CN101984834A

CN101984834A - 果实病害防腐保鲜剂

Info

Publication number: CN101984834A
Application number: CN 201010173206
Authority: CN
Inventors: 余挺; 郑晓冬; 陈荣乐; 卢黄娉
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2010-05-17
Filing date: 2010-05-17
Publication date: 2011-03-16
Anticipated expiration: 2030-05-17
Also published as: CN101984834B

Abstract

本发明公开了一种果实病害防腐保鲜剂，其由罗伦隐球酵母悬浮液、嘧霉胺和水组成，每1L保鲜剂中含有1×10¹⁰～1×10¹¹个罗伦隐球酵母细胞、4～400mg嘧霉胺，其余为水；罗伦隐球酵母的保藏名称为：罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii)ZJU 10，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2010年1月20日，保藏号：CGMCC NO.3590，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。该果实病害防腐保鲜剂具有防腐效果好的特点。

Description

果实病害防腐保鲜剂

技术领域

本发明涉及的是果实采后病害防治技术领域，更具体的是一种利用拮抗酵母和低剂量杀菌剂的果实防腐保鲜技术。

背景技术

水果和蔬菜采后病害，是一个全球性的问题。发达国家约有10％-30％的新鲜果蔬由于采后病害导致腐烂损失。长期以来，控制果蔬采后病害的主要措施是使用杀菌剂。但是由于杀菌剂的长期和大量使用，严重地污染了环境，并会对人类健康造成危害。此外，高频率地使用单一种类的杀菌剂会使病原菌产生抗药性问题，使杀菌剂的防治效果大大降低。

嘧霉胺(pyrimethanil)是一种新型植物病害杀菌剂，国内外对该杀菌剂的防治已有较多研究，包括单独使用或作为主效成分复合使用。中国发明专利，专利号99809537.0(含嘧霉胺的悬浮高浓度制剂)，公开了一种含嘧霉胺的悬浮浓缩水剂。中国发明专利，专利号CN1759674B(防治番茄灰霉病的杀菌剂组合物)，公开了一种含的嘧霉胺防治番茄灰霉病的化学杀菌剂组合物。中国发明申请号200710000069.4(含有嘧霉胺的油状透明液体杀真菌组合物)，公开了一种含有嘧霉胺的油状透明液体杀真菌组合物。中国发明申请号200910037471.9(嘧霉胺水剂)，公开了一种嘧霉胺水剂的配方。中国发明申请号200910016497.5(嘧霉胺水分散粒剂及其制备方法)，公开了一种以嘧霉胺为主效剂的植物病害杀菌剂。中国发明申请号200810027606.9(一种沙糖桔复合保鲜剂)，公开了一种含嘧霉胺的沙糖桔复合保鲜剂。中国发明申请号200910139726.2(一种杀菌组合物)公开了一种嘧霉胺与嘧菌环胺的复配杀菌组合物，可用于果树、棉花、水稻、蔬菜等作物的病害，尤其是真菌性病害防治。中国发明专利，专利号ZL02818140.9(含有嘧霉胺和异菌脲的杀真菌剂组合物)，公开了一种含嘧霉胺和异菌脲的新型杀真菌剂组合物，能控制特定植物病害或控制植物上存在或可能出现的特定的植物致病真菌。中国发明申请号200910139904.1(一种含有咯菌腈的复配杀菌组合物)，公开了一种农用杀菌组合物，嘧霉胺和咯菌腈的复配杀菌组合物。中国发明申请号200910023669.1(含有烟酰胺和嘧霉胺的农药杀菌组合物)，公开了一种以烟酰胺和嘧霉胺为有效成分的农药组合物。中国发明申请号200910165912.3(一种含氟啶胺的杀菌组合物)，公开了一种含嘧霉胺的杀菌剂组合物。中国发明申请号98805038.2(含有4-苯氧喹啉的杀菌混剂)，公开了一种含嘧霉胺的杀菌剂组合物。中国发明申请号200310115313.3(黄芩提取物作为农用杀菌剂的应用以及含有之的农用杀菌组合物)，公开了一种含嘧霉胺和黄苓提取物的防治农作物病害的杀菌剂。中国发明申请号200410023846.3(一种防治灰霜霉病的杀菌组合物)，公开了一种含嘧霉胺的防治灰霜霉病的杀菌组合物。中国发明申请号200680046042.2(杀真菌活性物质结合物)，公开了一种含嘧霉胺和肟醚衍生物的杀真菌剂。中国发明申请号200910032951.6(一种咪鲜胺和嘧霉胺复配的杀菌组合物)，公开了一种含咪鲜胺和嘧霉胺的复配杀菌组合物。此外，中国发明申请号200580036082.4(苯胺基嘧啶用于木材保护的用途)，公开了一种含嘧霉胺的防止木材霉变保护剂。中国发明申请号200810195214.3(鲍曼菌液活性粗浸膏嘧霉胺复配杀菌剂及其应用)公开了一种含鲍曼菌液和嘧霉胺复合杀菌剂。

