KR101110449B1

KR101110449B1 - 고사리 포자의 무균 배양 방법

Info

Publication number: KR101110449B1
Application number: KR1020090062455A
Authority: KR
Inventors: 오득실; 박화식; 위안진; 유석봉; 오찬진
Original assignee: 전라남도
Priority date: 2009-07-09
Filing date: 2009-07-09
Publication date: 2012-02-15
Also published as: KR20110004992A

Abstract

본 발명은 고사리 포자를 배양하는 방법에 관한 것으로 더욱 상세하게는 고사리 포자를 채취하여 멸균수에 진탕하고 알콜을 사용하여 포자의 표면을 살균하여세척한 후 NaOCl 수용액에 침지시켜 초음파 또는 진공살균을 실시한 후 NaOCl 수용액을 제거하여 MS, 1/2MS 및 Hyponex 고체 배지에서 접종한 후, 항온기에서 배양하는 단계로 구성된다.

본 발명의 고사리 포자 배양 방법을 이용하면 자연상태에서의 고사리 포자 발아시 문제점을 해결할 수 있고 대량생산이 가능토록 하여 농가 소득향상에 직접적인 도움을 줄 수 있다.

고사리, 재배, 포자, 발아, 살균, 배양

Description

고사리 포자의 무균 배양 방법{The method of aseptic culture of Pteridium aquilinum var. latiusculum}

본 발명은 고사리 포자를 무균 배양하는 기술과 관련된다. 또한 본 발명은 고사리 포자엽을 살균하는 방법과 효과적인 포자접종 방법, 그리고 포자배양용 적정배지를 선정하는 방법과 연관성이 깊다.

고사리(Pteridium aquilinum var. latiusculum(Desv.) U_NDERW)는 햇볕이 잘드는 양지에서 자라는 고사리과에 속하는 다년생 양치류로서 전국 각지에 야생하며 지리적으로는 일본, 중국, 사할린, 캄차카, 시베리아, 유럽, 남북아메리카 등 열대지방에서부터 온대지방에 이르기까지 전세게적으로 널리 분포한다. 땅속에 굵고 검은 땅속줄기기가 옆으로 뻗어가면서 마디에서 이른 봄부터 여름까지 잎이 나오는데 잎은 굵고 긴 잎자루를 가지고 있으며 땅에서 돋아날 때는 잎자루가 20?30cm 정도로 길다.

고사리는 열량이 높고 단백질과 탄수화물, 칼슘, 인, 철, 비타민 A, B₁, B₂, C, 니아신, 아스파라긴(Asparagine)과 글루타민산(Glutaminic acid), 아스트라갈 린(Astragalin) 등 특수 성분등이 들어있어 영양가가 풍부하고 독특한 향이 있어 산촌지역의 특산물로 인기가 높아 고가로 판매되는 고급 산나물이다. 뿐만 아니라 아직까지도 제삿상에 빠져서 안되는 대표적인 산나물로서 우리 민족의 얼이 담겨져 있는 전통식품이다. 또한 옛부터 궐채(蕨菜), 궐기근(蕨其根)이라 하여 해열, 이뇨, 설사, 황달, 대하증 등에 효능이 있어 약제로도 많이 이용하여 왔다.

상기 고사리를 재배하는 방법으로는 지하경(땅속줄기)과 포자가 이용되고 있다. 지하경을 이용하는 재배방법은 9월 내지 10월경 땅속줄기를 채취하는데, 이 때 채취된 땅속줄기에는 마디에 이듬해 봄에 돋아날 새눈이 자라고 있다. 이 것을 10?20cm 길이로 잘라서 초상 15일 전에 너비 120cm, 통로 60cm 의 두둑을 만들어 150주 정도 심고 짚이나 낙엽으로 피복하여 번식시키는 방법이다.

그러나 상기 지하경을 이용한 발아방법은 번식률이 비교적 낮고 시간이 오래걸리기 때문에 농가에서 이를 대량으로 재배하여 생산단가를 낮추는 데 한계가 있다는 문제점이 있다. 최근에는 이를 대신하기 위하여 포자를 이용하는 방법이 연구되고 있다.

