CN114933999B - 一株假单胞菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株假单胞菌及其应用，涉及植物根际促生菌技术领域。该菌株于2022年4月25日，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2022483。本发明分离和筛选得到了一株具有优良特性的促生菌，经鉴定，该菌株为假单胞菌(Pseudomonas sp.)，与Pseudomonas laurylsulfatiphila的同源性最相似(99.79％)。该菌株具有固氮、溶磷、解钾以及分泌IAA的功能，为丰富薄壳山核桃促生菌菌种资源库，在薄壳山核桃微生物菌肥的开发，农林业生产上如减少化肥的使用，促进植物生长等方面具有重要意义。

Description

一株假单胞菌及其应用

技术领域

本发明涉及植物根际促生菌技术领域，特别是涉及一株假单胞菌及其应用。

背景技术

薄壳山核桃商品名为碧根果，是胡桃科，山核桃属的一种木本油料树种，其种子因富含蛋白质，钙铁锌硒等人体必需的微量元素，被称之为坚果之王。氮素(N)是生物体最重要的元素之一，核酸、蛋白质、激素、维生素等有机分子的合成都离不开N，N在植物的生长和代谢过程中亦是不可或缺。经济园艺作物过量施肥现象比较普遍，但化学肥料的过度施用不仅浪费资源，还将使得肥料利用率降低，且容易造成一系列环境问题。微生物菌肥是实现农林业可持续发展的新型肥料。

探索挖掘适用于薄壳山核桃的微生物菌肥，对探索产出高效、产品安全、资源节约、环境友好的现代碧根果产业发展之路具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一株假单胞菌及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明提供的假单胞菌具有固氮、溶磷、解钾以及分泌IAA的功能。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供本发明提供一株假单胞菌(Pseudomonas sp.)T9，其特征在于，于2022年4月25日，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2022483。

本发明还提供一种微生物菌肥，包含上述的假单胞菌或上述的假单胞菌的发酵培养物。

进一步地，所述发酵培养物是将权利要求1所述的假单胞菌接种于发酵培养基中发酵培养得到。

进一步地，所述发酵培养基为LB培养基。

进一步地，所述发酵培养的条件为28℃，120r/min，24h。

本发明还提供上述的假单胞菌在制备薄壳山核桃促生长菌肥中的应用。

本发明还提供一种上述的假单胞菌或微生物菌肥在促进薄壳山核桃生长中的应用。

本发明还提供一种促进薄壳山核桃生长的方法，包括对核桃植株施用上述的假单胞菌或微生物菌肥。

本发明公开了以下技术效果：

本发明分离和筛选得到了一株具有优良特性的促生菌T9，经鉴定，T9菌株为假单胞菌(Pseudomonas)，与Pseudomonas laurylsulfatiphila的同源性最相似(99.79％)。

本发明的T9菌株具有固氮、溶磷、解钾以及分泌IAA的功能，其中，固氮酶活性为7.15nmol/h/mL，净固氮量为0.13mg/L，净溶磷量为45.394mg/L，净解钾量为4.14mg/L，净分泌IAA的量为18.56mg/L。该菌株为丰富薄壳山核桃促生菌菌种资源库，在薄壳山核桃微生物菌肥的开发，农林业生产上如减少化肥的使用，促进植物生长等方面具有重要意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为T9菌株的革兰氏染色(A)、鞭毛染色(B)和荚膜染色(C)结果；标尺均为20μm；

图2为T9菌株的甲基红实验结果；

图3为T9菌株的糖酵解实验结果；

图4为T9菌株的VP实验结果；

图5为T9菌株的淀粉水解实验结果；

图6为T9菌株的明胶水解实验结果；

图7为T9菌株的硝酸盐还原实验结果；

图8为T9菌株的氧化酶还原实验结果；

图9为T9菌株的吲哚实验结果；

图10为T9菌株的固氮实验结果；

图11为T9菌株的溶磷实验结果；

图12为T9菌株的解钾实验结果；

图13为T9菌株的分泌IAA实验结果，其中，A为对照，B为T9菌株。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1

一、菌株分离和筛选

1.薄壳山核桃根际土壤采集

采样地区位于江苏泰州金三盟科技有限公司，土壤采集时间为2020年10月上旬，采样目标为树龄7年生的薄壳山核桃人工林根际土壤。首先将土壤表面的腐殖质除去，用小铁锹挖取5-40cm深的土壤。其次，找到植物的根，去除石块，轻轻抖动，去掉多余土壤。最后将抖落后依旧附着在根系的土壤装入已灭菌的聚乙烯塑料袋中，封口后后置于干冰泡沫箱中带回实验室。遵循多点采样的原则，将江苏泰州金三盟科技有限公司样地内各方位的薄壳山核桃根际土壤样本混为一个土样，备用。