低剂量化学杀菌剂与采后生防制剂的混合使用也是目前的研究热点，因为该方法具有以下优点：增强处理对病害的控制，特别是杀菌剂对病原菌一般都具有杀灭的作用，而生防制剂往往仅具有抑菌的效应；消除病原菌对化学杀菌剂的抗药性；提高生防制剂的效力以达到商业化应用的抑菌水平；降低生防制剂的浓度以降低使用成本，从而提高生防制剂的经济性(Janisiewicz和Conway，2010)。

但国内外尚未见有拮抗酵母和嘧霉胺复合使用对果实病害控制的报道。

参考文献

Janisiewicz WJ and Conway WS.2010.Combining biological control with physical andchemical treatments tocontrol fruit decay after harvest.Stewart Postharvest Review 2010，1：3Published online 01 March 2010doi：10.2212/spr.2010.1.3(简尼斯维克和孔伟，2010，联合生物控制和物理、化学处理对果实采后病害的控制，斯图尔特采后综述，在线发表。)

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种防腐效果好的果实病害防腐保鲜剂。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种果实病害防腐保鲜剂，该保鲜剂由罗伦隐球酵母悬浮液、嘧霉胺和水组成，每1L保鲜剂中含有1×10¹⁰～1×10¹¹个罗伦隐球酵母细胞、4～400mg嘧霉胺，其余为水；所述罗伦隐球酵母的保藏名称为：罗伦隐球酵母(Cryptococcuslaurentii)ZJU 10，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2010年1月20日，保藏号：CGMCC NO.3590，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明提供的果实病害防腐保鲜剂，是含有罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏编号CGMCC 3590)悬浮液和低剂量杀菌剂嘧霉胺(pyrimethanil)的复合型防腐保鲜剂。上述罗伦隐球酵母悬浮液是指经过菌种活化，并配制成的具有抑菌效果且浓度适宜的酵母菌悬液。

本发明所使用的低剂量杀菌剂嘧霉胺的有效浓度是指其使用量不抑制拮抗酵母的生长和繁殖，并能发挥嘧霉胺特有的杀菌作用且能与罗伦隐球酵母产生对病害协同控制的浓度。

发明人在发明过程中，为了寻求合适的杀菌剂，曾进行了如下实验：

实验1、杀菌剂对扩展青霉在PDA平板上的抑制效应：

1、杀菌剂

(1)扑海因(Rovral，50％Iprodione SC)，拜耳作物科学公司生产；

(2)丰收纯(Moncozeb·Diniconazole，32.5％WP)，江苏农药研究所生产；

(3)甲基托布津(Topsin-M，70％WP)，日本曹达株式会社生产；

(4)特普唑(Diniconazole，12.5％WP)，沈阳丰收农药有限公司生产；

(5)好力克(Horizon，43％Tebuconazole SC)，拜耳作物科学公司生产；

(6)翠喜(Prochloraz，45％EC)，深圳诺普信农化有限公司生产；

(7)使百克(Prochloraz，25％EC)，上海迪拜农药有限公司生产；

(8)施加乐(有效成分嘧霉胺含量为40％)，拜耳作物科学公司生产；

2、PDA培养基：含马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，用水定容至1000ml，自然pH，121℃灭菌20min。

