CN103749542A - 解淀粉芽孢杆菌井冈霉素复配生物杀菌剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种解淀粉芽孢杆菌井冈霉素复配生物杀菌剂，包括有效活性成分以及助剂，其特征在于：有效活性成分占成品药剂的重量百分比为99%，所述的有效活性成分由解淀粉芽孢杆菌Lx-11和井冈霉素组成，在复配生物杀菌剂中，解淀粉芽孢杆菌生防菌株Lx-11的含量为30亿解淀粉芽孢杆菌活芽孢/毫升，井冈霉素的含量为2.5%。所述复配生物杀菌剂稀释后在水稻生长期喷洒在水稻上，用于防治水稻病害。

Description

解淀粉芽孢杆菌井冈霉素复配生物杀菌剂及其应用

技术领域：

本发明涉及一种复配生物杀菌剂及其应用，尤其是一种将解淀粉芽孢杆菌Lx-11和井冈霉素复配的生物杀菌剂及其在防治水稻病害中的应用。

背景技术：

随着国民经济的快速发展和人民生活水平的不断提高，对农产品的数量、质量及其安全性提出了越来越高的要求。保障无公害、优质农产品的供给和实现资源的可持续利用是21世纪农业生产面临的最大挑战。但是，近十年来，由于大面积种植晚熟型的优质、高产水稻品种，以及气候变暖和轻型栽培技术的推广使用，水稻病虫害的发生为害总体呈大幅度上升态势。2012年全国水稻白叶枯病发生约4000万亩，在南方籼稻稻区偏重发生；全国水稻纹枯病发生2.3亿亩，在华南、江南、长江流域及江淮稻区偏重发生。上述两种病害严重威胁水稻安全生产。目前农业生产上防治水稻白叶枯病和纹枯病主要依赖化学药剂，据不完全统计，每年用于防治水稻白叶枯病、纹枯病的药剂多达上万吨，这不仅造成了严重的水田生态环境和水质污染，而且直接增加了稻米中有毒化学物质的残留，对人类健康造成严重威胁。因此，“优质高产”与“安全性”已成为水稻生产中十分突出的矛盾。解决这一问题的根本途径是：突破目前以化学农药为主的防治对策的局限性，开拓以高效、无公害微生物复配农药为主的综合防治水稻病害的技术体系，为无公害优质稻米的产业化生产提供可持续发展的核心保障技术。

解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）是植物病害生物防治研究中的重要微生物之一，其种类多分布广，是土壤和植物微生态的优势种群。该类微生物通过分泌抗生物质和生长竞争，在防治植物病害方面发挥多种有益作用，大量研究发现一些解淀粉芽孢杆菌可以产生对植物病原菌有抑菌活性的抗菌物质，这些抗菌物质主要有低分子量的抗生素如肽类、脂肽类、细菌素以及高分子量蛋白类抗菌物质等。

中国专利文献CN101985608A公开了江苏省农科院筛选获得的对水稻白叶枯病有很好防效的解淀粉芽孢杆菌Lx-11，该菌株于2010年4月30日保藏于在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.3789，该菌株命名为Lx-11，分类命名：解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）。分离、纯化获得的Lx-11菌株在YPGA培养基上单细胞繁殖生长形成的菌落为圆形，四周光滑，乳白色；细胞形状为杆状，细胞直径大于1μm；形成芽孢，不形成伴孢晶体；需氧生长；接触酶、氧化酶反应为阳性；精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、脲酶、色氨酸脱羧酶反应为阴性；VP试验和硝酸盐还原为阳性；能利用葡萄糖，木糖，L-阿拉伯糖，甘露糖，乳糖，蔗糖，山梨糖，苦杏仁苷；不能利用蜜二糖，鼠李糖，肌醇等。

解淀粉芽孢杆菌生防菌Lx-11还具有许多优良性能，如：有较广的抑菌谱，对多种水稻病原菌有很强的抑制作用；生长速度快，适应环境能力强，能在土壤和植物表面定殖，并形成优势种群；诱导寄主产生抗病性；分泌产生多种抗菌物质；对水稻白叶枯病、细菌性条斑病有相当好的防治效果，对水稻纹枯病也有一定的防治效果。

