CN103937719B - 一种分离真盐生植物内生细菌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种分离获得真盐生植物内生细菌的方法，该方法是由配制培养基、植物预处理、表面消毒、二次剪切和破碎、内生细菌的分离和培养过程步骤完成，将真盐生植物表面消毒、二次剪切选取最佳部位后机械破碎真盐生植物组织，涡旋高速震荡分离内生细菌，通过特殊培养基低温培养内生细菌。本发明与现有方法相比，不仅可利用费用低廉的机器快速破碎真盐生植物组织，涡旋震荡使真盐生植物组织中的内生细菌释放更加充分，而且通过特殊培养条件提高得率，从而在种类和数量上均获得更好的真盐生植物内生细菌分离效果，以期尽可能获得真盐生植物体内所有的内生细菌，克服已有技术中的局限性。

Description

一种分离真盐生植物内生细菌的方法

技术领域

本发明属于微生物学领域，涉及一种从真盐生植物中全面分离获得内生细菌的方法。背景技术

植物内生细菌与宿主在长期共同进化中形成和谐联合关系。生长在高盐、冰冻等极端环境中的植物，其体内存在具有特殊功能的内生细菌类群。盐生植物作为盐渍环境中唯一能生存的植物，其内生细菌的研究正成为生物、医药、环境等领域的热点。

现有所公布的植物内生菌分离方法200710065724、200810107514主要分为四步，第一步先将植物清洗后剪切成1-2cm小片段，第二步把植物小片段放入消毒液浸泡进行消毒，第三步通过人工研磨或组织捣碎机破裂植物小片段，结合离心的方法将内生菌从植物组织匀浆中分离，第四步将含有内生细菌的液体和稀释液涂布于常规细菌培养基，在28℃-30℃下培养。

然而，这些常规步骤存在三方面缺点：其一，植物组织尤其是根和茎含有多种细微管道，在消毒过程中消毒液会浸入植物片段的两端导致内生细菌死亡，这些部分作为分离源从开始就减少了内生细菌的数量和种类；其二，人工研磨和费用高昂的组织捣碎机均无法快速将木质化程度高的植物组织充分破碎，并且离心只是通过离心力将植物组织碎片沉淀，不能将附着在碎片内的细菌剥离，从而造成很多内生细菌仍然存在植物组织中；其三，内生细菌与宿主长期共同进化，适应宿主植物体内的物质环境，极端环境中的植物具有特殊的植物内环境，其内生细菌也与普通植物内生细菌不同，常规培养基并不适合全面分离特殊植物内生细菌从而降低分离得到的数量和种类，加上温度28-30℃培养会造成优势菌群快速生长繁殖形成大菌落，无法观测到劣势菌群和低温生长菌群，加剧最终内生细菌数量和种类丰度偏差。

盐生植物有别于普通植物，多分布于沿海和干旱区盐碱地。真盐生植物(euhalophyte)作为盐生植物中最抗盐的一类，其结构更为特殊。真盐生植物茎部和根部高度木质化，叶部多形成同化枝，含有大量导管和筛管，并且真盐生植物通过离子区隔化将盐分局限于液泡和老叶中，体内含有高于普通植物的盐分以及多种已知和未知的抗逆境性物质。正是因为真盐生植物结构和内环境的特殊性，采用常规分离方法因植物小片段消毒损失部分内生细菌，并且真盐生植物同化枝，茎和根的木质部破碎不完全，加之离心造成部分细菌未被从组织分离出来，以及培养条件尤其是常规培养基物质成分不合适，导致真盐生植物内生细菌的数量和种类显著减少。

发明内容

本发明目的在于，提供一种分离获得真盐生植物内生细菌的方法，该方法是由配制培养基、植物预处理、表面消毒、二次剪切和破碎、内生细菌的分离和培养过程步骤完成，将真盐生植物表面消毒、二次剪切选取最佳部位后机械破碎真盐生植物组织，涡旋高速震荡分离内生细菌，通过特殊培养基低温培养内生细菌。本发明与现有方法相比，不仅可利用费用低廉的机器快速破碎真盐生植物组织，涡旋震荡使真盐生植物组织中的内生细菌释放更加充分，而且通过特殊培养条件提高得率，从而在种类和数量上均获得更好的真盐生植物内生细菌分离效果，以期尽可能获得真盐生植物体内所有的内生细菌，克服已有技术中的局限性。

