CN101402918A - 一种用于植物内生菌的分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于植物内生菌的分离方法，包含以下步骤：1)将欲分离内生菌的宿主样品用无菌水清洗后，用0.1％－0.3％二氧化氯溶液浸泡1－5min，立即用无菌水清洗。2)将消毒后的宿主样品接入至加有宿主样品提取液的培养基中，在适宜的条件下培养。所述的加有宿主样品提取液的培养基是将宿主样品提取液超滤后加入至基础培养基中制备的。采用本发明的分离方法能充分消灭宿主表面的杂菌，最大限度分离出植物中的内生菌。

Description

一种用于植物内生菌的分离方法

技术领域

本发明涉及一种用于植物内生菌的分离方法。

背景技术

早在19世纪中叶人们就开始对植物内生菌的研究。内生菌是指一类在其部分或全部生活史中存活于健康植物组织内部，而不使宿主植物表现出明显感染症状的微生物。由于它们生活在没有外在感染症状的健康植物组织内部，长期以来其存在和作用一直为人们所忽视。随着人们对植物内生菌研究的深入，对微生物资源的不断开发，微生物研究领域的不断扩展，植物内生菌成为了巨大且宝贵的微生物资源库。由于植物内生菌能产生多种活性物质，在生物防治，医药卫生等领域有着巨大的应用潜力，现已成为国内外学者研究的热点。

但是内生菌的研究由于历史不长，在研究方法等方面都还存在问题，还有待改进。如目前用于分离植物内生菌的培养基常采用分离细菌用的KB培养基，分离真菌用的PDA培养培养基。由于植物内生菌的种类丰富，各种菌所需求的营养成分都不相同，而KB、PDA培养基组成简单，不存在部分内生菌所需的生长因子。因此，部分内生菌在PDA等基础培养基上生长不佳或不生长，难以被分离，直接影响到有用内生菌的开发。

在内生菌分离过程中，对宿主植物表面消毒即不能过重，否则内生菌可能被杀死；但又不能过轻，否则不是内生菌的大量杂菌也会被混作内生菌研究，耗费人力物力。已往的研究多采用化学消毒法：无菌水清洗，用75％酒精浸泡，再用0.1％的氯化汞浸泡后，用无菌水洗涤。此种消毒方法如果浸泡消毒时间过轻，表面消毒不彻底，浸泡消毒时间过长，使得内生菌也被杀死，同时无菌水洗涤不彻底，消毒液易残留，也对内生菌带来危害。也有个别采用物理消毒法如无菌水清洗10次后，再用紫外线照射1h，由于紫外线照射有些部位难以照射到，待用宿主表面成消毒不彻底，仍含有菌。二氧化氯是一种强氧化剂，对常见致病微生物、真菌及病毒等具有高效、快速的杀灭能力。在国外发达国家，二氧化氯消毒剂已经普及，而在我国则刚刚兴起，目前已广泛用于各种饮料、食品加工、医院、宾馆、浴池、游泳池的消毒，水果，蔬菜、水产品、肉类的保鲜等。

发明内容

针对现有技术中存在的不足之处，本发明提供一种能最大限度分离出植物内生菌的分离方法。

本发明为达到以上目的，是通过这样的技术方案来实现的，一种用于植物内生菌的分离方法，其特征在于包含以下步骤：

1)将欲分离内生菌的宿主样品用无菌水清洗后，用0.1％-0.3％二氧化氯溶液浸泡1-5min，立即用无菌水清洗。

2)将消毒后的宿主样品接入至加有宿主样品提取液的培养基中，在适宜的条件下培养。

以上所述的宿主样品是指任何含有内生菌的植物。

以上所述无菌水清洗次数为2-10次。

以上1)中所述的加有宿主样品提取液的培养基的制备方法包括以下步骤：

1)将欲分离内生菌的宿主样品加适量水，打浆或研磨，超滤除菌，得提取液。

2)基础培养基经高温灭菌后冷却至50-80℃，立即加入1％-20％经超滤后的宿主样品提取液，混匀，倒平板。

上述基础培养基是指PDA、KB、NA培养基。

本发明选择了一种高效消毒剂二氧化氯，消毒彻底，所需消毒时间短，减少了消毒剂扩散进入植物组织的量，能最大限度的减少对内生菌的损伤。二是本发明通过在分离培养基中加入了原宿主植物提取液，提供了更丰富的营养物质，能更多分离出内生菌，有利于内生菌的开发。三是本发明操作简便，易行。

具体实施方式

以下通过实施例更详细的介绍本发明的实施。但是本发明并不仅仅局限于这些实施例，这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

选取青蒿为内生菌宿主样品，取青蒿根、茎，用无菌水冲洗干净，用剪刀剪成1cm长的小块，置于0.2％的二氧化氯溶液浸泡1min，用无菌水清洗6次。对样品表面进行印迹法检验。将消毒后的样品按常规方法进行培养内生菌。