2.根际土壤固氮菌的分离和筛选

步骤1：准备培养基

使用常用的固氮培养基——阿须贝氏培养基(Ashby)具体配方如下：

甘露醇10g，磷酸氢二钾0.2g，七水硫酸镁0.2g，氯化钠0.2g，二水硫酸钙0.1g，碳酸钙5.0g，琼脂粉15g，用蒸馏水定容至1L。将配好的培养基加热融化，待至55-60℃时倒至各培养皿中(每皿15mL左右，厚度3-5mm)。

步骤2：制备土壤悬浮液

称取土样10g，放入盛90mL无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，振荡均匀约20min，静置30s后，即制成10^-1的稀释液；用移液枪从三角瓶中吸取1mL土壤悬浮液加到编号为10^-2的试管中充分摇匀，混合均匀后，从此管中吸取1mL加到编号为10^-3的试管中充分混合均匀，以此类推，制成10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7不同稀释度的土壤稀释液。

步骤3：涂布平板，恒温培养。

待培养基凝固后，用移液枪吸取10^-3-10^-7几种不同稀释度土壤溶液0.1mL接种到培养基中央位置，用无菌玻璃涂布棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温下静置5-10min，使菌液吸附进培养基后，培养皿倒置放入恒温培养箱28℃培养3-5d。

步骤4：平板划线纯化

用接种环将单菌落平板划线接种到新的培养基(尽量挑取单菌落中心处的细菌)。约四到五代可以分离到纯种的菌落。待菌苔长出后，检查其特征是否一致，同时将细胞涂片染色后检查是否为单一微生物。若发现有杂菌，需再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。

步骤5：菌种保存

经过初筛复筛，最终保留了19株菌，用移液枪吸取0.5mL菌悬液，0.5mL 30％灭菌后的甘油，将其均匀混合在灭菌过的2mL离心管中，并保存在-80℃冰箱中。保证甘油浓度为15％。经定性研究发现，上述19株菌中的T9菌株是一株具有固氮、溶磷、解钾和分泌IAA功能的多功能菌株。

二、菌株T9的形态、生理生化特性及分子鉴定

1.鉴定方法

(1)形态观察方法

对通过平板划线纯化得来的菌落进行形态观察，包括形状、色泽、表面、透明度、气味、粘度。将菌体在培养基上培养至对数生长期，按试剂盒说明书(索莱宝公司)染色后于光学显微镜下观察菌株T9的革兰氏阴阳性、有无荚膜，有无鞭毛等形态特征。

(2)生理生化特性方法

a.甲基红实验

将菌株T9接种至MR生化管中，200r/min，28℃恒温培养24h，滴加5滴甲基红溶液，混匀后立即观察结果，显红色为阳性，显黄色则为阴性。

b.糖酵解实验

将菌株T9接种在2支糖酵解生化管中，接种后一支加液体石蜡封口，另一支不封口。200r/min，28℃恒温培养24h。培养结束后，二者均变黄为发酵型细菌，不封口者变黄而封口者不变黄为氧化型细菌，二者均不变黄者为产碱型细菌。

c.VP实验

将菌株T9接种在VP生化管中，200r/min，28℃恒温培养24h。培养结束后滴加VP试剂(A液6滴，B液2滴)，混匀后将VP管静止0.5-2h。变红则为阳性，不变色或棕黄色为阴性。

d.淀粉水解实验

将菌株T9接种于淀粉水解固体平板培养基上，28℃恒温培养3d。培养结束后在平板培养基上滴加碘液，待碘液均匀散开后，观察菌落是否变蓝。若变蓝，则为阴性，不变蓝则为样性。

e.明胶水解实验

将菌株T9接种于明胶水解固体平板培养基上，28℃恒温培养3d。培养结束后，将平板培养基放置于4℃冰箱里30min，如内容物不凝固呈液态状，则为阳性反应，如内容物凝固不流动，则为阴性反应。

f.硝酸盐还原实验

将菌株T9接种在硝酸盐还原实验生化管中，200r/min，28℃恒温培养24h。培养结束后，滴加硝酸盐还原试剂A液和B液各2-3滴，数秒后观察颜色变化，若变红则为阳性反应；若不变色，继续加入少量锌粒，如仍不变红则也为阳性反应，如变红则为阴性反应。

g.氧化酶实验

将氧化酶试纸用少量蒸馏水润湿，用一次性无菌接种环挑取单个菌落涂在试纸上，在30s内变蓝色或者蓝紫色为阳性反应，如不变色则为阴性反应。

h.吲哚实验

将菌株T9接种在装有1mL LB液体培养基的离心管内，200r/min，28℃恒温培养24h。培养结束后，加入Kovacs试剂2-3滴，混匀后立即观察结果，如在培养物上出现玫红色环则为阳性反应，如不变色则为阴性反应。

