CN105861317B - 快速分离纯化茶花花腐病菌的方法及其专用培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种分离纯化茶花花腐病菌的专用培养基，称取麦麸200g，加入蒸馏水，煮沸后过滤，滤液中加入葡萄糖和琼脂，蒸馏水定容，灭菌后冷却至40～50℃时加入利福平摇匀，得专用培养基。本发明还同时提供了一种分离纯化茶花花腐病菌的方法，依次进行以下步骤：采集疑似感染了山茶花腐病的山茶花花瓣，将所得病样进行预处理和消毒，将所得的消毒后样品进行四周边缘处的修剪后放入专用培养基进行接种培养至长出菌丝为止；将所得的菌丝进行纯化培养，直至获得纯菌种。
Description
技术领域
本发明涉及一种快速分离纯化茶花花腐病菌的方法及其专用培养基，属于植物病理学研究技术领域。
背景技术
山茶花腐病(camellia flower blight)由茶花花腐真菌Ciborinia camelliaeKohn侵染花瓣所引发，主要危害花瓣，导致花瓣维管束变黑，完全坏死﹑干腐、脱落，极大降低了山茶花的观赏价值。山茶花腐病是国内检疫性病害之一。在世界范围内，主要分布在美洲、欧洲等地，亚洲地区只有日本有报道。
山茶花腐真菌属于属真菌界(Fungi)，子囊菌门(Ascomycota)，子囊菌纲(Ascomycetes)，柔膜菌目(Helotiales)，核盘菌科(Sclerotiniaceae)，叶杯菌属(Ciborinia)。该菌引起的病害花腐症状与灰葡萄孢(Botrytis cinerea)和核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)所引起的茶花腐烂症状相似，这对病害鉴定和病原菌的分离造成很大困难。
山茶花腐病病原的常规分离方法为组织分离法，即取感病花瓣病健交界处组织(0.5×05cm大小)数块，用1％NaOCl进行表面消毒3min，无菌水冲洗3次，置于PDA平板上，于20℃～25℃、12h白光光照下培养。待菌落出现后观察菌落的形态、颜色、生长速率及子实体等培养性状，显微镜检分生孢子座、产孢细胞、分生孢子的形态特征，将疑似山茶花腐病菌的菌株转到新鲜PDA平板上纯化，保存备用。该方法存在如下不足：①分离率较低(仅为75.2％)；②容易污染杂菌；③分离纯化时间长(约需要7天)。
山茶花腐病具有典型的病症：①花受侵染后，坏死﹑干腐、脱落，但花的结构保持良好，即使整个枯萎的花朵经手的挤压后仍能保持完好。②环境湿润时，花瓣基部或中心产生褐色至黑色有光泽的小“液滴”，直径1mm，即小型分生孢子、分生孢子梗和链状分生孢子的分生孢子座(子座)；较早的病部，分生孢子座汇集并形成粘性黑斑。③侵染后期，围绕花瓣基部出现一个白色至灰白色毛毯状近似环状的不育菌丝。④菌核扁平葡萄干状，较大，常联合成环状，可以与寄主组织结合。依据病害的典型病症，采集病样，可以提高病害鉴定和病原分离效率。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种快速分离纯化茶花花腐病菌的方法及其专用培养基。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种分离纯化茶花花腐病菌的专用培养基，该专用培养基的制备方法为：称取麦麸200g，加入750～850mL蒸馏水，煮沸15～25min后过滤，所述滤液中加入葡萄糖19～21g和琼脂17～19g混合，完全溶解后，蒸馏水定容至1000mL；灭菌后冷却至40～50℃时，取1/4的体积量(即，250ml)并加入19～21mg的利福平摇匀，得专用培养基。
本发明还同时提供了一种分离纯化茶花花腐病菌的方法，依次进行以下步骤：
1)、病样的采集：
采集感染(高度疑似感染)了山茶花腐病的山茶花花瓣；
2)、病样的预处理和消毒：
将步骤1)所得的花瓣进行如下处理：
以病健交界处为中心线进行花瓣取样，从而获得样品，所述样品中患病花瓣面积等于(基本等于即可)正常花瓣面积；取样面积为整个花瓣面积的0.6～0.7倍(即，约2/3左右)；
将所述样品进行清洗和消毒；
3)、将病样进行病原菌的分离纯化培养：
将步骤2)所得的消毒后样品进行四周边缘处的修剪后放入专用培养基(分离纯化茶花花腐病菌的专用培养基)进行接种培养，于18±0.5℃恒温、12h光照、12h黑暗条件下培养直至长出菌丝为止(约2-3d)；
