CN116649214A - 羊踯躅组织培养技术体系的建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了羊踯躅组织培养技术体系的建立方法，包括以下步骤：步骤1：外植体的消毒；步骤2：防褐化剂浓度筛选；步骤3：种子萌发；步骤4：带腋芽茎段培养；步骤5：增殖培养；步骤6：壮芽培养；步骤7：生根培养；步骤8：炼苗移栽；步骤9：愈伤组织诱导。本发明选取了2个羊踯躅优良单株，以叶片、带腋芽茎段、种子为外植体，对羊踯躅外植体的消毒方法、防褐化方法、继代增殖、生根移栽等各方面都进行了细致的探究，提出了新的外植体消毒方法和降低叶片褐化率的方法，建立并优化了羊踯躅的快繁体系，为羊踯躅的快速繁殖和工厂化育苗提供了理论依据。同时成功诱导下胚轴产生愈伤组织，为羊踯躅的再生体系和遗传转化研究提供了参考。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及羊踯躅组织培养技术体系的建立方法。
背景技术
羊踯躅(Rhododendron molle)，又名闹羊花、黄杜鹃，是杜鹃花科(Ericaceae)杜鹃花属(Rhododendron)羊踯躅亚属(Subgen.Pentanthera)落叶灌木，产自江苏、安徽、浙江、江西等地。植株约高0.5～2m，叶片纸质,全株多部分有毛,顶生总状伞形花序，花期4月，常先花后叶，花冠宽钟形5裂，金黄色至橙黄色，上侧有淡绿色斑点。蒴果圆柱状矩圆形，常于9～10月成熟。羊踯躅为喜酸植物，耐旱不耐涝，主要分布在我国海拔1000米左右的山坡草地或丘陵地带的灌丛或山脊杂木林下。
国内对于羊踯躅组织培养的研究开始于2006年，顾宏辉等首次利用羊踯躅当年新发枝条，诱导出芽并进行增殖培养，后瓶外生根，幼苗存活率约为75％。翁明武以羊踯躅的叶片和茎段为外植体，研究了不同取材季节、消毒时间、pH值、防褐化剂对外植体生长状态的影响，以及不同生长调节剂对不同外植体诱导愈伤组织、诱导芽的影响，但各种处理得到的试验效果均不甚理想，如茎段诱导愈伤组织的诱导率仅7％，这是首次利用羊踯躅茎段来诱导愈伤组织的试验。后罗向东以羊踯躅茎尖为试材，研究了不同培养基和生长调节剂对不定芽增殖的影响，结果表明，其不定芽增殖的最佳培养条件为WPM+1.00mg/L ZT；后在1/2WPM+0.05mg/LNAA上生根，40天后生根率可达86.7％，驯化成活率达92.86％。顾地周等首次以DR为基本培养基，诱导叶片产生愈伤组织，并进行不定芽的分化和增殖，生根及驯化培养，结果表明其诱导率和生根率均可达90％以上。孙晓波等也对羊踯躅叶片直接诱导不定芽展开研究，结果显示其诱导率可达85％。杨灿娇向培养基中添加AC和干酪素对羊踯躅进行壮芽处理。
近几年，田晓玲、王亚如等对羊踯躅的组织培养也展开了一定的研究，但尚需完善并优化。例如，羊踯躅叶片在组培中出现的褐化问题，尚未提出有效的解决办法。愈伤组织的诱导多是以叶片和茎段为材料，尚未发现其他材料诱导愈伤组织的研究。腋芽萌发后进行增殖时的增殖率存在较大差异，难以重复，且增殖到生根的周期还需优化。
发明内容
1.要解决的技术问题
本发明的目的是为了解决现有技术中还没有解决的叶片褐化率过高、愈伤组织诱导途径单一的问题，而提出的羊踯躅组织培养技术体系的建立方法。
2.技术方案
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
羊踯躅组织培养技术体系的建立方法，包括以下步骤：
步骤1：外植体的消毒，以R3798叶片为外植体，用75％酒精和3％NaClO为消毒剂对其进行不同时间的消毒处理；
步骤2：防褐化剂浓度筛选，以R3798叶片为外植体，以PVP和VC为防褐化剂，探究PVP和VC对叶片褐化率的影响；
步骤3：种子萌发，以R3798种子为外植体，采用步骤1中的最佳消毒时间对种子进行消毒，将消毒后的种子接种到添加不同浓度的GA3和NAA的培养基中，始终置于光照下培养，探究基本培养基、GA3和NAA对R3798种子萌发的影响；以R3805种子为外植体，采用步骤1中的最佳消毒时间对种子进行消毒，将消毒后的种子接种到添加不同浓度的GA3的培养基中，先黑暗培养15天，再置于光照下培养，探究基本培养基、GA3对R3805种子萌发的影响
步骤4：带腋芽茎段培养，选取R3805优良单株上的幼嫩带腋芽茎段，剪去叶片，保留叶柄，剪成6cm～7cm长短的茎段备用。经消毒处理后接种在WPM培养基上，用于后期继代增殖培养；
步骤5：增殖培养，选取步骤3中R3798种子萌发后生长良好的芽和取步骤4中R3805带腋芽茎段萌发后的芽为试验材料，探究基本培养基(WPM、1/2DR、Read)、ZT(0.3、0.5、0.8mg/L)和NAA(0.3、0.5、1.0mg/L)对R3798和R3805芽增殖的影响。
步骤6：壮芽培养，选取步骤5获得的R3798和R3805长势不佳的芽或芽丛进行壮芽培养，探究基本培养基(WPM、1/2DR、Read)、ZT(0.05、0.1、0.5mg/L)、NAA(0.2、0.5、1.0mg/L)和GA3(0.2、0.5、1.0mg/L)对R3798和R3805壮芽培养的影响。
步骤7：生根培养，选取步骤6获得的R3798和R3805长势良好的芽进行生根培养，探究基本培养基(1/2Read、1/2WPM)和IAA(0.8、1.2、1.6mg/L)组合、活性炭浓度对R3798和R3805生根的影响。
步骤8：炼苗移栽，挑选步骤7中R3798和R3805茎段粗壮、叶色浓绿、茎和根系较长的小苗，经炼苗处理后将其移栽到用1000倍多菌灵消毒的基质中，并用聚乙烯塑料杯罩住幼苗；
步骤9：愈伤组织诱导，取步骤1和步骤2中生长状态较好的R3798叶片以及R3798下胚轴为试验材料，接种在含不同浓度的TDZ和NAA的1/2DR培养基上，探究TDZ和NAA对愈伤组织诱导的影响；
优选地，所述步骤1叶片消毒的最佳时间筛选中，叶片消毒前，用洗衣粉水浸泡叶片约30min，后放在自来水下冲洗1h，并用柔毛刷刷洗，再放入超净工作台中。
优选地，所述步骤1种子消毒的最佳时间筛选中，种子消毒前，用洗衣粉水浸泡种子约30min，后放在自来水下冲洗1h，再放入超净工作台中。
优选地，所述步骤2中每个处理均接种20个叶片，重复3次，以“褐化面积＞1/2叶片面积”为褐化的记录标准。
优选地，所述步骤3中不同基本培养基及生长调节剂对R3798种子萌发的影响具体包括以下步骤：以R3798种子为外植体，采用步骤1中的最佳消毒时间进行消毒，将消毒后的种子分别接种到添加不同浓度的GA3和NAA的培养基中进行萌发，始终置于光照下培养。
优选地，所述步骤3中不同基本培养基及生长调节剂对R3805种子萌发的影响具体包括以R3805种子为外植体，采用步骤1中的最佳消毒时间进行消毒，将消毒后的种子接种到添加了不同浓度GA3的培养基中，先置于黑暗中培养15天，再移至光照下培养。
优选地，所述步骤9中TDZ和NAA对叶片诱导愈伤组织的影响具体包括以下步骤：取前期试验中留下的生长状态较好的R3798叶片为材料，接种在含不同浓度的TDZ和NAA的1/2DR基本培养基上。
优选地，所述步骤9中TDZ和NAA对下胚轴诱导愈伤组织的影响具体包括以下步骤：将R3798种子经最佳的消毒处理后接种在WPM+0.8mg/L GA3的培养基中，黑暗培养45天后，将萌发的下胚轴切成长约1cm的小段，接种在含不同浓度的TDZ和NAA的1/2DR基本培养基上。
