CN107164250B - 一种增强果酒芳香的酿造方法 - Google Patents

一种增强果酒芳香的酿造方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种增强果酒芳香的酿造方法,属于工业微生物技术领域。本发明所用的高产β‑苯乙醇酿酒酵母菌株,于2016年12月16日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M 2016785。利用安琪葡萄酒酿酒酵母、CCTCC NO:M 2016785酿酒酵母及CCTCC NO:M 2016785冻干粉发酵结束的成品果酒,β‑苯乙醇含量分别为61mg/L、350mg/L、325mg/L,此外利用所述菌株发酵的复合果酒β‑苯乙醇含量最高达370mg/L。本发明的方法明显提高发酵果酒中β‑苯乙醇含量,改善果酒风味品质,因此具有广泛的应用前景。

Description

一种增强果酒芳香的酿造方法
技术领域
本发明涉及一种增强果酒芳香的酿造方法,属于工业微生物技术领域。
背景技术
以新鲜水果和果汁为原料,经酵母菌发酵酿制而成的含酒精饮料称为果酒。酵母发酵过程主要产生的物质有:乙醇、CO2、甘油(g/L);高级醇、有机酸、短链脂肪酸、脂类、醛类、SO2(mg/L);H2S、双乙酰(μg/L)。各种因素如酵母种类、水果品种、原料成熟度、酿造工艺、陈酿条件等均对果酒最终的风味品质产生影响,而酿酒酵母是果酒发酵产生风味的重要来源,也是影响果酒品质的重要因素。
β-苯乙醇是一种具有玫瑰风味的芳香醇,天然存在于茉莉、玫瑰等植物精油中,同时作为一种重要的香精香料成分,在化妆品、烟草及日化用品中也广泛应用。β-苯乙醇由微生物代谢产生,酿酒酵母在发酵过程中通过艾利希途径和其他代谢途径产生β-苯乙醇,作为发酵酒产品中特征的风味物质,可以提高发酵产品风味和整体品质。虽然在葡萄酒中β-苯乙醇含量可以达到60mg/L左右,但是对于玫瑰芳香性果酒的特征开发,有待于进一步提高β-苯乙醇含量,所以有必要筛选具有优良性能的酵母。
虽然目前已有能够显著提高微生物产β-苯乙醇能力的措施,但是绝大多数都需要外源添加L-苯丙氨酸等前体化合物。目前有多个具有产生一定浓度β-苯乙醇的酿酒酵母应用于酿造食品的报道,但是菌株是否具有较高的酒精生产能力尚不清楚。由于β-苯乙醇对酵母的胁迫能力显著高于乙醇,高产β-苯乙醇的酿酒酵母产乙醇的能力通常会有降低,所以已有高产β-苯乙醇的酿酒酵母的酒精生产能力较低。因此在不外源添加前体化合物情况下,能够高产β-苯乙醇和乙醇的酿酒酵母在酿造工业中具有较高应用价值。
发明内容
针对目前普通酿酒酵母的不足,筛选出的一株高产β-苯乙醇酿酒酵母菌株,于2016年12月16日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCCM 2016785。该菌株具有高产β-苯乙醇能力和高产风味物质乙酸-2-苯乙酯的能力,且发酵性能良好,能够明显提高发酵产品中β-苯乙醇含量,改善发酵产品品质,具有广泛的应用前景。同时,为了增强果酒中的芳香成分,尤其是玫瑰芳香,本发明将筛选得到的这株酿酒酵母菌株用于传统的酿造工艺酿造芳香的果酒。
本发明的第一个目的是提供一株高产β-苯乙醇的酿酒酵母菌株(Saccharomycescerevisiae),于2016年12月26日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏地址为中国武汉武汉大学,保藏编号为CCTCC NO:M 2016785。
