KR20100035055A - 디노피시스 아쿠미나타의 대량배양 및 이로부터 펙테노톡신-2의 분리 방법 - Google Patents

디노피시스 아쿠미나타의 대량배양 및 이로부터 펙테노톡신-2의 분리 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 설사성 패독을 유발하는 해양 와편모류, 디노피시스 아쿠미나타(Dinophysis acuminata) 종을 대량배양하는 방법 및 상기 디노피시스 아쿠미나타로부터 패류독소인 펙테노톡신-2를 추출 및 분리정제하는 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 디노피시스 아쿠미나타는 하면이 중앙 하측 방향으로 함입형성된 폴리카보네이트 재질의 수조; 상기 수조 내측 중앙부에 길이방향으로 길게 형성되어 형광등이 내장되는 아크릴관(E); 상기 수조의 하면의 함입된 중앙부에 공기를 공급하는 공기 공급 수단(B); 및 상기 공기 공급 수단으로부터 공급되는 공기를 정화시키는 자외선 램프(C) 또는 탄소카트리지 필터(D)에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 공기 정화 수단;을 포함하는 대량배양장치로부터 대량배양되어진다.
디노피시스 아쿠미나타, 대량배양, 펙테노톡신-2

Description

디노피시스 아쿠미나타의 대량배양 및 이로부터 펙테노톡신-2의 분리 방법{Methods for massive culture of Dinophysis acuminata and isolation of pectenotoxin-2}
본 발명은 설사성 패독을 유발하는 해양 와편모류, 디노피시스 아쿠미나타(Dinophysis acuminata) 종을 대량배양하는 방법 및 상기 디노피시스 아쿠미나타로부터 패류독소인 펙테노톡신-2를 추출 및 분리정제하는 방법에 관한 것이다.
적조를 일으키는 와편모 조류인 디노피스 종은 (Dinophysis sp.)는 설사성 패독에 속하는 펙테노톡신(pectenotoxin, PTX)을 생산한다고 알려져 있다. 따라서 해양에서 이 생물로 인하여 적조가 발생하게 되면 연안에서 양식되고 있는 패류에 막대한 피해를 끼쳐 왔다. 이 생물이 만드는 주요 독성 물질로는 오카다익 산 (okadaic acid), 펙테노톡신 (pectenotoxin), 디노톡신(dinotoxin) 예스톡신(yessotoxin)등이 알려져 있다. 하지만 최근 문헌에 의하면 펙테노톡신은 항암 세포에 선택적으로 사멸을 유도한다는 보고가 발표되어 이 물질에 대한 향후 의·약학적으로 유용성이 증대되고 있으며 또한 해양에서의 이 생물로 인한 적조 발생시 펙테노톡신은 독소의 표준 물질로 사용될 수 있다. 이와 같이 펙테노톡신은 그 응용성이 높음에도 불구하고 오랜 기간 동안 디노피시스 생물을 대량 배양에 성공하지 못하여 현장에서 한정된 채집에만 의존하여 왔기 때문에 많은 연구가 활발하게 진행되어 못하였다.
해양 와편모조류인 디노피시스 아쿠미나타는 2006년 이전까지 실험실에서 배양에 성공하지 못하였던 설사패독 원인생물이다. 2006년 해양섬모류인 미리오넥타 루브라의 실험실 배양체를 먹이로 공급하여, 처음으로 디노피시스 아쿠미나타를 배양할 수 있게 되었다 (Park et al. 2006. First successful culture of the marine dinoflagellate Dinophysis acuminata. Aquat. Microb. Ecol. 45, 101-106). 그 후, 미리오넥타 루브라를 먹이로 하는 디노피시스 아쿠미나타 또는 디노피시스에 속하는 다른 종들의 실험실 배양 성공에 대한 보고가 이어지고 있다.
그러나, 해양 와편모조류인 디노피시스 아쿠미나타는 실험실 규모로만 배양되고 있어 의·약학적으로 유용성이 증대되고 펙테노톡신에 대한 연구가 수행될 정도로 디노피시스 아쿠미나타의 배양량이 부족한 실정이며, 펙테노톡신에 대한 연구를 위하여 디노피시스 아쿠미나타의 대량 배양이 요구되고 있다.