3.有益效果
相比于现有技术，本发明的优点在于：
(1)本发明中，选取了2个羊踯躅优良单株，以叶片、带腋芽茎段、种子为外植体，对羊踯躅外植体的消毒方法、防褐化方法、继代增殖，生根移栽等各方面都进行了细致的探究，提出了新的外植体消毒方法和降低叶片褐化率的方法，建立并优化了羊踯躅的快繁体系，为羊踯躅的快速繁殖和工厂化育苗提供了技术参考。
(2)本发明中，以羊踯躅叶片及下胚轴为材料诱导愈伤组织，丰富了愈伤组织的诱导途径，为羊踯躅的再生体系和遗传转化研究提供了新的参考。
附图说明
图1为本发明中不同时期叶片褐化状态的对比图；图中标尺均为1.0cm；
图2为本发明中PVP和VC对叶片褐化率的影响，图中小写字母分别表示差异0.05显著性水平，相同字母表示无显著差异；
图3为本发明中R3798种子萌发状态图，a：R3798种子；b～f：2号处理不同时期的生长状态；图中标尺均为1.0cm；
图4为本发明中R3805种子萌发状态图，a：R3805种子；b～f：3号处理组合的生长状态；图中标尺均为1.0cm；
图5为本发明中R3798芽增殖图，a～d：8号处理不同时期的生长状态；e～f：芽基部产生的大块愈伤组织；图中标尺均为1.0cm；
图6为本发明中R3805芽增殖图，a～d：8号处理的生长状态；图中标尺均为1.0cm；
图7为本发明中R3798壮芽培养图，a～d：3号处理不同时期的生长状态；图中标尺均为1.0cm；
图8为本发明中R3805壮芽培养图，a～d：3号处理组合的生长状态(a：壮芽的初始状态；b：壮芽15d后；c：壮芽30d后；d：壮芽35d后)；图中标尺均为1.0cm；
图9为本发明中R3798生根图Ⅰ，a～f：1号处理组合不同时期的生长状态；图中标尺均为1.0cm；
图10为本发明中基本培养基和IAA对R3798生根的影响图，图中小写字母表示差异0.05显著性水平，相同字母表示无显著差异；
图11为本发明中基本培养基和IAA对R3805生根的影响图，图中小写字母表示差异0.05显著性水平，相同字母表示无显著差异；
图12为本发明中AC浓度对R3798生根的影响图，图中小写字母分别表示差异0.05显著性水平，相同字母表示无显著差异；
图13为本发明中AC浓度对R3805生根的影响图，图中大小写字母分别表示差异0.05显著性水平，相同字母表示无显著差异；
图14为本发明中R3798叶片诱导愈伤组织图，a～c：5号处理不同时期的生长状态；d～f：不同状态的愈伤组织；标尺：(a～c)＝1.0cm；(d～f)＝0.5cm；
图15为本发明中R3798下胚轴诱导愈伤组织图，a～b：种子萌发；c～e：2号处理不同时期的生长状态；f：不同状态的愈伤组织；g～i：下胚轴诱导的不定芽；标尺：(a～e)＝1.0cm；(f～i)＝0.5cm；
图16为本发明中的试验材料图，a：优良单株R3798；b：优良单株R3805；
图17为本发明中基本培养基和IAA对R3798生根的影响图；
图18为本发明中AC浓度对R3798生根的影响图；
图19为本发明中基本培养基和IAA对R3805生根的影响图；
图20为本发明中AC浓度对R3805生根的影响图；
图21为本发明中R3798移栽情况图，a：移栽0天；b：移栽30天后；
图22为本发明中R3805移栽情况图，a：移栽0天；b：移栽30天后；
图23为本发明中R3798叶片诱导愈伤组织结果图；
图24为本发明中R3798下胚轴诱导愈伤组织结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1：
羊踯躅组织培养技术体系的建立方法，包括以下步骤(各试验材料的培养温度为25±2℃，如无特殊说明，光照条件均为光照16h，黑暗8h，光照强度为2000Lx)：
步骤1：外植体的消毒；包括叶片消毒的最佳时间筛选，以R3798叶片为外植体，用75％酒精和3％NaClO为消毒剂对其进行不同时间的消毒处理。叶片消毒前，用洗衣粉水浸泡约30min，并用柔毛刷刷洗，后放在自来水下冲洗1h，再放入超净工作台中。采用双因素三水平完全随机设计，先用75％酒精分别消毒20sec、30sec、40sec(消毒完之后用无菌水清洗3次)，再用3％NaClO分别消毒6min、8min、4min+4min(消毒完之后用无菌水清洗5次)，其中4min+4min为“3％NaClO浸泡4min，用无菌水清洗一次后再浸泡4min”，共9个处理组合(见表1)。消毒结束后，将叶片的边缘部分和主脉切除，使外植体大小为1cm×1cm，接种在WPM+0.8mg/L TDZ+0.2mg/L NAA的培养基上。每个处理均接种20个叶片，重复3次，以“褐化面积＞1/2叶片面积”为褐化的记录标准，30天后统计叶片的污染率、褐化率。
表1叶片消毒的最佳时间筛选试验方案
注：“4+4”为3％NaClO浸泡4min，用无菌水清洗一次后再用3％NaClO浸泡4min。
还包括种子消毒的最佳时间筛选：以R3798和R3805的种子为外植体，用75％酒精和3％(体积分数)NaClO为消毒剂对其进行不同时间的消毒处理。消毒前，先用洗衣粉水浸泡种子约30min，后放在自来水下冲洗1h，再放入超净工作台中。采用双因素三水平完全随机设计，先用75％酒精分别消毒20sec、30sec、40sec(消毒完之后用无菌水清洗3次)，再用3％NaClO分别消毒3min、5min、7min(消毒完之后用无菌水清洗5次)，共9个处理组合(见表2)。消毒结束后，将种子接种在1/2DR+1.0mg/L GA3+0.5mg/L NAA的培养基上。每个处理均接种15粒种子，重复3次，30天后分别统计种子的污染率及萌发率。
表2种子消毒的最佳时间筛选试验
步骤2：PVP和VC对叶片褐化率的影响，以R3798叶片为外植体，以PVP和VC为防褐化剂，采用双因素三水平完全随机设计，PVP的三个水平分别为0.5、1.0、1.5g/L，VC的三个水平分别为50、80、100mg/L，并设置空白对照，共10个处理组合(见表3)。采用表1中的最佳消毒时间对叶片进行消毒，将叶片切成1cm×1cm大小，并接种在WPM+0.8mg/LTDZ+0.2mg/LNAA培养基中。每个处理均接种20个叶片，重复3次，分别于30天和40天后统计叶片的褐化率。
表3PVP和VC浓度对叶片褐化率的影响试验设计
步骤3：种子萌发，具体包括以下步骤：
(1)不同基本培养基及生长调节剂对R3798种子萌发的影响：
以R3798种子为外植体，研究基本培养基、GA3、NAA对R3798种子萌发的影响，采用3因素3水平正交试验设计，基本培养基的三个水平为WPM、1/2DR、Read，GA3的三个水平为0.5、1.0、1.5mg/L，NAA的三个水平为0.2、0.5、0.8mg/L，共9个处理组合(见表4)。采用步骤1中的最佳消毒时间对种子进行消毒，将消毒后的种子分别接种到添加不同的培养基中，始终置于光照下培养。每个处理均接种15粒种子，重复3次。50天后统计种子的萌发率及生根率。
表4R3798种子萌发正交试验设计
(2)不同基本培养基及生长调节剂对R3805种子萌发的影响：
以R3805种子为外植体，研究培养基、GA3对R3805种子萌发的影响，采用双因素三水平完全随机设计，基本培养基的三个水平为WPM、1/2DR、Read，GA3的三个水平为0.5、1.0、1.5mg/L，共9个处理组合(见表5)。采用步骤1中的最佳消毒时间对种子进行消毒，将消毒后的种子接种到不同的培养基中，先置于黑暗中培养15天，再移至光照下。每个处理均接种15粒种子，重复3次，45天后统计R3805种子的萌发率及生根率。