目前，江苏省苏科农化有限责任公司生产用于防治水稻白叶枯病、细菌性条斑病的解淀粉芽孢杆菌Lx-11水剂。

井冈霉素，英文通用名Validamycin，分子式/结构式，C₂₀H₃₅O₁₃N，分子量：497.51，其他名称：有效霉素。纯品为白色无定型粉末，溶于水、二甲基甲酰胺，微溶于乙醇，不溶于丙酮、苯、乙酸乙酯、等有机溶剂，吸湿性强，在室温pH3-9水溶液中稳定。井冈霉素属低毒杀菌剂。纯品大小鼠急性经口LD50均大于2000毫克/公斤，皮下注射LD50均大于1500毫克/公斤。5000毫克/公斤涂抹大鼠皮肤无中毒反应。对鱼类低毒，鲤鱼TLM(96h)LD50>40毫克/升。井冈霉素是一种放线菌产生的抗生素，具有较强的内吸性，易被菌体细胞吸收并在其内迅速传导，作用机理主要是干扰和抑制菌体细胞生长和发育。主要用于水稻纹枯病防治，也可用于水稻稻曲病、玉米大小斑病以及蔬菜和棉花、豆类等作物病害的防治。

目前，将解淀粉芽孢杆菌Lx-11和井冈霉素复配的生物杀菌剂并未见诸报道。

发明内容：

本发明的目的在于：针对目前生产上大量使用化学农药防治水稻病害、严重污染农田生态环境、导致农药残留超标、影响优质稻米品质的问题，提出了一种对水稻重要病害——白叶枯病和纹枯病具有良好防治效果的解淀粉芽孢杆菌井冈霉素复配生物杀菌剂及其在防治水稻病害中的应用。解淀粉芽孢杆菌Lx-11和井冈霉素复配后，形成优势互补的特点，既能发挥井冈霉素能够有效控制纹枯病的作用，又能发挥解淀粉芽孢杆菌Lx-11诱导水稻植物抗病性、防治白叶枯病的作用。通过使用该复配生物杀菌剂剂，在稻田生态环境引进大量有益微生物，恶化病原菌的生存环境，结合栽培管理等农业措施，形成一个稳定的、平衡的、生物多样化的水稻生态系统，达到一药多治、持久地控制水稻病害流行的目的。

本发明的目的是这样实现的：一种解淀粉芽孢杆菌井冈霉素复配生物杀菌剂，包括有效活性成分以及助剂，其特征在于：有效活性成分占成品药剂的体积百分比为99%，所述的有效活性成分由解淀粉芽孢杆菌Lx-11和井冈霉素组成，在复配生物杀菌剂中，解淀粉芽孢杆菌Lx-11的含量为30亿解淀粉芽孢杆菌Lx-11活芽孢/毫升，井冈霉素的含量为5%。

本发明中，复配生物杀菌剂的有效活性成分是由60亿解淀粉芽孢杆菌Lx-11活芽孢/毫升水剂与5%井冈霉素水剂以重量比1:1复配后获得。

在本发明中，助剂为NNO（亚甲基双荼磺酸钠），NNO占复配生物杀菌剂重量的1%。

一种上述的复配生物杀菌剂的应用，其特征在于：将复配生物杀菌剂稀释100-1000倍。

在所述的复配生物杀菌剂的应用中：将稀释后的复配生物杀菌剂在水稻生长期喷洒在水稻上，用于防治水稻病害。

在所述的复配生物杀菌剂的应用中：所述的水稻病害是指：水稻白叶枯病，或水稻纹枯病。

本发明的优点在于：将生防微生物解淀粉芽孢杆菌Lx-11和农用抗生素井冈霉素按一定比例混合使用，不仅能发挥井冈霉素有效控制纹枯病的作用，又能发挥解淀粉芽孢杆菌Lx-11诱导水稻植物抗病性、防治白叶枯病的作用。通过复配、协同作用，达到优势互补、扩大防治范围、减少用药次数、降低用药成本、提高防治效果的目的。

由于有效成分含量高，便于存储和运输，使用时取水稀释，非常方便。

经测试表明，本发明复配杀菌剂产品中的井冈霉素对解淀粉芽孢杆菌Lx-11的生长、繁殖无干扰作用，并且延长了解淀粉芽孢杆菌活芽孢的货架期，使产品具有更加稳定的药效。

具体实施方式

实施例1、2.5%井冈霉素·30亿活芽孢∕毫升解淀粉芽孢杆菌水剂的配制

有效药物：

5%井冈霉素水剂由浙江省桐庐汇丰生物科技有限公司生产提供。

60亿解淀粉芽孢杆菌Lx-11活芽孢/毫升水剂（以下简称60亿活芽孢/毫升水剂）由江苏省苏科农化有限责任公司生产提供。

助剂：NNO（亚甲基双萘磺酸钠），外购。

将5%井冈霉素水剂和60亿活芽孢/毫升水剂按照重量百分比1:1备料，助剂NNO总重量的1%备料，即：

5%井冈霉素水剂：49.5%；60亿活芽孢/毫升水剂：49.5%；助剂NNO：1%。

制备过程：将5%井冈霉素水剂和60亿活芽孢/毫升水剂按上述比例置于混合器中，加入上述比例的助剂NNO,所有物料在混合器中混合均匀后，即成2.5%井冈霉素·30亿解淀粉芽孢杆菌Lx-11活芽孢∕毫升的解淀粉芽孢杆菌复配生物杀菌剂（以下简称2.5%井冈霉素·30亿活芽孢∕毫升解淀粉芽孢杆菌水剂）。

