CN101054566B - 一种甘蓝枯萎病的生防制剂及其制备方法和专用菌株 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种甘蓝枯萎病的生防制剂及其制备方法和专用菌株。该甘蓝枯萎病的生防制剂，它的活性成分是发酵枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03CGMCC No.1983得到的代谢产物，和/或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03CGMCC No.1983菌体。该甘蓝枯萎病的生防制剂在温室盆栽试验中表现出对甘蓝枯萎病很好的防病效果，最高防效达96.25％。
Description
技术领域
本发明涉及一种甘蓝枯萎病的生防制剂及其制备方法和专用菌株。
背景技术
植物病害是农业生产中重要的自然灾害之一，其对全球农作物产量造成的损失达13-20％。真菌所引致的植物病害占所有植物病害的80％以上，许多重大病害对农业生产造成的损失惨重，如作物的白粉病、锈病、灰霉病、稻瘟病、枯萎病和疫病等。其中由镰刀菌引致的蔬菜枯萎病，是一个具有潜在危险的流行病害，曾在新世纪初毁灭了北京的大兴冬瓜专业村；镰刀菌引起的黄瓜枯萎病的猖獗也使京郊黄瓜种植面积在近年减少了近2/3；同一类病原引起的甘蓝枯萎病，也是由镰刀菌侵染所致，这种病原菌可在土壤中长期存活，垂直分布可达80～100厘米深度，很难根除，并且正以每年面积扩大10倍的速度发展蔓延，为害严重的地块造成了绝产。目前枯萎病的控制主要是通过化学农药处理土壤或利用抗病品种来防治，但效果均不理想。土壤在使用化学农药熏蒸消毒过程中，有益微生物群被杀死，破坏了土壤的微生物区系和微生态平衡。就甘蓝枯萎病而言，目前尚无生产中理想的抗病品种，因此该病的防治主要依赖于化学农药。长期大量应用化学农药，不但污染环境、破坏生态平衡，而且也导致病原生物抗药性的产生，致使病害再度猖獗且更难防治。微生物农药源于自然，具有环境兼容性好、持效期长、低毒、对人畜和天敌安全等特点，同时其资源丰富，是植物尤其是果蔬病害控制的重要绿色环保途径之一，符合可持续农业发展的要求。因此，近年微生物农药在全球范围内得到了迅速发展。
发明内容
本发明的目的是提供一株新的枯草芽孢杆菌，该菌株经过发酵培养后的菌剂和代谢产物对枯萎镰刀病菌具有强烈的生长抑制作用，通过发酵培养的菌剂及无菌滤液可作为抗甘蓝枯萎病的生防制剂，用于植物土传真菌病害的生物防治。
本发明所提供的枯草芽孢杆菌，是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03，该菌株已于2007年03月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市海淀区中关村北一条13号)，保藏号为CGMCCNo.1983。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983，是从北京郊区种植蔬菜的土壤中分离得到的。具体方法如下：从北京郊区蔬菜田采集土样，取10g加入内装100ml无菌水和玻璃珠的三角瓶中，于100转/min摇床上振荡20min，取0.5ml加入4.5ml无菌水中，再依次稀释10-2，10-3，10-4倍，分别取各稀释土壤悬液0.1ml在PDA平板上均匀涂布，超净工作台内吹至略干；每浓度3个重复，置于28℃恒温箱中培养5-10天，挑取细菌单菌落进行稀释划线分离纯化。以镰刀枯萎菌等病原真菌为靶标菌，利用平板对峙培养法进行拮抗菌的初筛；对初筛获得的有拮抗性的菌株进行摇瓶发酵培养，并分别获得发酵菌液和发酵液经0.45μm的无菌微孔滤膜过滤除菌获得无菌发酵滤液；进一步测试发酵菌液和无菌发酵滤液对病原菌菌丝生长、孢子萌发的抑制作用和温室防病效果，最终筛选出性状优良的生防菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983。
综合枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983的形态学特征和生理生化特性的结果，将其鉴定为枯草芽孢杆菌。具体鉴定结果如下：
(1)菌体的形态特征
革兰氏染色阳性，细胞形状为杆状。
(2)生理生化特性
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983的生理生化特性如表1所示。
表1.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983的生理生化特性
| 试验项目 | 结果 | 试验项目 | 结果 |
| 形成芽孢细胞直径＞1μm芽孢膨大芽孢圆形接触酶氧化酶厌氧生长VP试验VP＜pH6VP＞pH7甲基红试验 | +---+--++-+ | 利用碳水化合物产酸葡萄糖木糖L-阿拉伯糖甘露醇利用葡萄糖产气利用柠檬酸盐硝酸盐还原50℃生长pH5.7生长7％NaCl生长淀粉水解明胶液化分解酪素 | ++++-++-+++++ |
注：“+”表示阳性结果；“-”表示阴性结果。
本发明的另一个目的是提供一种甘蓝枯萎病的生防制剂。
本发明所提供的甘蓝枯萎病的生防制剂，它的活性成分是发酵枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983得到的代谢产物，和/或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983菌体。
所述代谢产物可从除去枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983菌体的发酵滤液中获得。
用于生产所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983菌体的发酵培养基的初始pH可为5-7，可由如下物质配成：玉米粉20-36g，豆饼粉50-70g，K2HPO4·3H2O 4-12g，加水定容至1000ml。
所述发酵培养基的初始pH优选为6-7，优选由如下物质配成：玉米粉30g，豆饼粉60g，K2HPO4·3H2O 8g，加水定容至1000ml。
用于生产所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983菌体的发酵温度可为30-37℃；发酵时间可为72-84小时。所述发酵温度优选为35℃，发酵时间优选为84小时。
所述发酵过程中的通气量可由装液量为摇瓶体积的1/10，13mm旋转半径180rpm/min振荡的条件控制。