表5R3805种子萌发试验设计
步骤4：带腋芽茎段培养，选取R3805优良单株上的幼嫩带腋芽茎段，剪去叶片，保留叶柄，剪成6cm～7cm长短的茎段备用。洗去茎段表面的灰尘后，用洗衣粉水浸泡叶片约30min，并用柔毛刷刷洗，后放在自来水下冲洗1h，再放入超净工作台中。先用75％酒精消毒30sec，无菌水清洗3次，再用0.1％升汞溶液消毒8min，无菌水清洗4～5次后，将茎段切成1cm长短，每个茎段至少保留1个腋芽，接种在WPM培养基上，用于后期继代增殖培养。
步骤5：增殖培养
选取步骤3中R3798种子萌发后生长良好的芽为试验材料，探究培养基、ZT、NAA三种因素对R3798芽增殖的影响；选取步骤4中R3805带腋芽茎段萌发后的芽为试验材料，探究培养基、ZT、NAA三种因素对R3805芽增殖的影响。均采用3因素3水平正交试验设计，基本培养基的三个水平为WPM、1/2DR、Read，ZT的三个水平为0.3、0.5、0.8mg/L，NAA的三个水平为0.3、0.5、1.0mg/L，共9个处理组合(见表6)。每个处理均接种15个芽，重复3次。40天后统计芽的增殖系数及有效率(芽高>1.0cm为有效芽)。
表6芽增殖正交试验设计
步骤6：壮芽培养
取步骤5中R3798和R3805增殖后长势较弱的丛生芽，分成独立小芽或更小块的芽丛，接种在壮芽培养基中，采用4因素3水平正交试验设计，基本培养基的三个水平为WPM、1/2DR、Read，ZT的三个水平为0.05、0.1、0.5mg/L，NAA的三个水平为0.2、0.5、1.0mg/L，GA3的三个水平为0.2、0.5、1.0mg/L，共9个处理组合(见表7)。每个处理均接种15个材料，重复3次，35天后统计芽或芽丛的增长高度及生长状态。
表7壮芽培养正交试验设计
步骤7：生根培养
(1)不同基本培养基及IAA对R3798和R3805生根的影响
挑选步骤6中R379和R3805生长良好的芽进行生根培养，采用完全随机设计，基本培养基的2个水平为1/2Read、1/2WPM，IAA的三个水平为0.8、1.2、1.6mg/L，共6个处理组合(见表8)。每个处理均接种15个芽，重复3次。45天后统计R3798和R3805的生根率、平均根数。
表8生根试验方案设计
(2)活性炭(AC)浓度对R3798和R3805生根的影响
挑选步骤6中R3798和R3805生长良好的芽进行生根试验，选用1/2Read为基本培养基，添加0.8mg/L IAA，在此基础上，采用单因素试验设计，设计3个AC浓度处理:0g/L、1.0g/L、2.0g/L。每个处理均接种15个芽，重复3次。40天后分别统计R3798和R3805的生根率及平均根数。
步骤8：炼苗移栽
挑选步骤7中R3798和R3805茎段粗壮、叶色浓绿、茎和根系较长的小苗，在组培室内拧松瓶口炼苗2～3天，再完全开盖培养1天，之后将幼苗从培养基中分离，用自来水冲洗干净残留在根上的培养基，将其移栽到用1000倍多菌灵消毒的基质中，并用聚乙烯塑料杯罩住幼苗。移栽的基质为泥炭土、珍珠岩和蛭石按2：1：1的体积比混合而成，30天后分别统计R3798和R3805幼苗的存活率。
步骤9：愈伤组织的诱导
(1)TDZ和NAA对叶片诱导愈伤组织的影响
取步骤1(叶片消毒)和步骤2(防褐化剂浓度筛选)中生长状态较好的R3798叶片为试验材料，以1/2DR为基本培养基，采用完全随机设计，TDZ的三个水平为0.6、0.8、1.0mg/L，NAA的两个水平0.3、0.5mg/L，共6个处理组合(见表9)。将叶片边缘的褐化部分切除，并接种在不同的培养基上。每个处理均接种15个叶片，重复3次。分别于30天和50天后统计愈伤组织的诱导率及生长状态。
表9诱导愈伤组织的影响试验设计
(2)TDZ和NAA对下胚轴诱导愈伤组织的影响
将R3798种子经最佳的消毒处理后接种在WPM+0.8mg/L GA3的培养基中，黑暗培养45天后，将萌发的下胚轴切成长约1cm的小段。同时以1/2DR为基本培养基，采用完全随机设计，TDZ的三个水平为0.6、0.8、1.0mg/L，NAA的两个水平为0.3、0.5mg/L，共6个处理组合(见表9)。将下胚轴小段分别接种在不同的培养基上，每个处理均接种15个材料，重复3次。30天后统计愈伤组织的诱导率及生长状态。
本发明中，选取了2个羊踯躅优良单株，以叶片、带腋芽茎段、种子为外植体，对羊踯躅外植体的消毒方法、防褐化方法、继代增殖，生根移栽等各方面都进行了细致的探究，建立了高效的羊踯躅快繁体系，完善了羊踯躅的组织培养技术体系。
本发明中，以羊踯躅叶片及种子黑暗萌发后的下胚轴为材料诱导愈伤组织，丰富了愈伤组织的诱导途径，为羊踯躅的遗传转化体系研究提供了新的参考。
实施例2：
结果与分析：
1.外植体的消毒
1.1叶片消毒的最佳时间筛选：
按照表1试验设计，以75％酒精和3％NaClO为消毒剂，对R3798叶片进行不同时间的消毒处理，污染率及褐化率结果如表10所示。
表10不同处理组合对叶片消毒的效果
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注：“4+4”为3％NaClO浸泡4min，用无菌水清洗一次后再用3％NaClO浸泡4min。表中小写字母分别表示差异0.05显著性水平，相同字母表示无显著差异。
由表10可知，不同的消毒处理对叶片的消毒效果存在差异。各处理的污染率均较低，在1.67％～33.33％之间，褐化率为26.67％～75.00％。在4号处理下，叶片的污染率最低，为1.67％，此时褐化率为35.00％。在3号处理下，叶片的褐化率最低，为26.67％，此时污染率为5.00％。
当75％酒精消毒20sec时，3％NaClO消毒4min+4min的污染率和褐化率均低于消毒8min时的污染率和褐化率。当75％酒精浸泡时间为30sec时，与3％NaClO消毒4min+4min相比，3％NaClO消毒8min的污染率较高，但褐化率较低。当75％酒精消毒40sec时，3％NaClO消毒8min和4min+4min的污染率相同，但后者的褐化率较高。当3％NaClO浸泡时间为6min时，随着75％酒精处理时间的延长，污染率和褐化率均表现为先降低后升高。当3％NaClO消毒8min时，随着75％酒精处理时间的延长，污染率先增后降，褐化率则与之相反。当3％NaClO的浸泡时间为4min+4min时，随着75％酒精处理时间的延长，污染率和褐化率总体均呈现升高的趋势。
表11 75％酒精和3％NaClO处理对污染率影响的方差分析
由表11可以看出，75％酒精处理时间对叶片污染率的影响不显著，P值大于0.05。3％NaClO浸泡时间对叶片污染率的影响有显著差异，P值为0.018，小于0.05；二者的交互作用表现为极显著，P值小于0.01。
表12 75％酒精和3％NaClO处理对褐化率影响的方差分析
从表12中可以看出，75％酒精消毒时间对叶片褐化率的影响存在极显著性差异，P值为0.001，小于0.01。3％NaClO浸泡时间对叶片褐化率的影响不显著，P值为0.065，大于0.05。二者的交互作用也存在极显著性差异，P值为0.005，小于0.01。
