CN105754891A - 一种农作物病原体拮抗放线菌及其筛选和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，公开了一种农作物病原体拮抗放线菌及其筛选和应用。所述农作物病原体拮抗放线菌属于利迪链霉菌属，保藏编号为：CCTCC M 2016038。所述筛选方法，包括：（1）采用梯度稀释法从土壤样品中得到培养的放线菌；（2）采用琼脂块法筛选得到拮抗靶标菌的放线菌；（3）将所述放线菌恒温培养得到放线菌发酵液；（4）将靶标菌制成含菌的PDA平板，采用牛津杯法测量抑菌圈直径；（5）选取抑菌圈直径大于20mm的所述放线菌。本发明通过抑制病原菌的生长繁殖，对植物病害起到防治的作用，该方法较化学农药对植物病害的防治相比，效果显著，对土壤无污染，利于无公害、绿色产品的生产。

Description

一种农作物病原体拮抗放线菌及其筛选和应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种农作物病原体拮抗放线菌及其筛选和应用。
背景技术
农用抗生素是指由微生物发酵产生、具有农药的功能、应用于农业上防治病虫草鼠等有害生物的次生代谢产物。按照作用功能来说，则可分为杀菌抗生素、除草抗生素和杀虫抗生素。农用抗生素的应用和开发可以追溯20世纪40年代，最初是在发达国家随着医用抗生素的使用而发展起来的，如链霉素、灰黄霉素等，但由于其性能和成本与化学农药相比，都不具备优势，所以一直发展缓慢。20世纪50年代后，各国科研人员在微生物农药的研究上开展了许多工作，这促进了农用抗生素在这一时期发展的较快。放线菌属于原核生物界、厚壁菌门，因气生菌丝呈放射状而得名。从放线菌中筛选具有农用活性的抗生素一直是我国科技工作者的研究热点。放线菌作为生防菌和用放线菌生产农用抗生素进行植物病害生物防治与传统化学农药相比具有诸多优点。
镰孢霉菌是农作物的重要病原体，是一类数量大、种类繁多的真菌，它可引起多种农作物腐烂和枯萎病，其中以大麻顶枯病和玉米穗腐病最为普遍。镰孢霉菌代谢所产生的霉菌毒素也会污染农产品，其中单端孢霉烯族毒素污染粮食和饲料非常普遍，是食品安全的重大威胁，每年对种植业和养殖业造成巨大的经济损失并且镰孢霉菌污染农作物以及毒素的产生具有连续效应。厚垣镰孢霉会造成多种严重的植物病害，大麻、大豆、头花蓼等作物都会被其感染并引发病害。但是对于厚垣镰孢霉产生的植物病害的防治、拮抗菌的筛选，鲜见报道。
发明内容
本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供一种农作物病原体拮抗放线菌及其筛选和应用。
本发明采用的技术方案如下：
一种农作物病原体拮抗放线菌，该菌命名为RS15，属于利迪链霉菌属（Streptomyceslydicus），其保藏编号为：CCTCCM2016038；保藏地点为：中国，武汉，武汉大学；中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2016年1月14日。
进一步地，所述筛选方法包括如下步骤：
（1）采用梯度稀释法从待分离的土壤样品中得到培养的放线菌；
（2）采用琼脂块法从所述培养的放线菌中筛选得到拮抗靶标菌的放线菌；
（3）将所述具有拮抗靶标菌的放线菌接种到放线菌液体发酵培养基后，在28℃下恒温培养6-10天，得到放线菌发酵液；
（4）将所述靶标菌接种在PDA平板上，制成含菌的PDA平板，将已灭菌的牛津杯放置于平板中央，牛津杯中加入120-170μL放线菌发酵液上清液，恒温培养后测量抑菌圈直径；
（5）选取抑菌圈直径大于20mm的所述放线菌。
进一步地，所述靶标菌为厚垣镰孢霉。病原真菌和细菌均可以作为筛选放线菌的靶标菌，根据使用目的的不同，可以选取不同的靶标菌，本发明选取厚垣镰孢霉作为靶标菌。
进一步地，所述采用梯度稀释法从待分离的土壤样品中得到培养的放线菌，具体步骤为：取待分离的土壤样品置于磷酸缓冲液中，并得到上清液；将所述上清液分成多份，分别稀释至10-8、10-4和10-2梯度，得到不同浓度的样品悬液；将所述不同浓度的样品悬液分别涂在高氏一号培养基上，28℃恒温培养3-10天，得到培养的放线菌。
