CN109971662A - 一种从猪肠道分离贝氏酵母菌的方法及其发酵方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种从猪肠道分离贝氏酵母菌的方法及其发酵方法，属于微生物领域。本发明的一种从猪肠道分离贝氏酵母菌的方法，包括步骤：将猪肠道内容物置于灭菌瓶内，加生理盐水稀释，混匀得到菌液；将菌液接种于酵母菌培养基中，使菌液在所述酵母菌培养基的表面均匀扩散，在30‑34℃下培养20‑28h，得到贝氏酵母菌的菌体。本发明的从猪肠道分离贝氏酵母菌的方法，可从动物消化道内分离出既能助消化促生长又能预防动物腹泻的酵母菌，其易于培养，耐受性强，在动物体同源菌种好定植，发酵成本低，适合液体培养和固体高密度培养。

Description

一种从猪肠道分离贝氏酵母菌的方法及其发酵方法
技术领域
本发明涉及一种从猪肠道分离贝氏酵母菌的方法及其发酵方法，属于微生物领域。
背景技术
随着人们对抗生素的认识的深入，抗生素得到了大规模的生产和广泛的应用，同时抗生素所带来的负面影响得到人们越来越多的关注，科学家们发现滥用抗生素能引起机体的正常菌群失调、机体产生耐药性，畜产品中的化学药品、抗菌素、激素含量的超标，不仅会导致动物抗病力减弱，药物残留还通过畜产品威胁人类健康。而且耐药性可通过耐药因子(R因子)经细菌传递给人类，使保健和治疗更趋困难、这将对人类的生存和发展产生严重负面的影响。于是，出现了很多代替抗生素的新药物，其中益生菌效果较好。益生菌是一种能够直接饲喂的微生物饲料添加剂，即将某些对动物机体健康有益的微生物饲料喂给动物，在消化道内通过竞争性排斥作用，抑制病原菌，维持肠道微生物区系的平衡。益生素以其安全高效、环保等功能正发挥着巨大的潜能，益生菌无毒副作用、无耐药性；能替代抗生素、调整肠道菌群平衡预防二重感染、提高机体免疫力、提高综合抗病力、降低发病率，并能分泌多种酶、提高消化率、促生长剂、降低养殖成本、提高动物产品品质、丰富食品风味、安全提高瘦肉率、它能提高有害物质(胺、氨)的排出，减少臭味、去蝇咀。随着人民生活水平和消费水平的提高以及农产品国际市场竞争力的提升，益生菌必将具有十分广阔的发展的空间。双岐杆菌和乳酸菌具有很好的作用，但耐高温和耐酸碱等耐受力差，活性易下降。
因此，针对上述问题，目前亟待提出一种方法，能够分离出耐受力强、活性好的益生菌。
发明内容
本发明的目的是提供一种从猪肠道分离贝氏酵母菌的方法及其发酵方法，以取代现有技术中的抗生素。
本发明的从猪肠道分离贝氏酵母菌的方法，包括如下步骤：将猪肠道内容物置于灭菌瓶内，加生理盐水稀释，混匀得到菌液；将菌液接种于酵母菌培养基中，使菌液在所述酵母菌培养基的表面均匀扩散，在30-34℃下培养20-28h，得到贝氏酵母菌的菌体。
进一步地，所述酵母菌培养基中包括：蛋白胨、麦芽糖、酒石酸、牛肉粉、氯化钠与琼脂。
进一步地，所述酵母菌培养基按照质量百分比计包括：蛋白胨1％、麦芽糖4％、浓度为10％的酒石酸溶液1.4％、牛肉粉0.35％、氯化钠0.5％、琼脂2％，余量为水。
进一步地，所述酵母菌培养基的pH为5.8-6.0。
本发明的从猪肠道分离的贝氏酵母菌的发酵方法，包括步骤：包括如下步骤：
(1)将所述的贝氏酵母菌的菌体接种于酵母菌发酵培养基中，培养基pH为6.0-6.5，于28-32℃、150-200rpm的条件下培养24-36h，得到一级种子发酵液；
(2)将步骤(1)中得到的一级种子发酵液接种于酵母菌发酵培养基中，于30-34℃、180-220rpm的条件下培养10-15h，得到二级种子发酵液；
(3)将步骤(2)中得到的二级种子发酵液接种于酵母菌发酵培养基中，于30-34℃、180-220rpm的条件下培养4-8h，即可。
进一步地，步骤(1)中，所述一级种子发酵液的菌体为6h-12h对数生长期的贝氏酵母菌；步骤(2)中，所述二级种子发酵液的菌体为对数生长期的贝氏酵母菌。
进一步地，步骤(1)中，所述的贝氏酵母菌的菌体的接种量为3-10％；步骤(2)中，所述一级种子发酵液的接种量为4-10％；步骤(3)中，所述二级种子发酵液的接种量为4-10％。
进一步地，所述酵母菌发酵培养基包括：酵母浸粉、蛋白胨、葡萄糖与微量盐。