实验证明，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983对供试的16种植物病原真菌都具有明显的抑制作用，表明其对植物病原真菌的抑菌谱较广。本发明实施例中所采用的指示病原菌均属于半知菌亚门，而半知菌在自然界最为常见，可引起许多作物的重要病害，是农业生产的大敌，尤其是镰刀菌引起的枯萎病等土传病害，由于其病原菌存活于土壤之中，一般化学农药难以控制其危害，频繁使用高毒农药又会加重土壤的农药残留，同时也容易使病原菌产生抗药性，所以防治十分困难，例如近年在北京发生的甘蓝枯萎病危害面积迅速扩大，对当地的甘蓝生产造成了极大的威胁。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983对半知菌亚门的病原真菌有广谱的抗性，且对甘蓝枯萎病的温室防治效果显著。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983是内生芽孢的、嗜温性好氧杆状、革兰氏阳性细菌，是一种在自然界中广泛存在，对人畜无毒无害，不污染环境，能产生枯草菌素、杆菌肽等抗菌活性物质及多种抗菌素和酶，并具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力的生防微生物。由于其产生耐热抗逆的芽孢，因此对生防菌剂的生产、剂型加工及在环境中的存活、定殖与繁殖都十分有利。它通过竞争性生长繁殖而占据生存空间的方式来阻止植物病原真菌的生长，能在植物表面迅速形成一层高密保护膜，使植物病原菌得不到生存空间，从而保护了农作物免受病原菌危害。枯草芽孢杆菌也可分泌抑菌物质，抑制病菌孢子发芽和菌丝生长，达到防控病害的目的。
本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983在离体条件下对3种枯萎病菌(表3)具有一定的抑制作用，但不够强烈，对菌丝生长的抑制率均在40％以下；而其发酵液在温室盆栽试验中却表现出很好的防病效果，最高防效达96.25％。
附图说明
图1为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983与供试病原菌的平板对峙培养实验
图2A为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983无菌发酵滤液对甘蓝枯萎病菌培养2天的抑菌圈照片
图2B为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983无菌发酵滤液对甘蓝枯萎病菌培养4天的抑菌圈照片
图3为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983无菌发酵滤液对甘蓝枯萎病菌培养3天的抑菌圈照片
图4为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983对甘蓝枯萎病菌分生孢子萌发的抑制作用照片
图5为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983发酵液对甘蓝枯萎病的温室防效照片
图6a为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983的生长曲线，用比浊法测定，纵坐标为660nm下的OD值，表示菌体在培养基中的浓度
图6b为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983生长过程中的pH值变化
图7为接种量对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983生长的影响
图8为发酵培养基初始pH对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCCNo.1983生长的影响
图9为发酵培养基的装液量对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCCNo.1983生长的影响
图10为温度对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983生长的影响
图11为摇床转速对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983生长的影响
图12为优化发酵条件培养过程中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCCNo.1983菌株产量的变化
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983的发酵液及其代谢产物的抑菌活性试验
该实施例中采用的培养基：A、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCCNo.1983斜面保存采用PDA培养基。B、种子培养基及发酵培养基：牛肉浸膏3g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、水1000ml，pH 7.0-7.2。
1、菌株代谢产物抑菌活性测定
(1)无菌发酵滤液的制备
将经活化的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983用接种环挑取2环于种子培养基中，摇床振荡培养24h后，取5％(体积比)种子培养液转接至发酵培养基，于摇床振荡培养72h。种子培养及发酵培养的发酵条件为：瓶装量50ml/500ml、温度35℃、摇床转速180r/min(旋转半径13mm)。接种后的摇瓶在35℃条件下，以180rpm/min(旋转半径13mm)的转速振荡培养36h，收集发酵液。此时菌株已在发酵液中产生高浓度的具生物活性的产物。取发酵液4500rpm(2250g)离心15min，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤灭菌后得无菌发酵滤液备用。
(2)杯碟法测定抑菌活性
抑菌活性测定采用杯碟法：靶标病原菌在PDB培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000ml)中培养3-5天，取200μl靶标菌孢子悬液均匀涂于PDA平板，在超净工作台上吹干后在PDA平板上等距离放置三个无菌牛津杯，每个杯中加入100μl枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983无菌发酵滤液，25-28℃静置培养2-3天，待产生明显的抑菌圈后采用十字交叉法测量抑菌圈直径。每处理3次重复。
供试靶标病原菌为甘蓝枯萎病菌(F.oxysporum f.sp.conglutinans)(李明远、张涛涛、李兴红、严红，十字花科蔬菜枯萎病及其病原鉴定；植物保护，2003，29(3)：44-45))、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)ACCC(中国农业微生物菌种保藏管理中心)30442、西瓜枯萎病菌(F.oxysporum f.sp.niveum)ACCC 30024。
杯碟法测定结果表明，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983的无菌发酵滤液对甘蓝枯萎病菌、西瓜枯萎病菌和黄瓜枯萎病菌的抑菌圈直径分别为27、27和28mm，三者在α＝0.05水平上无显著性差异。在试验过程中发现枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983无菌发酵滤液并不抑制病原菌的孢子萌发，在1天后看不到明显的抑菌圈产生，而随着菌丝的生长，3天后在牛津杯周围可以看到明显的抑菌圈，说明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03CGMCC No.1983无菌发酵滤液能够抑制病原菌的菌丝生长。