所述酿酒酵母菌株是从黄酒醪液筛选出的酿酒酵母作为出发菌株,经紫外诱变后进行对氟苯丙氨酸抗性筛选,然后筛选长势良好的菌株接种在含有10%乙醇的YPD液体培养基中,进行酒精耐受性筛选以及黄酒模拟液发酵筛选,得到的β-苯乙醇产量相对较高的菌株作为常温等压等离子诱变出发菌株,第二次诱变后菌株进行对氟苯丙氨酸抗性筛选,以及发酵特性筛选,得到高产β-苯乙醇酿酒酵母。
本发明的酿酒酵母,具有如下特性:
应用于果酒(葡萄酒、苹果酒、桑葚酒、山楂酒、杨梅酒、樱莓酒)发酵体系,纯种发酵所得果酒中β-苯乙醇含量可达350mg/L,乙酸-2-苯乙酯含量为50μg/L,酒精度12.8度。
本发明的第二个目的是提供一种增强果酒芳香的方法,尤其是增强果酒玫瑰芳香的方法,所述方法是利用本发明的酿酒酵母CCTCC NO:M 2016785作为发酵菌株。
在一种实施方式中,所述酿酒酵母为CCTCC NO:M 2016785菌株冻干粉。
在一种实施方式中,所述方法,是将冷冻干燥得到的酿酒酵母CCTCC NO:M2016785干菌体按2‰添加量添加到果汁中。
在一种实施方式中,所述果酒是以葡萄汁、苹果汁、桑葚汁、山楂酒、杨梅汁、樱莓汁中的一种或者两种以上按一定比例混合发酵得到的。
在一种实施方式中,所述果酒为葡萄酒、苹果酒、桑葚酒、山楂酒、杨梅酒、樱莓酒等。
在一种实施方式中,所述方法包括如下步骤:
(1)清洗果实原料,进行破碎与压榨,分离得到果汁;
(2)补加白砂糖,搅拌均匀;
(3)流加焦亚硫酸钾160mg/L,果胶酶100mg/L,入罐搅拌均匀;
(4)将酿酒酵母CCTCC M 2016785进行种子液活化,50g/L白砂糖水的作为活化液,在38℃下活化30min-60min;或者取2‰CCTCC NO:M 2016785冻干粉,在38℃下搅拌30min-60min让干菌体充分吸水,得到菌液;
(5)将上一步活化好的种子液或者冻干粉的菌液接种入发酵罐中,进行前发酵;接种后,控温23-25℃,12-24h后启酵,启酵后控温20℃-23℃;
(6)在发酵过程中,根据发酵情况确定是否需要补加白砂糖及补加量;前发酵时间8-12d;
(7)前发酵结束后,将发酵液中的酵母分离,在发酵液中添加一定浓度二氧化硫转入后发酵;
(8)后发酵温度控制20℃以下,添加澄清剂,充分混合,发酵时间为16~24d;
(9)过滤:将发酵罐底部酒脚放掉,上部液体进行过滤。
本发明的优点和效果:
(1)本发明的高产β-苯乙醇的酿酒酵母菌株CCTCC NO:M 2016785,可以在不添加外源氨基酸的情况下高产β-苯乙醇,并且产酒精特性良好。
(2)利用CCTCC NO:M 2016785制备果酒,成品果酒中β-苯乙醇的含量达350mg/L,比普通葡萄酒酵母菌种酿造的果酒提高571%左右,显著增强果酒芳香,并且产酒精特性良好,酒精度12.8度。
(3)本发明还提供了所述酿酒酵母CCTCC NO:M 2016785菌株冻干粉的应用。
生物材料保藏
一株酿酒酵母菌株,分类学命名为酿酒酵母BYC3Saccharomyces cerevisiaeBYC3,于2016年12月26日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏地址为中国武汉武汉大学,保藏编号为CCTCC NO:M 2016785。
附图说明
图1是酵母菌株在YPD中β-苯乙醇产量。
具体实施方式
实施例1:一种增强樱莓酒芳香的酿造方法
(1)清洗野樱莓果实,进行破碎与压榨,碟片分离得到樱莓果汁。
(2)根据樱莓果汁含糖量补糖,按按17g/L糖转化为1度酒精的换算关系,根据发酵情况确定补加白砂糖量,搅拌均匀。