따라서, 본 발명자들은 상기한 바와 같이, 실험실 배양에 최초로 성공한 디노피시스 아쿠미나타 종을 대상으로 이전의 소량의 실험실 배양 방법을 근거로 하여 500 리터급 대량배양을 위한 간편한 배양수조의 설계와 이를 이용한 생물 배양방법과 이 종이 함유하고 있는 설사성 패류독소인 펙테노톡신을 추출, 분리하는 방법을 확립하고자 하였다.
본 발명의 목적은 디노피시스 아쿠미나타 종을 대량배양하는 방법을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 디노피시스 아쿠미나타로부터 세포내 독소인 펙테노톡신-2(PTX-2)를 추출 및 분리정제하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 설사성 패독을 유발하는 해양 와편모류, 디노피시스 아쿠미나타(Dinophysis acuminata) 종을 대량배양하는 방법 및 상기 디노피시스 아쿠미나타로부터 패류독소인 펙테노톡신-2를 추출 및 분리정제하는 방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 설사성 패독을 유발하는 해양 와편모류, 디노피시스 아쿠미나타 종을 대량배양하는 방법에 관한 것으로, 하기의 4 단계로 이루어져 있다.
1) 해수배지에서 미리오넥타 루브라(Myrionecta rubra) 및 이의 먹이인 텔레 아우락스(Teleaulax)를 초기 밀도비 1:10 내지 1:15로 접종하여 10~30 ℃의 온도 및 연속광 하에서 미리오넥타 루브라를 계대배양시키는 단계;
2) 자외선 조사 후 탄소카트리지 필터를 거쳐 정화된 공기가 연속적으로 공급되는 수조 내에 상기 1)단계에서 배양된 미리오넥타 루브라를 접종하고 10~30 ℃의 온도 및 연속광 하에서 수조의 하단에 구비된 공기분산 노즐을 통해 형성된 기포로 상기 1)단계에서 배양된 미리오넥타 루브라 및 해수배지를 교반시켜 미리오넥타 루브라를 대량배양시키는 단계;
3) 디노피시스 아쿠미나타(Dinophysis acuminata)과 이의 먹이인 미리오넥타 루브라를 초기 밀도비 1: 10 내지 1:30로 접종시켜 10~30 ℃의 온도 및 연속광 하에서 디노피시스 아쿠미나타를 계대배양시키는 단계;
4) 상기 3)단계에서 배양된 디노피시스 아쿠마나타를 상기 2) 단계의 수조에 접종하여 대량배양시키는 단계.
본 발명의 디노피시스 아쿠미나타 종을 대량배양하는 방법에 사용되는 해수배지는 규조류를 제외한 조류를 배양하는데 사용될 수 있는 통상적인 배지를 모두 포함하며, 예를 들어 f/2-Si 배지, 특히 30 psu(practical salinity unit) f/2-Si 배지일 수 있다.
디노피시스 아쿠미나타 종을 대량배양하기 위한 대량배양장치, 즉, 500리터급 수조와 그 부속품에 대하여 도 1에 일례를 도시하였으며, 상기 대량배양장치는 디노피시스 아쿠미나타 뿐만 아니라 다른 종류의 식물플랑크톤의 대량 배양에도 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 디노피시스 아쿠미나타 종을 대량배양하는 방법 중 상기 2) 단계 및 4) 단계에서의 대량배양은 하면이 중앙 하측 방향으로 함입형성된 폴리카보네이트 재질의 원통형 수조; 상기 수조 내측 중앙부에 길이방향으로 길게 형성되어 형광등이 내장되는 아크릴관(E); 상기 수조의 하면의 함입된 중앙부에 공기를 공급하는 공기 공급 수단(B); 및 상기 공기 공급 수단으로부터 공급되는 공기를 정화시키는 자외선 램프(C) 또는 탄소카트리지 필터(D)에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 공기 정화 수단;을 포함하는 대량배양장치에서 실시되어진다[도 1].
상기 대량배양장치의 수조는 500리터급 이상의 수조로, 유해뮬질의 유출이 가장 적은 폴리카보네이트 재질의 판을 둥글게 말아 직경 0.8m 이상이면서, 하면이 중앙 하측 방향으로 함입형성되었기 때문에 대량배양된 디노피시스 아쿠미나타의 수확 및 수조 청소 후 배수가 용이하다. 또한, 외부로부터의 이물질 유입을 방지하기 위하여 수조의 상단에는 뚜껑이 구비되어진다. 수조의 전체 높이는 1m 이상으로, 원통형 부분과 원뿔형 부분이 2:1~3:2의 길이 비율을 가지고 있으며, 직경이 0.8m이상이므로 빛을 충분히 받을 수 있다.