进一步地，所述酵母菌发酵培养基按照质量份计包括：所述酵母菌发酵培养基按照质量份数计包括：酵母浸粉4-6份、蛋白胨2-6份、葡萄糖4-12份、微量盐。
进一步地，所述微量盐包括氯化钙、硫酸镁、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾与氯化钠中的一种或多种。
本发明与现有技术相比具有以下的优点：
1.从猪肠道分离的菌种能保证其在动物肠道定植和迅速生长繁殖形成一定数量。
2.酵母菌作为微生态制剂，在生产中培养基底物成本低廉、应用方便等优点。
3.从动物消化道内分离出既能助消化促生长又能预防动物腹泻的酵母菌，其好培养，耐受性强，在动物体同源菌种好定植，发酵成本低，适合液体培养和固体高密度培养；很有生产价值和经济效益。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例的从猪肠道分离贝氏酵母菌的方法，包括如下步骤：
将猪肠道内容物1克，装入放有30个玻璃球的灭菌瓶内，加生理盐水稀释，充分打匀后，将菌液接种于酵母菌选择性培养基中，每种培养基接种10个平板，接种量0.2毫升，接种后立即上下翻转培养皿使接种液在平皿表面均匀扩散。放置培养箱培养24小时，培养温度为32℃，得到贝氏酵母菌的菌体。作为本实施例可替换的实现方式，培养温度可以为30-34℃范围内的任意值；培养时间可以为20-28h范围内的任意值。
其中，所述酵母菌培养基为选择性培养基，按照质量百分比计包括：蛋白胨1％、麦芽糖4％、浓度为10％的酒石酸溶液1.4％、牛肉粉0.35％、氯化钠0.5％、琼脂2％，余量为水。所述酵母菌培养基的pH值为5.8-6.0。
为验证得到的菌体，本实施例中采用如下方法进行贝氏酵母菌的鉴定：
(a)菌落特征的观察
将待检菌用平板稀释法在麦芽汁琼脂平板上32℃条件下培养24h，选择单个菌落，观察其颜色、形状、透明、光滑、湿润和边缘整齐等特征。麦芽汁液体培养则用于观察其是否发酵、培养液清浊、是否形成醭(浮膜)、环或岛、沉淀物的疏松或紧密度等。
(b)细胞形态的观察
挑取单菌落涂片，观察细胞形状、大小和无性生殖方式。
(c)生理生化鉴定
选取有酵母典型形态的单菌落，进行生理生化试验，包括葡萄糖发酵试验、乙醇同化试验、KNO3同化试验、类淀粉化合物形成的测定。
鉴定结果：根据形态学特征、生理生化特征分析，确定本实施例中得到的菌株为贝氏酵母菌。
实施例2
本实施例的从猪肠道分离的贝氏酵母菌的发酵方法，包括步骤：
(1)将所述的贝氏酵母菌的菌体按照3％的接种量接种于酵母菌发酵培养基中，培养基pH为6.5，于30℃、150rpm的条件下培养24h，得到一级种子发酵液；
(2)将步骤(1)中得到的一级种子发酵液按照4％的接种量接种于酵母菌发酵培养基中，于32℃、200rpm的条件下培养12h，得到二级种子发酵液；
(3)将步骤(2)中得到的二级种子发酵液按照8％的接种量接种于酵母菌发酵培养基中，于32℃、200rpm的条件下培养6h，即可。
其中，所述酵母菌发酵培养基按照质量份数计包括：酵母浸粉4-6份、蛋白胨2-6份、葡萄糖4-12份、微量盐。所述微量盐为氯化钙、硫酸镁、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾与氯化钠中的一种或多种。
作为本实施例的具体实现方式，以下对所述的从猪肠道分离的贝氏酵母菌的发酵方法进行如下对比实验：
1、酵母菌一级种子培养基生长情况实验
步骤(1)中，根据一级种子发酵液的培养条件培养酵母菌，每2小时取样检验OD600值。
表1一级种子发酵液中菌体的生长曲线的测定
时间/h 0 4 6 8 10 12 14 16 18
OD值 0.06 0.12 0.58 1.96 2.74 3.68 3.93 4.12 4.18
由上表结果可知，菌体在0h-4h为延滞期，在6h-12h为对数生长期，在14h达到稳定期，在18h进入衰亡期，转种最佳时间为12h。
2、酵母菌发酵培养基的优化
取对数生长期的一级种子培养液，按照3％的接种量接入1#～8#发酵培养基中，初始pH为6.5，500mL三角瓶装液量为200mL，32℃，200rpm条件下培养12h，活菌计数结果如表2。