综合分析，叶片的最佳消毒方法为75％酒精消毒30sec和3％NaClO消毒6min的组合，此时叶片污染率最低，为1.67％，褐化率也较低，为35.00％，较适合建立羊踯躅叶片的无菌体系。
1.2种子消毒的最佳时间筛选：
1.2.1R3798种子消毒的最佳时间筛选：
以75％酒精和3％NaClO为消毒剂，对R3798种子进行不同的消毒时间处理，种子的污染率如表13所示。
由表13可以看出，不同的消毒处理对R3798种子的消毒效果不同，但各处理的污染率较低，在6.67％～37.78％之间。当75％酒精消毒时间不变时，种子的污染率随着3％NaClO浸泡时间的延长整体呈现下降的趋势。3％NaClO浸泡时间为3min和7min，75％酒精处理时间延长时，污染率逐渐降低。当3％NaClO浸泡时间为5min，75％酒精处理时间延长时，污染率先降低后升高。
表13不同处理组合对R3798种子的消毒效果
注：表中小写字母分别表示差异0.05显著性水平，相同字母表示无显著差异。。
表14 75％酒精和3％NaClO处理对R3798种子污染率影响的方差分析
由方差分析表14可以看出，3％NaClO浸泡时间对R3798种子污染率的影响存在极显著差异，P值小于0.01。75％酒精处理时间对种子污染率的影响存在显著性差异，P值为0.044，小于0.05。但二者的交互作用对种子污染率的影响不显著。
综合分析，R3798种子的最佳消毒方法为75％酒精消毒40sec、3％NaClO消毒7min，污染率最低为6.67％。
1.2.2R3805种子消毒的最佳时间筛选：
以75％酒精和3％NaClO为消毒剂，对R3805种子进行不同的消毒时间处理，种子的污染率如表15所示。
表15不同处理组合对R3805种子的消毒效果
注：表中小写字母分别表示差异0.05显著性水平，相同字母表示无显著差异。
由表15可以看出，不同的消毒处理对R3805种子的消毒效果不同，但各处理下的污染率均较低，在6.67％～35.56％之间。当75％酒精消毒时间为20sec、30sec时，3％NaClO浸泡时间越长，种子的污染率越低。当酒精消毒时间为40sec时，7号处理的污染率高于9号处理，低于8号处理，呈现先增后降的趋势。当3％NaClO浸泡时间为3min、7min时，种子的污染率随着75％酒精浸泡时间的延长而降低。当3％NaClO处理时间为5min时，污染率随着75％酒精浸泡时间的延长呈现先降低后增加。
表16 75％酒精和3％NaClO处理对R3805种子污染率影响的方差分析
由表16可以看出，75％酒精对R3805种子污染率的影响存在极显著性差异，P值小于0.01。3％NaClO浸泡时间对R3805种子污染率的影响存在显著性差异，P值为0.027，小于0.05。但二者的交互作用对种子污染率的影响不显著，P值大于0.05。总体来看，在5、6、9号处理下，种子的污染率均表现最低，仅为6.67％。为尽可能缩短消毒剂处理时间，减少消毒剂对种子的伤害，以75％酒精消毒30sec、3％NaClO消毒5min为R3805种子的最佳消毒方法。
2.防褐化剂浓度筛选
按照表3试验设计，探究不同浓度的PVP和VC对R3798叶片褐化率的影响。试验结果如图1和图2所示。由图1可以看出，刚接种时的叶片均为绿色(图1a)，接种30天后，有部分叶片已全部褐化，无绿色部分(图1b)。
由图2可以看出，不同浓度的PVP和VC组合对叶片的防褐化效果不同。在不添加防褐化剂，即空白对照(CK)的培养基中培养的叶片，其褐化率在30天和40天后分别为23.33％、35.00％。与CK组相比较，30天后仅有3个处理组的褐化率低于23.33％，分别是0.5g/L PVP+80mg/L VC、1.0g/L PVP+50mg/L VC、1.5g/L PVP+50mg/L VC，其中又以1.0g/LPVP+50mg/L VC的褐化率最低，仅为8.33％。随着接种天数的延长，叶片的褐化程度加重，褐化率升高。接种40天后，CK组的褐化率增加到35.00％，相比较而言，1.0g/L PVP+50mg/L VC处理的褐化率最低，且远低于CK组，为13.33％。
表17PVP和VC处理30天后对R3798叶片褐化率影响的方差分析
由表17可以看出，PVP对30天后的叶片褐化率影响不显著，P值为0.068，大于0.05。VC、PVP和VC的交互作用对叶片褐化率的影响均存在显著性差异，P值分别为0.016和0.035。综合而言，在以PVP和VC作为叶片组织培养的防褐化剂时，最适宜添加的浓度处理为1.0g/LPVP+50mg/L VC。
3.种子萌发：
3.1不同基本培养基及生长调节剂对R3798种子萌发的影响：
按照表4试验设计，探究基本培养基、GA3和NAA对R3798种子萌发的影响，试验结果如下。由图3可知，接种7～15天后，种子逐渐开始萌发(图3c)，接种30天后能观察到少数成形的无菌芽(图3d)，50天后全部种子萌发完毕(图3e，f)。观察发现，R3798种子萌发后总体生长状态不佳，芽矮小纤细，叶色偏黄，长势较差，且仅有少数种子有根系生成，生根率较低。
表18不同处理组合对R3798种子萌发的影响
注：表中小写字母分别表示差异0.05显著性水平，相同字母表示无显著差异。
由不同处理组合结果表18可知，各处理均能诱导R3798种子萌发，萌发率在31.11％～75.56％之间，但生根率偏低，为0.00％～13.33％，有超过一半的处理下无根系长出，诱导效果差异极大。6号处理下的萌发率最高，为75.56％，此时的生根率为0.00％。2号处理下的生根率最高，为13.33％，此时萌发率为57.78％。
表19基本培养基、GA3和NAA对R3798种子萌发率影响的方差分析
表20基本培养基、GA3和NAA对R3798种子生根率影响的方差分析
由方差分析表19可以看出，基本培养基和GA3对R3798种子萌发率的影响不显著，P值分别为0.493和0.814，均大于0.05，而NAA的对萌发率的影响存在极显著差异，P值小于0.01。由方差分析表20可以看出，基本培养基和GA3对R3798种子生根率的影响不显著，P值分别为0.097和0.225，均大于0.05。NAA对生根率的影响有着显著性差异，P值为0.026，小于0.05。
表21不同因素对R3798种子萌发的影响结果
注：表中小写字母分别表示差异0.05显著性水平，相同字母表示无显著差异。
进一步多重比较结果如表21所示，从萌发率来看，不同基本培养基处理之间无显著性差异，WPM培养基中的萌发率最高，为57.78％。GA3的不同浓度水平之间无显著性差异，浓度为0.5mg/L时萌发率最高，为55.56％。NAA的不同浓度之间均存在显著性差异，0.2mg/L处理下的萌发率最高为69.63％，显著高于0.5mg/L和0.8mg/L的处理。从生根率来看，不同基本培养基处理之间无显著性差异，1/2DR培养基中的生根率最高，为5.19％。GA3的不同浓度水平之间无显著性差异，浓度为1.0mg/L时生根率最高，为4.44％。0.5mg/L NAA处理下的生根率最高为5.93％，显著高于0.2mg/L的1.48％和0.8mg/L的0.00％。
综合萌发率和生根率而言，基本培养基和GA3对R3798种子萌发过程的影响不显著，且NAA浓度对R3798种子萌发的影响是显著的，且NAA的浓度不宜过高，否则不利于种子的萌发。同时，结合各处理下种子的生长状态来看，为获得较多的、长势较好的无菌材料，选用2号处理，即WPM+1.0mg/L GA3+0.5mg/L NAA作为R3798种子萌发的最佳处理组合。