本发明所述的一种分离真盐生植物内生细菌的方法，按下列步骤进行：

a、配制培养基：取5-15克真盐生植物盐角草、梭梭、囊果碱蓬、盐爪爪、里海盐爪爪、盐穗木或盐节木组织为同化枝、茎和根，剪碎后在100mL水中煮沸10-30min，温度95-100℃，再将煮沸液通过3-4层纱布过滤，收集滤液，用10-20mL蒸馏水冲洗植物残渣通过1-2层纱布过滤，收集冲洗液，将冲洗液加入滤液中使总体积为100mL，得到混合液，再将混合液与常规的R2A固体培养基按体积比为混合液∶R2A固体培养基＝1∶10混合，温度121℃灭菌15-20min后，制成平板；

b、植物预处理：将真盐生植物盐角草、梭梭、囊果碱蓬、盐爪爪、里海盐爪爪、盐穗木或盐节木组织经超声清洗后，切成4-6cm片段；

c、表面消毒：将步骤b的片段进行表面消毒，先用有效氯浓度为3.5％次氯酸钠溶液浸泡消毒3-3.5min，再用体积分数为75％乙醇溶液浸泡消毒3-3.5min，浸泡后用无菌水冲洗5次去除残余表面消毒液，选取第5次洗涤后的水涂布检测消毒结果；

d、二次剪切和破碎：经步骤c表面消毒后的真盐生植物片段用无菌滤纸吸干表面水分，在无菌条件下将真盐生植物片段两侧0.5-1cm边缘切除，然后将剩余部分剪切成0.5-1cm小段，放入温度0-4℃预冷处理30min-60min的无菌干磨杯中，使用搅拌刀头刀片数为2-5片，功率为300W-350W的搅拌机充分打碎；

e、内生细菌的分离：在无菌条件下，取1g真盐生植物组织碎片转入装有9mL无菌质量百分含量为0.85％生理盐水的离心管中，置于涡旋震荡器上，在转速为2000rpm-3000rpm、室温条件下震荡10s-60s，取上清液；

f、培养过程：在无菌条件下，将步骤e得到的200μL上清液用无菌生理盐水进行10-100倍的稀释，再将稀释液涂布于步骤a制备的平板上，将平板于温度15℃恒温培养14-20天后，挑取不同形态的菌落，纯化即得真盐生植物内生细菌。

步骤a中真盐生植物组织为同化枝、茎和根，其质量比为枝∶茎∶根＝1∶1∶2。

步骤d二次剪切和破碎中使用搅拌刀头刀片数为5片，搅拌机功率为350W。

步骤e中在无菌条件下，取1g真盐生植物组织碎片转入装有9mL无菌质量百分含量为0.85％生理盐水的离心管中，置于涡旋震荡器上，在转速为3000rpm、室温条件下震荡60s，取上清液。

本发明所述的一种分离获得真盐生植物内生菌的方法，该方法中的真盐生植物为对盐角草(Salicorniaeuropaea)，梭梭(Haloxylonammodendron)，囊果碱蓬(Suaedaphysophora)，盐爪爪(Kalidiumfoliatum)，里海盐爪爪(Kalidiumcaspicum)，盐穗木(Halostachyscaspica)，盐节木(Halocnemumstrobilaceum)。

本发明所述的一种分离获得真盐生植物内生菌的方法，与一般方法相比，该方法特点为：

1、通过二次剪切将真盐生植物片段边缘过度消毒部分去除，保留更多的内生细菌源；

2、通过廉价易得的榨汁机充分打碎真盐生植物组织，同时预冷处理可避免局部过热对细胞的破坏；

3、高速涡旋震荡可将内生细菌从真盐生植物组织上充分分离；

4、将一定比例的宿主真盐生植物煮出液与常规的R2A固体培养基混合制成新的培养基，提供全面的物质成分满足真盐生植物体内各种内生菌生长需求；

5、通过低温培养以避免劣势菌群和低温生长菌群无法或者过慢生长而被忽略，从而获得更好的真盐生植物内生细菌分离效果。

全面分离内生细菌是研究真盐生植物内生菌的根本，分离效果优劣是判断分离方法是否科学的标准。利用本发明方法分离真盐生植物内生细菌无论在数量和种类上均显著优于一般分离方法，因此，本发明是研究真盐生植物内生细菌的优良方法。