현재 행해지고 있는 고사리 포자의 파종방법에 대하여 살펴보면 고사리 포자를 증류수가 첨가된 비이커에 넣은 후 진탕배양기에서 진탕하여 흡수시킨다. 파스튜르 피펫을 이용하여 충분히 흡수되어 가라앉은 포자만을 모아서 원심분리용 튜브에 넣은 후 다시 70% 알콜로 살균한다. 이후 원심분리를 통해 NaOCl 용액을 제거한 후 살균수를 부어 5회 정도 세척한다. 세척이 끝난 다음 MS나 Hyponex 액체배지를 포자 부피의 5?6배 정도 부은 후 피펫을 사용하여 MS 고체배지를 분주한 배양병에 고르게 접종한다.

그러나 종래의 고사리 포자 파종방법은 포자가 발아될 때 오염율이 너무 높고, 발아율이 너무 낮아 경제성이 떨어지는 문제점이 있었다.

본 발명은 고사리 포자의 발아 시 문제점 즉, 오염율을 낮추고 발아율을 높히는 것을 해결하고자 하는 내용을 주된 과제로 삼고,

더 나아가 최적의 고사리 포자 살균 및 배양방법을 제시하는 것을 해결하고자 하는 최우선 과제로 삼는다.

상기한 과제를 해결하기 위하여 본 발명은

고사리 포자를 채취하여 2~5℃에서 3~5일간 냉장 보관하는 단계와;

상기 냉장 보관된 고사리 포자에 멸균수를 첨가하여 100rpm에서 24시간 동안 진탕하는 단계와;

상기 진탕된 포자를 70중량% 알콜을 사용하여 30초간 표면을 살균시킨뒤 시험관에 담아서 1~5 % 농도의 NaOCl 수용액을 첨가하여 5분~15분 동안 침지시키는 단계와;

상기 침지된 NaOCl 수용액을 원심분리기에 넣고 2000rpm에서 2~5분간 원심분리하는 단계와;

상기 원심분리된 용액에서 NaOCl를 제거한 후 살균수를 첨가하여 5회 세척하여 순수 포자를 준비하는 단계와;

상기 순수 포자를 MS 액체배지 또는 Hyponex 액체배지를 사용하여 포자 부피 대비 5~6배 부어 포자 배양을 위한 액체배지를 제조하는 단계와;

상기 액체배지를 1/2 MS 고체배지 배양병에 넣고 1ml씩 고르게 접종하는 단계와;

상기 접종된 포자를 20~22℃의 항온기에서 형광등으로 10~20시간 동안 조명하면서 배양하는 단계;로 구성된 고사리 포자의 배양 방법.

을 제시하고자 한다.

본 발명의 고사리 포자의 발아 방법을 이용하면 기존 포자 발아 시 문제점 을 쉽게 해결할 수 있고 대량생산이 가능하여 농가 소득향상에 직접적인 도움을 줄 수 있다.

이하 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명에서는 고사리 포자의 파종방법을 수행함에 있어서 세척된 포자를 NaOCl 수용액에 침지시키고, 필요에 따라 초음파, 진공, 초음파+진공 살균을 실시하는 것을 특징으로 한다. 상기와 같은 NaOCl 수용액에 침지시키는 단계와 초음파 등과 같은 살균단계를 거치면서 포자의 오염율은 낮아지고 발아율은 더욱 높아진다.

10월 초부터 10월 중순까지 장성, 완도 야산지역 및 전라남도 산림환경연구소 뒷산 시험림에서 오염되지 않은 신선하고 청결한 고사리 포자만을 골라 채취하였다. 이렇게 채취된 포자엽을 포자가 자연스럽게 비산되도록 깨끗한 종이로 가볍 게 싸서 응달에 건조시킨 후 비산된 포자만을 조심스럽게 모아서 시료로 이용하였으며 포자엽은 시료채취 즉시 시험재료로 이용하였다.