实施例2、2.5%井冈霉素·30亿活芽孢∕毫升解淀粉芽孢杆菌水剂抑制水稻白叶枯病菌生长的增效作用测定

供试菌株：水稻白叶枯病菌：XooZ173由江苏省农科院植保所提供。

被测药剂：由实施例1提供的2.5%井冈霉素·30亿活芽孢∕毫升解淀粉芽孢杆菌水剂。

对比药剂：

5%井冈霉素水剂由浙江省桐庐汇丰生物科技有限公司生产提供。

60亿解淀粉芽孢杆菌活芽孢/毫升水剂由江苏省苏科农化有限责任公司生产提供。

室内增效生物测定：

供试水稻白叶枯病菌XooZ173菌株在NA（每升中含牛肉浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，葡萄糖2.5g，琼脂18.0g）斜面培养基上活化，挑取一环接种到NA液体培养基中于28℃下培养24h，将菌液稀释到10⁸cfu/ml，吸取200μl均匀涂在NA平板上晾干，将1个直径为5mm灭菌滤纸片放在平板中央备用。

将5%井冈霉素稀释成500ppm、100ppm、50ppm、10ppm、5ppm、1ppm6个不同梯度；

将60亿解淀粉芽孢杆菌活芽孢/毫升稀释成6×10⁶cfu/ml、3×10⁶cfu/ml、6×10⁵cfu/ml、3×10⁵cfu/、6×10⁴cfu/ml、3×10⁴cfu/ml6个不同梯度；

将2.5%井冈霉素·30亿活芽孢∕毫升解淀粉芽孢杆菌水剂稀释成250ppm+3×10⁶cfu/ml、50ppm+1.5×10⁶cfu/ml、25ppm+3×10⁵cfu/ml、5ppm+1.5×10⁵cfu/ml、2.5ppm+3×10⁴cfu/ml、0.5ppm+1.5×10⁶cfu/ml6个不同梯度；

将3种待测药剂稀释成6个不同梯度，然后分别吸取20μl不同浓度的待测药液滴入灭菌滤纸片上。同时设立空白对照（将NA培养基滴入灭菌滤纸片），每处理3个重复。当空白对照平板长满白叶枯病菌时，测量抑菌圈直径，并计算抑制率。

抑制率（%）=2×抑菌圈直径/病原菌直径×100%

采用毒力曲线法即取剂量对数为横坐标(x)，抑菌百分率值为纵坐标(y)，在计算机上绘制毒力曲线，求出两种药剂毒力回归方程(y=a＋bx)、相关系数(r)，进而计算出EC₅₀值。

复配剂的理论EC₅₀=单剂IEC₅₀×配比数+单剂IIEC₅₀×配比数

增效系数SR=混合物的理论EC₅₀/混合物的实测EC₅₀

参考Wadle_y公式（增效系数SR>1.5为增效作用，1.5>SR>1.0为相加作用，SR<1.0为拮抗作用），求出在各种配比中的类扩展系数（SR）复配增效作用的大小。