附图说明

图1为常规方法分离梭梭内生细菌对照图；

图2为本发明实施例2分离梭梭内生细菌图；

图3为常规方法分离里海盐爪爪内生细菌对照图；

图4为本发明实施例5分离里海盐爪爪内生细菌图；

图5为常规方法分离囊果碱蓬内生细菌对照图；

图6为本发明实施例3分离囊果碱蓬内生细菌图；

图7为常规方法分离盐穗木内生细菌对照图；

图8为本发明实施例6分离盐穗木内生细菌图；

图9为常规方法分离盐角草内生细菌对照图；

图10为本发明实施例1分离盐角草内生细菌图。

具体实施方式

以下实施方式和实施例旨在进一步说明本发明，而不是对本发明的限定：

实施例1

a、配制培养基：取5克真盐生植物盐角草组织为同化枝、茎和根，其质量比为枝∶茎∶根＝1∶1∶2，剪碎后在100mL水中煮沸10min，温度95℃，再将煮沸液通过3层纱布过滤，收集滤液，用10mL蒸馏水冲洗植物残渣通过1-2层纱布过滤，收集冲洗液，将冲洗液加入滤液中使总体积为100mL，得到混合液，再将混合液与常规的R2A固体培养基按体积比为混合液∶R2A固体培养基＝1∶10混合，温度121℃灭菌15min后，制成平板；

b、植物预处理：将真盐生植物盐角草组织经超声清洗后，切成4-6cm片段；

c、表面消毒：将步骤b的片段进行表面消毒，先用有效氯浓度为3.5％次氯酸钠溶液浸泡消毒3min，再用体积分数为75％乙醇溶液浸泡消毒3min，浸泡后用无菌水冲洗5次去除残余表面消毒液，选取第5次洗涤后的水涂布检测消毒结果；

d、二次剪切和破碎：经步骤c表面消毒后的真盐生植物片段用无菌滤纸吸干表面水分，在无菌条件下将真盐生植物盐角草片段两侧0.5-1cm边缘切除，然后将剩余部分剪切成0.5-1cm小段，放入温度0℃预冷处理30min的无菌干磨杯中，使用搅拌刀头刀片数为2片，功率为300W的搅拌机充分打碎；

e、内生细菌的分离：在无菌条件下，取1g真盐生植物盐角草组织碎片转入装有9mL无菌质量百分含量为0.85％生理盐水的离心管中，置于涡旋震荡器上，在转速为2000rpm、室温条件下震荡10s，取上清液；

f、培养过程：在无菌条件下，将步骤e得到的200μL上清液用无菌生理盐水稀释100倍，再将稀释液涂布于步骤a制备的平板上，将平板于温度15℃恒温培养14天后，挑取不同形态的菌落，纯化，即得真盐生植物内生细菌，纯化获得纯培养后于温度4℃保存。

实施例2

a、配制培养基：取10克真盐生植物梭梭组织为同化枝、茎和根，其质量比为枝∶茎∶根＝1∶1∶2剪碎后在100mL水中煮沸15min，温度100℃，再将煮沸液通过3-4层纱布过滤，收集滤液，用15mL蒸馏水冲洗植物残渣通过1-2层纱布过滤，收集冲洗液，将冲洗液加入滤液中使总体积为100mL，得到混合液，再将混合液与常规的R2A固体培养基按体积比为混合液∶R2A固体培养基＝1∶10混合，温度121℃灭菌15-20min后，制成平板；；