其中，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983的无菌发酵滤液对甘蓝枯萎病菌培养2、4和3天的抑菌圈照片分别如图2A、2B和图3所示。
(3)对峙培养法测定抑菌活性
采用对峙培养法，在PDA平板两侧距离中心3cm处接种经活化培养的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983，1天后在平板中心接种直径5mm的供试病原菌菌饼，以只接种供试病原菌菌饼的PDA平板作为对照，28℃下恒温培养，待产生明显抑菌带时测量抑菌带宽度，在抑菌带边缘挑取菌丝块进行镜检，观察靶标菌菌丝生长状况，并拍照记录。
供试靶标病原菌为：番茄早疫病菌Alternari solani(康立娟、韩秀英、马志强，嘧菌酯对三种蔬菜病害的毒力、防效及安全性研究，农药学学报2004.6(1)：85～88)，番茄灰霉病菌Botrytis cinerea ACCC 30387，葡萄灰霉病菌B.cinerea(陈宇飞，文景芝，李立军，葡萄灰霉病研究进展，东北农业大学学报，2006，3(5)：37(5)693-699)，辣椒灰霉病菌B.cinerea(吕佩珂，李明远，易齐等，中国蔬菜病虫原色图谱，1992，农业出版社，94页)，茄子灰霉病菌B.cinerea(吕佩珂，李明远，易齐等，中国蔬菜病虫原色图谱，1992，农业出版社，86页)，辣椒炭疽病菌Colletotrichum capsici(吕佩珂，李明远，易齐等，中国蔬菜病虫原色图谱，1992，农业出版社，93页)，玉米大斑病菌Exserohilum turcicumACCC 30085，甘蓝枯萎病菌Fusarium oxysporum f.sp.conglutinans(李明远、张涛涛、李兴红、严红，十字花科蔬菜枯萎病及其病原鉴定；植物保护，2003，29(3)：44-45)，黄瓜枯萎病菌F.oxysporum f.sp.cucumerinum ACCC 30442，西瓜枯萎病菌F.oxysporum f.sp.niveum ACCC 30024，豌豆萎凋病菌F.oxysporum f.sp.pisi ACCC 31037，腐皮镰胞菌F.solani ACCC 30119，桃褐腐病菌Monilinia fructicola(陈笑瑜，师迎春，骆勇，国立耘，桃褐腐病菌(Monilinia fructicola)对3种杀菌剂的敏感性，植物保护，2006，32(3)：25-28)，苹果轮斑病菌Alternaria mali ACCC 30003，小麦纹枯病菌Rhizoctoniacerealis ACCC 31183，棉花黄萎病菌Verticillium dahliae ACCC 30308。
实验结果如表2所示，表明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B-03 CGMCCNo.1983对所有供试的植物病原真菌都具有明显的抑制作用，抑菌带宽度为6.6mm-12.5mm，其中辣椒炭疽病菌的抑菌带最宽，为12.5mm；玉米大斑病菌、小麦纹枯病菌、桃褐腐病菌和茄子早疫病菌的抑菌带都在9.0mm以上。图1显示的是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B-03 CGMCC No.1983在平板对峙培养实验中对16种病原真菌的抑菌作用。A1是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B-03 CGMCCNo.1983在甘蓝枯萎病菌Fusarium oxysporum f.sp.conglutinans培养7天时产生的抑菌带为8mm的照片，A2是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B-03 CGMCCNo.1983与西瓜枯萎病菌F.oxysporum f.sp.niveum ACCC 30024在培养8天时抑菌带为8mm的照片，B1是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983在平板培养条件下对腐皮镰刀菌F.solani ACCC 30119产生的抑菌带照片，B2是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B-03 CGMCC No.1983对番茄灰霉病菌Botrytiscinerea ACCC30387产生的抑菌带照片，B3是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B-03 CGMCC No.1983在平板培养条件下对辣椒灰霉病菌B.cinerea产生的抑菌带照片，C1是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983在平板培养条件下对辣椒炭疽病菌Colletotrichum capsici产生的抑菌带照片，C2是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983在平板培养条件下对棉花黄萎病菌Verticillium dahliae ACCC 30308产生的抑菌带照片，C3是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983在平板培养条件下对苹果轮斑病菌Alternaria mali ACCC 30003产生的抑菌带照片，D1是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983在平板培养条件下对葡萄灰霉病菌B.cinerea产生的抑菌带照片，D2是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCCNo.1983在平板培养条件下对茄子灰霉病菌B.cinerea产生的抑菌带照片，D3是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983在平板条件下对茄子早疫病菌Alternari solani产生的抑菌带照片，E1是枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)B-03 CGMCC No.1983在平板培养条件下对桃褐腐病菌Moniliniafructicola产生的抑菌带照片，E2是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCCNo.1983在平板培养条件下对豌豆萎凋病菌F.oxysporum f.sp.pisi ACCC 31037产生的抑菌带照片，E3是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983在平板培养条件下对小麦纹枯病菌Rhizoctonia cerealis ACCC 31183产生的抑菌带照片，F1是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983在平板培养条件下对玉米大斑病菌Exserohilum turcicum ACCC 30085产生的抑菌带照片。