이하의 파종 실험은 순수 포자만을 이용하여 파종하는 방법과 포자엽 및 포자낭군을 이용하여 포자접종 방법으로 구분하여 실시하였다.

[실시예 1] 순수포자를 이용한 파종방법

포자엽을 채취하여 흐르는 수돗물에 가볍게 씻은 후 실험 티슈(킴와이프스)로 싸서 응달에 건조 후 포자가 비산되면 포자를 따로 모아 저온 보관하였으며 포자낭은 예리한 메스를 이용하여 따로 긁어서 4℃에서 보관하였다. 채취된 포자를 멸균수가 첨가된 비이커에 넣은 후 진탕기를 이용 100rpm에서 24시간 진탕하여 흡수시킨 후 70중량%의 알콜로 30초간 표면살균된 시험관에 넣고 Sodium hypochlorite(NaOCl)의 농도를 1,3,5%로 하고 침지시간은 15, 10, 5분으로 처리 후 원심분리기 2000rpm에서 원심분리 후 멸균수로 헹궈(500rpm) Sodium hypochlorite액을 완전 제거하여 순수 포자를 준비하였다.

본 발명에서는 고사리 포자를 액체배양하기 위하여 MS 액체배지와 Hyponex 액체배지를 제조하였다. MS stock 10ml와 sucrose 30g에 초순수 945ml를 첨가하여 1N의 NaOH와 1N의 HCl을 섞어 pH를 5.7~5.8로 조절한 후 121℃, 1.2기압에서 약 15분간 고압살균하여 MS 액체배지를 제조하였다. 한편 Hyponex 액체배지는 초순수 1L에 Hyponex 3g과 펩톤 2~4g을 첨가하여 설탕 30g을 넣고 핫플레이트로 시료를 녹였다. 그런 다음 121℃, 1.2기압에서 약 15분간 고압살균하여 Hyponex 액체배지를 제 조하였다.

상기 제조된 MS 액체배지와 Hyponex 액체배지를 포자 부피의 5~6배 부은 후 1/2MS 고체배지(MS stock 5ml와 sucrose 30g에 초순수 945ml를 첨가하여 1N의 NaOH와 1N의 HCl을 섞어 pH를 5.7~5.8로 조절한 후 121℃, 1.2기압에서 약 15분간 고압살균하여 제조)에 1㎖씩 고르게 접종하였다. 접종된 포자의 21±1℃로 조절한 항온기내에서 형광등 (3000Lux)으로 16시간 조명하면서 배양하였다.

그 결과 NaOCl 1%, 15분 침지 처리해서 원심 분리한 처리구가 오염율이 7%로 가장 낮았고 NaOCl 3%, 10분 처리구가 27%, NaOCl 5%, 5분 처리구가 93%로 가장오염율이 높았으며 발아율 역시 NaOCl 1% 15분 처리구가 20%로 가장 높은 발아율을 보였다.

실시예 1을 수행한 후 포자의 오염율과 발아율에 대한 결과를 표 1을 통해 나타내었다.

[표 1] Sodium hypochlorite(NaOCl)의 처리농도와 시간에 따른 오염율과 발아율 결과

구분	NaOCl의 농도와 침지시간에 따른 오염율과 발아율 정도
구분	NaOCl 1%(15min)	NaOCl 3%(10min)	NaOCl 5%(5min)
오염율(%)	7	27	93
발아율(%)	20	13	0

[실시예 2] 포자엽의 관행살균을 통한 파종방법

포자낭군이 부착된 고사리 포자엽을 채취하여 Sodium hypochlorite(NaOCl)를 1, 3, 5%로 조제하여 15, 10, 5분 동안 포자엽을 침지 살균하였다. 이렇게 살균된 포자엽은 멸균수로 헹군 후 실시예 1의 순수포자를 준비하는 단계와 동일한 과정을 거쳐 포자엽(Sporophyll), 포자낭(Sporangium), 포자(Spores)로 각각 조제 후 실시예 1과 동일한 방법으로 제조된 각각의 MS액체배지, Hyponex액체배지 및 1/2MS고체배지에 배양하였다.