1#：酵母浸出粉4.00g，胰蛋白胨2.00g，蛋白胨2.01g，葡萄糖4.00g，微量盐16mL；所述微量盐为氯化钙、硫酸镁、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾与氯化钠混合而成。将浓度分别为1mol/L、1mol/L、1mol/L、1mol/L、1mol/L、1mol/L的氯化钙、硫酸镁、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化钠(即浓度为1mol/L的氯化钙、浓度为1mol/L的硫酸镁、浓度为1mol/L的碳酸氢钠、浓度为1mol/L的磷酸二氢钾、浓度为1mol/L的磷酸氢二钾、浓度为1mol/L的氯化钠)，按照1:1:1:1:1:1的体积比混合而成。
2#：安琪酵母浸粉4.00g，安琪蛋白胨4.00g，葡萄糖4.00g，微量盐16mL；所述微量盐为氯化钙、硫酸镁、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾与氯化钠混合而成。将浓度分别为0.5mol/L、0.8mol/L、0.5mol/L、1.2mol/L、2mol/L、1mol/L的氯化钙、硫酸镁、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾与氯化钠，按照1:1:1:1:1:1的体积比混合而成。
3#：安琪酵母浸粉4.00g，安琪蛋白胨6.00g，葡萄糖4.00g，微量盐16mL；所述微量盐为氯化钙、硫酸镁、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾与氯化钠混合而成。将浓度分别为1mol/L、3mol/L、0.5mol/L、0.8mol/L、2mol/L、1mol/L的氯化钙、硫酸镁、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾与氯化钠，按照1:1:1:1:1:1的体积比混合而成。
4#：安琪酵母浸粉4.00g，安琪蛋白胨8.00g，葡萄糖4.00g，微量盐16mL；所述微量盐为氯化钙、硫酸镁、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾与氯化钠混合而成。将浓度分别为1.2mol/L、2.5mol/L、0.5mol/L、0.8mol/L、2mol/L、1mol/L氯化钙、硫酸镁、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾与氯化钠，按照1:1:1:1:1:1的体积比混合而成。
5#：安琪酵母浸粉6.01g，安琪蛋白胨6.00g，葡萄糖4.00g，微量盐16mL；所述微量盐为氯化钙、硫酸镁、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾与氯化钠混合而成。将浓度分别为0.8mol/L、1mol/L、0.5mol/L、0.8mol/L、2mol/L、1mol/L的氯化钙、硫酸镁、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾与氯化钠，按照1:1:1:1:1:1的体积比混合而成。
6#：安琪酵母浸粉8.01g，安琪蛋白胨6.00g，葡萄糖4.00g，微量盐16mL；所述微量盐为氯化钙、硫酸镁、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾与氯化钠混合而成。将浓度分别为1mol/L、1.2mol/L、0.5mol/L、0.8mol/L、2mol/L、1mol/L氯化钙、硫酸镁、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾与氯化钠，按照1:1:1:1:1:1的体积比混合而成。
7#：安琪酵母浸粉6.01g，安琪蛋白胨6.00g，葡萄糖8.00g，微量盐16mL；所述微量盐为氯化钙、硫酸镁、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾与氯化钠混合而成。将浓度分别为1.2mol/L、2.5mol/L、1mol/L、1mol/L、1.8mol/L、0.5mol/L的氯化钙、硫酸镁、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾与氯化钠，按照1:1:1:1:1:1的体积比混合而成。
