CN110972939B

CN110972939B - 一种快速繁殖闹羊花组培苗的方法

Info

Publication number: CN110972939B
Application number: CN201911256604.1A
Authority: CN
Inventors: 史俊; 杨鹤同; 贾君; 席刚俊; 葛晓宽; 徐晓燕
Original assignee: Jiangsu Polytechnic College of Agriculture and Forestry
Current assignee: Jiangsu Polytechnic College of Agriculture and Forestry
Priority date: 2019-12-09
Filing date: 2019-12-09
Publication date: 2022-06-28
Anticipated expiration: 2039-12-09
Also published as: CN110972939A

Abstract

本发明公开了一种快速繁殖闹羊花试管苗的方法：每年7～8月，采集闹羊花的成熟塑果，剥出种子，搓揉去除膜状翅，再装入纱布袋进行漂洗、消毒，然后接入固体培养基，培养30～40d，种子萌发长成幼苗；将幼苗转入增殖培养基中培养，40～50d继代一次，增殖系数达4～5，直到达到所需的种苗量，再转入壮苗生根培养基，培养60～70d，苗高3～4cm，根2～3条，即可移栽。本发明可直接用于工厂化规模化的种苗生产，具有污染少，增殖速度快，变异率低，种苗整齐健壮，生产成本低，移栽成活率高等优势。

Description

一种快速繁殖闹羊花组培苗的方法

技术领域

本发明属于植物栽培技术，具体涉及一种快速繁殖闹羊花组培苗的方法。

背景技术

闹羊花为杜鹃花科闹羊花属植物Rhododendron molle G.Don，又名羊踯躅，羊踯躅华，羊踯躅花，玉枝，羊不吃草，羊不食草，搜山虎，老虎花等，分布于我国长江流域至南部各地，生长于山坡、灌丛或草丛中。闹羊花以花入药，每年四、五月花初开时采收，阴干或晒干后入药。《中国药典(2015版)》记载，闹羊花味辛，性温；有大毒。归肝经。具有祛风除湿，散瘀定痛之功效。用于风湿痹痛，偏正头痛，跌扑肿痛，顽癣。用量0.6～1.5g，浸酒或入丸散，外用适量，煎水洗。因闹羊花易引起严重的不良反应，所以不宜多服、久服；体虚者及孕妇禁用。闹羊花虽有毒，但对治疗风湿痹痛，偏正头痛，跌扑肿痛，顽癣有很好的疗效，本发明通过组织培养的方法可一年四季不间断提供闹羊花种苗，满足药农种植需求。

发明内容

发明目的：针对上述现有技术，本发明提供一种规模化高效繁殖闹羊花组培苗的方法。

技术方案：本发明所述的一种快速繁殖闹羊花组培苗的方法，包括以下步骤：

(1)从闹羊花塑果中剥取出种子，搓揉去除膜质翅，清洗消毒，备用；

(2)将步骤(1)得到的闹羊花种子播种于固体培养基中，在22～25℃、光照度500～1000勒克斯、光照时间11～13h/d的条件下，培养30～40d，种子萌发形成1～2cm的幼弱的小苗，取小苗备用；

(3)将步骤(2)得到的小苗在超净工作台上转移到增殖培养基，在22～25℃、光照度500～1000勒克斯、光照时间11～13h/d的条件下，培养45～60d，小苗长至2～3cm，并形成多个分枝，将形成的分枝从小苗上切下，重新接入新的增殖培养基，继续增殖培养，直到种苗量达到需求，便可进行壮苗生根培养；

(4)将步骤(3)中得到闹羊花小苗转接到壮苗生根培养基中，在25～28℃、光照度1000～2000勒克斯、光照时间11～13h/d的条件下培养50～60d，苗长至4～5cm，根2～3根时可进行移栽；

(5)将步骤(4)得到的成苗移至有外遮荫的大棚温室苗床上，温度控制在25～30℃，利用太阳光或自然光作为光源进行驯化培养，驯化10d左右得到成苗，将苗从瓶内取出用清水冲洗去除培养基后，移栽入基质上。

步骤(1)中，所述清洗消毒是指：用纱布袋包裹种子并扎好袋口，置于流水中冲洗10min，用去污剂清洗10min，再用流水冲洗20min，挤干水分带入超净工作台，在超净工作台上，酒精浸泡45～60s，消毒剂浸泡6～8min，无菌水冲洗5～7次。然后剪开纱布袋，用镊子夹出种子。其中，所述去污剂是指家用洗衣粉，所述酒精体积百分浓度为70％～75％，优选75％。所述消毒剂是指质量百分含量为0.1％～0.15％的氯化汞。