室内试验结果（表1）表明，被测的2.5%井冈霉素·30亿活芽孢∕毫升解淀粉芽孢杆菌水剂增效系数为1.01，该复配组合表现出对抑制水稻白叶枯病菌的生长有相加作用。

表12.5%井冈霉素?30亿活芽孢/毫升解淀粉芽孢杆菌水剂抑制水稻白叶枯病菌生长的增效测定

实施例3、2.5%井冈霉素·30亿活芽孢∕毫升解淀粉芽孢杆菌水剂抑制水稻纹枯病菌菌丝生长的增效作用测定

供试菌株：

水稻纹枯病菌RH-2，由江苏省农科院植保所提供。

被测药剂：

由实施例1提供的2.5%井冈霉素·30亿活芽孢∕毫升解淀粉芽孢杆菌水剂。

对比药剂：

5%井冈霉素水剂由浙江省桐庐汇丰生物科技有限公司生产提供。

60亿解淀粉芽孢杆菌活芽孢/毫升水剂由江苏省苏科农化有限责任公司生产提供。

室内增效生物测定：

供试水稻纹枯病菌株移植PSA（每升含马铃薯200克、蔗糖20克、琼脂20克）培养基上，在25℃下培养2d，备用。

将水稻纹枯病菌菌块（直径7mm）接入PSA培养基平板中央，将3个直径为5mm的灭菌滤纸片分别放在离纹枯病菌菌块30mm处，成等边三角形放置在的平板上，备用。

将3种待测药剂稀释成6个不同梯度（具体稀释倍数见实例2），然后分别吸取20μl不同浓度的待测药液滴入灭菌滤纸片上。同时设立空白对照平板（将NA培养基滴入灭菌滤纸片），每处理3个重复。当空白对照平板长满纹枯病菌时，测量抑菌圈直径，并计算抑制率。

计算抑制率：抑制率（％）＝[(对照菌落直径－药剂处理菌落直径)/（对照菌落直径－7）]×100%

增效指数SR计算与实施例2相同。

室内试验结果（表2）表明，被测的2.5%井冈霉素·30亿活芽孢∕毫升解淀粉芽孢杆菌水剂增效系数为2.1，该复配组合表现出对抑制水稻纹枯病菌的生长有显著的增效作用。

表22.5%井冈霉素?30亿活芽孢/毫升水剂抑制水稻纹枯病菌生长的增效测定

实施例4、2.5%井冈霉素·30亿活芽孢∕毫升解淀粉芽孢杆菌水剂防治水稻白叶枯病的田间小区试验

试验时间：于2013年7月29日（水稻分蘖盛期）在江苏省农科院试验场水稻田内进行。

试验水稻品种：金刚30

被测药剂：

由实施例1提供的2.5%井冈霉素·30亿活芽孢∕毫升解淀粉芽孢杆菌水剂（一组采用当年生产的60亿解淀粉芽孢杆菌活芽孢/毫升水剂与5%井冈霉素水剂复配，另一组采用前一年生产的60亿解淀粉芽孢杆菌活芽孢/毫升水剂与5%井冈霉素水剂复配）。

对比药剂：

5%井冈霉素水剂由浙江省桐庐汇丰生物科技有限公司生产提供。

60亿解淀粉芽孢杆菌活芽孢/毫升水剂由江苏省苏科农化有限责任公司提供（一组为当年生产的60亿解淀粉芽孢杆菌活芽孢/毫升水剂，另一组为前一年生产的60亿解淀粉芽孢杆菌活芽孢/毫升水剂）。

田间药效试验设计：采用喷雾法防治水稻白叶枯病。在水稻分蘖盛期施药，按每亩用量兑水50Kg（相当于稀释100倍）均匀喷雾。每个小区面积为33.4m²；每个处理设4次重复，处理间以小埂分隔，并设保护行。药后21天调查各个小区的白叶枯病发病指数,计算防治效果。

病情分级标准如下:

0级，无病斑；

1级，病斑占叶片面积＜10%；

3级，病斑面积占叶片面积＜20%；

5级，病斑面积占叶片面积20%～49%；

7级，病斑面积占叶片面积49%～75%；

9级，病斑面积占叶片面积＞75%。

田间试验结果（表3）表明：2.5%井冈霉素·30亿活芽孢∕毫升解淀粉芽孢杆菌水剂亩用量500毫升，施药后21天，以采用当年生产的60亿解淀粉芽孢杆菌活芽孢/毫升水剂与5%井冈霉素水剂复配的为例，对水稻白叶枯病防治效果为61.79%。该复配生物杀菌剂明显好于5%井冈霉素水剂对水稻白叶枯病的防治效果（32.90%）；同时略好于60亿解淀粉芽孢杆菌活芽孢/毫升水剂（当年生产的）对水稻白叶枯病的防治效果（61.54%）。

另外，田间试验结果（表3）表明：前1年生产的60亿活芽孢∕毫升解淀粉芽孢杆菌水剂对白叶枯病的防效（49.44%）比当年生产的同类产品的防效（61.54%）下降了12.1%，而前1年生产的复配生物杀菌剂对白叶枯病的防效（60.11%）比当年生产的同类产品的防效（61.79）仅下降了1.68%，说明复配的生物杀菌剂（2.5%井冈霉素·30亿活芽孢∕毫升解淀粉芽孢杆菌水剂）可以延长货架期，使产品具有更加稳定的药效。

