CN113322285B - 一种利用荧光假单胞菌发酵生产诺尔霉素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用荧光假单胞菌发酵生产诺尔霉素的方法，属于微生物发酵领域，步骤可分为菌种发酵和提取精制两步，具体包括：将荧光假单胞菌接种至固体培养基培养后取孢子制成悬浮液，接种至液体培养基搅拌培养得到培养液，将培养液接种至发酵培养基中搅拌培养得发酵液，过滤、萃取，萃取液转入缓冲液中静置，再转入醋酸丁酯中经活性炭脱色，加入成盐剂，经共沸蒸馏即得诺尔霉素。本发明利用荧光假单胞菌发酵生产诺尔霉素，可以作为生物农药，能够有效防治番茄青枯病病害，是一种极具应用前景的生物防治制剂。
Description
技术领域
本发明涉及一种荧光假单胞菌发酵工艺，具体涉及一种利用荧光假单胞菌发酵生产诺尔霉素的方法，属于微生物发酵领域。
背景技术
诺尔霉素(normycin)由多位微生物专家和植病专家多年研究而成，于2003年首次提供成品为研究生做剂型试验论文而命名；诺尔霉素呈白色或者类白色粉末，是一种抗生素的衍生物，由原抗生素脱毒增效而成，室内灭菌试验表明其杀菌活性是相同浓度一般农用抗生素的100倍以上，同位素跟踪实验表明，诺尔霉素能被植物的叶片、表皮和根部吸收并上下传导，且在植物体内能发挥更优异的杀菌效力。其作用机理是在很低浓度的情况下能快速干扰致病菌菌体代谢酶系统的活性，从而抑制菌体的生长，在较高浓度时阻断菌体蛋白质的合成，造成菌体原生质膜丧失功能而起到杀菌作用。
诺尔霉素中性偏酸，诺尔霉素对细菌和低等真菌有高效的抑制和杀灭作用，是预防和治疗细菌性病害(如：溃疡病、软腐病、细菌性角斑病、细菌性条斑病、白叶枯病、青枯病、穿孔病、细菌性流胶病等)及低等真菌引起的病害(如：猝倒病、根腐病、霜霉病、白锈病、疫病、绵疫病等)的特效药物，在抑制杀灭有害致病菌的同时对大多数有益菌群和农作物非常安全。
诺尔霉素在水里的溶解度较低，而且对作为溶剂的水质要求较高，在不纯的水溶液里不稳定，容易形成絮状沉淀，在常温下的纯净水里能溶解到1％左右，且很难与其它物质混配稳定的溶解于水里；一般水溶液为0.4～0.6％,比较稳定。
荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)属革兰氏阴性杆状细菌，是植物根际最普遍的微生物类群，具有分布广、数量多、营养需要简单、繁殖快、竞争定殖力强的特点，能产生几种活性物质，抗多种植物病害，其作用机制包括：抗生素的作用、噬铁素对铁的营养竞争、有效的根际定殖等。我国农业部已将其列为可注册登记的微生物农药和肥料品种之一，在全国范围内推广使用。对植物病害，尤其是土传病害如碎倒病、根腐病、枯萎病等均有很好的防治作用，是一类重要的有益微生物资源，在农业生产上具有非常重要的意义。
但目前为止，有关荧光假单胞菌的报道多为其具有植物促生和增强植物抗逆的作用，主要集中在荧光假单胞菌具有良好的溶磷能力，能够促进植物体磷含量，从而促进植物生长，而利用其进行菌种发酵尚未有相关报道。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种利用荧光假单胞菌发酵生产诺尔霉素的方法，使得荧光假单胞菌剂具有更优的生防效果。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种利用荧光假单胞菌发酵生产诺尔霉素的方法，步骤如下：
1)将荧光假单胞菌接种至固体培养基23-28℃培养7-10d，优选为在25℃下培养7-10d，得到荧光菌孢子培养物；
2)用无菌水将荧光菌孢子培养物制成悬浮液接种至已灭菌的液体培养基中，通入无菌空气，25-30℃搅拌培养24-28h，优选为在27℃下搅拌培养24-28h，得到培养液；
3)将培养液接种至发酵培养基中，通入无菌空气，25-28℃搅拌培养7-10d，优选为在27℃下搅拌培养7d，即得发酵液；
4)发酵液自然冷却后过滤、萃取，萃取液转入pH值为7.0-7.2的缓冲液中静置，再转入醋酸丁酯中经活性炭脱色，加入成盐剂，经共沸蒸馏即可得诺尔霉素。
进一步，上述的诺尔霉素通过与有机酸进行酰化反应得到半合成诺尔霉素。
进一步，固体培养基为：金氏B培养基。
液体培养基为：蒙金娜有机磷液体培养基。
发酵培养基为含有苯乙酸的发酵培养基。
进一步，步骤3)还包括在发酵过程中补足苯乙酸前体及发酵培养基的操作。
进一步，步骤4)中萃取的操作为在pH值为2.0-2.5的条件下以醋酸丁酯多级逆流萃取。
本发明的有益效果在于：本发明利用荧光假单胞菌发酵生产诺尔霉素，可以作为生物农药，能够有效防治番茄青枯病病害，是一种极具应用前景的生物防治制剂。
附图说明