步骤(2)中，所述的固体培养基组成为：萘乙酸(NAA)0.1～0.5mg/L+土豆汁60～80g/L+蔗糖25～30g/L+琼脂6～8g/L+改良MS培养基+pH 5..4～5.6。优选的，所述的固体培养基组成为：萘乙酸(NAA)0.2mg/L+土豆汁80g/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L+改良MS培养基+pH5.4。

步骤(3)中，所述的增殖培养基组成为：萘乙酸(NAA)0.1～0.3mg/L+6苄氨基嘌呤(6～BA)0.5～1.0mg/L+玉米素(ZT)0.1～0.5mg/L+土豆汁60～80g/L+蔗糖25～30g/L+琼脂6～8g/L+改良MS培养基+pH 5.4～5.6。优选的，所述的继代增殖培养基组成为：萘乙酸(NAA)0.2mg/L+6～苄氨基嘌呤(6～BA)0.8mg/L+玉米素(ZT)0.3mg/L+土豆汁80g/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L+改良MS培养基+pH 5.4。

步骤(4)中，所述的壮苗生根培养基组成为：萘乙酸(NAA)0～0.3mg/L+香蕉泥60～80g/L+蔗糖25～30g/L+white培养基+琼脂6～8g/L+pH 5.4～5.6。优选的，所述的壮苗生根培养基组成为：萘乙酸(NAA)0.2mg/L+香蕉泥80g/L+蔗糖25g/L+white培养基+琼脂8g/L+pH5.4。

本申请中，所述改良MS培养基是指MS培养基中KNO₃含量调整为480mg/L，NH₄NO₃含量调整为400mg/L。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：

(1)闹羊花种子较小，有膜状翅，采用搓揉的方法去除膜状翅，并用纱布袋包裹消毒，相比现有消毒方法，种子消毒更彻底，损失少，便于接种。(2)闹羊花种子消毒后，将种子播散到步骤(2)中的固体培养基中，采用改良MS并配以适当的激素和添加天然附加物土豆汁，与现有的种子萌发培养基相比，该方法种子萌发时间大大缩短至20～30d，并且萌发率高达90％以上，变异率小于1％，出芽整齐。(3)步骤(3)所述的继代增殖培养基中，采用改良MS并配以适当的激素和天然附加物，与传统的继代增殖培养基相比，该方法能更好更快的促进小苗的生长和分枝，增殖系数可达到4～5。(4)步骤(4)所述的壮苗生根培养基中，采用white培养基并配合适当的激素与天然附加物，与传统的壮苗生根培养基相比，该方法能更好促进小苗迅速生根且根较粗壮。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。

实施例1：一种高效繁殖闹羊花试管苗的方方法，该方法包括以下步骤：

(1)从闹羊花塑果中剥取出种子，通用搓揉去除膜质翅，用纱布袋包裹种子并扎好袋口，置于流水中冲洗10min，用去污剂清洗10min，再用流水冲洗20min，挤干水分带入超净工作台，在超净工作台上，用75％酒精浸泡45～60s，0.1％升汞浸泡6～8min，无菌水冲洗5～7次。然后剪开纱布袋，用镊子夹出种子，备用。

(2)将步骤(1)得到的闹羊花种子播种于固体培养基中，在22～25℃、光照度500～1000勒克斯、光照时间11～13h/d的条件下，培养30～40d，种子萌发形成1～2cm的幼弱的小苗，取小苗备用；其中，所述的固体培养基组成为：萘乙酸(NAA)0.2mg/L+土豆汁80g/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L+改良MS培养基+pH 5.4；

(3)将步骤(2)得到的小苗在超净工作台上转移到增殖培养基，在22～25℃、光照度500～1000勒克斯、光照时间11～13h/d的条件下，培养45～60d，小苗长至2～3cm，并形成多个分枝，将形成的分枝从小苗上切下，重新接入新的增殖培养基，继续增殖培养，直到种苗量达到需求，便可进行壮苗生根培养，其中，所述的增殖培养基组成为：萘乙酸(NAA)0.2mg/L+6苄氨基嘌呤(6～BA)0.8mg/L+玉米素(ZT)0.3mg/L+土豆汁80g/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L+改良MS培养基+pH 5.4；