3、滤纸片制作：用打孔器在定量滤纸上打出直径5mm的小圆片，于121℃灭菌20min，备用。

4、病原菌：供试病原菌分离于自然发病的苹果果实，经鉴定为扩展青霉(Penicilliumexpansum)。将扩展青霉接种于PDA培养基28℃下培养7天后置于4℃冰箱中备用。

5、病原菌培养和孢子悬浮液制备：

1)、活化：将扩展青霉孢子接种于PDA斜面培养基上，在28℃培养7天，重复传代培养2次。

2)、离心分离：向培养基中加入5mL含0.05％(V/V)Tween80(使病原菌孢子悬浮均匀)的无菌水，用接种环刮下孢子，形成孢子悬浮液。用移液枪取1ml孢子悬浮液于离心管中，在3000r/min条件下，离心10-15分钟，并用0.05％Tween80的无菌水洗涤2次，以去除培养介质。

3)、悬浮和确定浓度：向离心管中加入少量0.05％Tween80的无菌水，使孢子振荡混匀，并将孢子悬浮液稀释成10倍和100倍两个浓度梯度，用血球计数板计数并调整浓度至5×10⁴cfu/mL，待用。

6、病原菌对杀菌剂的敏感性：

用移液枪取1000μl浓度为5×10⁴cfu/ml的扩展青霉孢子悬浮液注入平板上，与PDA培养基混合均匀，待培养基凝固后，将无菌的滤纸片置于平板中心，取20μl一定浓度的杀菌液加入到滤纸片上，将平板置于28℃下培养72小时。每种杀菌剂设6个处理，浓度依次为10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml，每个浓度做3个重复，用无菌水作对照。用十字交叉法测量抑菌圈直径大小，观察不同浓度杀菌剂对扩展青霉的抑制效果。

7、结果：

从图1和表1可以看出，丰收纯在最高浓度10mg/ml下对P.expansum几乎不存在抑制作用。特普唑对P.expansum的最小抑菌浓度大于2.5mg/ml，远远高于推荐使用浓度0.05mg/ml，因此特普唑不适合作为P.expansum的杀菌剂。相比较而言，翠喜、使百克、施加乐对P.expansum的抑制效果较好，其最小抑菌浓度分别为0.0143mg/ml、0.0521mg/ml、0.0150mg/ml。虽然甲基托布津对C.laurentii没有影响，但是其对P.expansum的毒性不如以上三种杀菌剂。因此综合各种杀菌剂对C.laurentii和P.expansum的毒性影响，选择施加乐作为体内实验的杀菌剂。

表1、不同种类杀菌剂对扩展青霉(P.expansum)在PDA平板上的抑制效应

杀菌剂	抑制线性方程(x：杀菌剂浓度；y：抑制)	回归系数	最低抑制浓度(MIC，mg/ml)
				丰收纯	-	-	None
翠喜	y＝19.4340x+35.85	0.9769	0.0143
				好力克	y＝9.6645x+9.7961	0.8689	0.0969
施加乐	y＝24.7970x+31.812	0.9976	0.0521
				甲基托不津	y＝20.2600x+15.378	0.9852	0.1742
扑海因	y＝16.0700x+5.0593	0.9654	0.4844
				特普坐	-	-	＞2.50
使百克	y＝20.0130x+36.505	0.9947	0.0150

实验2、杀菌剂对罗伦隐球酵母在PDA平板上的抑制效应

1、拮抗菌培养和细胞悬浮液制备：罗伦隐球酵母CGMCC NO.3590在低温(4℃)下保存在NYDA培养基(牛肉浸膏8g，酵母粉5g，葡萄糖10g，琼脂20克，水定容至1000ml，121℃灭菌20min)中。培养程序依次为：