进一步地，步骤（4）所述靶标菌接种在PDA平板上前，还包括将靶标菌制成孢子含量为100-120个/mL的悬浮液，加0.5-1.5mL的所述孢子悬浮液到PDA培养基中，然后快速倒入培养皿中，制成含菌的PDA平板。
本发明还提供一种含有所述的农作物病原体拮抗放线菌的组合物。
本发明还提供一种农作物病原体拮抗放线菌以及所述的组合物在防治植物病害中的应用。
进一步地，引起植物病害的病原菌为大麻顶枯病菌、玉米穗腐病菌、大豆镰孢根腐病菌、黄瓜枯萎病菌或番茄枯萎病中的一种或几种。
更进一步地，将筛选得到的放线菌或其组合物的发酵液喷撒在植株的病害部位；或者以放线菌活体菌株或发酵液为有效成分用作农用抗生素制成抑菌肥料，并将抑菌肥料施加到植株的根部土壤中。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
本发明提供的农作物病原体拮抗放线菌，该菌属于利迪链霉菌属，在实验室条件下，对于多种导致植物病害的病原菌，例如，厚垣镰孢霉、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌，有明显的抑制效果；可以作为一种很好的抑菌微生物，用于杀死或者抑制导致植物发生病害的多种病原菌；进而对植物起到防护病害的作用，在具体的操作中，可将筛选得到的放线菌的发酵液喷撒在植株的病害部位；或者以放线菌活体菌株或发酵液为有效成分用作农用抗生素制成抑菌肥料，并将抑菌肥料施加到植株的根部土壤中，进而形成以病原菌为靶标，通过抑制病原菌生长繁殖的作用对植物病害起到防治的作用，该方法较传统的化学农药防治植物病害的防线相比，其防治效果显著，对土壤无污染，利于无公害、绿色产品的生产。
附图说明
本发明将通过例子并参照附图的方式说明，其中：
图1是本发明已纯化的利迪链霉菌RS15的菌株照片。
图2是本发明的利迪链霉菌RS15菌株发酵液对厚垣镰孢霉的抑制效果图。
图3是本发明的利迪链霉菌RS15菌株发酵液对金黄色葡萄球菌的抑制效果图。
图4是本发明的利迪链霉菌RS15菌株发酵液对枯草芽孢杆菌的抑制效果图。
图5是本发明的利迪链霉菌RS15培养10天后的照片。
图6是本发明的利迪链霉菌RS15在扫描电镜（放大100倍）下的照片。
图7是本发明的利迪链霉菌RS15的16SrDNA的PCR产物电泳图。
图8是Neighborjoining方法建立的RS15系统进化树图。
具体实施方式
本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
本说明书（包括任何附加权利要求、摘要）中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。
菌株RS15的分离、筛选
本实施例使用的培养基包括如下几种：
（1）高氏一号培养基：
可溶性淀粉20.0g，KNO31.0g，NaCl0.5g，K2HPO40.5g，MgSO·7H2O0.5g，FeSO4·7H2O0.01g，琼脂20.0g，蒸馏水1000mL，pH7.2～7.4。
（2）放线菌液体发酵培养基：
可溶性淀粉5.0g，葡萄糖1.0g，蛋白胨0.2g，酵母膏0.2g，NaCl0.2g，MgSO·7H2O0.5g，K2HPO40.5g，黄豆饼粉20g，蒸馏水1000mL，pH7.2～7.4。
（3）真菌培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA培养基）:
马铃薯200.0g，葡萄糖20.0g，琼脂15.0~20.0g，蒸馏水1000mL，pH自然。
本发明的农作物病原体拮抗放线菌的筛选方法，包括如下步骤：
（1）采用梯度稀释法从待分离的土壤样品中得到培养的放线菌，具体步骤为：取待分离的土壤样品10g置于磷酸缓冲液中，并得到上清液；将所述上清液分成多份，分别稀释至10-8、10-4和10-2梯度，得到不同浓度的样品悬液；将所述不同浓度的样品悬液分别涂在高氏一号培养基上，28℃恒温培养3-10天，得到培养的放线菌。
本发明的待分离的土壤样品分别从广西宜州市仁信药厂附近，六妹村，怀远等地采集。