(4)将步骤(3)中得到闹羊花小苗转接到壮苗生根培养基中，在25～28℃、光照度1000～2000勒克斯、光照时间11～13h/d的条件下培养50～60d，苗长至4～5cm，根2～3根时可进行移栽，其中，所述的壮苗生根培养基组成为：萘乙酸(NAA)0.2mg/L+香蕉泥80g/L+蔗糖25g/L+white培养基+琼脂8g/L+pH 5.4；

实施例2

与实施例1基本相同，步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)中闹羊花种子萌发、小苗继代增殖、壮苗生根分别以表1、表2和表3中所列各因子及水平进行正交设计进行筛选，通过正交设计分析优选出最适培养基组合。表1、表2、表3说明如下：

①本实例中均设计成固体培养基，每种配方中琼脂浓度均为8g/L，种子萌发和小苗增殖阶段蔗糖为30g/L，壮苗生根阶段蔗糖浓度为25g/L，培养环境为温度25℃、光照度1000～2000勒克斯、光照时间12h/d培养室内。

②种子播种阶段主要观察种子萌发的快慢、长势、颜色(翠绿为佳)等指标判断配方是否合理；继代增殖阶段主要观察小苗分枝情况(越多越好)、玻璃化程度、种苗健壮程度等指标判断配方是否合理；壮苗生根培养阶段，主要通关观察苗的生长势、生根速度、玻璃化程度(越低越好)、颜色等指标来判断配方的好坏。通过观察和各项指标的测定，对各阶段各因素、水平组合给予附分，分值为0～10分。

表1闹羊花种子萌发各因素、水平L₉3⁴正交设计分析结果

表2闹羊花增殖培养各因素、水平L₁₆4⁵正交设计分析结果

表3闹羊花生根培养各因素、水平L₉3⁴正交设计分析结果

从表1中可以看出，基本培养基R值大于其他因子，说明基本培养基对闹羊花种子萌发的影响最大，综合分析，基础培养基因子K2>K3>K1，即改良MS优于WPM优于MS，因此在种子萌发阶段，最佳的基础培养基为MS，同理，在种子萌发阶段，最佳的NAA水平为0.2mg/L，6～BA为0mg/L，土豆汁为80g/L，因此，闹羊花种子萌发的最优培养基组合为改良MS+NAA0.2mg/L+土豆汁80g/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L，pH5.4；分析方法同上，从表2中可以看出，基本培养基和NAA的R值略大于其他因子，但差异不大，说明在闹羊花增殖培养中各因子都对闹羊花增殖有影响，闹羊花增殖培养的最优培养基组合为改良MS培养基+NAA 0.2mg/L+6～BA 0.8mg/L+ZT 0.3mg/L+土豆汁80g/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L，pH 5.4；从表3中可以看出，基本培养基R值大于其他因子，说明基本培养基对闹羊花壮苗生根的影响最大，闹羊花壮苗生根的最适培养基为white培养基+NAA 0.2mg/L+香蕉泥80g/L+蔗糖25g/L+琼脂8g/L，pH 5.4。

实施例4为更好验证本配方的有益效果，将本配方与传统配方进行比较。

(1)种子萌发，①为传统配方，配方为MS+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.4，②为新配方，配方为改良MS+NAA0.2mg/L+土豆汁80g/L+蔗糖80g/L+琼脂8g/L，pH5.4，消毒后常规播种，以萌发率达60％所需的时间为平均萌发时间，60d后统计总萌发率。

表4种子萌发新配方与传统配方对种子萌发的影响

(2)小苗增殖，①为传统配方，配方为MS+NAA0.1mg/L+6～BA1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.4，②为新配方，配方为改良MS培养基+NAA0.2mg/L+6～BA 0.8mg/L+ZT0.3mg/L+土豆汁80g/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L，pH5.4，将种子萌发获得的小苗转接到新的培养基，每瓶接种6株，60d后将小苗长出的分枝剪成带2个节的小段，重接接种新的培养基，每瓶接种6个茎段，统计增殖率。

表5增殖阶段传统配方与新配方对小苗增殖的影响

序号	初始接种瓶数	60d后增殖瓶数	平均增殖率	种苗生长情况
					1	5	12	2.4	苗高1～2cm，叶色淡绿，分枝较少
2	5	17	3.4	苗高2～3cm，叶色浓绿，分枝较多