①、活化：罗伦隐球酵母CGMCC NO.3590先在上述NYDA培养基中28℃培养48小时，然后重复传代培养2次(每次均为在NYDA培养基中28℃培养48小时)；

将上述重复传代培养2次所得的酵母用接种环接到NYDB种子培养基(牛肉浸膏8g、酵母粉5g、葡萄糖10g，水定容至1000ml，121℃灭菌20min)中，于200rpm、28℃下培养24小时；然后在相同条件下重复培养1次(即将NYDB种子培养基中培养而得的酵母再次用接种环接到NYDB种子培养基中，200rpm、28℃下培养24小时)；

②、液体培养：用接种环将步骤①所得活化好的酵母按照5％(重量比)的接种量接到NYDB种子培养基中，在200rpm、28℃条件下培养24小时；

③、离心分离：将步骤②液体培养所得产物在3000rpm条件下，离心10分钟，并用灭菌蒸馏水洗2次，以去除培养介质；

④、悬浮和确定浓度：用无菌蒸馏水重新悬浮酵母细胞，用血球记数板的方法确定酵母的浓度，并用无菌蒸馏水调整到试验所需要的浓度。

2、拮抗酵母对杀菌剂的敏感性：用移液枪取200μl浓度为1×10⁸cfu/ml的酵母悬浮液注入制备好的PDA培养基平板上，用灭菌的涂布棒涂布均匀，待其表面干燥后，将无菌的滤纸片置于平板中心，取20μl一定浓度的杀菌液加入到滤纸片上，将平板置于28℃下培养24小时。每种杀菌剂设6个处理，浓度依次为10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml，每个浓度做3个重复，用无菌水作对照。用十字交叉法测量抑菌圈直径大小，观察杀菌剂对拮抗酵母的毒性影响。

3、结果：由图2和表2可以看出，在体外试验中，翠喜、扑海因、特普唑对C.laurentii的毒力较大，其最小抑菌浓度分别为0.1073mg/ml、0.2498mg/ml、0.1348mg/ml；丰收纯、使百克、好力克对C.laurentii的毒性次之；相对而言，C.laurentii对施加乐敏感性较小(图2)，其最小抑菌浓度大于2.5mg/ml，约为推荐使用浓度的2.5倍，而甲基托布津对C.laurentii几乎不存在毒性影响，即使在10mg/ml的高浓度下也不出现抑菌圈，远远超过推荐使用浓度。

表2、不同种类杀菌剂对罗伦隐球酵母(C.laurentii)在PDA平板上的抑制效应

杀菌剂	抑制线性方程(x：杀菌剂浓度；y：抑制)	回归系数	最低抑制浓度(MIC，mg/ml)
				丰收纯	y＝6.1394x+1.6816	0.9629	0.5322
翠喜	y＝5.1486x+4.9907	0.9883	0.1073
				好力克	y＝17.3380x+2.6108	0.9802	0.7070
施加乐	-	-	＞2.50
				甲基托不津	-	-	None
扑海因	y＝6.5003x+3.9153	0.9990	0.2498
				特普坐	y＝9.0081x+7.841	0.9898	0.1348
使百克	y＝7.3130x+2.4913	0.9747	0.4564

因此，发明人考虑选用嘧霉胺作为低剂量杀菌剂。

综上所述，本发明提供的防腐保鲜剂有效整合了拮抗酵母和低剂量杀菌剂对果实病害控制的活性，对果实病害能达到完全抑制的效果；而且能大幅度降低拮抗酵母、杀菌剂的使用量(能降低90％以上)，从而显著降低成本。

本发明的果实病害防腐保鲜剂实际使用方式如下：

1)、预处理：

用保鲜剂对采前果实进行表面喷洒(果实表面润湿即可)或将采后的果实在保鲜剂中浸泡1～5分钟；

2)、将预处理后的果实进行常温或低温贮藏。常温一般为15～25℃，低温一般为0～6℃。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是杀菌剂对扩展青霉的在PDA平板上的抑制效应图；