放线菌的分离过程主要通过上述步骤实现，将土壤置于磷酸缓冲液之后，土壤中的微生物就会溶解到缓冲液中，由于土壤中的微生物数量巨大，因此需要将上清液稀释成不同的浓度梯度，得到不同浓度的悬液，将不同浓度的悬液分别涂在高氏培养基上28℃恒温培养，此时，除放线菌之外的多数微生物可被杀死，通过重复培养之后即会得到放线菌的单菌落。
利用琼脂块法从所述培养的放线菌中筛选得到拮抗靶标菌的放线菌：把用高氏一号培养基分离得到的放线菌在28℃的条件下培养7d，制作放线菌菌块进行抑菌活性测定。以厚垣镰孢霉为靶标菌测定不同放线菌株的拮抗活性。观察抑菌圈情况并测量其直径的大小，选取抑菌圈直径大于20mm的所述放线菌。
以厚垣链孢霉为靶标菌，获得一株菌对厚垣镰孢霉的抑菌圈平均直径为26.1mm，将其命名为菌株RS15。该种所述靶标菌为病原引起的病害可作为菌株RS15的防治对象。参见附图1为本发明已纯化的RS15的菌株照片。
（3）将所述具有拮抗靶标菌的放线菌接种到放线菌液体发酵培养基后，在28℃下恒温培养6-10天，得到放线菌发酵液。
（4）将靶标菌厚垣镰孢霉制成孢子含量约为110个/mL的悬浮液，加1mL的所述孢子悬浮液到PDA培养基中，然后快速倒入培养皿中，制成含菌的PDA平板；将已灭菌的牛津杯放置于平板中央，牛津杯中加入150μL放线菌发酵液上清液，置于30°C恒温培养3天后测量抑菌圈直径。
（5）选取抑菌圈直径大于20mm的所述放线菌。
测得菌株RS15发酵液对厚垣镰孢霉的抑菌圈平均直径为30.1mm，进而将具有抑制效果的放线菌发酵液应用到靶标菌引起的植物病害的防治中，可重点用于防治大麻顶枯病、玉米穗腐病、大豆镰孢根腐病、黄瓜枯萎病或番茄枯萎病。参见附图2为本发明的利迪链霉菌RS15菌株发酵液对厚垣镰孢霉的抑制效果图。
菌株RS15的抑菌效果
在得到所述拮抗靶标菌的放线菌之后：
（1）将具有拮抗靶标菌的放线菌接种到放线菌液体发酵培养基后，在28℃下恒温培养6-10天，得到放线菌发酵液；
（2）以金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，白色念珠菌作为指示菌，采用牛津杯法测定其发酵液的抑菌活性。指示菌分别接种在PDA平板上，距PDA平板中央2.5cm处围绕圆心等距接种培养，培养时间为4-6天；将已灭菌的牛津杯放置于平板中央，牛津杯中加入150μL放线菌发酵液上清液，置于30°C恒温培养4天后测量抑菌圈直径。菌株RS15发酵液对不同指示菌的抑菌圈平均直径参见表1；参见附图3和4分别为本发明的利迪链霉菌RS15菌株发酵液对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的抑制效果图。
表1
试验结果表明，该菌株对枯草芽孢杆菌具有明显的拮抗作用，对于金黄色葡萄球菌具有较弱的拮抗作用，对于大肠杆菌、白色念珠菌不具有抑菌作用。进而将具有抑制效果的放线菌发酵液应用到金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌引起的植物病害的防治中。
菌株RS15的鉴定
（1）菌株形态特征鉴定
采用平皿插片法观察菌落的形态特征。将菌株RS15在高氏一号培养基上培养，28℃恒温培养3-6天时，菌落为乳白色，菌落形态较分散，直径大小为小型，菌株产孢子的时间在培养3天达到高峰，7天完全成熟，培养10天后菌落上有大量灰色孢子散布在整个菌落表面，其边缘有少量的同心轮纹。菌株RS15培养10天后的照片参见附图5；菌株RS15在扫描电镜下（放大100倍）的照片参见附图6。
（2）菌株培养特征鉴定
将菌株RS15分别接种于高氏一号、察氏、克氏合成一号、淀粉铵、马铃薯块、柴斯纳、葡萄糖天冬门素培养基上，观察记录菌在各种不同培养基上的表观特征，包括菌株的生长状况及气生菌丝、基内菌丝和可溶性色素的颜色。菌株RS15在不同培养基上生长的培养特征参见表2。
表2
其中，“＋＋＋”：生长良好Growingwell；“＋＋”：生长一般Growinggenerally；“＋”：生长差Growingbadly。
（3）菌株生理生化特征鉴定
测定菌株的生理生化特征，开展明胶液化、牛奶凝固与胨化、过氧化氧酶试验、纤维素上生长及利用情况、淀粉水解、H2S的产生、碳源的利用测定等实验。对于菌株RS15进行的各种生理生化特征研究结果参见表3。