8#：安琪酵母浸粉6.01g，安琪蛋白胨6.00g，葡萄糖12.00g，微量盐16mL。所述微量盐为氯化钙、硫酸镁、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾与氯化钠混合而成。将浓度分别为1.2mol/L、2.5mol/L、1mol/L、1mol/L、1.8mol/L、0.5mol/L的氯化钙、硫酸镁、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾与氯化钠为水溶液，按照1:1:1:1:1:1的体积比混合而成。
表2不同发酵培养基中酵母菌的活菌计数
组别 活菌数(cfu/mL)
1 2.8×10<sup>8</sup>
2 1.1×10<sup>8</sup>
3 1.7×10<sup>8</sup>
4 1.5×10<sup>8</sup>
5 2.3×10<sup>8</sup>
6 1.9×10<sup>8</sup>
7 3.6×10<sup>8</sup>
8 3.5×10<sup>8</sup>
由表2的试验结果可知，选取适于酵母菌生长的7#和8#培养基。
3、发酵培养基接种量优化
将处于对数生长期的一级种子，分别以2％、4％、8％、10％、12％的接种量接入7#培养基中，初始pH为6.5，500mL三角瓶装液量为200mL，32℃，200rpm条件下培养12h，其活菌数结果如表3所示。
表3发酵培养基接种量的优化
接种量/％ 2 4 8 10 12
活菌数(cfu/mL) 1.2×10<sup>8</sup> 3.4×10<sup>8</sup> 3.0×10<sup>8</sup> 3.2×10<sup>8</sup> 2.9×10<sup>8</sup>
由表3可知，接种量为4％时，活菌数达到最大，因此以4％作为最佳接种量。
4、发酵培养基生长曲线绘制
以7#培养基为基础培养基，初始pH为6.5，500mL三角瓶装液量为200mL，接种量为4％，32℃，200rpm条件下培养，每隔2小时在600nm下检测菌体OD600值(表4)。
表4发酵培养基中酵母菌的生长曲线的测定
时间/h 0 1 2 3 4 5 6 7 8
OD值 0.07 0.18 0.92 1.96 2.44 3.51 4.12 4.37 4.36
由以上结果可知，菌体在0h-1h为延滞期，在1h-6h为对数生长期，在7h达到稳定期，在8h进入衰亡期，转种最佳时间为6h。
5、20L发酵罐发酵pH的优化
以7#培养基为发酵培养基，用4mol/L的NaOH控制pH，使发酵罐中含有不同的初始pH，发酵条件为：温度32℃，转速200rpm，通气量0.75L/h，罐压0.05MPa，溶氧控制在40％以上，培养酵母菌6h，菌液的活菌计数结果见表4-6。结果显示在初始pH为6.5时，活菌数最高，因此，选择pH6.5为发酵罐培养基的初始pH。
表5不同pH的一级种子培养基的酵母菌生长的影响
6、20L发酵罐接种量的优化
以7#培养基为基础培养基，4mol/L的NaOH控制发酵罐中初始pH为6.5，将处于对数生长期的二级种子，分别以2％、4％、8％、10％、12％的接种量接入发酵罐中，发酵条件为：温度32℃，转速200rpm，通气量0.75L/h，罐压0.05MPa，溶氧控制在40％以上，培养6h，其活菌数结果见表6。
表6发酵培养基接种量的优化
接种量/％ 3 5 8 10 12
活菌数(cfu/mL) 1.3×10<sup>8</sup> 2.1×10<sup>8</sup> 3.4×10<sup>8</sup> 3.2×10<sup>8</sup> 2.9×10<sup>8</sup>
由表6可知，接种量为8％时，活菌数达到最大，因此以8％作为最佳接种量。
试验例
将本发明的贝氏酵母菌添加至饲料中，进行动物试验：
将每kg饲料添加50g贝氏酵母菌菌种；按照如下剂量加入抗生素：25mg黄霉素+500mg氨苯胂酸/kg饲料+0.2％乳清粉。