3.2不同基本培养基及生长调节剂对R3805种子萌发的影响
按照表5试验设计，探究基本培养基和GA3对R3805种子萌发的影响，试验结果如下。由图4可知，接种20天后，R3805种子萌发，胚根突破种皮开始伸长(图4c)。接种30天后，子叶逐渐展开，移至光照下培养后，逐渐长出真叶(图4d)。45天后萌发率不变，再无增加，叶片逐渐增大(图4e，f)。与R3798种子相比，R3805种子萌发后的叶片大，叶色翠绿，生长良好。
表22基本培养基和GA3对R3805种子萌发的影响
注：表中小写字母分别表示差异0.05显著性水平，相同字母表示无显著差异。
由表22可以看出，各处理组合均能诱导R3805种子萌发。在相同GA3浓度下，WPM培养基中萌发率和生根率均高于其他2种基本培养基。而在相同的基本培养基中，不同GA3浓度处理下的萌发率和生根率增减趋势不一。R3805种子的萌发率在3号处理(WPM+1.5mg/LGA3)下最高，为60.00％，此时生根率也最高，为55.56％。在3号处理(Read+1.0mg/L GA3)下种子的萌发率最低，仅11.11％，此时生根率为11.11％，即在此处理组合下已萌发的种子，皆全部生根。并且，在相同处理组合下，R3805种子的萌发率和生根率相差不大，即已萌发的种子大部分都已生根。结合种子萌发后的生长状态来看，根系正常生长的幼苗，其叶色、叶形、叶的大小、茎的粗细等状态都较好，生长更健壮。
表23基本培养基和GA3对R3805种子萌发率影响的方差分析
由表23可知，基本培养基、基本培养基和GA3的交互作用对R3805种子萌发率的影响均存在极显著性差异，P值分别为0.007和0.003，均小于0.01。GA3对R3805种子萌发率的影响存在显著性差异，P值小于0.05。结合表22可知，WPM培养基中种子的萌发率总体高于Read、1/2DR培养基。因此，R3805种子萌发时宜选用WPM为基本培养基。
表24基本培养基和GA3对R3805种子生根率影响的方差分析
由表24可知，基本培养基对R3805种子生根率的影响存在极显著性差异，P值为0.008，小于0.01。而GA3、基本培养基和GA3的交互作用对R3805种子生根率的影响无显著性差异，P值分别为0.144、0.060，均大于0.05。结合表22可知，WPM培养基中种子的生根率总体高于Read、1/2DR培养基。再次证明，R3805种子萌发时宜选用WPM为基本培养基。综合萌发率、生根率而言，最适合R3805种子的萌发的基本培养基为WPM+1.5mg/L GA3。
4.芽增殖培养：
4.1不同基本培养基及生长调节剂对R3798芽增殖的影响：
选用步骤3中R3798种子萌发后的长势良好的芽为试验材料，按照表6正交试验设计，探究基本培养基、ZT、NAA对R3798芽增殖的影响，试验结果如下。由图5可知，在继代时需将芽基部的褐色部分切除干净，如茎基部有大块愈伤组织，也应进行切除，继代时只可保留少量的愈伤组织，否则会影响后续的增殖培养(图5a)。增殖15天后，芽丛基部开始有不成形小芽产生(图5b)。增殖30天后，芽丛基部产生的新芽数量增多(图5c)。增殖40天后，丛生芽长势更健壮(图5d)。有部分芽丛基部长出大块的、质地紧密且坚硬的红色愈伤组织(图5e，f)，这部分芽丛增殖的新芽较少，且叶色偏黄，长势较差。总体来看，各处理诱导出的丛生芽叶色偏黄色或黄绿色，有效芽多，长势较好。
表25不同处理组合对R3798芽增殖的影响
注：表中小写字母分别表示差异0.05显著性水平，相同字母表示无显著差异。
由不同处理组合结果表25可知，各个处理均能诱导R3798芽增殖。其中，3号处理(WPM+0.8mg/L ZT+1.0mg/L NAA)的增殖系数最低，仅为2.49，且长势较弱，此时有效芽率仅为48.33％。8号处理(Read+0.5mg/L ZT+0.3mg/L NAA)的增殖系数最高，为4.44，长势较好，此时有效芽率也最高，为80.00％。仔细观察发现，增殖系数较高的处理组合中，有效芽率也较高，芽的长势也较好。
表26基本培养基、ZT和NAA对R3798增殖系数影响的方差分析
由表26可以看出，基本培养基、ZT、NAA对R3798芽增殖系数均存在极显著差异，P值分别为0.000、0.003和0.000，均小于0.01。
表27基本培养基、ZT和NAA对R3798有效芽率影响的方差分析
由表27可以看出，ZT、NAA对R3798有效芽率的影响均存在极显著差异，P值分别为0.000和0.006，均小于0.01。而基本培养基对R3798有效芽率的影响无显著差异。
表28不同因素对R3798芽增殖的影响结果
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注：表中小写字母分别表示差异0.05显著性水平，相同字母表示无显著差异。
进一步多重比较结果如表28所示，从R3798芽的增殖系数来看，Read培养基中的增殖系数最高为3.78，显著高于WPM培养基的3.01和1/2DR培养基的2.67，WPM培养基和1/2DR培养基之间无显著性差异。0.5mg/L ZT处理下的增殖系数最高为3.58，显著高于0.3mg/L的2.64，与0.8mg/L之间无显著性差异。0.5mg/L NAA处理下的增殖系数最高为3.61，显著高于1.0mg/L的2.50，与0.3mg/LNAA之间无显著性差异。从R3798的有效芽率来看，不同基本培养基处理之间无显著性差异，Read培养基中的有效芽率最高，为65.78％。ZT浓度为0.5mg/L时有效芽率最高为74.44％，显著高于0.3mg/L的54.00％和0.8mg/L的60.00％。NAA的不同浓度之间无显著性差异，0.5mg/L处理下的有效芽率最高为67.33％。
综合R3798芽的增殖系数和有效芽率而言，最适合R3798芽增殖的培养基为Read+0.5mg/L ZT+0.3mg/L NAA，在40d的继代培养后，其增殖系数可达4.44，有效芽率为80.00％。
4.2不同基本培养基及生长调节剂对R3805芽增殖的影响：
取步骤4中R3805带腋芽茎段萌发后的芽为试验材料，按照表6正交试验设计，探究基本培养基、ZT、NAA对R3805芽增殖的影响，试验结果如下。由图6可知，在继代时，仍需将芽基部的褐色部分及大块愈伤组织切除(图6a)。增殖15天后，芽丛基部开始产生芽点，有不成形小芽产生(图6b)。增殖30天后，芽的数量持续增多，且叶色总体为绿色，长势好(图6c)。增殖40天后，丛生芽的数量更多，长势较好(图6d)。总体来看，各处理诱导出的丛生芽叶色偏绿，有效芽多，总体长势较好。
表29不同处理组合对R3805芽增殖的影响
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注：表中小写字母分别表示差异0.05显著性水平，相同字母表示无显著差异。
由不同处理组合结果表29可知，不同的基本培养基和生长调节剂组合均能诱导R3805芽发生增殖。其中，4号处理(1/2DR+0.3mg/L ZT+0.5mg/L NAA)的芽增殖系数最低，仅为1.58，且芽的长势一般，此时有效芽率也最低，仅为54.67％。8号处理(Read+0.5mg/L ZT+0.3mg/L NAA)的芽增殖系数最高为3.89，长势较好，此时有效芽率也最高，为80.00％。仔细观察发现，增殖系数较高的处理组合中，有效芽率也较高，芽的长势也较好。