图2是杀菌剂对罗伦隐球酵母在PDA平板上的抑制效应图。

图3是嘧霉胺对罗伦隐球酵母在梨果实伤口处生长的影响图；

图3中：CK为无菌水对照；Y+S1为每升保鲜剂配方中含罗伦隐球酵母浓度为1×10¹⁰cfu和400mg嘧霉胺；Y+S2为每升保鲜剂配方中含罗伦隐球酵母浓度为1×10¹⁰cfu和40mg嘧霉胺；Y+S3为每升保鲜剂配方中含罗伦隐球酵母浓度为1×10¹⁰cfu和4mg嘧霉胺。误差线为标准差，数据源于3组重复实验。

具体实施方式

下面详细说明本发明的具体实施例。

实施例1、一种果实病害防腐保鲜剂，其由罗伦隐球酵母悬浮液、嘧霉胺和水组成，每1L保鲜剂中含有1×10¹⁰个罗伦隐球酵母细胞、4mg嘧霉胺，其余为水。将上述3者简单加以混合即可。

罗伦隐球酵母的保藏名称为：罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii)ZJU 10，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2010年1月20日，保藏号：CGMCC NO.3590。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

罗伦隐球酵母CGMCC NO.3590在低温(4℃)下保存在NYDA培养基中，罗伦隐球酵母悬浮液的制备方法具体如下：

1)、活化：罗伦隐球酵母CGMCC NO.3590先在NYDA培养基中28℃培养48小时，然后重复传代培养2次(每次均为在NYDA培养基中28℃培养48小时)；

将上述重复传代培养2次所得的活化好的酵母用接种环接到NYDB种子培养基中，于200rpm、28℃下培养24小时；然后在相同条件下重复培养1次(即将NYDB种子培养基中培养而得的酵母再次用接种环接到NYDB种子培养基中，200rpm、28℃下培养24小时)；

2)、液体培养：用步骤1)活化所得的酵母按照5％(重量比)的接种量接到NYDB种子培养基中，在200rpm、28℃条件下培养24小时；

3)、离心分离：将步骤2)液体培养后的所得物在3000rpm条件下，离心10分钟，并用灭菌蒸馏水洗2次，以去除培养介质；

4)、悬浮和确定浓度：用无菌蒸馏水重新悬浮酵母细胞，用血球记数板的方法确定酵母的浓度，并用无菌蒸馏水调整到试验所需要的浓度。

以上所用的NYDA培养基为：牛肉浸膏8g，酵母粉5g，葡萄糖10g，琼脂20克，水定容至1000ml，高压(121℃，30分钟)灭菌。所用的NYDB种子培养基为：牛肉浸膏8g、酵母粉5g、葡萄糖10g，水定容至1000ml，高压(121℃，30分钟)灭菌。

实施例2、一种果实病害防腐保鲜剂，其由罗伦隐球酵母悬浮液、嘧霉胺和水组成，每1L保鲜剂中含有1×10¹⁰个罗伦隐球酵母细胞、40mg嘧霉胺，其余为水。其余内容同实施例1。

实施例3、一种果实病害防腐保鲜剂，其由罗伦隐球酵母悬浮液、嘧霉胺和水组成，每1L保鲜剂中含有1×10¹⁰个罗伦隐球酵母细胞、400mg嘧霉胺，其余为水。其余内容同实施例1。

实施例4、一种果实病害防腐保鲜剂，其由罗伦隐球酵母悬浮液、嘧霉胺和水组成，每1L保鲜剂中含有1×10¹¹个罗伦隐球酵母细胞、4mg嘧霉胺，其余为水。其余内容同实施例1。

实施例5、一种果实病害防腐保鲜剂，其由罗伦隐球酵母悬浮液、嘧霉胺和水组成，每1L保鲜剂中含有1×10¹¹个罗伦隐球酵母细胞、40mg嘧霉胺，其余为水。其余内容同实施例1。