表32.5%井冈霉素·30亿活芽孢∕毫升解淀粉芽孢杆菌水剂防治水稻白叶枯病的田间药效

实施例5、2.5%井冈霉素·30亿活芽孢∕毫升解淀粉芽孢杆菌水剂防治水稻纹枯病的田间小区试验

试验时间：于2013年8月3日（水稻分蘖盛期）在溧水县白马镇江苏省农科院植物科学基地水稻田内进行。

试验水稻品种：金刚30

被测药剂：

由实施例1提供的2.5%井冈霉素·30亿活芽孢∕毫升解淀粉芽孢杆菌水剂（一组采用当年生产的60亿解淀粉芽孢杆菌活芽孢/毫升水剂与5%井冈霉素水剂复配，另一组采用前一年生产的60亿解淀粉芽孢杆菌活芽孢/毫升水剂与5%井冈霉素水剂复配）。

对比药剂：

5%井冈霉素水剂由浙江省桐庐汇丰生物科技有限公司生产提供。

60亿活芽孢/毫升水剂由江苏省苏科农化有限责任公司生产提供（一组为当年生产的60亿解淀粉芽孢杆菌活芽孢/毫升水剂，另一组为前一年生产的60亿解淀粉芽孢杆菌活芽孢/毫升水剂）。

田间药效试验设计：采用喷雾法防治水稻纹枯病。在水稻分蘖盛期施药，按每亩用量兑水50Kg（相当于稀释100倍）均匀喷雾，每小区33.4m²；每个处理设4次重复，处理间以小埂分隔，并设保护行。药后15天调查各个小区的纹枯病发病指数,计算防治效果。

病情分级标准如下:

0级：无病斑；

1级：基部有少量病斑；

2级：基部有较多病斑，并上升到第2叶（倒4叶）；

3级：倒3叶有病斑；

4级：倒2叶有病斑；

5级：剑叶有病斑或全株枯死。

田间试验结果（表4）表明：2.5%井冈霉素·30亿活芽孢∕毫升解淀粉芽孢杆菌水剂亩用量500毫升，施药后15天，对水稻纹枯病的防治效果为71.25％。该复配生物杀菌剂明显好于5%井冈霉素水剂对水稻纹枯病的防治效果（62.24%）；同时明显好于60亿解淀粉芽孢杆菌活芽孢/毫升水剂对水稻纹枯病的防治效果（61.30%）。

另外，田间试验结果（表4）表明：前1年生产的60亿活芽孢∕毫升解淀粉芽孢杆菌水剂对纹枯病的防效（53.71%）比当年生产的同类产品的防效（61.30%）下降了6.59%，而前1年生产的复配生物杀菌剂对纹枯病的防效（71.25%）比当年生产的同类产品的防效（68.25）仅下降了3%，说明复配的生物杀菌剂（2.5%井冈霉素·30亿活芽孢∕毫升解淀粉芽孢杆菌水剂）可以延长货架期，使产品具有更加稳定的药效。

表42.5%井冈霉素·30亿活芽孢∕毫升解淀粉芽孢杆菌水剂防治水稻纹枯病的田间药效

以上各实施例不是对本发明的具体限制，只要本领域的普通技术人员根据权利要求的启示，结合本领域的基本常识，都落入本发明的保护范畴，例如，在实际应用中，可以根据病害的发病情况和用药期间的气候条件，选择适当的每亩用药量和药物的稀释浓度。

Claims (6)

1.一种解淀粉芽孢杆菌井冈霉素复配生物杀菌剂，包括有效活性成分以及助剂，其特征在于：有效活性成分占复配生物杀菌剂的重量百分比为99%，所述的有效活性成分由解淀粉芽孢杆菌Lx-11和井冈霉素组成，在复配生物杀菌剂中，解淀粉芽孢杆菌Lx-11的含量为30亿解淀粉芽孢杆菌Lx-11活芽孢/毫升，井冈霉素的含量为2.5%。

2.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌井冈霉素复配生物杀菌剂，其特征在于，所述有效活性成分是由60亿解淀粉芽孢杆菌Lx-11活芽孢/毫升水剂与5%井冈霉素水剂以重量比1:1复配后获得。

3.根据权利要求1或2所述的解淀粉芽孢杆菌井冈霉素复配生物杀菌剂，其特征在于，助剂为NNO，NNO占复配生物杀菌剂重量的1%。

4.一种权利要求3所述的复配生物杀菌剂的应用，其特征在于：将复配生物杀菌剂稀释100-1000倍。

5.根据权利要求4所述的复配生物杀菌剂的应用，其特征在于：将稀释后的复配生物杀菌剂在水稻生长期喷洒在水稻上，用于防治水稻病害。

6.根据权利要求5所述的复配生物杀菌剂的应用，其特征在于：所述的水稻病害是指：水稻白叶枯病或水稻纹枯病。