LB培养基配方：胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10g，pH 7.0-7.1，总体积1L。

(3)分子鉴定方法

采用菌体直接扩增16S rDNA的方法。以MR4、R6的总DNA作模板，PCR扩增引物选用16S rDNA细菌通用引物27f-1492r。5’端引物为5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，3’端引物为：5’-TACCTTGTTACGACTT-3’。50μL的反应体系：DNA模板1μL，dNTP(2.5mM)4μL，引物(1mM)各1μL，10xBuffer15μL，MgCl₂(25mM)3μL，Taq酶(5UμL-1)0.5μL，超纯水35.5μL。PCR反应条件：94℃预变性2min，进入热循环：94℃变性30s，52℃退火，72℃延伸1min，共30个循环。扩增后，取5μL的扩增样品在1％的琼脂糖凝胶上60V电压下进行电泳检测。回收目标DNA片段，然后送往测序公司进行测序。采用系统发育学分析时，将所测得的序列经拼接后在NCBI数据库中进行BLAST比对，并选择同源性比较高的菌株及常见固氮菌种的16S rDNA序列作为参比菌株，然后应用MEGA5.05软件的邻位相接法构建系统进化树，检验支持率的重复抽样次数为1000次。

2.鉴定结果

对通过平板划线纯化得来的T9菌落进行形态观察，发现该T9菌落在Ashby培养基中的形态特征为黄色，圆形，边缘透明，较易挑落，表面不光滑，无味。对T9菌株进行形态染色观察发现该菌株为革兰氏阴性菌，有荚膜，无鞭毛(图1)。对该菌株的生理生化特征进行研究，发现该菌株为氧化型(图3)，明胶液化(图6)、甲基红(图2)、VP(图4)呈阴性结果，淀粉水解(图5)、氧化酶(图8)，硝酸盐还原(图7)以及分泌吲哚(图9)呈阳性结果。

采用菌体直接扩增16S rDNA的方法，对T9菌株进行测序，经BLAST比对，该菌株为与假单胞属(Pseudomonas)下的Pseudomonas laurylsulfatiphila同源性最相似(99.79％)。

3.菌种保藏

菌株T9于2022年4月25日，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2022483。

三、菌株T9的促生特性研究

1.定性研究

将固氮菌株T9分别接种到无机磷、解钾固体平板培养基上，28℃恒温培养2-5d。培养结束后观察它们否有透明圈从而判断具有溶有机磷/无机磷，解钾的能力。同时，将菌株分别接种至含色氨酸的King液体培养基上，培养结束后采用Salkowski比色法判断菌株是否具有分泌IAA的功能，若反应液颜色变成粉红色则说明菌株具有分泌IAA的能力。

无机磷培养基配方：葡萄糖10.0g，硫酸铵0.5g，酵母浸粉0.5g，氯化钠0.3g，氯化钾0.3g，硫酸镁0.3g，硫酸亚铁0.03g，硫酸锰0.03g，磷酸三钙5.0g，琼脂粉15g(固体平板时用)，pH 7.0-7.5，总体积1L。

解钾培养基配方：葡萄糖5g，七水硫酸镁0.05g，氯化铁0.1g，碳酸钙2g，钾长石粉3.0g，磷酸钙2g，琼脂粉15g(固体平板时用)，pH 6.8-7.0，总体积1L。

含色氨酸的King培养基配方：蛋白胨20g，磷酸氢二钾1.15g，七水硫酸镁1.5g，丙三醇15mL；色氨酸100mg，总体积1L。

定性研究结果发现T9菌株是一株具有固氮(图10)、溶磷、解钾和分泌IAA功能的多功能菌株。在溶磷(图11)，解钾(图12)固体平板培养基上均有透明圈，IAA反应液变粉红色(图13)。

2.定量研究

对T9菌株的促生特性进行定量研究，具体方法如下：

a.固氮酶活性和净固氮量测定

T9菌株能在Ashby无氮培养基上连续稳定传达5代以上，证明T9菌株为一株具有固氮能力的促生菌。固氮效能主要体现在固氮酶活性的大小，是菌株的潜在固氮能力。而净固氮量则为菌株固定大气氮满足自身消耗后所剩余在培养液里的氮含量。采用乙炔还原法测定固氮菌株固氮酶活性，采用靛酚蓝比色法测定T9菌株的净固氮量。