靠近枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983菌株的边缘处，靶标病原菌菌丝变黑，形成一条黑色条带。经过镜检，发现枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)B03 CGMCC No.1983菌株对所选16种靶标病原菌抑制作用的效果基本相似，均是致使靶标病原菌菌丝生长及孢子萌发畸形。菌丝顶端和中间形成大量圆球形或椭圆形囊状体，而有的菌丝细胞内含物泄漏，菌丝裂解，形成若干的空泡。其中，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983对甘蓝枯萎病菌分生孢子萌发的抑制作用如图4所示。由此可见，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983菌株可以分泌对靶标病原菌有抑制作用的代谢物质，能够在抑制病原菌生长，防治植物病害发生中起作用。菌株分泌的抗菌物质，是其防病机制之一；试验结果还表明，当靶标病原菌孢子悬浮液与枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)B03 CGMCC No.1983悬浮液混合培养时，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)B03 CGMCC No.1983在1天后迅速长满PDA平板，而使靶标病原菌不能正常生长。由此可见，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983菌株对靶标病原菌具有明显的空间竞争作用。
表2枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMOC No.1983对供试病原真菌的平板抑制作用
注：各处理均值后的字母a-e示方差分析的结果，同一列内标有不同字母的均值在α＝0.05水平上具显著性差异，下表同。
从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983对各供试病原真菌的抑菌率来看，在7天时的抑菌效果均在50％以上，其中以对番茄灰霉病菌和桃褐腐病菌的抑菌效果最好，达到69.4％。B-03菌株对大多数供试病原真菌的抑菌效果都是随着时间的推移逐渐提高，只有对桃褐腐病菌、苹果轮斑病菌及几种灰霉病菌的抑菌效果逐渐减弱。结果表明，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCCNo.1983及其代谢产物的抑菌谱较广，具有良好的应用前景。
(4)无菌发酵滤液对靶标菌生长速率的测定：将枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)B03 CGMCC No.1983无菌发酵液进行10、20、50、100、200倍稀释后与PDA培养基混合，以混有相应体积的原始发酵培养基(牛肉浸膏3g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、水1000ml，pH 7.0-7.2)的PDA平板为对照(CK)，平板中央接种靶标病原菌菌饼，28℃下培养，测量菌落直径，计算抑菌率，各3次重复。
抑菌率(％)＝[(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径]×100
供试靶标病原菌：甘蓝枯萎病菌Fusarium oxysporum f.sp.conglutinans(李明远、张涛涛、李兴红、严红，十字花科蔬菜枯萎病及其病原鉴定；植物保护，2003，29(3)：44-45)，黄瓜枯萎病菌F.oxysporum f.sp.cucumerinum ACCC30442，西瓜枯萎病菌F.oxysporum f.sp.niveum ACCC 30024。菌丝生长抑制率测定结果如表3所示，3种作物枯萎病菌在含有5种浓度无菌发酵滤液的PDA平板上的生长均受到了一定程度的抑制，无菌发酵液的浓度与其抑菌作用呈正相关，且不同浓度的无菌发酵液对同一菌株的菌落扩展抑制作用具有显著性差异。从表中可以看出不同浓度的无菌发酵滤液对靶标病原菌均有明显的抑制作用。抑制作用随着稀释倍数的增加而降低，随着时间的延长而下降。随着无菌发酵滤液浓度的增大，靶标病原菌菌落直径明显减小。
表3枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983不同稀释度的无菌发酵液对枯萎病菌菌丝生长速率的抑制
注：各处理均值后的字母a～e示方差分析的结果，同一列内标有不同字母的均值在α＝0.05水平上具显著性差异，下表同。CK为对照。
实施例2、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983发酵液温室防治效果实验
供试靶标病原菌：甘蓝枯萎病菌Fusarium oxysporum f.sp.conglutinans(李明远、张涛涛、李兴红、严红，十字花科蔬菜枯萎病及其病原鉴定；植物保护，2003，29(3)：44-45)。供试作物品种；甘蓝中甘11号(北京益农种苗公司)。
实验设4个处理：
处理I：接种甘蓝枯萎病菌Fusarium oxysporum f.sp.conglutinans前3天，向甘蓝的根部灌实施例1的1中(1)制备的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983发酵液，每株40ml。
处理II：接种甘蓝枯萎病菌Fusarium oxysporum f.sp.conglutinans的同时向甘蓝的根部灌实施例1的1中(1)制备的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983发酵液，每株40ml。
处理III：接种甘蓝枯萎病菌Fusarium oxysporum f.sp.conglutinans三天后向甘蓝的根部灌实施例1的1中(1)制备的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983发酵液，每株40ml。
处理IV(CK)：只接种甘蓝枯萎病菌Fusarium oxysporum f.sp.conglutinans，以只灌同样体积的水的处理作为对照。
每个处理50株苗，三次重复；各处理随机排列。
其中，甘蓝在4-6叶期按照如下方法接种甘蓝枯萎病菌Fusarium oxysporumf.sp.conglutinans。将根系浸泡在病原菌孢子悬浮液内沾根后移栽，待供试植物入穴培土后，用病原菌孢子液进行灌根。
接种后第12天和第20天调查发病情况，计算病株率(发病株数/50株)、病情指数和防治效果。
其中，病情调查以叶片为单位进行普查，病害分级标准如下：
0级：无病斑；
1级：单叶片有病斑3个；