(3)流加焦亚硫酸钾160mg/L,果胶酶100mg/L,入罐搅拌均匀。
(4)种子液活化:50g/L白砂糖水的作为活化液,接种酿酒酵母CCTCC NO:M2016785(对照组为安琪葡萄酒酿酒干酵母),种子液体积为总发酵体系的5%,在38℃下活化30min-60min。
(5)将活化好的种子液接种入发酵罐中,进行前发酵。接种后,控温23-25℃,12-24h后启酵,启酵后控温20℃-23℃。每隔24h测定酒精度、残糖、酸度、pH。
(6)待残糖小于60g/L时,为使果汁发酵酒精度达到要求,按17g/L糖转化为1度酒精的换算关系,根据发酵情况确定是否需要补加白砂糖及补加量;待残糖量为4g/L左右,酒体表面平静,气泡较少,上层酒液清澈时,前酵结束,前发酵时间10d左右。
(7)前发酵结束后,将发酵液硅藻土过滤,在发酵液中添加0.04g/L的二氧化硫转入后发酵。
(8)后发酵温度控制20℃以下,添加2‰皂土澄清剂,充分混合,20d左右。
(9)过滤:静置澄清结束后,将发酵罐底部酒脚放掉,上部液体进行硅藻土过滤,在硅藻土过滤后用膜过滤器进行微滤。
发酵完毕后采用液相色谱法测定β-苯乙醇含量,其中安琪酿酒酵母发酵β-苯乙醇含量为61mg/L,而利用酿酒酵母CCTCC M 2016785发酵的樱莓酒β-苯乙醇含量平均在350mg/L左右。
实施例2:一种增强苹果酒芳香的酿造方法
因苹果酒加工和贮藏过程中易发生褐变,导致酒体色泽、酒质和风味受到影响,使酒体氧化感增强,感官特性降低,部分营养物质的流失,苹果酒成品易出现浑浊、沉淀、雾浊等问题,因此在生产过程中可以添加40mg/L的还原型谷胱甘肽,对苹果酒褐变值及风味物质含量有积极影响。
与实施例1相比,仅仅是在步骤(1)分离的果汁中额外添加了40mg/L的还原型谷胱甘肽,且原料换成了苹果,其他步骤同实施例1。所得苹果酒β-苯乙醇含量为345mg/L。
实施例3:一种增强山楂酒芳香的酿造方法
山楂果实果胶含量高达3%~7%,果实破碎后呈胶着状态,因此在实施1中步骤(1)破碎时可加入40~50℃温水,水量控制在山楂量的1倍以内;加热使品温达到沸腾,浸提取汁,在煮沸过程中可按照成品酒的酒精度要求调整果浆糖度、酸度。浸提取汁结束后使果浆温度降到40℃左右,加入果胶酶和SO2,搅拌均匀装置。
原料换成了山楂,其他步骤同实施例1。所得山楂酒β-苯乙醇含量为343mg/L。
实施例4:一种增强混合果汁发酵果酒芳香的酿造方法
方法一:将樱莓汁与苹果汁按1:1比例混合可中和纯樱莓酒中的涩味。以混合后的混合果汁代替实施例1中的樱莓果汁进行发酵,所用菌株为酿酒酵母CCTCC NO:M 2016785,其他步骤与参数同实施例1。所得混合果酒发酵体系β-苯乙醇含量为356mg/L。
方法二:将樱莓汁、苹果汁、葡萄汁按1:1:1比例混合,以混合后的混合果汁代替实施例1中的樱莓果汁进行发酵,所用菌株为酿酒酵母CCTCC NO:M 2016785,其他步骤同实施例1。所得混合果酒发酵体系β-苯乙醇含量为370mg/L。
实施例5:一种使用酿酒酵母CCTCC NO:M 2016785冻干粉增强果酒芳香的酿造方法
在实施例1中是采用活化的CCTCC NO:M 2016785种子液;本实施例中为添加2‰CCTCC NO:M 2016785冻干粉,在38℃下搅拌30min-60min让干菌体充分吸水,同时达到消泡目的,其他步骤同实施例1。所得果酒β-苯乙醇含量为325mg/L。
其中,实施例1和实施例5采用不同菌株发酵的樱莓果酒的结果,如表1所示。