将所得的菌丝于18±0.5℃，12h光照、12h黑暗条件下进行纯化培养，直至获得纯菌种。
备注说明：所述纯化培养中，培养4d后菌落直径达到约4.0-4.2cm，菌丝由白色转为灰白色；在超净工作台中观察，菌落单一，毛毯状，表面菌丝呈辐射状生长，无杂菌落，即为纯菌种，即可停止纯化培养，进行后续的斜面接种保存。如继续同等条件下培养，进行菌株的培养性状观察，在第10d，菌丝开始凝结，15d可见环状菌核，比常规培养提前15d。
作为本发明的分离纯化茶花花腐病菌的方法的改进：
所述步骤1)中，当具备花瓣褐色、花朵坏死但仍保持结构不变这些症状的，判定为感染(高度疑似感染)了山茶花腐病的山茶花花瓣。
作为本发明的分离纯化茶花花腐病菌的方法的进一步改进：
所述步骤2)中，
样品的大小为2×2cm；
清洗和消毒为：将样品用自来水清洗后晾干表面水分；然后依次采用70％酒精和1％次氯酸钠液进行两次消毒；上述％均为质量％。
作为本发明的分离纯化茶花花腐病菌的方法的进一步改进：
所述步骤3)的修剪为：用消毒的剪刀将步骤2)所得的消毒后样品的四周边缘均减去1mm的宽度；
以再病健交界处为中心线，修剪成0.4×0.5cm的尺寸；此时，患病花瓣面积仍基本等于即可正常花瓣面积。
利福平，化学名3-[[(4-甲基-1-哌嗪基)亚氨基]甲基]，分子式C43H58N4O12。
在本发明的步骤1)中，依据山茶花腐病的花瓣褐色、花朵坏死但仍保持结构不变等典型症状，进行病样的采集和标注，是成功分离病原菌的关键之一。具体可为：在2-3月份，选取具有花瓣褐色、花朵坏死但仍保持结构不变等花腐病显著发病病状的茶花植株，采集新鲜发病的花瓣，按不同采样的地点、品种进行编号。
步骤2)的消毒方法具体为：在无菌操作室内，将清洗并晾干表面水分后的样品用质量浓度为70％酒精浸泡10s，再用质量浓度1％次氯酸钠液浸泡1min，无菌水清洗后置于无菌滤纸上晾干。
所述步骤3)为：用无菌镊子将所剪的病样接入专用培养基平板中，每皿接入5块病样，置于18±0.5℃恒温箱中培养，2-3d后长出的菌丝进行再转接纯化培养。
本发明具有如下有益效果：
本发明方法使茶花花腐病菌的分离率平均达到89.5％，比常规(小块消毒处理，小块分离)处理方法分离率平均提高14.3％；整个分离过程(病样经消毒，接种到专用培养基上的整个过程)用时平均仅需25分钟，分离时间比常规分离(大约35min左右)平均缩短30.5％，并且操作简便易行；18℃下培养2～3天(约60h左右)后长出菌丝，即可进行转接纯化培养，比PDA培养基培养时间平均缩短25.0％。由上述可知，本发明具有操作简单，省时省力，分离纯化效率高等特点。
具体实施方式
实施例1、一种分离纯化茶花花腐病菌的方法，依次进行以下步骤：
(1)病样采集：在每年的2-3月份，选取具有花瓣褐色、花朵坏死但不改变结构等花腐病显著发病病状的茶花植株，采集新鲜发病的花瓣，按不同采样的地点、品种进行编号。
(2)病样切取：将编号后的花瓣，以病健交界处为中心，切取病健部分共长度为2×2cm的部分作为样品(即，取样面积为整个花瓣面积的2/3左右)；该样品中患病花瓣面积基本等于正常花瓣面积；
将样品用自来水清洗后晾干表面水分。
(3)病样消毒：在无菌操作室内，将上述步骤2)所得的样品用质量分数为70％酒精浸泡10s，无菌水冲洗后，再用1％(质量％)次氯酸钠液浸泡1min，无菌水清洗三次，置于无菌滤纸上晾干。
(4)专用培养基的配制：市场采购生麦麸，称取麦麸200g，加入800mL蒸馏水，小火煮沸20min，三层纱布过滤，滤液中加入将葡萄糖20g和琼脂17g混合，完全溶解后，蒸馏水定容至1000mL，均匀分装至4个250mL三角瓶，121℃高压灭菌20min。冷至40～50℃时，每个三角瓶加入20mg的利福平摇匀，即制成所述的专用培养基；无菌超净工作台内，倒入灭菌培养皿(培养皿直径9cm，每皿导入专用培养基15mL)中，做好标记，备用。
(5)分离纯化培养：用无菌剪刀将消毒处理的病样剪去四周宽约1mm的褐化组织，再以病健交界处为中心，剪成长度为0.4×0.5cm的病样(即，具体根据茶花花瓣的取样形状，一般可剪成3-4块；此时，患病花瓣面积仍基本等于即可正常花瓣面积)，用无菌镊子将所剪的病样接入步骤(4)配制的专用培养基中，每皿接入5块病样，放在18℃恒温箱12h光照(光照强度为2000Lux)、12h黑暗条件中培养，约60h就能长出茶花花腐病菌白色菌丝，再进行转接纯化培养。