表3
其中，“＋”：阳性结果positiveresults，“－”：阴性结果negativeresults。菌株RS15能水解淀粉和纤维素，明胶可以液化，牛奶不能凝固胨化，产生H2S，产生过氧化氢酶，能利用D-葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、甘油、甘露糖、麦芽糖、D-果糖。
（4）菌株分子生物学鉴定
由PCR成功扩增得到菌株RS15的16SrDNA序列800bp，参见附图7为菌株RS15的16SrDNA的PCR产物电泳图，其中1为PCR产物，M为分子量标准蛋白质标记（Marker）。进入NCBI网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）BLAST比对，以比对得到的相似度超过99％的菌种序列建立进化树。参见附图8为Neighborjoining方法建立的RS15系统进化树，其中节点引导值n=1,000，核苷置换位置刻度差1。RS15系统进化树显示，RS15菌株和利迪利迪链霉菌S3521（StreptomyceslydicusstrainS3521）处于进化树同一分支上，表明该菌株和利迪链霉菌分类地位很接近，有很近的亲缘关系。
结合形态特征、培养特征和生理生化结果，判定菌株RS15为利迪链霉菌属。利迪链霉菌（Streptomyceslydicus）RS15，已于2016年1月14日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌珞珈山，武汉大学保藏中心，邮编430072）其保藏编号为：CCTCCM2016038。
利迪链霉菌（Streptomyceslydicus）RS15，其16SrDNA序列如下：
AAAAGTGGGGGCTGCTTACACATGCAAGTCGAACGATGAACCTCCTTCGGGAGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTTCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATACGACCTCCGACCGCATGGTCTGGTGGTGGAAAGCTCCGGCGGTGAAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTGATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAGAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCGCGTCGGATGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCATTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAGACGTTGGGAACTAGGTGTGGGCGACATTCCACGTCGTCCGTGC
本发明并不局限于前述的具体实施方式。本发明扩展到任何在本说明书中披露的新特征或任何新的组合，以及披露的任一新的方法或过程的步骤或任何新的组合。
<110>河池学院
<120>一种农作物病原体拮抗放线菌及其筛选和应用
<160>1
<210>1
<211>800
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
AAAAGTGGGGGCTGCTTACACATGCAAGTCGAACGATGAACCTCCTTCGGGAGGGGATTA60
GTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTTCACTCTGGGACAAGCCCTGGA120
AACGGGGTCTAATACCGGATACGACCTCCGACCGCATGGTCTGGTGGTGGAAAGCTCCGG180
CGGTGAAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTGATGGCCTACCAAGGCG240
ACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGA300
CTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGAC360
GCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAGA420
GTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGT480
AGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCGCGT540
CGGATGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCATTCGATACGGGCAGGCTAGAGTT600
CGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACA660
CCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAG720
CGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAGACGTTGGGAACTAGGTGTGGGCG780
ACATTCCACGTCGTCCGTGC800

Claims (9)

1.一种农作物病原体拮抗放线菌，其特征在于：该菌属于利迪链霉菌属（Streptomyceslydicus），其保藏编号为：CCTCCM2016038。
2.根据权利要求1所述农作物病原体拮抗放线菌的筛选方法，其特征在于：所述筛选方法包括如下步骤：
（1）采用梯度稀释法从待分离的土壤样品中得到培养的放线菌；
（2）采用琼脂块法从所述培养的放线菌中筛选得到拮抗靶标菌的放线菌；
（3）将所述具有拮抗靶标菌的放线菌接种到放线菌液体发酵培养基后，在28℃下恒温培养6-10天，得到放线菌发酵液；
（4）将靶标菌接种在PDA平板上，制成含菌的PDA平板，将已灭菌的牛津杯放置于平板中央，牛津杯中加入120-170μL放线菌发酵液上清液，恒温培养后测量抑菌圈直径；
（5）选取抑菌圈直径大于20mm的放线菌，得到所述农作物病原体拮抗放线菌。
3.根据权利要求2所述的农作物病原体拮抗放线菌筛选方法，其特征在于：所述靶标菌为厚垣镰孢霉。
4.根据权利要求2所述的农作物病原体拮抗放线菌筛选方法，其特征在于：步骤（1）中，所述采用梯度稀释法从待分离的土壤样品中得到培养的放线菌，具体步骤为：取待分离的土壤样品置于磷酸缓冲液中，并得到上清液；将所述上清液分成多份，分别稀释至10-8、10-4和10-2梯度，得到不同浓度的样品悬液；将所述不同浓度的样品悬液分别涂在高氏一号培养基上，28℃恒温培养3-10天，得到培养的放线菌。
5.根据权利要求2所述的农作物病原体拮抗放线菌筛选方法，其特征在于：步骤（4）中，在将靶标菌接种在PDA平板上之前，还包括将靶标菌制成孢子含量为100-120个/mL的悬浮液，加0.5-1.5mL的所述孢子悬浮液到PDA培养基中，然后快速倒入培养皿中，制成含菌的PDA平板。
6.一种含有权利要求1所述的农作物病原体拮抗放线菌的组合物。
7.权利要求1所述的农作物病原体拮抗放线菌或权利要求6所述的组合物在防治由厚垣镰孢霉、金黄色葡萄球菌或枯草芽孢杆菌引起的植物病害中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述植物病害的病原菌为大麻顶枯病菌、玉米穗腐病菌、大豆镰孢根腐病菌、黄瓜枯萎病菌或番茄枯萎病菌中的一种或几种。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：将筛选得到的放线菌或其发酵液，或放线菌的组合物喷撒在植株的病害部位；或者以放线菌活体菌株或发酵液为有效成分用作农用抗生素制成抑菌肥料，并将抑菌肥料施加到植株的根部土壤中。
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