使其终浓度为100mg/L；接入4ml新鲜菌液，混匀，置于30℃，165rpm的摇床培养，3天后(72小时)取样测定化合物的降解率。结果见表2。

表2菌株SG-20在制革废水中对苯酚的降解率和对铬(VI)去除率(3天)

底物	苯酚	Cr(VI)
			降解率/去除率(％)	＞99	＞50

序列表

<110>北京大学

<120>一株棒杆菌菌株及其应用

<130>CCGNARY102083

<160>1

<210>1

<211>1466

<212>DNA

<213>棒状杆菌(Corynebacterium sp.)

<400>1

aggatgaacg ctggcggcgt gcttaacaca tgcaagtcga acggaaaggc cccgcttgcg 60

gggtactcga gtggcgaacg ggtgagtaac acgtgggtga tctgccttgt acttcgggat 120

aagcttggga aactgggtct aataccggat aggaccactg tttggtgatg gtggtggaaa 180

gcttttgcgg tatgagatga gctcgcggcc tatcagcttg ttggtggggt aatggcctac 240

caaggcgtcg acgggtagcc ggcctgagag ggtgtacggc cacattggga ctgagatacg 300

gcccagactc ctacgggagg cagcagtggg gaatattgca caatgggcgg aagcctgatg 360

cagcgacgcc gcgtggggga tgacggcctt cgggttgtaa actcctttcg atagggacga 420

agcgtaagtg acggtacctg tagaagaagc accggctaac tacgtgccag cagccgcggt 480

aatacgtagg gtgcgagcgt tgtccggaat tactgggcgt aaagagctcg taggtggttt 540

gtcgcgtcgt ctgtggaagt ccggggctta actccggggg tgcaggcgat acgggcataa 600

cttgagtgct gtaggggaga ctggaatttc ctggtgtagc ggtggaatgc gcagatatca 660

ggaggaacac cgatggcgaa cgcaggtctc tgggcagtta ctgacgctga ggagcgaaag 720

catgggtagc gaacaggatt agataccctg gtagtccatg ctgtaaacgg tgggcgctag 780

gtgtagggga cttccacgtt tcctgtgccg tagctaacgc attaagcgcc ccgcctgggg 840

agtacggccg caaggctaaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggcggagc 900

atgtggatta attcgatgca acgcgaagaa ccttacctgg gcttgacata caccagatcg 960

ccgtagagat acggtttccc ttgtggttgg tgtacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct 1020

cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttgtct tatgttgcca 1080

gcacgtgatg gtggggactc atgagagact gccggggtta actcggagga aggtggggat 1140

gacgtcaaat catcatgccc cttatgtcca gggcttcaca catgctacaa tggtcggtac 1200

agcgcgttgc tacatcgtga ggtggtgcta atcgcttaaa gccggcctta gttcggattg 1260

gggtctgcaa ctcgacccca tgaagtcgga gtcgctagta atcgcagatc agcaatgctg 1320

cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca cgtcatgaaa gttggtaaca 1380

cccgaagcca gtggcctatc ctttagtggg ggggagctgt cgaaggtggg atcggcgatt 1440

gggacgaagt cgtaacaagg taacca 1466

Claims

1.棒杆菌(Corynebacterium sp.)菌株SG-20，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.3557。

2.一种菌剂，它的活性成分为棒杆菌(Corynebacterium sp.)SG-20CGMCCNo.3557。

3.权利要求1所述菌株和/或权利要求2所述菌剂在降解有毒物质中的应用；所述有毒物质为苯酚、邻苯二酚和对氯苯酚中的至少一种。

4.权利要求1所述菌株和/或权利要求2所述菌剂在去除铬(Ⅵ)中的应用。

5.一种降解有毒物质的方法，是用权利要求1所述菌株和/或权利要求2所述菌剂降解有毒物质；所述有毒物质为苯酚、邻苯二酚和对氯苯酚中的至少一种。

6.权利要求1所述菌株和/或权利要求2所述菌剂在废水处理中的应用；所述废水为含铬废水或制革废水。

7.一种处理废水的方法，是将权利要求1所述菌株和/或权利要求2所述菌剂加入所述废水中；所述废水为制革废水。