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Abstract

本发明公开了一种发酵生产高品质桑葚酒的方法，采用双酵母混合发酵；单独使用酵母属贝酵母发酵所得桑葚酒香气不足，后味寡淡，戴尔有孢圆酵母的添加，显著性提高了桑葚酒的酯香、醇香和烯萜醇，尤其乙基酯含量的提高以及癸酸含量的降低极大改善了桑葚酒的香气风味，酒香果香浓郁，口感柔和醇厚。

Description

一种发酵生产高品质桑葚酒的方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，更具体的说是涉及一种采用双酵母混合发酵生产高品质桑葚酒的方法。
背景技术
桑葚，为桑科植物桑树的果实，皮薄多汁且营养丰富。桑葚每年4-6月果实成熟，它在室温下容易变质且不利于储存和运输，为延长它的保质期，采摘后应迅速加工。桑葚既可以新鲜食用，也可以加工成多种形式，包括糖浆、果酱、醋、浓缩物和果酒。桑葚富含多糖、白藜芦醇等功能成分，在增强人体免疫力、降血脂血糖和防癌抗变等方面具有显著功效。
非酿酒酵母是在葡萄，酿酒设备和发酵过程中发现的天然微生物群，Torulasporadelbrueckii能产生更高浓度的高级醇(异戊醇，2-苯乙醇)，乙酯类(辛酸乙酯和癸酸乙酯)，萜烯(芳樟醇，a-萜品醇)，由于乙醇耐受性低，大多数非酿酒酵母都不能完成酒精发酵。
因此，提供一种采用双酵母混合发酵生产高品质桑葚酒的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种采用双酵母混合发酵生产高品质桑葚酒的方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种发酵生产高品质桑葚酒的方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)将桑椹破碎，加入100～140mg/L NaHSO3，60～90mg/L果胶酶，在22～28℃条件下静置5～10h；
(2)加入135-160mg/L(NH4)2HPO3，接种等量酵母Saccharomyces Bayesian Y4和Torulaspora delbrueckii Y7，使步骤(1)所述醪液中两种酵母的初始菌体浓度均为1～5×106CFU/mL；
(3)在20℃～28℃条件下发酵，4～7天后补加蔗糖5％～8％，继续发酵3～6天，将发酵液过滤得桑葚酒。
进一步，步骤(2)所述Saccharomyces Bayesian Y4的保藏编号为CCTCC NO：M2019522。
贝酵母Saccharomyces bayanus Y4的保藏编号为CCTCC NO：M 2019522，已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学，保藏日期为2019年7月4日，分类命名为Saccharomyces bayanus Y4。
进一步，步骤(2)所述Torulaspora delbrueckii Y7的保藏编号为CCTCC NO：M2019523。
生香酵母Torulaspora delbrueckii Y7的保藏编号为CCTCC NO：M 2019523，已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学，保藏日期为2019年7月4日，分类命名为Torulaspora delbrueckii Y7。
Saccharomyces bayanus Y4和Torulaspora delbrueckii Y7是通过从不同企业果酒醪及周围环境采样后，通过梯度稀释，培养皿发酵、形态观察等获得200株分离菌株后，再对这些菌株进行杜氏小管发酵、以产气状况及感官品鉴方式复筛得到的分离菌株。其中S.bayanus Y4产乙醇浓度>10％，乙醇耐受能力>12％，二氧化硫耐受能力≥10mg/L，且感官评价具有浓郁果香。Saccharomyces bayanus Y4菌落较大，不透明，乳白色，较湿润，边缘较圆整，与中央颜色一致；Torulaspora delbrueckii Y7菌落较小，不透明，白色，较湿润，边缘与中央颜色一致。