图1为本发明实施例4诺尔霉素HPLC色谱图峰。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在以下实施例中，荧光假单胞杆菌为荧光假单胞杆菌AbⅢ745-6，由实验室分离得到。
固体培养基、液体培养基、发酵培养基为自配，原料均自市场购买获得，其中，固体培养基为：金氏B培养基。
液体培养基为：蒙金娜有机磷液体培养基。
发酵培养基为含有苯乙酸的发酵培养基。
实施例1
利用荧光假单胞菌发酵生产诺尔霉素的方法，步骤如下：
1)将荧光假单胞菌接种至固体培养基25℃下培养7d，得到荧光菌孢子培养物；
2)用无菌水将荧光菌孢子培养物制成悬浮液接种至已灭菌的液体培养基中，通入无菌空气，27℃下搅拌培养24h，得到培养液；
3)将培养液接种至发酵培养基中，通入无菌空气，27℃下搅拌培养7d，在发酵过程中，随时补足苯乙酸前体及发酵培养基，得到发酵液；
4)发酵液自然冷却后过滤、在pH值为2.3的条件下于萃取机内以醋酸丁酯多级逆流萃取，萃取液转入pH值为7.0的缓冲液中静置，再转入醋酸丁酯中经活性炭脱色，加入成盐剂，经共沸蒸馏即可得诺尔霉素。
实施例2
利用荧光假单胞菌发酵生产诺尔霉素的方法，步骤如下：
1)将荧光假单胞菌接种至固体培养基23℃培养7d，得到荧光菌孢子培养物；
2)用无菌水将荧光菌孢子培养物制成悬浮液接种至已灭菌的液体培养基中，通入无菌空气，25℃搅拌培养24h，得到培养液；
3)将培养液接种至发酵培养基中，通入无菌空气，25℃搅拌培养7d，在发酵过程中，随时补足苯乙酸前体及发酵培养基，得到发酵液；
4)发酵液自然冷却后过滤、在pH值为2.0的条件下于萃取机内以醋酸丁酯多级逆流萃取，萃取液转入pH值为7.0的缓冲液中静置，再转入醋酸丁酯中经活性炭脱色，加入成盐剂，经共沸蒸馏即可得诺尔霉素。
实施例3
利用荧光假单胞菌发酵生产诺尔霉素的方法，步骤如下：
1)将荧光假单胞菌接种至固体培养基28℃培养10d，得到荧光菌孢子培养物；
2)用无菌水将荧光菌孢子培养物制成悬浮液接种至已灭菌的液体培养基中，通入无菌空气，30℃搅拌培养28h，得到培养液；
3)将培养液接种至发酵培养基中，通入无菌空气，28℃搅拌培养10d，在发酵过程中，随时补足苯乙酸前体及发酵培养基，得到发酵液；
4)发酵液自然冷却后过滤、在pH值为2.5的条件下于萃取机内以醋酸丁酯多级逆流萃取，萃取液转入pH值为7.2的缓冲液中静置，再转入醋酸丁酯中经活性炭脱色，加入成盐剂，经共沸蒸馏即可得诺尔霉素。
实施例4
取实施例1中诺尔霉素制备成冻干粉，以诺尔霉素标样为对照，分别进行高效液相色谱检测，具体操作如下：
色谱条件：
色谱柱：ODS不锈钢柱5μm；流动相：乙腈+溶剂＝12+88，溶剂为0.005mol/L磷酸钠水溶液与0.05mol/L IPR-B6的混合液，以磷酸调节pH值为4；流量：1.0mL/min；柱温25℃；波长230nm；进样量10μL。
操作步骤：
分别取冻干粉(试样)和标样0.5000g于25mL容量瓶中，以水溶解并稀释至刻度，摇匀，在上述色谱条件下，连续注入4-5针标样至相邻两针峰面积相对变化＜1.5％，按标样、试样、试样、标样的顺序进样。
检测结果：
试样色谱图如图1，保留时间3.935min，标样保留时间3.921min。
实施例5
选择江苏连云港东海县蔬菜基地作为试验地，参照农药田间药效试验准则(三)，稀释浓度5000倍，选择番茄青枯病初发期，共施药2次，前后间隔7d，施药采用灌根方式，每株每次灌药量200mL。
于第一次施药后每7d调查一次，按下式计算病株率与防治效果，结果如表1。
表1番茄青枯病病害防治结果
Claims (1)
1.一种利用荧光假单胞菌(Psdeuomnoda fluoerncnet)发酵生产诺尔霉素的方法，其特征在于，步骤如下：
1)将荧光假单胞菌接种至固体培养基25℃下培养7d，得到荧光菌孢子培养物；
2)用无菌水将荧光菌孢子培养物制成悬浮液接种至已灭菌的液体培养基中，通入无菌空气，27℃下搅拌培养24h，得到培养液；
3)将培养液接种至发酵培养基中，通入无菌空气，27℃下搅拌培养7d，在发酵过程中，随时补足苯乙酸前体及发酵培养基，得到发酵液；
4)发酵液自然冷却后过滤,在pH值为2.3的条件下于萃取机内以醋酸丁酯多级逆流萃取，萃取液转入pH值为7.0的缓冲液中静置，再转入醋酸丁酯中经活性炭脱色，加入成盐剂，经共沸蒸馏即可得诺尔霉素；
所述荧光假单胞杆菌为：荧光假单胞杆菌AbⅢ745-6，所述固体培养基为：金氏B培养基，所述液体培养基为：蒙金娜有机磷液体培养基，所述发酵培养基为：含有苯乙酸的发酵培养基。
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