表30基本培养基、ZT和NAA处理对R3805增殖系数影响的方差分析
由表30可以看出，基本培养基、ZT对R3805芽增殖系数的影响均存在极显著性差异，P值分别为0.005、0.001，均小于0.01。NAA对R3805芽增殖系数的影响存在显著性差异，P值为0.037，小于0.05。
表31基本培养基、ZT和NAA处理对R3805有效芽率影响的方差分析
由表31可以看出，基本培养基对R3805有效芽率的影响存在显著性差异，P值为0.034，小于0.05。ZT、NAA对R3805有效芽率的影响均存在极显著性差异，P值分别为0.006和0.003，均小于0.01。
表32不同因素对R3805芽增殖的影响结果
注：表中小写字母分别表示差异0.05显著性水平，相同字母表示无显著差异。
进一步多重比较结果如表32所示，从增殖系数来看，Read培养基中的增殖系数最高为3.24，显著高于WPM培养基的2.95和1/2DR培养基的2.17。ZT浓度为0.8mg/L时的增殖系数最高为3.27，显著高于0.3mg/L的2.05，与0.5mg/L处理之间无显著性差异。NAA的不同浓度之间无显著性差异，0.3mg/L处理的增殖系数最高为3.14。从有效芽率来看，不同基本培养基处理之间无显著性差异，Read培养基中的有效芽率最高，为71.89％。ZT浓度为0.5mg/L时有效芽率最高为71.00％，显著高于0.3mg/L的59.11％，与0.8mg/L处理之间无显著性差异。0.3mg/L NAA处理下的有效芽率最高为72.22％，显著高于1.0mg/L处理下的58.78％，与0.5mg/L处理之间无显著性差异。
综合而言，最适合R3805芽增殖的基本培养基为Read+0.5mg/L ZT+0.3mg/L NAA，在40天的增殖培养后，其增殖系数可达3.89，有效芽率为80.00％。
5.壮芽培养：
5.1不同基本培养基及生长调节剂对R3798壮芽培养的影响：
按照表7试验设计，以步骤5中R3798增殖后的芽为试验材料，探究基本培养基、ZT、NAA和GA3对R3798壮芽的影响，试验结果如下。在壮芽培养开始时，需将过密的芽丛分离，切除基部愈伤，分成独立小芽或更小块的芽丛(图7a)。15天后，叶片增大，叶色逐渐变绿(图7b)。30天后，芽或芽丛增高较明显(图7c)。35天后，芽的长势更好，并有少量的芽增殖(图7d)。
表33不同处理组合对R3798壮芽培养的影响
注：表中小写字母分别表示差异0.05显著性水平，相同字母表示无显著差异。
由表33可知，不同的基本培养基和生长调节剂组合对R3798的壮芽效果存在显著性差异，各种处理组合均能促进芽或芽丛增高，增长高度为0.2cm～1.3cm。总体而言，WPM培养基中芽的长势较好，平均增长高度均大于1/2DR和Read培养基。3号处理(WPM+0.5mg/L ZT+1.0mg/L NAA+1.0mg/L GA3)的壮芽效果最好，平均增长高度可达0.56cm，且芽的长势良好，并有少量丛生芽增殖。
表34基本培养基、ZT和NAA处理对R3798壮芽效果影响的方差分析
由方差分析表34可知，基本培养基对R3798壮芽效果存在极显著差异，P值小于0.01。GA3对R3798壮芽效果存在显著差异，P值为0.045。ZT和NAA对壮芽效果无显著性差异。
表35不同因素对R3798壮芽的影响结果
注：表中小写字母分别表示差异0.05显著性水平，相同字母表示无显著差异。
进一步多重比较结果如表35所示，WPM培养基处理下的增长高度最大为0.50cm，显著高于1/2DR培养基的0.35cm和Read培养基的0.38cm。ZT的不同浓度水平之间无显著性差异，浓度为0.5mg/L时的增长高度最大为0.44cm。NAA的不同浓度水平之间无显著性差异，0.5mg/L处理下的增长高度最大为0.43cm。GA3的不同浓度水平之间无显著性差异，1.0mg/L处理下的增长高度最大为0.45cm。
综合而言，最适合R3798壮芽的基本培养基为WPM+0.5mg/L ZT+1.0mg/L NAA+1.0mg/L GA3，平均增长高度为0.56cm。
5.2不同培养基及生长调节剂对R3805壮芽培养的影响：
按照表7试验设计，以步骤5中R3805增殖后的芽为试验材料，探究基本培养基、ZT、NAA和GA3对R3805壮芽的影响，试验结果如下。R3805壮芽培养过程如图8所示。
表36不同处理组合对R3805壮芽培养的影响
注：表中小写字母分别表示差异0.05显著性水平，相同字母表示无显著差异。
由不同处理组合结果表36可知，不同的基本培养基和生长调节剂组合对R3805的壮芽效果存在显著性差异，各种处理组合对壮芽有一定的促进作用，增长高度为0.2cm～1.3cm。与1/2DR和Read培养基相比较，WPM培养基中的壮芽效果较好，增高明显，长势较好。其中，3号处理(WPM+0.5mg/L ZT+1.0mg/L NAA+1.0mg/L GA3)的壮芽效果最好，平均增长高度可达0.52cm，增高较明显且长势良好，并有少量丛生芽增殖。
表37基本培养基、ZT、NAA和GA3处理对R3805壮芽影响的方差分析
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由表37可知，ZT对R3805的壮芽效果存在极显著性差异，P值为0.001，小于0.01。GA3对R3805的壮芽效果存在显著性差异，P值为0.045，小于0.05。基本培养基、NAA对壮芽效果无显著性差异。
表38不同因素对R3805壮芽的影响结果
注：表中小写字母分别表示差异0.05显著性水平，相同字母表示无显著差异。
进一步多重比较结果如表38所示，不同的基本培养基处理之间无显著性差异，WPM培养基处理下的增长高度最大为0.40cm，1/2DR培养基和Read培养基的增长高度均为0.36cm。ZT浓度为0.5mg/L时的增长高度最大为0.44cm，显著高于0.05mg/L处理下的0.33cm和0.1mg/L处理下的0.34cm。NAA的不同浓度水平之间无显著性差异，1.0mg/L处理下的增长高度最大为0.40cm。GA3的不同浓度水平之间无显著性差异，浓度为1.0mg/L时的增长高度最大，为0.40cm。综上所述，最适宜R3805壮芽的基本培养基为WPM+0.5mg/L ZT+1.0mg/LNAA+1.0mg/L GA3，平均增长高度为0.52cm。
在羊踯躅的快速增殖和壮芽培养探索中，首先是对前期的无菌芽进行增殖培养，在40天的周期内，R3798的增殖系数可达4.44，R3805的增殖系数最高为3.89，且芽的长势均较好，实现了短期内获得大量丛生芽的目标。其次，在壮芽培养时，添加GA3使芽或芽丛增高、长势健壮，结果表明R3798在35天的周期内可以增高0.56cm，R3805在35天的周期内可以增高0.52cm，长势也逐渐变好。
6.生根培养：
6.1基本培养基和IAA对生根的影响：
6.1.1基本培养基和IAA对R3798生根的影响
按照表8试验设计，取步骤6中生长良好的R3798无菌芽为试验材料，探究基本培养基和IAA对R3798生根的影响，试验结果如下。
由图9可知，在生根处理时，需将芽基部的褐色部分或愈伤组织切除干净，再插入培养基中(图9a)。15天后，叶片开始变黄，茎逐渐木质化(图9b)。30天后，茎的木质化程度加重，基部逐渐生根(图9c)。45天后，芽基部产生多条根系，但叶色偏黄(图9d)，根系状态见图9e～f。各处理中已生根的幼苗总体长势较好，但叶色偏黄色，有少量新叶产生(图17)。