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种发酵生产高品质桑葚酒的方法，单独使用贝酵母发酵所得桑葚酒香气不足，后味寡淡，戴尔有孢圆酵母的添加，显著性提高了桑葚酒的酯香、醇香和烯萜醇，尤其乙基酯含量的提高以及癸酸含量的降低极大改善了桑葚酒的香气风味，酒香果香浓郁，口感柔和醇厚。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明3种桑葚酒中重要挥发性组分含量。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1.2kg新鲜桑葚原料经挑选，清洗，进行捏碎处理，破碎后立即加入0.15g NaHSO3，加入0.09g果胶酶，在25℃恒温条件下静置8h；添加0.23g(NH4)2HPO3，添加蔗糖120g。同时接种等量经活化的贝酵母Y4和戴尔有孢圆酵母Y7，使两种酵母的初始菌体浓度均为106CFU/mL(活化方法：从麦芽汁试管斜面挑取适量菌体，在麦芽汁液体培养基两次逐级扩大至菌体含量达到107)，20℃恒温条件下发酵6天后补加蔗糖105g，继续发酵4天，即刻过滤得桑葚酒。
实施例2
1.2kg新鲜桑葚原料经挑选，清洗，进行捏碎处理，破碎后立即加入0.18g NaHSO3，加入0.105g果胶酶，在25℃恒温条件下静置8h。添加0.23g(NH4)2HPO3，添加蔗糖120g。同时接种等量经活化的贝酵母Y4和戴尔有孢圆酵母Y7，使两种酵母的初始菌体浓度均为3x106CFU/mL(活化方法：从麦芽汁试管斜面挑取适量菌体，在麦芽汁液体培养基两次逐级扩大至菌体含量达到107)，25℃恒温条件下发酵6天后补加蔗糖105g，继续发酵4天，即刻过滤得桑葚酒。
对比例
1.2kg新鲜桑葚原料经挑选，清洗，进行捏碎处理，破碎后立即加入0.15g NaHSO3，加入0.09g果胶酶，在25℃恒温条件下静置8h；添加0.23g(NH4)2HPO3，添加蔗糖120g。接种经活化的贝酵母Y4，使其初始菌体浓度为106CFU/mL(活化方法：从麦芽汁试管斜面挑取适量菌体，在麦芽汁液体培养基两次逐级扩大至菌体含量达到107)，20℃恒温条件下发酵6天后补加蔗糖105g，继续发酵4天，即刻过滤得桑葚酒。
对实施例1、实施例2和对比例制备得到的桑葚酒进行检测
(1)理化指标的测定
根据GB/T15038-2006的方法完成桑葚酒的残糖、总酸及酒精度检测。
表1不同酵母的桑葚酒样品理化性质差异
Figure BDA0002288143990000041
表1结果表明，由于乙醇的不耐受性，大多数非酿酒酵母都不能完成酒精发酵，但是，T.delbrueckii Y7通过与贝酵母Y4混合发酵，使得Y4+Y7(25℃)和Y4+Y7(20℃)发酵样品的酒精度达到了13％vol以上，改善了戴尔有孢圆酵母单独发酵产生酒精少的问题。
(2)挥发性组分的测定及分析
应用顶空固相微萃取-气相质谱(HS/SPME-GC/MS)技术检测实施例1、实施例2和对比例制备得到的桑葚酒中的挥发性组分。
1)操作步骤及条件准确量取0.5ml样品于25ml顶空瓶中，加入2ml蒸馏水及10μl辛酸甲酯密封。于恒温磁力搅拌器上水浴60℃预平衡15min后，插入固相微萃取针头(50/30μmDVB/CAR/PDMS)并暴露微萃取头，萃取吸附40min达到平衡后，取出针头插入GC-MS进样口解析3min，测定其挥发性组分。
2)GC-MS条件初始温度40℃，保持5min后，以4℃/min升至100℃，然后以6℃/min升至220℃，保持8min；进样口温度为250℃；载气流速为1.0ml/min；载气为高纯氦；离子源温度为230度；进样口温度为250℃；EI电子能量为70eV；色谱扫描范围为35-400amu。
3)定性、定量分析将未知挥发性物质与标准质谱数据文库NIST05中的标准物质质谱进行对比，将SI和RSI均大于80％的比对结果作为初步定性结果，然后根据未知物质组分在HP-innowax色谱柱上的保留时间和在该条件下C7～C30直链烷烃的保留时间计算未知组分的保留系数。将保留系数与采用相同色谱柱的文献或者数据库中已有的保留指数做对比来校正初始定性结果。将影响因子视为1，对挥发性物质进行半定量分析。所有的样品重复3次平行，结果表示为平均值±标准偏差。使用方差分析(ANOVA)对不同样品间挥发性物质含量进行显著性分析(p＜0.05)。所有统计分析均使用SPSS17.0。