또한, 대량배양에 따른 배양배지, 즉 해수배지 혼합 및 배양생물의 빛을 골고루 받게 하기 위한 상기 수조의 내측 중앙부에 길이 방향으로 길게 형광등(예를 들면, 32와트, 길이 120cm)이 내장된 아크릴관이 구비되어 있어 배양생물이 효과적으로 광합성을 할 수 있다. 뿐만 아니라 공기를 수조의 하면의 함입된 중앙부로 공 급하는 공기 공급 장치, 연결관 및 분사노즐로 이루어진 공기 공급 수단(B)과 상기 공기 공급 수단으로부터 공급되는 공기를 정화시키는 자외선 램프 또는 탄소 카트리지필터(D)에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 공기 정화 수단을 구비하고 있다. 공기 공급 수단에서 분사 노즐을 통해 수조의 하면의 함입된 중앙부로부터 작은 기포를 형성할 수 있다.
또한, 상기 대량배양 방법으로 배양된 디노피시스 아쿠미나타는 수조의 하면의 함입된 중앙부와 연결된 초고속 원심분리기(F)로 회수될 수 있다.
상기 대량배양장치를 이용하여 디노피시스 아쿠미나타 종을 배양한 결과를 도 2에 도시하였다.
본 발명의 방법에서 디노피시스 아쿠미나타 종과 이 종의 먹이인 미리오넥타 루브라 종의 대량배양을 위해서는 먼저, 100㎖ 규모로 실험실 종주를 대상으로 2ℓ로 배양하고, 2ℓ 용기는 20ℓ로, 20ℓ는 500ℓ로 계대배양하는 것이다. 이때 미리오넥타 루브라 종은 먹이인 텔레아우락스 종과 비율을 1:10 내지 1:15로 하는 반면 디노피시스 아쿠미나타 종과 먹이인 미리오넥타 루브라 종은 1: 10 내지 1:30의 비율로 초기 접종한다. 또한 디노피시스 아쿠미나타 종의 최대 밀도를 높이기 위해서는 먹이인 미리오넥타 루브라가 고갈되었을 때 배양해수의 1/5을 제거하고 새로운 미리오넥타 루브라 먹이와 동시에 새로운 배양해수를 주입하는 바람직하다.
또한, 본 발명은 대량배양된 디노피시스 아쿠미나타는 대량배양장치를 구성하는 수조의 하면의 함입된 중앙부와 연결된 초고속 원심분리기(F)를 이용하여 디 노피시스 아쿠미나타를 배양 해수로부터 수확하고, 수확된 디노피시스 아쿠미나타로부터 용매 분배와 크로마토크래피법을 이용하여 독성 성분인 펙테노톡신-2(도 3)를 분리 및 정제하는 방법에 관한 것이다. 분리 정제된 펙테노톡신-2를 확인하기 위하여 질량분석기 및 핵자기공명분광기를 사용하였다. 이로부터 얻어진 질량분석 데이터(도 4)와 수소 및 탄소 스펙트럼(도 5 및 도 6)을 각각 도시하였으며, 펙테노톡식-2에 대한 수소 및 탄소의 화학적 이동값을 도 7에 도시하였다.
상기 용매 분배는 부탄올 수용액으로 용매추출하는 과정; 상기 알콜 추출액을 농축한 후 메탄올:물:노르말 헥산이 1: 5~6:6~7의 부피비로 혼합되어 있는 혼합액으로 용매 분획하는 과정; 및 상기 메탄올과 물로 이루어진 용매 분획층을 농축하는 과정으로 실시되며, 용매분배가 완료된 후 크로마토그래피법, 즉 역상실리카플래쉬 크로마토그래피 및 역상반분취 고성능 액체 크로마토그래피로 순차적으로 수행되어 펙테노톡신-2가 분리정제된다.
상기 역상실리카플래쉬 크로마토그래피는 고정상으로 역상 실리카겔을 사용하고 용리액으로 물과 메탄올이 1:1~9의 부피비로 혼합된 용액, 메탄올 및 아세톤을 사용하며, 더욱 좋게는 물과 메탄올이 1:4의 부피비로 혼합된 용액을 사용한다. 또한, 상기 역상실리카플래쉬 크로마토그래피를 통한 용출액을 농축시켜 역상 실리카겔(C18)로 충진된 컬럼, 메탄올 75% 및 물 25%로 이루어진 용리액으로 역상반분취 고성능 액체 크로마토그래피를 실시하여 머무름시간 59분에서 펙테노톡신-2가 추출되었다.