由图10可知，试验中的每个处理组合均能在不同程度上诱导R3798生根，生根率为26.67％～68.89％，平均根数为2.38～3.59条。从培养基来看，1/2WPM培养基处理下的生根率高于1/2Read培养基，但平均根数的差异不大。从IAA的浓度变化来看，IAA浓度越高，生根率越低，平均根数也越少。在1/2Read+0.8mg/L IAA处理下，R3798的生根率最高，为68.89％，平均根数也最多，为3.77条。
表39基本培养基和IAA处理对R3798生根率影响的方差分析
由表39可知，IAA对R3798生根率的影响存在极显著性差异。基本培养基对生根率的影响存在显著性差异，P值为0.038。基本培养基和IAA的交互作用不显著。
表40基本培养基和IAA处理对R3798平均根数影响的方差分析
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由表40可知，IAA对R3798平均根数的影响存在显著性差异，P值为0.014，但基本培养基、基本培养基和IAA的交互作用对平均根数的影响均无显著性差异。
结合生根率和平均根数而言，最适合R3798生根的培养基为1/2Read+0.8mg/LIAA，生根率可达68.89％，平均根数为3.77条。
6.1.2基本培养基和IAA对R3805生根的影响
按照表8试验设计，取步骤6中生长良好的R3805小芽为试验材料，探究基本培养基和IAA对R3805生根的影响，试验结果如下。其中，各处理的生根状态见图19。由图11可知，试验中的每个处理组合均能在不同程度上诱导生根，但生根效果较差，生根率为4.44～26.67％，平均根数为0.6条～3.06条。从基本培养基来看，1/2Read和1/2WPM培养基处理下的生根率和平均根数的差异不大。从IAA的浓度变化来看，IAA浓度越高，生根率越高，平均根数也越多。1/2Read+1.6mg/L IAA处理下，R3805的生根率最高，为26.67％，平均生根数为2.65条。在1/2WPM+1.6mg/L IAA处理下，平均根数最多，为3.06条，此时生根率为24.44％。
表41基本培养基和IAA处理对R3805生根率影响的方差分析
由表41可知，IAA对R3805生根率的影响存在极显著性差异，P值为0.001，小于0.01。而基本培养基、基本培养基和IAA的交互作用对生根率的影响均无显著性差异。
表42基本培养基和IAA处理对R3805平均生根数影响的方差分析
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由表42可知，IAA对R3805平均根数的影响存在极显著性差异，P值为0.002，小于0.01。而基本培养基、基本培养基和IAA的交互作用对平均根数的影响均无显著性差异。
结合生根率和平均根数而言，适合R3805生根的培养基为1/2Read+1.6mg/LIAA，生根率为26.67％，平均根数也较多，为2.65条。
6.2AC浓度对羊踯躅生根的影响：
6.2.1AC浓度对R3798生根的影响
取步骤6中生长良好的R3798小芽为试验材料，探究活性炭(AC)浓度对R3798生根的影响，试验结果如下。各处理的生根状态见图18。由图12可知，不同浓度的AC处理均能诱导R3798生根，但生根率和平均根数有所差异。培养基中未添加AC时，生根率为66.67％，平均根数为3.76条。添加AC后，生根率和平均根数都有所增加，且AC浓度越高，生根率也越高，平均根数也越多。当AC浓度为2.0g/L时，生根率最高，为93.33％，平均根数也最多，为5.01条。可以看出，添加AC有利于提高生根率和增加平均根数。
表43AC浓度处理对R3798生根率影响的方差分析
表44AC浓度处理对R3798平均根数影响的方差分析
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由表43和表44可知，AC浓度对R3798的生根率和平均根数的影响均存在显著性差异，P值为0.036和0.048。
总的来说，最适合R3798生根的AC浓度为2.0g/L，生根率最高为93.33％，平均根数最多为5.01条。
6.2.2AC浓度对R3805生根的影响
取步骤6中生长良好的R3805小芽为试验材料，探究活性炭(AC)浓度对R3805生根的影响，各处理结果如下。各处理的生根状态见图20。由图13可知，不同浓度的AC处理均能诱导R3805生根，但生根率和平均根数有所差异。与R3798相比，R3805的生根率较低，平均根数也较少。当培养基中未添加AC时，生根率为6.67％，平均根数仅1条。添加AC后，生根率和平均根数都有所增加。当AC浓度为2.0g/L时，生根率最高，为42.22％，平均根数也最多，为4.59条。因此，添加AC有利于提高R3805的生根率和平均根数。
表45AC浓度处理对R3805生根率影响的方差分析
表46AC浓度处理对R3805平均根数影响的方差分析
由表45和表46可知，AC浓度对R3805的生根率和平均根数的影响均存在显著性差异，P值为0.030和0.027，表明AC浓度对R3805生根的影响具有研究意义。总的来说，最适合R3805生根的AC浓度为2.0g/L，此时生根率最高，为42.22％，平均根数也最多，为4.59条。综上所述，在羊踯躅的生根试验中，可添加AC促进生根，且最适合添加的AC浓度为2.0g/L，对提高生根率及平均根数有较大的促进作用。
7.炼苗移栽：
将生根成功的R3798和R3805幼苗经炼苗处理后移栽到泥炭土：珍珠岩：蛭石＝2：1：1的基质中，移栽30天后，R3798和R3805幼苗的移栽成活率分别为90.48％和86.21％，生长状态见图21和图22。
8..愈伤组织诱导：
8.1叶片诱导愈伤组织：
按照表9试验设计，选取前期R3798叶片消毒(步骤1)和褐化处理(步骤2)中生长状态较好的叶片为试验材料，筛选最适合叶片诱导愈伤组织的TDZ和NAA浓度，试验结果如下。由图14可以看出，接种时，需切除叶片边缘已褐化的部分(图14a)。接种20天后，叶片开始皱缩弯曲，部分组织脱离培养基，切口处出现明显褐色(图14b)。接种50天后，部分叶片成功诱导愈伤组织，但叶片褐色面积增大，且愈伤组织总体状态不佳，褐化较严重，颜色偏褐色，呈颗粒状(图14c～f)。各处理诱导的愈伤组织状态见图23。
从表47的各项数据可以看出，试验中的6个处理组合均能在不同程度上诱导叶片产生愈伤组织。处理时间从30天延长到50天时，愈伤组织的诱导率大部分都有所增加，但增幅较小。NAA浓度为0.3mg/L时，TDZ浓度升高时，愈伤组织的诱导率逐渐升高，TDZ浓度为1.0mg/L时，愈伤组织的诱导率最高。NAA浓度为0.5mg/L时，TDZ浓度升高时，愈伤组织的诱导率先降低后升高。由此可见，高浓度的TDZ可能更有利于叶片诱导愈伤组织。
表47TDZ、NAA对R3798叶片诱导愈伤组织的影响
注：表中小写字母分别表示差异0.05显著性水平，相同字母表示无显著差异。
表48TDZ和NAA对愈伤组织诱导率影响的方差分析(30天)
由表48可知，TDZ对30天后愈伤组织诱导率的影响存在显著性差异，P值为0.032。而NAA、TDZ和NAA二者的交互作用不显著。