实施例1至实施例4,以CCTCC NO:M 2016785为发酵菌株,采用不同果汁原料进行发酵得到的果酒的结果如表2所示。
表1不同菌株发酵的樱莓果酒的结果对比
Figure BDA0001304787900000051
表2不同果汁原料的发酵结果对比
Figure BDA0001304787900000052
实施例6:菌株的筛选
一、紫外诱变
(1)从甘油保藏管中取由本实验室从黄酒醪液筛选的酿酒酵母菌液,活化培养,确定出发菌株指数增长中期时间即是紫外诱变开始时间;
(2)紫外诱变时间的确定
取出发酵母菌株菌液,洗涤多次后得到菌悬液,采用紫外线照射;具体是:先将紫外灯打开预热20min,以稳定光波。用5mL无菌移液管移取上述菌悬液4.5mL于无菌的直径为9cm的培养皿中,培养皿中加入无菌大头针。将装有菌悬液的培养皿放置于磁力搅拌器上,垂直放置于紫外灯下,照射20s,黑暗条件下打开皿盖(确保紫外灯照射均匀),暴露紫外光下照射(15W紫外灯,距离30cm),时间为40s、60s、80s、100s、120s。
然后计算致死率,绘制致死率曲线。分别确定紫外致死率为70-80%、80-90%、90-100%时紫外照射时间。致死率=(对照组菌落数一诱变组菌落数)/对照组菌落数。根据致死率曲线图,致死率70-80%、80-90%、90-100%时照射时间分别为110s、130s、150s。
二、对氟苯丙氨酸筛选
(1)先确定对氟苯丙氨酸的最低全部致死浓度,结果显示对氟苯丙氨酸浓度增加到0.09g/L时酵母全部致死,因此对氟苯丙氨酸最低全部致死浓度确定为0.09g/L。
(2)取紫外诱变得到的菌株进行对氟苯丙氨酸抗性筛选和酒精耐受性筛选,计算OD60012h、OD60024h以及OD60024h-OD60012h值,挑选数值相对较高的诱变酵母菌共计22株。
(3)进行黄酒模拟液发酵筛选;黄酒模拟液的制备:1kg蒸熟米饭(含水率为70%)中加入水1L、麦曲0.05kg,搅拌均匀,60℃保温8h,4500r/min离心5min,取上清液115℃灭菌15min。
将22株突变菌株活化培养后移取5%菌液,接种到黄酒模拟液的中,30℃,静止发酵7d,采用高效液相色谱法测定黄酒模拟液中β-苯乙醇含量,筛选β-苯乙醇含量相对较高的菌株。
结果得到1-e4突变菌株的β-苯乙醇平均含量相对较高为185.032mg/L,产酒精能力优良,因此将此菌株作为下一轮常温等压等离子诱变的出发菌株。
三、常温等压等离子诱变与筛选
(1)将上一步筛选得到的1-e4作为常温等压等离子诱变出发菌株。1-e4菌株YPD摇瓶30℃培养24h,用生理盐水制成OD600为0.6-0.8的菌悬液,进行常温等压等离子诱变,诱变时间为60s,功率为100w,将诱变后菌株重悬成菌液,稀释涂布于YPD平板,30℃培养48h,将单菌落划线到YNBP平板(对氟苯丙氨酸浓度为0.5g/L),YNBP平板长势良好菌株进行黄酒模拟液发酵筛选。高效液相色谱法测定黄酒模拟液中β-苯乙醇含量,筛选β-苯乙醇含量相对较高的菌株。
高效液相色谱法测定黄酒模拟发酵液中β-苯乙醇含量。3-c10、4-c7、5-f5突变菌株β-苯乙醇平均含量相对较高,分别为217.192mg/L、257.388mg/L、337.168mg/L,将该三株菌株分别命名为BYC1、BYC2、BYC3。酿酒酵母β-苯乙醇产量增加,且酿酒酵母BYC3仍可良好进行酒精发酵,黄酒模拟发酵液的酒精含量可达8.3(V/V)。将BYC-3菌株于保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M 2016785。将CCTCC NO:M 2016785菌株接种于黄酒发酵体系,酒精发酵性能良好,所得黄酒中β-苯乙醇含量为365.70mg/L。