b、植物预处理：将真盐生植物梭梭组织经超声清洗后，切成4-6cm片段；

c、表面消毒：将步骤b的片段进行表面消毒，先用有效氯浓度为3.5％次氯酸钠溶液浸泡消毒3-3.5min，再用体积分数为75％乙醇溶液浸泡消毒3-3.5min，浸泡后用无菌水冲洗5次去除残余表面消毒液，选取第5次洗涤后的水涂布检测消毒结果；

d、二次剪切和破碎：经步骤c表面消毒后的真盐生植物梭梭片段用无菌滤纸吸干表面水分，在无菌条件下将真盐生植物片段两侧0.5-1cm边缘切除，然后将剩余部分剪切成0.5-1cm小段，放入温度1℃预冷处理40min的无菌干磨杯中，使用搅拌刀头刀片数为3片，功率为350W的搅拌机充分打碎；

e、内生细菌的分离：在无菌条件下，取1g真盐生植物梭梭组织碎片转入装有9mL无菌质量百分含量为0.85％生理盐水的离心管中，置于涡旋震荡器上，在转速为3000rpm、室温条件下震荡20s，取上清液；

f、培养过程：在无菌条件下，将步骤e得到的200μL上清液用无菌生理盐水稀释10倍，再将稀释液涂布于步骤a制备的平板上，将平板于温度15℃恒温培养15天后，挑取不同形态的菌落，纯化即得真盐生植物内生细菌，纯化获得纯培养后于温度4℃保存。

实施例3

a、配制培养基：取15克真盐生植物囊果碱蓬组织为同化枝、茎和根，其质量比为枝∶茎∶根＝1∶1∶2，剪碎后在100mL水中煮沸30min，温度100℃，再将煮沸液通过3-4层纱布过滤，收集滤液，用20mL蒸馏水冲洗植物残渣通过1-2层纱布过滤，收集冲洗液，将冲洗液加入滤液中使总体积为100mL，得到混合液，再与常规的R2A固体培养基按体积比为混合液∶R2A固体培养基＝1∶10混合，温度121℃灭菌20min后，制成平板；；

b、植物预处理：将真盐生植物囊果碱蓬组织经超声清洗后，切成4-6cm片段；

c、表面消毒：将步骤b的片段进行表面消毒，先用有效氯浓度为3.5％次氯酸钠溶液浸泡消毒3-3.5min，再用体积分数为75％乙醇溶液浸泡消毒3-3.5min，浸泡后用无菌水冲洗5次去除残余表面消毒液，选取第5次洗涤后的水涂布检测消毒结果；

d、二次剪切和破碎：经步骤c表面消毒后的真盐生植物囊果碱蓬片段用无菌滤纸吸干表面水分，在无菌条件下将真盐生植物片段两侧0.5-1cm边缘切除，然后将剩余部分剪切成0.5-1cm小段，放入温度3℃预冷处理50min的无菌干磨杯中，使用搅拌刀头刀片数为4片，功率为300W的搅拌机充分打碎；

e、内生细菌的分离：在无菌条件下，取1g真盐生植物囊果碱蓬组织碎片转入装有9mL无菌质量百分含量为0.85％生理盐水的离心管中，置于涡旋震荡器上，在转速为2500rpm、室温条件下震荡30s，取上清液；

f、培养过程：在无菌条件下，将步骤e得到的200μL上清液用无菌生理盐水稀释80倍，再将稀释液涂布于步骤a制备的平板上，将平板于温度15℃恒温培养18天后，挑取不同形态的菌落，纯化即得真盐生植物内生细菌，纯化获得纯培养后于温度4℃保存。

实施例4

a、配制培养基：取5-15克真盐生植物盐爪爪组织为同化枝、茎和根，其质量比为枝∶茎∶根＝1∶1∶2，剪碎后在100mL水中煮沸25min，温度95℃，再将煮沸液通过3-4层纱布过滤，收集滤液，用15mL蒸馏水冲洗植物残渣通过1-2层纱布过滤，收集冲洗液，将冲洗液加入滤液中使总体积为100mL，得到混合液，再与常规的R2A固体培养基按体积比为混合液∶R2A固体培养基＝1∶10混合，温度121℃灭菌20min后，制成平板；