본 발명에 따른 디노피시스 아쿠미나타의 대량배양방법을 통해 지금까지 대량 배양에 성공하지 못한 디노피시스 생물의 한 종인 아쿠미나타를 500리터에 이르기까지 성공적으로 배양하였다. 상기 디노피시스 아쿠미나타로부터 분리된 펙테노톡신은 독성 성분을 분석하는데 표준 독소로 사용될 뿐 아니라 최근 연구가 활발히 진행되고 있는 항암 연구에 응용될 수 있어 향후 의·약학적으로 유용한 물질로 기대된다.
이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는 바, 본 발명이 다음의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 디노피시스 아쿠미나타의 대량배양
본 발명에서 디노피시스 아쿠미나타 종을 배양하기 위해서는 먼저 디노피시스 아쿠미나타 종의 먹이인 섬모류 미리오넥타 루브라와 미리오넥타 루브라 종의 먹이인 은편모류 텔레아우락스 종을 충분히 배양해야 하는데, 이들 두 종의 먹이배양은 실험실 규모(소규모, 500㎖)의 방법에 대한 문헌(Yih et al. 2004. Ingestion of cryptophyte cells by the marine photosynthetic ciliate Mesodinium rubrum. Aquat. Microb. Ecol. 36:165-170)을 참고하여 100㎖ 규모의 실험실 종주를 2ℓ로, 2ℓ를 20ℓ 규모까지 중규모 배양한 다음, 디노피시스 아쿠미나타 종주 접종 1주일 전 500ℓ 수조를 포함하는 대량배양장치에 미리 접종하여 성장시켰으며, 이때 먹이인 텔레아우락스 종과의 농도비는 1:10～1:15로 하였고, f/2-Si 배지, 온도 20℃, 염분 30psu, 광도 60 광자/㎡/sec로 연속조명하여 배양하였으며, 최대 세포농도는 10,000 세포/㎖이 되었을 때 새로운 용기로 계대배양하였다.
디노피시스 아쿠미나타의 500ℓ급 대량배양을 위해 먼저 소규모(100㎖)의 실험실 종주를 2ℓ로, 2ℓ를 20ℓ로 점차적으로 규모를 늘리면서 배양하였으며, 이때 디노피시스 아쿠미나타 종과 먹이인 미리오넥타 루브라 종의 먹이농도는 초기 접종시 1:30으로 조절하여 공급하였고, 각각의 단계는 5～10일 간격을 유지하면서 계대 배양하였으며, 디노피시스 아쿠미나타 종의 최대 밀도가 ㎖당 2,000 세포 이상이 되었을 때 더 큰 규모의 배양용기로 접종하였다. 배양은 f/2-Si 배지, 온도 20℃, 염분 30psu, 광도 60 광자/㎡/sec로 연속조명하였다. 디노피시스 아쿠미나타 종이 20ℓ 배양용기까지 성장하였을 때, 1주일 전 먹이인 미리오넥타 루브라 종을 미리 키워둔 500ℓ 수조를 포함하는 대량배양장치에 접종하여 배양하였으며, 6일째 되던 날 먹이인 미리오넥타 루브라 종이 고갈되고, 디노피시스 아쿠미나타 종의 밀도가 약 3,000 세포/㎖이 됨에 따라, 배양해수의 1/5을 제거한 다음, 20ℓ 배양용기에 따로 키워둔 미리오넥타 루브라 종을 새로이 공급함과 동시에 새로운 배양해수를 공급하여 수확당시 디노피시스 아쿠미나타 종의 최대 농도가 ㎖당 약 5,000 세포가 되었다[도 2].