实施例7:高产β-苯乙醇酵母菌株验证性实验
用BYC3(即CCTCC NO:M 2016785)菌株、商业酵母菌株、实施例6的野生酵母菌株(诱变出发菌株)进行对比发酵实验。三株菌株用YPD平板活化后接入YPD摇瓶,再分别按5%依次接入YPD摇瓶、YPD摇瓶(加入1g/L苯丙氨酸的)。
实验结果如图1,酿酒酵母菌株BYC3的β-苯乙醇产量明显高于商业酵母菌株和野生酵母菌株,CCTCC NO:M 2016785酵母在YPD培养基中β-苯乙醇产量达31.6mg/L,是添加1g/L苯丙氨酸的YPD培养基的50.9%(而商业酵母为27%、野生酵母为22%左右),酵母BYC3高产β-苯乙醇性能得到验证。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可做各种的改动与修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (6)

1.一种芳香增强的果酒的酿造方法,其特征在于,所述方法是以保藏编号为CCTCC NO:M 2016785的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为发酵菌株。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述保藏编号为CCTCC NO:M 2016785的酿酒酵母以冻干粉的形式用于所述酿造方法。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述方法是将冷冻干燥得到的所述保藏编号为CCTCC NO:M 2016785的酿酒酵母干菌体按2‰添加量添加到果汁中。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述果酒是以葡萄汁、苹果汁、桑葚汁、山楂酒、杨梅汁、樱莓汁中的一种或者两种以上按一定比例混合发酵得到的。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述果酒为葡萄酒、苹果酒、桑葚酒、山楂酒、杨梅酒或者樱莓酒。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:
(1)清洗果实原料,进行破碎与压榨,分离得到果汁;
(2)补加白砂糖,搅拌均匀;
(3)流加焦亚硫酸钾160mg/L,果胶酶100mg/L,入罐搅拌均匀;
(4)将保藏编号为CCTCC NO:M 2016785的酿酒酵母进行种子液活化,50g/L白砂糖水的作为活化液,在38℃下活化30min-60min;或者取2‰保藏编号为CCTCC NO:M 2016785的酿酒酵母冻干粉,在38℃下搅拌30min-60min让干菌体充分吸水,得到菌液;
(5)将上一步活化好的种子液或者冻干粉的菌液接种入发酵罐中,进行前发酵;接种后,控温23-25℃,12-24h后启酵,启酵后控温20℃-23℃;
(6)在发酵过程中,根据发酵情况确定是否需要补加白砂糖及补加量;前发酵时间8-12d;
(7)前发酵结束后,将发酵液中的酵母分离,在发酵液中添加一定浓度二氧化硫转入后发酵;
(8)后发酵温度控制20℃以下,添加澄清剂,充分混合,发酵时间为16~24d;
(9)过滤:将发酵罐底部酒脚放掉,上部液体进行过滤。
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