b、植物预处理：将真盐生植物盐爪爪组织经超声清洗后，切成4-6cm片段；

c、表面消毒：将步骤b的片段进行表面消毒，先用有效氯浓度为3.5％次氯酸钠溶液浸泡消毒3-3.5min，再用体积分数为75％乙醇溶液浸泡消毒3-3.5min，浸泡后用无菌水冲洗5次去除残余表面消毒液，选取第5次洗涤后的水涂布检测消毒结果；

d、二次剪切和破碎：经步骤c表面消毒后的真盐生植物盐爪爪片段用无菌滤纸吸干表面水分，在无菌条件下将真盐生植物盐爪爪片段两侧0.5-1cm边缘切除，然后将剩余部分剪切成0.5-1cm小段，放入温度4℃预冷处理60min的无菌干磨杯中，使用搅拌刀头刀片数为5片，功率为350W的搅拌机充分打碎；

e、内生细菌的分离：在无菌条件下，取1g真盐生植物组织碎片转入装有9mL无菌质量百分含量为0.85％生理盐水的离心管中，置于涡旋震荡器上，在转速为3000rpm、室温条件下震荡60s，取上清液；

f、培养过程：在无菌条件下，将步骤e得到的200μL上清液用无菌生理盐水稀释40倍，再将稀释液涂布于步骤a制备的平板上，将平板于温度15℃恒温培养20天后，挑取不同形态的菌落，纯化即得真盐生植物内生细菌，纯化获得纯培养后于温度4℃保存。

实施例5

a、配制培养基：取15克真盐生植物里海盐爪爪组织为同化枝、茎和根，其质量比为枝∶茎∶根＝1∶1∶2，剪碎后在100mL水中煮沸25min，温度98℃，再将煮沸液通过3-4层纱布过滤，收集滤液，用15mL蒸馏水冲洗植物残渣通过1-2层纱布过滤，收集冲洗液，将冲洗液加入滤液中使总体积为100mL，得到混合液，再将混合液与常规的R2A固体培养基按体积比为混合液∶R2A固体培养基＝1∶10混合，温度121℃灭菌18min后，制成平板；；

b、植物预处理：将真盐生植物里海盐爪爪组织经超声清洗后，切成4-6cm片段；

c、表面消毒：将步骤b的片段进行表面消毒，先用有效氯浓度为3.5％次氯酸钠溶液浸泡消毒3-3.5min，再用体积分数为75％乙醇溶液浸泡消毒3-3.5min，浸泡后用无菌水冲洗5次去除残余表面消毒液，选取第5次洗涤后的水涂布检测消毒结果；

d、二次剪切和破碎：经步骤c表面消毒后的真盐生植物里海盐爪爪片段用无菌滤纸吸干表面水分，在无菌条件下将真盐生植物里海盐爪爪片段两侧0.5-1cm边缘切除，然后将剩余部分剪切成0.5-1cm小段，放入温度3.5℃预冷处理35min的无菌干磨杯中，使用搅拌刀头刀片数为4片，功率为350W的搅拌机充分打碎；

e、内生细菌的分离：在无菌条件下，取1g真盐生植物组织碎片转入装有9mL无菌质量百分含量为0.85％生理盐水的离心管中，置于涡旋震荡器上，在转速为3000rpm、室温条件下震荡60s，取上清液；

f、培养过程：在无菌条件下，将步骤e得到的200μL上清液用无菌生理盐水稀释50倍，再将稀释液涂布于步骤a制备的平板上，将平板于温度15℃恒温培养20天后，挑取不同形态的菌落，纯化即得真盐生植物内生细菌，纯化获得纯培养后于温度4℃保存。