결과를 종합해보면 포자 및 포자낭군이 부착된 포자엽을 이용한 접종구에서는 모두 오염으로 조사되었고 포자만 채취한 처리구에서는 전혀 오염이 발생되지 않았으며 포자낭 처리구에서는 NaOCl 1%, 15분 침지 살균한 처리구가 오염율 27%로 가장 낮았다. 발아율 역시 NaOCl 1%, 15분 처리구가 포자와 포자낭 접종시 발아율이 60%, 67%로 높게 나타났다.

실시예 2를 수행한 후 포자엽, 포자낭, 포자의 오염율과 발아율에 대한 결과를 표 2를 통해 나타내었다.

[표 2] 포자엽의 관행살균에 의한 NaOCl의 처리농도와 시간에 따른 오염율과 발아율

구분	시간에 따른 오염율과 발아율
구분	NaOCl 1%(15min.)	NaOCl 3%(10min.)	NaOCl 5%(5min.)
포자	0(60)	0(67)	0(67)
포자낭	27(67)	80(7)	47(33)
포자엽	100(0)	100(0)	100(0)

※( ): 발아율(%)

[실시예 3] 포자엽의 초음파살균을 통한 파종방법

실시예 2와 동일하게 준비된 포자엽, 포자낭, 포자를 NaOCl 1, 3, 5%농도에 6, 4, 2분 동안 초음파 세척을 실시한 후 멸균수로 치아염소산나트륨액을 완전 제거하였다. 그리고 나서 포자엽, 포자낭, 포자를 농도별 배지별로 분리조제 후 MS액체배지, Hyponex액체배지 및 1/2MS고체배지에 배양하였다.

포자 및 포자낭군이 부착된 포자엽을 Sodium hypochlorite 1, 3, 5%용액에 6, 4, 2분 동안 초음파 살균하여 포자를 접종한 결과 포자엽은 100%오염율을 보였고 포자낭은 NaOCl 3%, 4분 처리구가 20%로 오염율이 낮았고 포자접종구에서는 NaOCl 3%, 4분, NaOCl 5%, 2분 처리구에서만 오염율이 없었다. 또한 발아율 역시 순수포자만 채취한 처리구가 발아율이 높게 나타났다.

실시예 3을 수행한 후 포자엽, 포자낭, 포자의 오염율과 발아율에 대한 결과를 표 3을 통해 나타내었다.

[표 3] 포자엽의 초음파 살균에 의한 Sodium hypochlorite(NaOCl)의 처리농도와 시간에 따른 오염율과 발아율

구분	시간에 따른 오염율과 발아율
구분	NaOCl 1%(6min.)	NaOCl 3%(4min.)	NaOCl 5%(2min.)
포자	15(53)	0(67)	0(60)
포자낭	53(20)	20(27)	33(60)
포자엽	100(0)	100(0)	100(0)

※( ): 발아율(%)

[실시예 4] 포자엽의 초음파 살균+ 진공살균을 통한 파종방법

채취된 포자엽에서 예리한 메스로 포자낭을 조심스레 분리해낸 후 치아염소산나트륨용액(NaOCl) 1, 3, 5%조제 후 5, 3, 1분 동안 초음파 세척을 해준다. 이렇게 세척된 포자낭은 다시 진공여과장치를 이용해 0.2㎛ membrane filter를 갈아 끼운 후 진공살균해서 멸균수로 헹궈준다. 이처럼 살균된 포자낭은 포자와 별도분리 후 NaOCl 1,3,5% 구분해서 MS액체배지, Hyponex액체배지 및 1/2MS고체배지에 배양하였다.