3级：单叶片有病斑4-6个；
5级：单叶片有病斑7-10个；
7级：单叶片有病斑11-20个，部分密集成片；
9级：单叶片有病斑密集占叶面积25％以上；
病情指数＝〔∑(各级病叶数×相对级数值)/(调查总叶数×9)〕×100。
防治效果(％)＝〔(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数〕×100。
结果表明甘蓝枯萎病菌接种后10天对照盆栽苗出现明显的症状，接种后12和20天病情调查结果表明，3种处理方式对甘蓝枯萎病的防治效果差异显著，以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983发酵液灌根后3d接种病原菌的防效最好，其病株率和病情指数均远低于其它2种处理；而接种3d后发酵液灌根防效最差(表4和表5)。
表4.接种后12天枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983发酵液对甘蓝枯萎病的防治效果
| 病株率％ | 病情指数 | 防治效果 | |
| CK | 100a | 66.67a | 0 |
| 处理I | 10d | 2.5d | 96.25a |
| 处理II | 80c | 27.5c | 58.75b |
| 处理III | 83.33b | 36.46b | 45.31c |
注：各处理均值后的字母a-d示方差分析的结果，同一列内标有不同字母的均值在α＝0.05水平上具显著性差异。CK为对照
表5.接种后20天枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983发酵液对甘蓝枯萎病的防治效果
| 病株率％ | 病情指数 | 防治效果 | |
| CK | 100a | 89.59a | 0 |
| 处理I | 80b | 22.5c | 74.89a |
| 处理II | 95a | 52.5b | 41.4b |
| 处理III | 95.83a | 53.125b | 40.7b |
注：各处理均值后的字母a-c示方差分析的结果，同一列内标有不同字母的均值在α＝0.05水平上具显著性差异。CK为对照。
其中，接种后20天枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983发酵液对甘蓝枯萎病的防治效果照片如图5所示。图5中左侧四列为处理I的照片，右侧四列为处理IV的照片。
实施例3、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983的菌株发酵条件优化。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种嗜温性的好氧产芽孢的G+杆状细菌。该菌在自然界中广泛存在，对人畜无毒无害，不污染环境，能产生多种抗菌素和酶，具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力。由于其产生耐热抗逆的芽孢，因此对生防菌剂的生产、剂型加工及在环境中的存活、定殖与繁殖都十分有利。芽孢杆菌制剂已广泛应用于农业、食品、饲料等各个领域，是一种理想的生防微生物。
本实施例筛选营养简单、成本低廉、原料易得、高活菌产量的培养基及发酵条件。
本实施例活菌数的测定方法如下：采用逐步稀释法稀释106-107倍后，将处理吸取100μl在NA培养基(每1000ml培养基含蛋白胨10g、牛肉膏3g、Nacl 5g、琼脂15g，pH6.5)上涂平板，28℃恒温培养24h-48h后计算菌落数，再折算成每ml培养基中含有的活菌数(cfu/ml)，设3次重复。
一、最适培养基的筛选
1、采用单因素试验对碳源、氮源和矿物质进行筛选。以产生活菌数(CFU/ml)的多少作为衡量标准，并考虑供试材料的经济性。
碳源的筛选：分别选取大米粉、玉米粉、蔗糖、葡萄糖或可溶性淀粉为碳素营养。每个处理加入碳源1g/50ml，以0.5g/50ml酵母粉为基本氮素营养，将培养基装入500ml三角瓶，培养基的装液量为50ml培养基/500ml三角瓶，接入枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983，接种量为5％(体积比)、使枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983在培养基中的初始含量为7×106CFU/ml。在35℃，13mm旋转半径的摇床转速为180rpm中培养72小时，测定枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983的活菌数(CFU/ml)。
氮源的筛选：分别选取酵母粉、进口鱼粉、豆饼粉、麦麸、尿素、蛋白胨为氮素营养。每个处理加入氮源lg/50ml，基本碳素营养为玉米粉1g/50ml，pH6.5。将培养基装入500ml三角瓶，培养基的装液量为50ml培养基/500ml三角瓶，接入枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983，接种量为5％。在35℃，13mm旋转半径的摇床转速为180rpm中培养72小时，测定枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)B03 CGMCC No.1983的活菌数(CFU/ml)。
矿物质的筛选：分别选取MgSO4·7H2O、NaCl、MnSO4·H2O、K2HPO4·3H2O、KH2PO4、CaCO3为矿物质。每个处理碳源为玉米粉1g/50ml，氮源为豆饼粉1g/50ml，矿物质按照其常用量加入，pH6.5，以不加矿物质的培养基为对照(CK)。将培养基装入500ml三角瓶，培养基的装液量为50ml培养基/500ml三角瓶，接入枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983，接种量为5％(体积比)、使枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983在培养基中的初始含量为7×106CFU/ml。在35℃，13mm旋转半径的摇床转速为180rpm中培养72小时，测定枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983的活菌数(CFU/ml)。
为了大规模的工业发酵培养，在筛选营养物质的同时，要着重考虑廉价的农副产品。单因素试验的结果如表6所示，在碳源的筛选试验中，大米粉、玉米粉和可溶性淀粉的结果都较为理想，但是考虑到原料成本，所以选择玉米粉作为碳素来源；豆饼粉作为氮素营养源更加有利于菌体的产生；矿物质K2HPO4·3H2O最有利于菌体的产生，而MnSO4·H2O、KH2PO4的加入也起到了一定的作用，但这几种营养物质是否显著影响发酵产生的活菌数以及如何进行配比，尚需进一步试验验证。
表6.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983在单因素实验中各测试营养元素中的活菌数(×亿CFU/ml)
2、采用均匀设计进行工业培养基的筛选