实施例6

a、配制培养基：取5-15克真盐生植物盐穗木组织同化枝、茎和根，其质量比为枝∶茎∶根＝1∶1∶2，剪碎后在100mL水中煮沸30min，温度100℃，再将煮沸液通过3-4层纱布过滤，收集滤液，用20mL蒸馏水冲洗植物残渣通过1-2层纱布过滤，收集冲洗液，将冲洗液加入滤液中使总体积为100mL，得到混合液，再将混合液与常规的R2A固体培养基按体积比为混合液∶R2A固体培养基＝1∶10混合，温度121℃灭菌20min后，制成平板；；

b、植物预处理：将真盐生植物盐穗木组织经超声清洗后，切成4-6cm片段；

c、表面消毒：将步骤b的片段进行表面消毒，先用有效氯浓度为3.5％次氯酸钠溶液浸泡消毒3-3.5min，再用体积分数为75％乙醇溶液浸泡消毒3-3.5min，浸泡后用无菌水冲洗5次去除残余表面消毒液，选取第5次洗涤后的水涂布检测消毒结果；

d、二次剪切和破碎：经步骤c表面消毒后的真盐生植物盐穗木片段用无菌滤纸吸干表面水分，在无菌条件下将真盐生植物盐穗木片段两侧0.5-1cm边缘切除，然后将剩余部分剪切成0.5-1cm小段，放入温度4℃预冷处理60min的无菌干磨杯中，使用搅拌刀头刀片数为5片，功率为350W的搅拌机充分打碎；

e、内生细菌的分离：在无菌条件下，取1g真盐生植物组织碎片转入装有9mL无菌质量百分含量为0.85％生理盐水的离心管中，置于涡旋震荡器上，在转速为3000rpm、室温条件下震荡60s，取上清液；

f、培养过程：在无菌条件下，将步骤e得到的200μL上清液用无菌生理盐水稀释60倍，再将稀释液涂布于步骤a制备的平板上，将平板于温度15℃恒温培养20天后，挑取不同形态的菌落，纯化即得真盐生植物内生细菌，纯化获得纯培养后于温度4℃保存。

实施例7

a、配制培养基：取5-15克真盐生植物盐节木组织为同化枝、茎和根，其质量比为枝∶茎∶根＝1∶1∶2，剪碎后在100mL水中煮沸30min，温度95℃，再将煮沸液通过3-4层纱布过滤，收集滤液，用18mL蒸馏水冲洗植物残渣通过1-2层纱布过滤，收集冲洗液，将冲洗液加入滤液中使总体积为100mL，得到混合液，再将混合液与常规的R2A固体培养基按体积比为混合液∶R2A固体培养基＝1∶10混合，温度121℃灭菌20min后，制成平板；；

b、植物预处理：将真盐生植物盐节木组织经超声清洗后，切成4-6cm片段；

c、表面消毒：将步骤b的片段进行表面消毒，先用有效氯浓度为3.5％次氯酸钠溶液浸泡消毒3-3.5min，再用体积分数为75％乙醇溶液浸泡消毒3-3.5min，浸泡后用无菌水冲洗5次去除残余表面消毒液，选取第5次洗涤后的水涂布检测消毒结果；

d、二次剪切和破碎：经步骤c表面消毒后的真盐生植物片段用无菌滤纸吸干表面水分，在无菌条件下将真盐生植物片段两侧0.5-1cm边缘切除，然后将剩余部分剪切成0.5-1cm小段，放入温度4℃预冷处理60min的无菌干磨杯中，使用搅拌刀头刀片数为5片，功率为350W的搅拌机充分打碎；

e、内生细菌的分离：在无菌条件下，取1g真盐生植物组织碎片转入装有9mL无菌质量百分含量为0.85％生理盐水的离心管中，置于涡旋震荡器上，在转速为3000rpm、室温条件下震荡60s，取上清液；

f、培养过程：在无菌条件下，将步骤e得到的200μL上清液用无菌生理盐水稀释100倍，再将稀释液涂布于步骤a制备的平板上，将平板于温度15℃恒温培养14-20天后，挑取不同形态的菌落，纯化即得真盐生植物内生细菌，纯化获得纯培养后于温度4℃保存。

实施例8

采用常规方法对本发明中涉及的盐角草，梭梭，囊果碱蓬，盐爪爪，里海盐爪爪，盐穗木，盐节木7种真盐生植物分离内生细菌作为对照：

其中所述的常规方法为：清洗后的植物组织剪切成1.5-2cm小段，体积浓度70％乙醇浸泡3-5min，2％次氯酸钠浸泡1-2min进行表面消毒，消毒后的植物小段研磨后收集原液，原液梯度稀释后涂布常规R2A培养平板，温度30℃培养；