实施例6、一种果实病害防腐保鲜剂，其由罗伦隐球酵母悬浮液、嘧霉胺和水组成，每1L保鲜剂中含有1×10¹¹个罗伦隐球酵母细胞、400mg嘧霉胺，其余为水。其余内容同实施例1。

为了证明本发明的果实病害防腐保鲜剂的防腐效果，发明人进行了如下对比实验：

对比实验1、嘧霉胺对罗伦隐球酵母在梨果实伤口处生长的影响：

1、水果预处理：梨(Pyrus pyrifolia Nakai)，产地河北，品种为水晶。所用水果均处于正常商业成熟期，实验中选取饱满圆润、外观整齐、无干枯、无受伤、无病害的果实。先用自来水清洗，然后再浸入0.1％的次氯酸钠溶液中消毒2分钟，取出，再用自来水冲洗干净，洗去残余次氯酸钠，晾干备用。

2、拮抗酵母在果实伤口处的生长动态

用消过毒的打孔器在果实表面形成4个3mm深×6mm宽的伤口，在每个伤口处分别加入30μl以下溶液：

(1)处理1：对照，每升溶液中含浓度为1×10¹⁰个罗伦隐球酵母细胞；

(2)处理2：Y+S1：每升溶液中含浓度为1×10¹⁰个罗伦隐球酵母细胞和嘧霉胺400mg(实施例3所得)；

(3)处理3：Y+S2，每升溶液中含浓度为1×10¹⁰个罗伦隐球酵母细胞和嘧霉胺40mg(实施例2所得)；

(4)处理4：Y+S3，每升溶液中含浓度为1×10¹⁰个酵母菌和嘧霉胺4mg(实施例1所得)。

然后将水果置于400×300×200mm大小的塑料筐中，用PE保鲜膜进行密封，以保持筐内95％的相对湿度。处理后贮藏在常温25℃下，定期取样对酵母的群体数量进行测定。测定方法是用打孔器将果实伤口处组织取出，放于定量无菌蒸馏水中，用研钵捣碎，用血球计数器在显微镜下对酵母菌数量进行统计。结果以每个伤口处总酵母数量为单位(logcells per wound)表示。每个处理重复3次，每重复2个果实。整个实验重复3次。

3、结果：将C.laurentii接种至梨伤口处，以5h、24h、48h、72h、96h为单位取样观察，然后以时间为横坐标，以每个伤口中酵母数目的常用对数值为纵坐标绘制生长曲线，结果见图3，具体数据见表3。从图3和表3可以看出，C.laurentii的生长没有明显的延滞期(Lag phase)，在0h到5h此期间酵母的分裂已经进行，且细胞数目开始增加；从0h到第24h为指数生长期，此期间细胞的同化作用大于异化作用，代谢旺盛，细胞分裂速度很快，处于积极的生长的状态；从24h开始酵母细胞的数目增长速度放缓，逐渐进入稳定期，同化作用与异化作用基本保持平衡，细胞数目基本保持不变。

表3嘧霉胺对罗伦隐球酵母在梨果实伤口处生长的影响

数据是均值±标准差(SD)，数据源于3组重复实验。

因此，4～400mg嘧霉胺/L并没有影响C.laurentii的生长，4种处理对C.laurentii的生长没有显著差异，这与体外试验的结果相一致，表明在低浓度下嘧霉胺对C.laurentii几乎没有毒性。

对比实验2、罗伦隐球酵母和嘧霉胺对梨果实青霉病的控制：

1、水果预处理：选取外观整齐、无病虫害的梨果实，先用自来水清洗，然后再浸入0.1％的次氯酸钠溶液中消毒2分钟，取出，再用自来水冲洗干净，洗去残余次氯酸钠，晾干备用。

2、防腐保鲜实验：用灭菌的打孔器在每个梨的腰部穿刺10个均一的3mm深×6mm宽的伤口。在每个伤口处分别加入30μl以下溶液：

空白对照：水，

对照1：每升溶液中含嘧霉胺400mg；

对照2：每升溶液中含嘧霉胺40mg；

对照3：每升溶液中含嘧霉胺4mg；

对照4：每升溶液中含高浓度C.laurentii(1×10¹¹cfu)