처리된 포자엽을 초음파 살균처리(NaOCl 1, 3, 5%용액에 6, 4, 2분)후 진공여과 살균하여 포자를 접종한 결과 포자접종시 Sodium hypochlorite 1%, 6분 처리구와 3%, 4분 처리구가 오염율 없이 발아율 73%로 성적이 우수했으며 포자낭의 경우 NaOCl 5%, 2분 처리구가 오염율이 다소 낮고 발아율이 높았다.

실시예 4를 수행한 후 포자엽, 포자낭, 포자의 오염율과 발아율에 대한 결과를 표 4를 통해 나타내었다.

[표 4] 포자엽의 초음파 살균+진공살균에 의한 Sodium hypochlorite(NaOCl)의 처리농도와 시간에 따른 오염율과 발아율

구분	시간에 따른 오염율과 발아율
구분	NaOCl 1%(6min.)	NaOCl 3%(4min.)	NaOCl 5%(2min.)
포자	0(73)	0(73)	7(67)
포자낭	40(47)	33(47)	27(60)
포자엽	100(0)	100(0)	100(0)

※( ): 발아율(%)

[실시예 5] 포자낭의 초음파 살균+ 진공살균을 통한 파종방법

포자엽에서 분리한 포자낭과 포자를 Sodium hypochlorite 1, 3, 5%용액에 5, 3, 1분 동안 초음파 살균한 후 진공 살균하여 포자를 접종한 결과 포자만 접종한 처리구에서는 NaOCl 5%, 1분 처리구가 오염율이 낮고 발아율이 높았으며 포자낭 접종처리구에서는 포자엽 접종시와 마찬가지로 전 처리구가 오염으로 조사되었다.

실시예 5를 수행한 후 포자엽, 포자낭, 포자의 오염율과 발아율에 대한 결과를 표 5를 통해 나타내었다.

[표 5] 포자낭의 초음파 살균+진공살균에 의한 Sodium hypochlorite(NaOCl)의 처리농도와 시간에 따른 오염율과 발아율

Division	Contamination rate(%) by treatment concentration and times
Division	NaOCl 1%(5min.)	NaOCl 3%(3min.)	NaOCl 5%(1min.)
Spores	67(13)	73(7)	20(47)
Sporangium	100(0)	100(0)	100(0)

※( ): 발아율(%)

[실시예 6] 포자의 접종배지별 발아율 조사

NaOCl의 처리 농도별(1%, 3%, 5%) 접종배지를 MS, 1/2MS, Hyponex로 달리하여 고사리 포자의 발아율을 조사하였다. 그 결과를 표 6을 통해 제시하였다. 그 결과 MS, 1/2MS 배지에 접종시 발아율은 비슷하게 조사되었으나 Hyponex배지에서 발아가 현저히 떨어졌다. 또한 NaOCl의 농도에 따른 발아율은 큰 차이가 없는 것으로 파악되었다. 이는 Cook(1979)이 Playtycerium이나 davallia의 포자 배양시 전엽체를 균일화하여 MS기본배지에 배양하였을 경우 생량 조정제 없이도 다량의 shoot를 유기 시킬 수 있다는 실험결과와도 일치한다.

[표 6] NaOCl의 처리농도에 의한 접종배지별 발아율

Division	Contamination rate(%) by sterilization treatment
Division	NaOCl 1%	NaOCl 3%	NaOCl 5%
Ms	51	40	51
1/2 MS	44	47	49
Hyponex	13	7	11

상기 실시예를 종합하여 보면 고사리 포자배양 증식을 위한 살균시험결과 포자의 전처리 후 원심분리기를 이용한 살균실험에서는 NaOCl 1%, 3%처리구가 오염율 7%, 27%로 낮게 조사되었음을 알 수 있다. 이는 포자의 발아율을 높이고 오염율을 감소시키기 위하여 NaOCl에 침지시키는 전처리 단계가 필수적으로 선행되어야 함을 나타내는 것이라 하겠다.