纯化培养的相应工艺参数为：18℃，12h光照、12h黑暗条件下培养。3d后，长出菌丝白色；4d后菌落直径达到约4.0-4.2cm，菌丝由白色转为灰白色，观察无杂菌(即在超净工作台中观察，菌落单一，毛毯状，表面菌丝呈辐射状生长，无杂菌落)即为纯菌种，即可停止纯化培养，进行后续的斜面接种保存。如继续同等条件下培养，进行菌株的培养性状观察，在第10d，菌丝开始凝结，15d可见环状菌核，比常规培养提前15d。
经验证，所得菌确为茶花花腐真菌。
实施例1的茶花花腐病菌分离过程用时25分钟；分离培养时间为60h，纯化培养时间为96h；分离率为89.5％，
备注说明：分离率＝分离出菌丝接种块数/总的接种块数*100％。
对比例1-1、将实施例1中的专用培养基改成常规的PDA培养基，其余等同于实施例1。
对比例1-2、将实施例1中的专用培养基中的麦麸改成马铃薯，其余等同于实施例1。
对比例1-3、取消实施例1中的专用培养基中的利福平的使用，即，将利福平的用量由20mg改成0mg；其余等同于实施例1。
对比例1-4、将实施例1中的专用培养基中的利福平的用量由20mg改成40mg；其余等同于实施例1。
对比例1-5、将实施例1中的专用培养基中的利福平改成链霉素；其余等同于实施例1。
对比例2、将实施例1步骤3)中接种培养的温度由18℃改成如常规技术告知的25℃；其余等同于实施例1。
对比例3、将实施例1的步骤2)改成：取感病花瓣病健交界处组织0.4×0.5cm大小的数块作为样品；
相应的，取消步骤5)中的“用无菌剪刀将消毒处理的病样剪去四周宽约1mm的褐化组织，再以病健交界处为中心，剪成长度为0.4×0.5cm的病样”，即，直接将消毒处理后的病样接入专用培养基中进行培养；
其余等同于实施例1。
上述所有对比例与本发明的结果对比如下述表1所述。
表1
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (3)
1.分离纯化茶花花腐病菌的方法，其特征是依次进行以下步骤：
1)、病样的采集：
采集感染了山茶花腐病的山茶花花瓣；
2)、病样的预处理和消毒：
将步骤1)所得的花瓣进行如下处理：
以病健交界处为中心线进行花瓣取样，切取病健部分共长度为2×2cm的部分作为样品，取样面积为整个花瓣面积的2/3；该样品中患病花瓣面积等于正常花瓣面积；
将所述样品进行清洗和消毒；
3)、将病样进行病原菌的分离纯化培养：
将步骤2)所得的消毒后样品用无菌剪剪去四周宽1mm的褐化组织，再以病健交界处为中心，剪成长度为0.4×0.5cm的病样放入专用培养基进行接种培养，于18±0.5℃恒温、12h光照、12h黑暗条件下培养直至长出菌丝为止；
将所得的菌丝于18±0.5℃，12h光照、12h黑暗条件下进行纯化培养，直至获得纯菌种；
专用培养基的制备方法为：称取麦麸200g，加入750～850mL蒸馏水，煮沸15～25min后过滤，滤液中加入葡萄糖19～21g和琼脂17～19g混合，完全溶解后，蒸馏水定容至1000mL；灭菌后冷却至40～50℃时，取1/4的体积量并加入19～21mg的利福平摇匀，得专用培养基。
2.根据权利要求1所述的分离纯化茶花花腐病菌的方法，其特征是：
所述步骤1)中，当具备花瓣褐色、花朵坏死但仍保持结构不变这些症状的，判定为感染了山茶花腐病的山茶花花瓣。
3.根据权利要求2所述的分离纯化茶花花腐病菌的方法，其特征是：所述步骤2)中，清洗和消毒为：将样品用自来水清洗后晾干表面水分；然后依次采用70％酒精和1％次氯酸钠液进行两次消毒；上述％均为质量％。
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| Review of literature on camellia flower blight caused by Ciborinia camelliae;C. H. Taylor et al;《New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science》;20001231;第28卷;123-138 |
| 核盘菌菌核培养方法的研究;张永杰等;《植物保护》;20041231;第30卷(第6期);第75页左栏第三段，第76页表1 |
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