对单因素试验筛选出的三种基本营养物质进行均匀设计试验，利用均匀设计软件设计5因素15水平的均匀设计表。为了利于回归模型的建立及优化，对该表进行优化，使其更加均匀。根据预试验结果及试验可行性确定考察因素的范围，安排试验方案。按照安排的条件进行试验，将每个试验号的结果列入表后，对其进行二次多项式逐步回归分析，建立回归方程，并检测方程的可行性，进一步筛选发酵培养基的最适宜原料。具体如下：
(1)均匀设计表的设计及其优化
根据基本营养单因素试验的结果，确定了5个考查因素，分别为玉米粉、豆饼粉、MnSO4·H2O、K2HPO4·3H2O、KH2PO4。因素及考察范围见表7和8。
表7.均匀试验因素水平表(g/50ml)
| 因素 | 考察范围 | |
| X1 | 玉米粉 | 0.2-3.0 |
| X2 | 豆饼粉 | 0.2-3.0 |
| X3 | MnSO<sub>4</sub>·H<sub>2</sub>O | 0-0.4 |
| 因素 | 考察范围 | |
| X4 | K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>·3H<sub>2</sub>O | 0-0.4 |
| X5 | KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> | 0-0.4 |
表8.5因素15水平的取值(g/50ml)
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | |
| X1 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 | 1.2 | 1.4 | 1.6 | 1.8 | 2.0 | 2.2 | 2.4 | 2.6 | 2.8 | 3.0 |
| X2 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 | 1.2 | 1.4 | 1.6 | 1.8 | 2.0 | 2.2 | 2.4 | 2.6 | 2.8 | 3.0 |
| X3 | 0 | 0.1 | 0.2 | 0.3 | 0.4 | 0 | 0.1 | 0.2 | 0.3 | 0.4 | 0 | 0.1 | 0.2 | 0.3 | 0.4 |
| X4 | 0 | 0.1 | 0.2 | 0.3 | 0.4 | 0 | 0.1 | 0.2 | 0.3 | 0.4 | 0 | 0.1 | 0.2 | 0.3 | 0.4 |
| X5 | 0 | 0.1 | 0.2 | 0.3 | 0.4 | 0 | 0.1 | 0.2 | 0.3 | 0.4 | 0 | 0.1 | 0.2 | 0.3 | 0.4 |
用均匀设计软件设计5因素15水平的均匀设计表，使其更加均匀，对其进行进一步优化，优化后的中心化偏差CD值为0.1241，L2-偏差D＝0.0284，修正偏差MD＝0.1737，对称化偏差SD＝0.9090，可卷偏差WD＝0.2309，条件数C＝1.3536，D-优良性＝5.9700E-13，A-优良性＝0.0181，见表9。
表9.优化后的5因素15水平均匀设计表
(2)均匀设计试验方案及试验结果
本试验采用5因素15水平共15组试验考查了发酵培养基中玉米粉、豆饼粉、MnSO4·H2O、K2HPO4·3H2O、KH2PO4 5种组分对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983发酵产生活菌数的影响。其中，各培养基的pH6.5。将培养基装入500ml三角瓶，培养基的装液量为50ml培养基/500ml三角瓶，接入枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983，接种量为5％(体积比)、使枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983在培养基中的初始含量为7×106CFU/ml。在35℃，13mm旋转半径的摇床转速为180rpm中培养72小时，测定枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983的活菌数(CFU/ml)。
试验设计方案及结果见表10。
表10.均匀设计方案及结果
(3)试验数据的分析及回归模型的建立
利用均匀设计软件将表中的试验数据进行二次多项式逐步回归分析，得出活菌数与各因素关系的回归方程：
Y＝612.113001-1119.1160622X3+48.08106048X2 2-2935.3159054X4 2
-659.58766922X1X3+523.9584017X1X4-359.1950374X1X5-884.7686328X2X5
+6635.198565X3X5+2086.0711678X4X5
N＝15，相关系数R＝0.9867，F值＝20.4653 Df＝(9，5)，显著水平p＝0.002，
剩余标准差S＝52.3392，调整后的相关系数Ra＝0.9623
表11列出了回归方程各项的t检验值及显著水平，每一项的t检验值均遵从tn-m-1分布，tn-m-1＝t5，因临界值t5(0.1)＝2.015，各项的t检验值均大于临界值t5(0.1)。根据回归方程的显著水平及方程各项的t检验值可知，回归方程显著。
分析上述方程式，可得出以下结论：
MnSO4·H2O的负性作用非常明显，而豆饼粉和K2HPO4·3H2O对菌体产生影响显著；X1X3，X1X4，X1X5，X2X5，X3X5，X4X5有交互作用；其中X1X3，X1X5，X2X5的交互作用非常显著但在方程中为一负系数，说明由于MnSO4·H2O的负性作用，影响到玉米粉的作用，而KH2PO4的存在可能同时影响玉米粉和豆饼粉的作用，因此，MnSO4·H2O和KH2PO4的存在不利于活菌体的产生。在考察的范围内，玉米粉和K2HPO4·3H2O增加到一定量时，活菌数达到最大，之后开始下降，因此不宜过高；而随着豆饼粉的不断增加，活菌数也随之提高；因此，经筛选而得到的工业培养基的组分为玉米粉、豆饼粉和K2HPO4·3H2O。
表11.回归方程各项的t检验值及显著水平
| t检验值 | 显著水平 | |
| r(y，X<sub>3</sub>) | 5.7215 | 0.0012 |
| r(y，X<sub>2</sub><sup>2</sup>) | 2.9858 | 0.0245 |
| r(y，X<sub>4</sub><sup>2</sup>) | 2.3333 | 0.0584 |
| r(y，X<sub>1</sub>X<sub>3</sub>) | 2.7859 | 0.0317 |
| r(y，X<sub>1</sub>X<sub>4</sub>) | 2.3156 | 0.0598 |
| r(y，X<sub>1</sub>X<sub>5</sub>) | 4.1715 | 0.0059 |
| r(y，X<sub>2</sub>X<sub>5</sub>) | 3.8769 | 0.0082 |
| r(y，X<sub>3</sub>X<sub>5</sub>) | 4.4267 | 0.0044 |
| r(y，X<sub>4</sub>X<sub>5</sub>) | 2.1859 | 0.0715 |