[실시예 2] 디노피시스 아쿠미나타로부터 펙테노톡신-2의 분리 및 정제
디노피시스 아쿠미나타 500ℓ를 실험실에서 배양한 후 연속 원심분리기(유속 3ℓ/min, 회전 속도 6,000rpm)를 사용하여 생물량 100g (습식중량)을 수확하였다. 이 생물체를 3일간 동결건조한 후 메탄올 3.0ℓ를 가하여 48시간 동안 방치하여 유기물을 추출하였다. 상기 추출물은 회전 감압 농축기를 사용하여 용매를 제거하고 다시 부탄올과 물(혼합 비율 1:1)로 이루어진 혼합 용액을 가하여 물층과 부탄올층으로 용매 분배를 실시하였다. 분배 후 얻어진 부탄올 층은 감압 농축기를 사용하여 부탄올 용매를 제거한 후 메탄올 15%와 물 85%로 이루어진 혼합 용액과 노르말 헥산(혼합비율 1:1)을 첨가하여 재분배를 실시하였다. 다음으로, 메탄올과 물로 이루어진 용매층을 분리하여 같은 방법으로 용매를 제거한 후 얻어진 분획에 대하여 역상 실리카 플래쉬 크로마토크래피를 수행하였다. 이 때 고정상은 역상 실리카젤(C-18)을 사용하였으며 용리액은 높은 극성으로 부터 낮은 극성의 용매순으로 사용하였다. 그 순서는 다음과 같으며 이 때 얻어진 유기물의 양을 함께 표시하였다; 50%물 / 50% 메탄올(300 mg), 40%물 / 60%메탄올 (200 mg), 30% 물 / 70% 메탄올 (10 mg), 20%물 / 80%메탄올 (10 mg), 10%물 / 90%메탄올(50 mg), 100%메탄올(240 mg), 100%아세톤(230 mg). 이와 같은 방법으로 얻어진 각 분액에 대하여 수소 핵자기 공명 분광기로 스펙트럼을 측정 분석한 결과, 물 20% 물 / 80% 메탄올층에 펙테노톡신 2가 약 70% 이상 함유된 것을 확인하였다. 따라서 펙테노톡신 2가 함유된 분액은 감압 농축기로 유기 용매를 제거한 후 역상 반분취 HPLC (reverse-phased semi-prep HPLC)를 수행하여 주성분인 펙테노톡신 2를 정제하였다. 이 때 사용된 HPLC 조건은 다음과 같다. 컬럼은 YMC ODS-C18, 입자 직경은 5㎛, 컬럼의 크기는 250 × 10㎜(길이 × 직경), 용출 속도는 1.5 ㎖/min, 검출기는 굴절율 검출기을 사용하였으며 용리액은 75% 메탄올 : 25% H2O 였다. 그 결과 머무름 시간 59분경에 희색 파우드 형태로 펙테노톡신 2를 분리되었다.
최종 얻어진 펙테노톡신 2를 검증하기 위하여 액체크로마토크래피-질량분석기(LC-MS)와 핵자기 공명 분광기(NMR)를 사용하였다. 액체 크로마토크래피-질량분석기에서는 펙테노톡신 분자량 858와 H2O가 붙은 876 [M+H2O]에 해당되는 분자량 신호를 확인할 수 있었으며, 펙테노톡신 2에 대하여 1D 와 2D 핵자기 공명 분광 실험을 통하여 이미 밝혀진 화학 구조를 확인할 수 있었다. 또한 액체크로마토크래피-질량분석 데이터[도 4]와 수소 및 탄소 핵자기 공명 스펙트럼[도 5 및 도 6]을 나타내었으며 도 7은 펙테노톡신 2의 분자에 있는 수소와 탄소에 대하여 핵자기 공명 스펙트럼에 있는 신호를 지정한 것이다.
도 1은 디노피시스 아쿠미나타를 배양하기 위한 500ℓ급 대량배양장치로, A는 전원공급 및 조절장치이고, B는 공기를 공급하기 위한 공기 공급 수단이고, C는 주입된 공기를 살균하기 위한 자외선 램프이고, D는 주입된 공기를 여과하기 위한 탄소 카트리지 필터이고, E는 32와트 형광등이고, F는 배양된 생물체를 수확하기 위한 초고속 원심분리기이다.
도 2는 실시예 1에서 디노피시스 아쿠미나타를 8일동안 대량배량(500ℓ)한 경우 먹이인 미리오넥타 루브라와 디노피시스 아쿠미나타의 세포밀도 변화를 나타낸 그래프이다.
도 3은 디노피시스 아쿠미나타에서 분리 정제된 펙테노톡신 2의 화학 구조이다.
도 4는 실시예 2에서 분리 정제된 펙테노톡신-2의 질량분석 데이터이다.