对照5：每升溶液中含低浓度C.laurentii(1×10¹⁰cfu)

实验组1：每升溶液中含1×10¹⁰cfu酵母菌和嘧霉胺400mg(实施例3)；

实验组2：每升溶液中含1×10¹⁰cfu酵母菌和嘧霉胺40mg(实施例2)；

实验组3：每升溶液中含1×10¹⁰cfu酵母菌和嘧霉胺4mg(实施例1)；

实验组4：每升溶液中含1×10¹¹cfu酵母菌和嘧霉胺4mg(实施例4)；

以上处理完成2小时后，取5×10⁴cfu/ml的扩展青霉菌悬液30μl，接种在每个水果伤口处。将这些处理过的水果放在400×300×200mm塑料筐中，用PE保鲜膜进行覆盖密封，保持95％的相对湿度。并将其于25℃下保藏。每天定时对果实伤口病害发生率和病斑直径进行观察和统计，连续观察5天。结果以平均病斑直径(mm)或抑制率(％)表示。每处理重复3次，每个重复6个果实。整个实验重复3次。其中，抑制率计算公式为：抑制率(％)＝(空白对照组平均病菌病斑直径一处理组平均病菌病斑直径)÷空白对照组平均病菌病斑直径×100。处理组指的是：对照2～对照5以及实验组1～实验组4。

数据分析：用统计软件SPSS V11.5(SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)进行统计分析和方差分析(one-way ANOVA)。用邓肯式多重差异分析进行均值分离，设定P＝0.05为显著性水平。

3、结果：如表4所示，所有处理组相对于空白对照组都有显著差异。其中，实验组1(每升溶液中含1×10¹⁰cfu酵母菌和嘧霉胺400mg)、实验组2(每升溶液中含1×10¹⁰cfu酵母菌和嘧霉胺40mg)和实验组4(每升溶液中含1×10¹¹cfu酵母菌和嘧霉胺4mg)对P.expansum的抑制效果最好，可以完全抑制P.expansum在果实上的侵染。而实验组3(每升溶液中含1×10¹⁰cfu酵母菌和嘧霉胺4mg)和对照2(每升溶液中含嘧霉胺40mg)或对照4(每升溶液中含1×10¹¹cfu C.laurentii)的效果相当。而且，当低浓度C.laurentii与低浓度嘧霉胺复合使用时，其对果实青霉病的防治效果显著高于两者单独使用时的效果。因此低浓度C.Laurentii与低剂量嘧霉胺结合使用时，能在降低成本并减少杀菌剂残留的前提下产生对梨果实青霉病更为有效的防治效果。

表4、不同处理对梨上P.expansum的抑制效果

处理	病害抑制率(％)	平均病斑直径(mm)
			空白对照	0±0e	10.1±1.76e
对照1	89.0±6.6ab	0.8±0.09a
			对照2	78.9±7.0bc	2.4±0.27b
对照3	53.4±0.9d	5.1±0.31d
			对照4	75.3±10.7c	2.7±0.17bc
对照5	52.2±5.6d	4.1±0.17cd
			实验组1	100±0a	0.0±0.0a
实验组2	100±0a	0.0±0.0a
			实验组3	70.0±2.8c	2.9±0.33bc
实验组4	100±0a	0.0±0.0a

数据是均值±标准差(SD)，数据源于3组重复实验。根据邓肯式多重差异分析，用相同字母标注的均值表示处理之间没有显著差异(P＝0.05)。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.一种果实病害防腐保鲜剂，其特征是：所述保鲜剂由罗伦隐球酵母悬浮液、嘧霉胺和水组成，每1L保鲜剂中含有1×10¹⁰～1×10¹¹个罗伦隐球酵母细胞、4～400mg嘧霉胺，其余为水；所述罗伦隐球酵母的保藏名称为：罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii)ZJU 10，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2010年1月20日，保藏号：CGMCCNO.3590，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。