3、采用均匀设计确定各因素的最佳配比
(1)均匀设计表的设计及其优化
将已筛选出的玉米粉、豆饼粉、K2HPO4·3H2O应用3因素9水平的均匀设计表安排试验，将各因素的各水平对活菌数进行二次多项式逐步回归分析，建立回归方程，检验方程的可行性，寻找最佳发酵培养基的配比及指标最大预测值并进行优化验证试验。
根据筛选试验的结果，用均匀设计软件设计3因素9水平的均匀设计表，为使其更加均匀，对其进行进一步优化，优化后的均匀设计表中心化偏差CD值为0.0936，L2-偏差D＝0.0488，修正偏差MD＝0.1082，对称化偏差SD＝0.3905，可卷偏差WD＝0.1484，条件数C＝1.1071，A-优良性＝0.0501；根据试验的可行性及经验，确定其考察范围，见表12和13。
表12.因素及考察范围
| 因素 | 考察范围(g/50ml) | |
| X1 | 玉米粉 | 0.6-3.0 |
| X2 | 豆饼粉 | 0.6-3.0 |
| X3 | K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>·3H<sub>2</sub>O | 0-0.4 |
表13.优化后的3因素9水平均匀设计表
其中，各培养基的pH6.5。将培养基装入500ml三角瓶，培养基的装液量为50ml培养基/500ml三角瓶，接入枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983，接种量为5％(体积比)、使枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983在培养基中的初始含量为7×106CFU/ml。在35℃，13mm旋转半径的摇床转速为180rpm中培养72小时，测定枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983的活菌数(CFU/ml)。
(2)均匀设计试验方案及试验结果
本试验采用3因素9水平共9组试验考查了发酵培养基中玉米粉、豆饼粉、K2HPO4·3H2O 3种组分对P-161菌株发酵产生活菌数的影响。试验设计方案及结果见表14。
表14 试验方案及结果
(3)试验数据的分析及回归模型的建立
利用均匀设计软件将表中的试验数据进行二次多项式逐步回归分析，得出活菌数与各因素关系的回归方程：
Y＝36.7749041-17.716711448X2-163.97358835X3+327.1171958X3 2
+115.40039076X2X3
N＝9，相关系数R＝0.9384，F值＝7.3693，Df＝(4，4)，显著水平p＝0.0394，
剩余标准差S＝14.4832
回归方程的F值＝7.3693，大于F(4，4) 0.05＝6.39，通过F检验(0.05)，回归方程非常显著。
分析上述方程式，可知：在考察的范围内，随着豆饼粉和K2HPO4·3H2O不断增加，活菌体的产量也随之提高；根据逐步回归分析的原则，将贡献最小的变量删去，因此包含玉米粉的变量由于并不起显著作用而没有被选入方程，但是根据经验及以上的试验结果可知，碳氮比需适中，玉米粉的过多和过少都不适合活菌体的产生。因此，得出最佳发酵培养基为：
玉米粉＝1.5g/50ml，豆饼粉＝3.0g/50ml，K2HPO4·3H2O＝0.4g/50ml。
对Y求最大值，Ymax＝108.85，其预测区间为Y＝Ymax±Uα·S＝108.85±28.39；即在优化条件下安排试验，发酵培养基产生活菌数Y应该在80.46×108-137.24×108之间。
5、优化培养基的验证试验
按优化所得的最佳培养基重新安排试验，即采用的培养基由玉米粉(北京市三元饲料厂)1.5g，豆饼粉(北京市三元饲料厂)3.0g，K2HPO4·3H2O 0.4g和水50ml组成。培养基的初始pH6.5。将培养基装入500ml三角瓶，培养基的装液量为50ml培养基/500ml三角瓶，接入枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983，接种量为5％(体积比)、使枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983在培养基中的初始含量为7×106CFU/ml。在35℃，13mm旋转半径的摇床转速为180rpm中培养72小时，测定枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983的活菌数(CFU/ml)。两次重复试验结果(表15)表明，由最佳培养基所得到的活菌数都在其方程Y的预测区间内。
表15 优化培养基的验证试验
| 试验 | 玉米粉(g/50ml) | 豆饼粉(g/50ml) | K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>·3H<sub>2</sub>O(g/50ml) | 活菌数(×10<sup>8</sup>cfu/ml) |
| 1 | 1.5 | 3.0 | 0.4 | 112 |
| 2 | 1.5 | 3.0 | 0.4 | 106 |
二、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983最适培养条件的筛选
1、菌株生长曲线及pH曲线的测定
采用的培养基由牛肉膏3g、葡萄糖5g、蛋白胨10g、水1000ml组成。培养基的初始pH7.0。将培养基装入500ml三角瓶，培养基的装液量为50ml培养基/500ml三角瓶，接入枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983，接种量为5％(体积比)、使枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983在培养基中的初始含量为7×106CFU/ml。在35℃，13mm旋转半径的摇床转速为180rpm中培养。从0h开始，每3h取样测定培养基的pH值，利用分光光度仪在660nm处测定菌株发酵培养基的光吸收值，用未接种的培养基作空白对照。绘制枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983菌株的生长曲线及pH曲线。结果如图6a和6b所示，在0～9h，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983菌株处于生长的延滞期，菌体数量很少；在9～24h，是枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)B03 CGMCC No.1983菌株的对数生长期，菌体数量急剧增加；在24～27h，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983处于生长的稳定期，菌体数量达到最大不再增加；27h之后，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03CGMCC No.1983开始进入生长的衰亡期，菌体数量逐渐减少。