将实施例1-7获得的细菌和常规方法对照获得的细菌分别通过三区划线纯化，纯菌落通过Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒(Sangon)提取DNA，然后采用细菌通用引物27f(5’–AGAGTTTAGTCCTGGCTCAG–3’),1492r(5’–TACGGCTACCTTGTTACGACTT–3’)进行PCR扩增，PCR产物送至上海生工公司测序，测得的16SrRNA基因序列在NCBI(http://www.Ncbi.nih.gov/index.html)通过BLAST比对后提交GenBank获得序列号，结果统计如表1-7所示：

表1.盐角草内生细菌分离情况

表2.梭梭内生细菌分离情况

表3.囊果碱蓬内生细菌分离情况

表4.盐爪爪内生细菌分离情况

表5.里海盐爪爪内生细菌分离情况

表6.盐穗木内生细菌分离情况

表7.盐节木内生细菌分离情况

由结果可见：采用本发明方法分离七种真盐生植物内生细菌在总数和种类方面，均明显高于未采用本发明方法；采用本发明方法能最大限度的分离获得盐生植物体内的内生细菌。本发明方法效果显著是一种分离获得真盐生植物体内生细菌的优良方法。

Claims (4)

1.一种分离真盐生植物内生细菌的方法，其特征在于按下列步骤进行：

a、配制培养基：取5-15克真盐生植物盐角草、梭梭、囊果碱蓬、盐爪爪、里海盐爪爪、盐穗木或盐节木组织为同化枝、茎和根，剪碎后在100mL水中煮沸10-30min，温度95-100℃，再将煮沸液通过3-4层纱布过滤，收集滤液，用10-20mL蒸馏水冲洗植物残渣通过1-2层纱布过滤，收集冲洗液，将冲洗液加入收集的滤液中使总体积为100mL，得到混合液，再将混合液与常规的R2A固体培养基按体积比为混合液∶R2A固体培养基=1∶10混合，温度121℃灭菌15-20min后，制成平板；

b、植物预处理：将真盐生植物盐角草、梭梭、囊果碱蓬、盐爪爪、里海盐爪爪、盐穗木或盐节木组织经超声清洗后，切成4-6cm片段；

c、表面消毒：将步骤b的片段进行表面消毒，先用有效氯浓度为3.5%次氯酸钠溶液浸泡消毒3-3.5min，再用体积分数为75%乙醇溶液浸泡消毒3-3.5min，浸泡后用无菌水冲洗5次去除残余表面消毒液，选取第5次洗涤后的水涂布检测消毒结果；

d、二次剪切和破碎：经步骤c表面消毒后的真盐生植物片段用无菌滤纸吸干表面水分，在无菌条件下将真盐生植物片段两侧0.5-1cm边缘切除，然后将剩余部分剪切成0.5-1cm小段，放入温度0-4℃预冷处理30min-60min的无菌干磨杯中，使用搅拌刀头刀片数为2-5片，功率为300W-350W的搅拌机充分打碎；

e、内生细菌的分离：在无菌条件下，取1g真盐生植物组织碎片转入装有9mL无菌质量百分含量为0.85%生理盐水的离心管中，置于涡旋震荡器上，在转速为2000rpm-3000rpm、室温条件下震荡10s-60s，取上清液；

f、培养过程：在无菌条件下，将步骤e得到的200μL上清液用无菌生理盐水进行10-100倍的稀释，再将稀释液涂布于步骤a制备的平板上，将平板于温度15℃恒温培养14-20天后，挑取不同形态的菌落，纯化即得真盐生植物内生细菌。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a中真盐生植物组织为同化枝、茎和根，其质量比为枝∶茎∶根=1∶1∶2。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤d二次剪切和破碎中使用搅拌刀头刀片数为5片，搅拌机功率为350W。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤e中在无菌条件下，取1g真盐生植物组织碎片转入装有9mL无菌质量百分含量为0.85%生理盐水的离心管中，置于涡旋震荡器上，在转速为3000rpm、室温条件下震荡60s，取上清液。