综合30天和50天的各处理结果而言，R3798叶片在5号处理(1/2DR+1.0mg/L TDZ+0.3mg/L NAA)中的愈伤组织诱导率最高，分别为40.00％、46.67％。
8.2下胚轴诱导愈伤组织：
将R3798种子置于黑暗条件下培养45天(图15a，b)，取萌发的下胚轴为材料，按照表9试验设计，向1/2DR培养基中添加不同浓度的TDZ和NAA，探究下胚轴诱导愈伤组织的最佳生长调节剂配比，试验结果如下。由图15可知，接种7天后，下胚轴逐渐膨大。接种15天后，切口处开始出现少量愈伤组织(图15d)。接种30天后，大部分胚轴均成功诱导愈伤组织，愈伤组织总体长势较好，颜色白色或黄白色(图15e，f)，并且在部分处理下的下胚轴还直接诱导出了不定芽(图15g～i)。各处理诱导的愈伤组织状态见图24。
表49不同处理组合对R3798下胚轴诱导愈伤组织的影响
注：表中小写字母分别表示差异0.05显著性水平，相同字母表示无显著差异。
从表49的各项数据可以看出，R3798下胚轴在不同处理下均能诱导出愈伤组织，各处理的诱导率较高，远大于叶片的愈伤诱导率。其中，2号处理(0.6mg/L TDZ+0.5mg/L NAA)的愈伤组织诱导率最高，为95.56％，6号处理(1.0mg/L TDZ+0.5mg/L NAA)的愈伤组织诱导率最低，为42.22％。
表50TDZ和NAA处理对愈伤组织诱导率影响的方差分析
由表50可以看出，TDZ对下胚轴诱导愈伤组织的影响存在显著性差异，P值为0.022。NAA、TDZ和NAA二者的交互作用不显著。综合而言，R3798下胚轴诱导愈伤组织的最佳处理为1/2DR+0.6mg/L TDZ+0.5mg/L NAA，诱导率最高为95.56％。
以叶片和下胚轴为材料诱导愈伤组织的结果表明，在相同处理下，下胚轴的诱导率更高，且愈伤组织的长势更好。本研究建立了新的诱导愈伤组织的途径，对羊踯躅的再生体系和遗传转化研究有贡献意义。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.羊踯躅组织培养技术体系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：外植体的消毒，包括叶片消毒的最佳时间筛选，以R3798叶片为外植体，用75％酒精和3％NaClO为消毒剂对其进行不同时间的消毒处理，筛选最佳消毒时间；叶片消毒前，用洗衣粉水浸泡约30min，并用柔毛刷刷洗，后放在自来水下冲洗1h，再放入超净工作台中；采用双因素三水平完全随机设计，先用75％酒精分别消毒20sec、30sec、40sec(消毒完之后用无菌水清洗3次)，再用3％NaClO分别消毒6min、8min、4min+4min(消毒完之后用无菌水清洗5次)，其中4min+4min为“3％NaClO浸泡4min，用无菌水清洗一次后再浸泡4min”，共9个处理组合；消毒结束后，将叶片的边缘部分和主脉切除，使外植体大小为1cm×1cm，接种在WPM+0.8mg/LTDZ+0.2mg/LNAA的培养基上，每个处理均接种20个叶片，重复3次；
步骤2：防褐化剂浓度筛选，以R3798叶片为外植体，添加不同浓度的PVP和VC为防褐化剂，探究PVP和VC对叶片褐化率的影响；
步骤3：种子萌发，包括不同基本培养基及生长调节剂对R3798种子、R3805种子萌发的影响；
步骤4：带腋芽茎段培养，选取R3805当年生枝条，剪去叶片，保留叶柄，剪成6～7cm长短的茎段，经消毒处理后接种在WPM培养基上，用于后期继代增殖培养；
步骤5：增殖培养，选取步骤3中R3798种子萌发后生长良好的芽和步骤4中R3805带腋芽茎段萌发后的芽为材料，进行增殖培养，探究不同基本培养基及生长调节剂对R3798和R3805芽增殖的影响；
步骤6：壮芽培养，选取步骤5获得的R3798和R3805长势不佳的芽或芽丛进行壮芽培养，探究不同基本培养基及生长调节剂对R3798和R3805壮芽培养的影响；
步骤7：生根培养，选取步骤6获得的R3798和R3805长势良好的芽进行生根培养，探究不同基本培养基和IAA、活性炭对R3798和R3805生根的影响；
步骤8：炼苗移栽，挑选步骤7中R3798和R3805茎段粗壮、叶色浓绿、茎和根系较长的小苗，经炼苗处理后进行移栽；
步骤9：愈伤组织的诱导，包括TDZ和NAA对R3798叶片、R3798下胚轴诱导愈伤组织的影响。
2.根据权利要求1所述的羊踯躅组织培养技术体系的建立方法，其特征在于，所述步骤1叶片消毒的最佳时间筛选中，叶片消毒前，用洗衣粉水浸泡叶片约30min，后放在自来水下冲洗1h，并用柔毛刷刷洗，再放入超净工作台中。
3.根据权利要求1所述的羊踯躅组织培养技术体系的建立方法，其特征在于，所述步骤1种子消毒的最佳时间筛选中，种子消毒前，用洗衣粉水浸泡种子约30min，后放在自来水下冲洗1h，再放入超净工作台中。
4.根据权利要求1所述的羊踯躅组织培养技术体系的建立方法，其特征在于，所述步骤2中每个处理20个叶片，重复3次，以“褐化面积＞1/2叶片面积”为褐化的记录标准。
5.根据权利要求1所述的羊踯躅组织培养技术体系的建立方法，其特征在于，所述步骤3中不同基本培养基及生长调节剂对R3798种子萌发的影响具体包括以下步骤：以R3798种子为外植体，采用步骤1中的最佳消毒时间对种子进行消毒，将消毒后的种子分别接种到添加不同浓度的GA3和NAA的培养基中进行萌发，始终置于光照下培养。
6.根据权利要求1所述的羊踯躅组织培养技术体系的建立方法，其特征在于，所述步骤3中不同基本培养基及生长调节剂对R3805种子萌发的影响具体包括以下步骤：以R3805种子为外植体，采用步骤1中的最佳消毒时间对种子进行消毒，将消毒后的种子接种到添加不同浓度GA3的培养基中，先置于黑暗中培养15天，再移至光照下培养。
7.根据权利要求1所述的羊踯躅组织培养技术体系的建立方法，其特征在于，所述步骤9中TDZ和NAA对叶片诱导愈伤组织的影响具体包括以下步骤：取前期试验中留下的生长状态较好的R3798叶片为材料，接种在含不同浓度的TDZ和NAA的1/2DR基本培养基上，每个处理均接种15个叶片，重复3次，分别于30天和50天后统计愈伤组织的诱导率及生长状态。
8.根据权利要求1所述的羊踯躅组织培养技术体系的建立方法，其特征在于，所述步骤9中TDZ和NAA对下胚轴诱导愈伤组织的影响具体包括以下步骤：将R3798种子经最佳的消毒处理后接种在WPM+0.8mg/LGA3的培养基中，黑暗培养45天后，将萌发的下胚轴切成长约1cm的小段，接种在含不同浓度的TDZ和NAA的1/2DR基本培养基上。
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| CN202310718196.7A Pending CN116649214A (zh) | 2023-06-16 | 2023-06-16 | 羊踯躅组织培养技术体系的建立方法 |
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2023
- 2023-06-16 CN CN202310718196.7A patent/CN116649214A/zh active Pending
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