发酵培养时间是影响发酵液浓度及芽孢成熟率的重要因素之一。对数期的微生物因其整个群体的生理特性较一致、细胞成分平衡发展和生长速率恒定，可作为代谢、生理等研究的良好材料，也是发酵生产中用作“种子”的最佳种龄。结果表明，发酵培养时间过短菌数尚可，但芽孢转化率及成熟度较低，时间过长芽孢转化率及成熟度并无明显提高，反而出现菌体老化、菌数下降的情况。由于在生产中通常选用处于对数生长期的菌体作为种子，此时的种子既保持有旺盛的增殖能力，又达到了高的浓度以缩短发酵周期，因此，选定枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03CGMCC No.1983的最佳种龄是21～24h。
在0-6h，发酵培养基的pH值下降，6h之后发酵培养基的pH值缓慢上升；发酵48h后，pH值达到8.41。结果表明，随着发酵时间的延长，pH值有升高现象，这主要是由于芽孢形成过程中菌体组织分离脱落，使孢内碱性物质溶出，另外也与芽孢形成过程中菌体的代谢有关。
2、接种量对菌株生长的影响
分别采用装液量体积的1％、2％、5％、10％、20％的接种量接种发酵培养基，使枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983在培养基中的初始含量分别为1.4×106CFU/ml、2.8×106CFU/ml、7×106CFU/ml、14×106CFU/ml、28×106CFU/ml。培养72小时，其它培养条件同步骤1，测量各处理的活菌数，各三次重复。结果如图7所示，表明接种量在1％-5％的范围内，菌株生长量随着接种量的增大而逐渐增加；接种量在5％-20％的范围内，随着接种量的增大，菌株的生长量下降的很快，说明接种量过高对菌株的生长影响较大。当接种量为2％-5％时，菌株生长量最大。因此，菌株的最适接种量为2％-5％。
3、发酵培养基起始pH对菌株生长的影响
用1mol/L HCl和1mol/L NaOH溶液调节发酵培养基的pH值，设为5、6、7、8、9共五个处理，其它培养条件同步骤1，测量各处理的活菌数，各三次重复。结果如图8所示，表明发酵培养基初始pH为5-6时，菌株生长量随pH值的升高而增多，随后逐渐下降；当pH值为6时，发酵产生的活菌体最多，为菌株培养最适培养基初始pH值。
4、瓶装量对菌株生长的影响
在500ml的三角瓶中加入发酵培养基分别为50ml、75ml、100ml、125ml、150ml，其它培养条件同步骤1，测量各处理的活菌数，各三次重复。结果如图9所示，表明菌株的生长量随着每瓶装液量的增加而逐渐减少，以每瓶装液量50ml/500ml的菌株生长最好，产生的活菌体最多，说明该菌株为好气菌，发酵培养时的通气条件对菌株的生长有较大的影响，通气条件越好，越有利于菌株的生长。
5、温度对菌株生长的影响
将恒温摇床的温度分别设置为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，其它培养条件同步骤1，测量各处理的活菌数，各三次重复。结果如图10所示，表明发酵温度对菌株的生长影响很大。较低的温度不利于菌体的生长，随着温度的提高，发酵培养基产活菌体数大幅度增长，当温度达到35℃时，产活菌体数最多。而温度过高，达到40℃时，产活菌体数迅速降低，说明过高的温度反而不利于菌株的生长。
6、摇床转速对菌株生长的影响
将旋转半径为13mm的恒温摇床的转速分别设置为120rpm、150rpm、180rpm、210rpm、240rpm，其它培养条件同步骤1，测量各处理的活菌数，各三次重复。结果如图11所示，表明转速对菌株的生长具有很大的影响。摇床转速过快或过慢都不利于菌株的生长；当转速为180rpm时，发酵培养基中产活菌体最多。枯草芽孢杆菌是需氧性发酵过程，通过改变摇床转速来调节通气量，转速太小，通气量小，不利于菌体生长，但摇床转速太大时，可能会引起菌体自溶，使得生物量减少。
7、发酵过程中菌株产量的变化
采用的培养基由玉米粉(北京市三元饲料厂)1.5g，豆饼粉(北京市三元饲料厂)3.0g，K2HPO4·3H2O 0.4g和水50ml组成。培养基的初始pH6.5。将培养基装入500ml三角瓶，培养基的装液量为50ml培养基/500ml三角瓶，接入枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983，接种量为5％(体积比)、使枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03 CGMCC No.1983在培养基中的初始含量为7×106CFU/ml。在35℃，13mm旋转半径的摇床转速为180rpm中培养24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h或120h。分别测定各处理的活菌数，设三次重复。结果如图12所示，表明菌株在优化培养基中培养36h之前为生长延滞期，之后菌量开始急剧增加，在培养84h时，菌量达到最大；培养84h后，菌量开始逐渐减少。因此，发酵终止时间应在84h。在84小时，活菌数达112×108cfu/ml。
Claims (7)
1.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03CGMCC No.1983。
2.一种甘蓝枯萎病的生防制剂，它的活性成分是下述a)或b)：
a)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03CGMCC No.1983菌体；
b)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03CGMCC No.1983菌体和其代谢产物。
3.根据权利要求2所述的生防制剂，其特征在于：所述代谢产物从除去枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03CGMCC No.1983菌体的发酵滤液中获得。
4.一种制备权利要求2或3所述的甘蓝枯萎病的生防制剂的方法，其特征在于：用于生产所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03CGMCC No.1983菌体的发酵培养基的初始pH为5-7，由如下物质配成：玉米粉20-36g，豆饼粉50-70g，K2HPO4·3H2O 4-12g，加水定容至1000ml。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基的初始pH为6-7，由如下物质配成：玉米粉30g，豆饼粉60g，K2HPO4·3H2O 8g，加水定容至1000ml。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：用于生产所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03CGMCC No.1983菌体的发酵温度为30-37℃；发酵时间为72-84小时。
7.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述发酵温度为35℃，发酵时间为84小时。
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