将上述各物质分别添加到猪的饲料中，饲喂断奶仔猪10天，而后测量10天前后的体重变化。
动物实验结果：
贝氏酵母的增重比抗菌素的高，差异极显著(p<0.01)(见表7)。
表7实验前后断奶仔猪体重比较
综合以上，贝氏酵母菌能够取代一些抗生素作为药物饲料添加剂，能在健康动物机体发挥出药物饲料添加剂的功效。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种从猪肠道分离贝氏酵母菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：将猪肠道内容物置于灭菌瓶内，加生理盐水稀释，混匀得到菌液；将菌液接种于酵母菌培养基中，使菌液在所述酵母菌培养基的表面均匀扩散，在30-34℃下培养20-28h，得到贝氏酵母菌的菌体。
2.根据权利要求1所述的从猪肠道分离贝氏酵母菌的方法，其特征在于，所述酵母菌培养基中包括：蛋白胨、麦芽糖、酒石酸、牛肉粉、氯化钠与琼脂。
3.根据权利要求2所述的从猪肠道分离贝氏酵母菌的方法，其特征在于，所述酵母菌培养基按照质量百分比计包括：蛋白胨1％、麦芽糖4％、浓度为10％的酒石酸溶液1.4％、牛肉粉0.35％、氯化钠0.5％、琼脂2％，余量为水。
4.根据权利要求3所述的从猪肠道分离贝氏酵母菌的方法，其特征在于，所述酵母菌培养基的pH为5.8-6.0。
5.一种从猪肠道分离的贝氏酵母菌的发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将权利要求1-4中任意一项所述的贝氏酵母菌的菌体接种于酵母菌发酵培养基中，培养基pH为6.0-6.5，于28-32℃、150-200rpm的条件下培养24-36h，得到一级种子发酵液；
(2)将步骤(1)中得到的一级种子发酵液接种于酵母菌发酵培养基中，于30-34℃、180-220rpm的条件下培养10-15h，得到二级种子发酵液；
(3)将步骤(2)中得到的二级种子发酵液接种于酵母菌发酵培养基中，于30-34℃、180-220rpm的条件下培养4-8h，即可。
6.根据权利要求5所述的贝氏酵母菌的发酵方法，其特征在于，步骤(1)中，所述一级种子发酵液的菌体为6h-12h对数生长期的贝氏酵母菌；步骤(2)中，所述二级种子发酵液的菌体为对数生长期的贝氏酵母菌。
7.根据权利要求5所述的贝氏酵母菌的发酵方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的贝氏酵母菌的菌体的接种量为3-10％；步骤(2)中，所述一级种子发酵液的接种量为4-10％；步骤(3)中，所述二级种子发酵液的接种量为4-10％。
8.根据权利要求5所述的贝氏酵母菌的发酵方法，其特征在于，所述酵母菌发酵培养基包括：酵母浸粉、蛋白胨、葡萄糖与微量盐。
9.根据权利要求8所述的贝氏酵母菌的发酵方法，其特征在于，所述酵母菌发酵培养基按照质量份数计包括：酵母浸粉4-6份、蛋白胨2-6份、葡萄糖4-12份、微量盐。
10.根据权利要求9所述的贝氏酵母菌的发酵方法，其特征在于，所述微量盐包括氯化钙、硫酸镁、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾与氯化钠中的一种或多种。
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WO2018207141A1 (en) * 2017-05-11 2018-11-15 Bioenologia 2.0 S.R.L. A strain of yeast saccharomyces bayanus subsp. uvarum dbvpg36p, its use in the fermentative production of foods and a method for the selection of the strain.
CN109576165A (zh) * 2019-01-11 2019-04-05 谭瑛 一种贝酵母菌及其应用

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