고사리 포자접종용 적정배지 선발을 위한 배지별 발아시험결과 Hyponex배지가 발아율 10%로 가장 느린 생장을 보였으며 MS배지와 1/2MS배지는 발아율 44%와 47%로 보다 우수한 생장을 나타내는 것을 볼 때 발아촉진을 위한 고사리 포자배양용 적정배지는 MS와 1/2MS배지를 이용하는 것이 효과적임을 알 수 있다.

도 1은 본 발명과 종래의 일반적인 방법에 의한 고사리 배양 결과를 나타내는 사진이다.

Claims

고사리 포자를 채취하여 2~5℃에서 3~5일간 냉장 보관하는 단계와;

상기 냉장 보관된 고사리 포자에 멸균수를 첨가하여 100rpm에서 24시간 동안 진탕하는 단계와;

상기 진탕된 포자를 70중량%의 알콜을 사용하여 30초간 표면을 살균시킨 시험관에 담지시켜 1~5 % 농도의 NaOCl 수용액을 첨가하여 5분~15분 동안 침지시키는 단계와;

상기 침지된 NaOCl 수용액을 원심분리기에 넣고 2000rpm에서 2~5분간 원심분리하는 단계와;

상기 원심분리된 용액에서 NaOCl를 제거한 후 살균수를 첨가하여 5회 세척하여 순수 포자를 준비하는 단계와;

상기 순수 포자를 MS 액체배지 또는 Hyponex 액체배지를 사용하여 포자 부피 대비 5~6배 부어 포자 배양을 위한 액체배지를 제조하는 단계와;

상기 액체배지를 1/2 MS 고체배지 배양병에 넣고 1ml씩 고르게 접종하는 단계와;

상기 접종된 포자를 20~22℃의 항온기에서 형광등으로 10~20시간 동안 조명하면서 배양하는 단계;

로 구성된 고사리 포자의 배양 방법.
포자낭군이 부착된 고사리 포자엽을 채취하여 2~5℃에서 3~5일간 냉장 보관하는 단계와;

상기 냉장 보관된 고사리 포자엽에 멸균수를 첨가하여 100rpm에서 24시간 동안 진탕하는 단계와;

상기 진탕된 포자엽을 70중량% 알콜을 사용하여 30초간 표면을 살균시킨 시험관에 담지시켜 1~5 % 농도의 NaOCl 수용액을 첨가하여 5분~15분 동안 침지시키는 단계와;

상기 침지된 NaOCl 수용액을 원심분리기에 넣고 2000rpm에서 2~5분간 원심분리하는 단계와;

상기 원심분리된 용액에서 NaOCl를 제거한 후 살균수를 첨가하여 5회 세척하여 포자엽, 포자낭, 포자를 각각 조제하는 단계와;

상기 조제된 포자엽, 포자낭, 포자를 MS 액체배지 또는 Hyponex 액체배지를 사용하여 포자 부피 대비 5~6배 부어 포자 배양을 위한 액체배지를 제조하는 단계와;

상기 액체배지를 1/2 MS 고체배지 배양병에 넣고 1ml씩 고르게 접종하는 단계와;

상기 접종된 포자를 20~22℃의 항온기에서 형광등으로 10~20시간 동안 조명하면서 배양하는 단계;

로 구성된 고사리 포자의 배양 방법.
제2항에 있어서,

상기 진탕된 포자엽을 70% 알콜을 사용하여 30초간 표면을 살균시킨 시험관에 담지시켜 1~5 % 농도의 NaOCl 용액을 첨가하여 5분~15분 동안 침지시키는 단계종료 후, 초음파 세척을 실시하는 단계가 추가되는 것을 특징으로 한 고사리 포자의 배양 방법.
제3항에 있어서,

상기 초음파 세척이 종료된 후 두께가 0.2μm 의 멤브레인 필터를 사용하여 진공여과 단계가 추가되는 것을 특징으로 한 고사리 포자의 배양 방법.
제3항 또는 제4항에 있어서,

상기 초음파 세척은 1~5% 농도의 NaOCl 수용액으로 2분~ 6분 간 수행되는 것을 특징으로 한 고사리 포자의 배양 방법.