도 5는 실시예 2에서 분리 정제된 펙테노톡신-2의 수소 핵자기 공명 분광 데이터이다.
도 6은 실시예 2에서 분리 정제된 펙테노톡신-2의 탄소 핵자기 공명 분광 데이터이다.
도 7은 실시예 2에서 분리 정제된 펙테노톡신-2의 분자 구조에 있어서 수소 및 탄소에 대한 핵자기 공명선을 지정한 표이다.

Claims (10)

1) 해수배지에서 미리오넥타 루브라(Myrionecta rubra) 및 이의 먹이인 텔레아우락스(Teleaulax)를 초기 밀도비 1:10 내지 1:15로 접종하여 10~30 ℃의 온도 및 연속광 하에서 미리오넥타 루브라를 계대배양시키는 단계;
2) 자외선 조사 후 탄소카트리지 필터를 거쳐 정화된 공기가 연속적으로 공급되는 수조 내에 상기 1)단계에서 배양된 미리오넥타 루브라를 접종하고 10~30 ℃의 온도 및 연속광 하에서 수조의 하단에 구비된 공기분산 노즐을 통해 형성된 기포로 상기 1)단계에서 배양된 미리오넥타 루브라 및 해수배지를 교반시켜 미리오넥타 루브라를 대량배양시키는 단계;
3) 디노피시스 아쿠미나타(Dinophysis acuminata)과 이의 먹이인 미리오넥타 루브라를 초기 밀도비 1: 10 내지 1:30로 접종시켜 10~30 ℃의 온도 및 연속광 하에서 디노피시스 아쿠미나타를 계대배양시키는 단계;
4) 상기 3)단계에서 배양된 디노피시스 아쿠마나타를 상기 2) 단계의 수조에 접종하여 대량배양시키는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 디노피시스 아쿠미나타의 대량배양 방법.
제 1항에 있어서,
상기 해수배지가 f/2-Si 배지인 것을 특징으로 하는 디노피시스 아쿠미나타 의 대량배양 방법.
제 1항에 있어서,
상기 2) 단계 및 4) 단계에서의 대량배양은 하면이 중앙 하측 방향으로 함입형성된 폴리카보네이트 재질의 수조; 상기 수조 내측 중앙부에 길이방향으로 길게 형성되어 형광등이 내장되는 아크릴관(E); 상기 수조의 하면의 함입된 중앙부에 공기를 공급하는 공기 공급 수단(B); 및 상기 공기 공급 수단으로부터 공급되는 공기를 정화시키는 자외선 램프(C) 또는 탄소카트리지 필터(D)에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 공기 정화 수단;을 포함하는 대량배양장치에서 실시되는 것을 특징으로 하는 디노피시스 아쿠미나타의 대량배양 방법.
상기 수조의 하면의 함입된 중앙부와 연결되는 원심분리기
디노피시스 아쿠미나타로부터 용매 분배 및 크로마토그래피법을 이용하여 펙테노톡신-2를 분리하는 방법.
제 4항에 있어서,
상기 용매 분배는 부탄올 수용액으로 용매추출하는 과정;
상기 알콜 추출액을 농축한 후 메탄올:물:노르말 헥산이 1: 5~6:6~7의 부피비로 혼합되어 있는 혼합액으로 용매 분획하는 과정; 및
상기 메탄올과 물로 이루어진 용매 분획층을 농축하는 과정;
으로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 4항에 있어서,
상기 크로마토그래피법은 용매분배 후 역상실리카플래쉬 크로마토그래피 및 역상반분취 HPLC로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 6항에 있어서,
상기 역상실리카플래쉬 크로마토그래피는 고정상으로 역상 실리카겔을 사용하고 용리액으로 물과 메탄올이 1:1~9의 부피비로 혼합된 용액, 메탄올 및 아세톤을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 7항에 있어서,
상기 역상실리카플래쉬 크로마토그래피의 용리액은 물과 메탄올이 1:4의 부피비로 혼합된 용액인 것을 특징으로 하는 방법.
제 6항에 있어서,
상기 역상반분취 고성능 액체 크로마토그래피는 역상 실리카겔(C18)로 충진된 컬럼, 메탄올 75% 및 물 25%로 이루어진 용리액으로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 9항에 있어서,
펙테노톡신-2는 머무름시간 59분에서 추출되는 것을 특징으로 하는 방법.
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