表2不同酵母及温度的桑葚酒样品挥发性组分含量
Figure BDA0002288143990000051
如表2所示，实施例1、实施例2和对比例制备得到的桑葚酒(3种桑葚酒)酯类含量的差异主要是由其辛酸乙酯、十二烷酸乙酯、丁二酸二乙酯、苯乙酸乙酯、肉桂酸乙酯、软脂酸乙酯和十八烷酸乙酯含量的显著性差异所引起的。其中，辛酸乙酯、苯乙酸乙酯、软脂酸乙酯、十八烷酸乙酯和十二烷酸乙酯在Y4+Y7(25℃)样品中的含量最高，Y4+Y7(20℃)样品次之。
致使3种桑葚酒之间酯类组成与含量差异的主要原因可能是贝酵母与T.delbrueckii混合发酵生成的乙基酯含量远高于贝酵母单独发酵，以及低温会影响T.delbrueckii生成一些物质。T.delbrueckii能增加果酒中乙酯含量，尤其是脂肪酸乙酯，如辛酸乙酯和十二烷酸乙酯，且T.delbrueckii相对于酿酒酵母和其他几种非酿酒酵母其辛酸乙酯的产量是最高的，有研究表明肉桂酸乙酯是由T.delbrueckii特别生产的酯。辛酸乙酯具有果香和茴香，十二烷酸乙酯具有舒适的花香，肉桂酸乙酯具有草莓香、肉桂香和奶酪味，这些物质对果酒发酵的特色果香贡献很大。
异戊醇和异丁醇在Y4+Y7(25℃)和Y4+Y7(20℃)样品中的含量显著高于Y4(20℃)，且异戊醇具有果香和酒香。其中，Y4+Y7(25℃)样品中独有正庚醇和Y4+Y7(20℃)中少许的3-甲硫基丙醇赋予了果酒橙花味；但Y4+Y7(20℃)样品中苯乙醇的含量有所降低，醇质量浓度的增加可能与戴尔有孢圆酵母中β-葡萄糖苷酶的活性有关。低温会使其醇类组分的种类有所变化，且对其总醇含量有降低的影响，造成其总醇含量变化的主要原因是在较低的温度下，样品中苯乙醇含量的降低。
Y4+Y7(25℃)和Y4+Y7(20℃)样品中未检测出反式-橙花叔醇而其芳樟醇和(-)-4-萜品醇的含量显著性高于Y4(25℃)样品。主要原因可能是T.delbrueckii催化的反应主要导致芳樟醇和α-萜品醇的形成，芳樟醇具有百合花香、果香，有研究表明橙花醇转化为芳樟醇是有益的。
表3不同酵母的桑葚酒样品挥发性组分OAV
Figure BDA0002288143990000071
Figure BDA0002288143990000081
注：“OTS”代表该物质感觉阈值，“OAV”代表果酒中检测出的该物质的浓度与该物质的感觉阈值之比，OAV>1即为该物质对果酒的贡献度高。
如表3所示，Y4+Y7(25℃)样品中己酸乙酯和苯丙酸乙酯的OAV值远高于Y4(25℃)样品。
3种桑葚酒中重要挥发性组分含量如表4、图1所示。
表4重要挥发性组分含量
Figure BDA0002288143990000082
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (3)

1.一种发酵生产高品质桑葚酒的方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)将桑椹破碎，加入100～140mg/L NaHSO3，60～90mg/L果胶酶，在22～28℃条件下静置5～10h；
(2)加入135-160mg/L(NH4)2HPO3，接种等比例的酵母Saccharomyces Bayesian Y4和Torulaspora delbrueckii Y7，使步骤(1)所述醪液中两种酵母的初始菌体浓度均为1～5×106CFU/mL；
(3)在20℃～28℃条件下发酵，4～7天后补加蔗糖5％～8％，继续发酵3～6天，将发酵液过滤得桑葚酒。
2.根据权利要求1所述的一种发酵生产高品质桑葚酒的方法，其特征在于，步骤(2)所述Saccharomyces Bayesian Y4的保藏编号为CCTCC NO：M 2019522。
3.根据权利要求1所述的一种发酵生产高品质桑葚酒的方法，其特征在于，步骤(2)所述Torulaspora delbrueckii Y7的保藏编号为CCTCC NO：M 2019523。
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