(3)生根培养①为传统配方，配方为1/2MS+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.4，②为新配方，配方为white培养基+NAA 0.2mg/L+香蕉泥80g/L+蔗糖25g/L+琼脂8g/L，pH 5.4，将增殖后的小苗接入新的培养基，每瓶接种6株，每配方接种5瓶，50d后统计生根数及种苗生长情况。

表6生根阶段传统培养基与新增养基对小苗生根壮苗的影响

序号	平均根系	种苗生长情况
			1	1.8	苗高2～3cm，叶色淡绿，根系较弱
2	2.4	苗高3～4cm，叶色浓绿，根系粗状

Claims

1.一种快速繁殖闹羊花组培苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）从闹羊花塑果中剥取出种子，搓揉去除膜质翅，清洗消毒，备用；

（2）将步骤（1）得到的闹羊花种子播种于固体培养基中，在22- 25℃、光照度500- 1000勒克斯、光照时间11- 13h/d的条件下，培养30- 40d，种子萌发形成1- 2cm的幼弱的小苗，取小苗备用；所述的固体培养基组成为：萘乙酸（NAA）0.1- 0.5mg/L+土豆汁60- 80g/L+蔗糖25- 30g/L+琼脂6- 8g/L+改良MS培养基，pH5.4- 5.6；

（3）将步骤（2）得到的小苗在超净工作台上转移到增殖培养基，在22- 25℃、光照度500- 1000勒克斯、光照时间11- 13h/d的条件下，培养45- 60d，小苗长至2- 3cm，并形成多个分枝，将形成的分枝从小苗上切下，重新接入新的增殖培养基，继续增殖培养，直到种苗量达到需求，便可进行壮苗生根培养；所述的继代增殖培养基组成为：萘乙酸（NAA）0.1-0.3mg/L+6苄氨基嘌呤（6-BA）0.5- 1.0mg/L+玉米素（ZT）0.1- 0.5mg/L+土豆汁60- 80g/L+蔗糖25- 30g/L+琼脂6- 8g/L +改良MS培养基，pH 5.4- 5.6；

（4）将步骤（3）中得到闹羊花小苗转接到壮苗生根培养基中，在25- 28℃、光照度1000-2000勒克斯、光照时间11- 13h/d的条件下培养50- 60d，苗长至4- 5cm，根2- 3cm时可进行移栽；所述的壮苗生根培养基组成为：萘乙酸（NAA）0.2mg/L+香蕉泥60- 80g/L +蔗糖25-30g/L+white培养基+琼脂6- 8 g/L，pH 5.4- 5.6；

（5）将步骤（4）得到的成苗移至有外遮荫的大棚温室苗床上，温度控制在25- 30℃，利用太阳光或自然光作为光源进行驯化培养，驯化10d左右得到成苗，将苗从瓶内取出用清水冲洗去除培养基后，移栽入基质上；

所述改良MS培养基是指MS培养基中KNO₃含量调整为480mg/L，NH₄NO₃含量调整为400mg/L。

2.根据权利要求1所述的快速繁殖闹羊花组培苗的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述清洗消毒是指：用纱布袋包裹种子并扎好袋口，置于流水中冲洗、用去污剂清洗、再用流水冲洗，挤干水分带入超净工作台，在超净工作台上，先后用酒精、消毒剂浸泡，然后无菌水冲洗5- 7次。

3.根据权利要求1所述的快速繁殖闹羊花组培苗的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述的固体培养基组成为：萘乙酸（NAA）0.2mg/L +土豆汁80g/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L+改良MS培养基，pH5.4。

4.根据权利要求1所述的快速繁殖闹羊花组培苗的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述的增殖培养基组成为：萘乙酸（NAA）0.2mg/L+6-苄氨基嘌呤（6-BA）0.8mg/L+玉米素（ZT）0.3mg/L+土豆汁80g/L +蔗糖30g/L +琼脂8g/L +改良MS培养基，pH 5.4。

5.根据权利要求1所述的快速繁殖闹羊花组培苗的方法，其特征在于，步骤（4）中，所述的壮苗生根培养基组成为：萘乙酸（NAA）0.2mg/L+香蕉泥80g/L +蔗糖25g/L+white培养基+琼脂8g/L，pH5.4。