实施例2

选取青蒿为内生菌宿主样品，取青蒿根、茎，用无菌水冲洗干净，用剪刀剪成1cm长的小块，置于0.3％的二氧化氯溶液浸泡30s，用无菌水清洗6次，对样品表面进行印迹法检验。将消毒后的样品按常规方法进行培养内生菌。

实施例3

取青蒿根、茎，用无菌水冲洗干净，用剪刀剪成1cm长的小块，用无菌水清洗样品10次后，用75％酒精浸泡5min，再用0.1％氯化汞浸泡10min后，用无菌水洗涤6次，对样品表面进行印迹法检验。将消毒后的样品按常规方法进行培养内生菌。

实施例4

取青蒿根、茎，用无菌水冲洗干净，用剪刀剪成1cm长的小块，用无菌水清洗样品10次后，用紫外线直射1h，对样品表面进行印迹法检验。将消毒后的样品按常规方法进行培养内生菌。

将发明实施例1-4经消毒处理的宿主样品表面进行印迹法检验及内生菌培养，结果表1所示。

表1不同方法消毒后表面印迹法检验结果及内生菌总数量

	消毒后表面印迹法检验	内生菌总数量(cfu/g)
			实施例1	无菌，符合质量要求	1.8×105
实施例2	无菌，符合质量要求	1.85×105
			实施例3	无菌，符合质量要求	1.1×105
实施例4	有菌，不符合质量要求

结果表明，经本发明的消毒方法比传统方法可以分离出更多的内生菌。

实施例5

配制100mLPDA培养基在121℃下灭菌处理20min。取青蒿根样品100g，加蒸馏水100mL，在打浆机中打至浆状，超滤得无菌青蒿提取液。待灭菌后的PDA培养基冷却至50℃左右时，加入2ml无菌青蒿提取液，混匀，倒平板。取青蒿根3g，按实施例1的方法对青蒿根样品经消毒处理后，无菌条件下剪碎加10mL无菌水碾碎静置15min后，用无菌移液枪移取0.2ml上清液至前述加有青蒿提取液的平板中，以未加青蒿提取液的PDA培养基作为对照，涂布，在28℃下培养5d，计数两种培养基中菌落的种类，

实施例6

配制100mLKB培养基在121℃下灭菌处理20min。取桑树叶鲜组织100g，加蒸馏水100mL，在打浆机中打至浆状，超滤得无菌桑树叶提取液。待灭菌后的KB培养基冷却至60℃左右时，加入10ml桑树叶提取液，混匀，倒平板。称取桑树鲜叶组织1g按实施例1的方法消毒后，无菌条件下剪碎，加10mL无菌水碾碎静置15min，用无菌移液枪移取0.2ml上清液至前述加有桑树叶提取液的培养基及未加桑树提取液的KB培养基中，涂布，在28℃下培养5d，计数两种培养基中菌落的种类。

实施例7

配制NA琼脂培养基，在121℃下灭菌处理20min。取黄瓜幼苗叶100g，加蒸馏水50mL，研磨至浆状，超滤，得无菌黄瓜提取液。待灭菌后的NB培养基冷却至80℃左右时，加入30ml黄瓜提取液，混匀，倒平板。取黄瓜健康幼苗(2~3片真叶)3g。按实施例1的方法进行消毒后，无菌条件下剪碎，加10mL灭菌生理盐水在灭菌的研钵里研碎，静置15min后吸取0.2ml上清液至前述加有黄瓜提取液的NA培养基及未加黄瓜提取液的NA培养基中，涂布，在28℃下培养3d，计数两种培养基中菌落的种类。

表2实施例1-3分离得到的菌落种类

结果表明，经加有原宿主样品提取液的培养基分离出的菌落种类明显比未加提取液的培养基多。

Claims (2)

1、一种用于植物内生菌的分离方法，其特征在于包含以下步骤：

1)将欲分离内生菌的宿主样品用无菌水清洗后，用0.1％-0.3％二氧化氯溶液浸泡1-5min，立即用无菌水清洗。

2)将消毒后的宿主样品接入至加有宿主样品提取液的培养基中，在适宜的条件下培养。

所述的宿主样品是指任何含有内生菌的植物。

所述无菌水清洗次数为3-10次。

2、权利要求1所述的加有宿主样品提取液的培养基的制备方法包括以下步骤：

1)将欲分离内生菌的宿主样品加适量水，打浆或研磨，超滤除菌，得提取液。

2)基础培养基经高温灭菌后冷却至50-80℃，立即加入1％-20％经超滤后的宿主样品提取液，混匀后倒平板。

上述基础培养基是指PDA、KB、NA培养基。