取0.5mL浓度为10⁸CFU/mL的菌液加入至25mL三角瓶中(20mLAshby培养基)，30℃恒温，150r/min培养3d，10000r/min离心10min，取上清液测介质测净固氮量。

b.净溶磷量测定

钼锑比色法测菌株T9的解磷能力。取0.5mL的待测菌(10⁸CFU/mL)加入至加入至25mL三角瓶中(20mL解磷培养基)，30℃恒温，150r/min培养3d，10000r/min离心10min，取上清液测介质有效磷含量。

c.净解钾量测定

火焰光度法测菌株T9的解钾能力。取0.5mL的的待测菌(10⁸CFU/mL)加入至加入至25mL三角瓶中(20mL解磷培养基)，30℃恒温，150r/min培养3d，10000r/min离心10min，取上清液测介质有效钾含量。

d.净分泌IAA含量测定

Salkowski比色法测菌株T9分泌IAA的能力。取0.5mL浓度为10⁸CFU/mL的菌液加入至25mL三角瓶中(含有100mg/L^-1色氨酸的King液体培养基)，30℃恒温，150r/min培养3d，10000r/min离心10min，取上清液测介质IAA含量。等体积的上清液和Salksowski比色液(FeCl₃4.5 g，ddH₂O 300mL，98％浓硫酸587.7mL，冷却定容至1L)混合后，于OD₅₃₀进行比色。

定量研究结果：

对菌株T9的促生特性进行定量研究后发现菌株T9的固氮酶活性为7.15nmol/h/mL，净固氮量为0.13mg/L，净溶磷量为45.394mg/L，净解钾量为4.14mg/L，净分泌IAA的量为18.56mg/L。研究结果表明，T9菌株具有固氮，溶磷，解钾以及分泌IAA的能力，其中以溶磷和分泌IAA的作用最突出。该菌株虽可以固定大气氮，自身对氮也有一定的需求量，因此该菌株产生植物可利用的有效氮含量较低。但总体而言，该菌株的多功能促生特性在后期生物菌肥的研发中具有重要意义，尤其是在提高土壤磷含量以及促进植物生长方面具有一定的应用价值。

实施例2菌株T9的回接效应研究

试验设计：本试验从2021年11月开始沙藏薄壳山核桃种子，待2022年春季种子萌发后，开展接种试验。采用单因素完全随机试验，试验植株选用生长状况一致的薄壳山核桃实生幼苗，试验菌株选用筛选出的高效多功能促生菌T9。采用菌液浸根+灌根接种法接种，以不接种为空白对照，每个处理设置3个重复，每个重复10株苗，即处理组和对照组共60株苗。

菌悬液制备：活化菌株后，按1％的接种量接种到装有100mL LB液体培养基的三角瓶中，至于摇床恒温培养(28℃，120r/min)24h。分光光度计测定OD₆₀₀菌悬液浓度，并用LB培养基调节OD值至0.4～0.5(约1×10⁸～1×10⁹CFU/mL)后，备用。

菌株T9回接：利用菌液浸根+灌根接种法接种，具体是将薄壳山核桃根系置于菌液中浸根10min后，将苗木移栽至盛有土壤基质的无纺布袋(直径32cm，高35cm)中，移栽后将苗木浇透，待水渗完之后，再用拔掉针头的注射器将菌液沿着根系附近灌根接种20mL，10d及20d后，分别用灌根接种法再接种20mL，共接种3次，以浇水作为空白对照。试验周期内定期浇水拔草，防虫害等管护，保证试验苗的正常生长条件。

接种菌株T9对薄壳山核桃生长和光合特性的影响：接种T9两个月后，测定薄壳山核桃生长和光合特性。结果如表1和表2所示，与不接菌(CK)相比较，接种菌株T9促进了薄壳山核桃苗高，地径，叶片数，叶面积等生长特性，并且提高了薄壳山核桃的光合特性。

表1接种T9对薄壳山核桃生长特性的影响

注:不同字母代表显著差异，p<0.05。

表2接种T9对薄壳山核桃光合特性的影响

注:不同字母代表显著差异，p<0.05。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (5)

1.一株假单胞菌（Pseudomonas sp.）T9，其特征在于，于2022年4月25日，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2022483。

2.一种微生物菌肥，其特征在于，包含权利要求1所述的假单胞菌。

3.一种如权利要求1所述的假单胞菌在制备薄壳山核桃促生长菌肥中的应用。

4.一种如权利要求1所述的假单胞菌或权利要求2所述的微生物菌肥在促进薄壳山核桃生长中的应用。

5.一种促进薄壳山核桃生长的方法，其特征在于，包括对薄壳山核桃植株施用权利要求1所述的假单胞菌或权利要求2所述的微生物菌肥的步骤。

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