ES2334753B1 - Cepa de saccharomyces cerevisiae cect 13030 y su uso para la elaboracion de bebidas alcoholicas. - Google Patents
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Abstract
Cepa de Saccharomyces cerevisiae CECT
13030 y su uso para la elaboración de bebidas alcohólicas.
La presente invención se refiere a la producción
de una nueva cepa de Saccharomyces cerevisiae aislada a
partir de la microbionta autóctona de la región vitivinícola de
Rioja Alavesa, depositada en la CECT con el número de acceso CECT
13030, y a su uso en la elaboración mediante fermentación alcohólica
de bebidas alcohólicas en particular en la elaboración de vinos.
Description
Cepa de Saccharomyces cerevisiae CECT
13030 y su uso para la elaboración de bebidas alcohólicas.
La presente invención se encuadra en el campo
general de la producción de levaduras y en particular se refiere a
una nueva cepa de Saccharomyces cerevisiae y su uso para la
elaboración de bebidas alcohólicas.
Hasta hace muy poco, y sobre todo en la enología
del viejo mundo, la idea predominante era que la fermentación
espontánea del mosto, es decir aquella que se da sin el empleo de
ningún inóculo externo, conducía hacia la obtención de vinos de
mejor aroma y bouquet.
En la actualidad, sin embargo, la tendencia
actual asume que el empleo de levaduras seleccionadas presenta
numerosas ventajas con respecto a la fermentación espontánea
tradicional:
- -
- Mayor velocidad de fermentación.
- -
- Máximo consumo de azúcares reductores.
- -
- Mayor reproducibilidad en la calidad del vino elaborado.
- -
- Evitar alteraciones químicas y microbiológicas en las primeras fases de fermentación.
- -
- Mayor flexibilidad en el control de la calidad sensorial del vino.
De hecho, las levaduras seleccionadas se han
empleado con excelentes resultados en muchos países, obteniéndose
productos finales con calidad más uniforme que los que se producían
con las fermentaciones espontáneas.
El vino es el producto obtenido de la
fermentación alcohólica, proceso mediante el cual, los azúcares de
la uva se transforman en etanol debido a la acción de las
levaduras. Sin embargo, su verdadera importancia no radica
únicamente en la producción del grado alcohólico del vino obtenido,
sino que además, en el transcurso del proceso fermentativo las
levaduras están implicadas en la generación de numerosos compuestos
secundarios que determinan la calidad final del vino elaborado, así
como su tipicidad.
En el transcurso de la fermentación del mosto,
se produce la acción secuencial de diferentes géneros y especies de
levaduras. En las primeras etapas de fermentación
(4-5% Vol. de alcohol), se desarrollan levaduras
indígenas con bajo poder fermentativo de las especies:
Kloeckera, Hanseniaspora, Candida y Pichia. Una vez
se superan los 4-5% Vol. de alcohol, el proceso
fermentativo es dominado fundamentalmente por la especie
Saccharomyces cerevisiae, más resistente al alcohol.
El origen de estas levaduras está
fundamentalmente en la superficie de las uvas así como en el
ambiente de la bodega (maquinaria, tolvas, prensas, depósitos de
fermentación, etc.), siendo esta última una importante fuente de
microorganismos que inoculan los mostos. El número de levaduras
presentes en el hollejo de la uva sana es muy bajo (entre 10^{3}
y 10^{6} UFC/mL), y el número de Saccharomyces cerevisiae
es aún menor, menos de 50 células/mL de mosto. En la bodega, S.
cerevisiae es la especie predominante.
La microflora presente en la uva se puede ver
afectada por un gran número de factores que influyen en el número y
proporción de las diferentes especies.
Entre estos factores se incluye la temperatura,
la pluviometría y otras influencias climáticas, el grado de madurez
de la uva, el empleo de tratamientos fitosanitarios, el daño físico
debido a hongos, insectos, etc. y la variedad de uva. Variaciones
en la flora inicial, pueden influir en el proceso fermentativo
provocando retrasos e incluso paradas de fermentación, pueden
incidir en la calidad del vino y dar lugar a cambios en la acidez
volátil y a sabores y/o aromas desagradables.
De hecho, la variabilidad en la flora
levaduriforme de los mostos se puede solventar mediante la adición
en cada vendimia de un inóculo microbiano que al ser mayoritario,
normalice la flora inicial y de esta forma, dé lugar a una
fermentación homogénea en cada bodega año tras año.
A la hora de la selección de las levaduras para
la producción de vinos de calidad se busca que las levaduras tengan
las siguientes características:
- -
- Alta tolerancia al etanol
- -
- Total degradación de los azúcares fermentables
- -
- Resistencia al SO_{2}
- -
- Alta capacidad fermentativa
- -
- Producción de glicerol
- -
- Fenotipo Killer.
Por el contrario se intentan evitar que la
levadura posea las siguientes características no deseables:
- -
- Producción de H_{2}S
- -
- Producción de acidez volátil
- -
- Producción de acetaldehído y piruvato
- -
- Formación de precursores de carbamato de etilo.
En la actualidad, casi todas las bodegas emplean
inóculos de levaduras comerciales para la fermentación de sus
mostos. La utilización de estos inóculos comerciales en las
bodegas, reduce el riesgo de cinéticas lentas de fermentación y
defectos en el gusto y aroma de los vinos. Debido a esto, la
inoculación del mosto con estas levaduras es una práctica
generalizada en bodega. Estas levaduras, en la mayoría de los
casos, han sido aisladas en áreas, variedades de uva y condiciones
diferentes a las existentes en las bodegas que las usan además de
emplearse indistintamente en otras denominaciones de origen
españolas como de otros países, siendo la consecuencia de su empleo,
la elaboración de vinos con cierta pérdida de tipicidad.
Frente a este inconveniente de una aplicación
generalista y la pérdida de tipicidad, una alternativa que está
demostrando ser válida es la utilización de levaduras autóctonas,
aisladas a partir de uva en una determinada zona para elaborar los
vinos de esa misma zona. De esta forma se puede controlar el
proceso fermentativo respetando al mismo tiempo el carácter local de
los vinos. En este punto debe indicarse por lo tanto las numerosas
ventajas que presentaría el empleo de levaduras autóctonas
seleccionadas en las denominaciones de origen para la elaboración
de los vinos. Por otra parte, la selección debe centrarse en las
uvas, no en el ambiente de bodega, debido a que precisamente en las
bodegas existe una población residual de levaduras de origen vario
y mayormente comercial.
En un primer aspecto, la presente invención
proporciona una cepa de la especie Saccharomyces cerevisiae
identificada como GBiot-EL 011, dicha cepa fue
depositada el 12 de mayo de 2009 en la Colección Española de
Cultivos Tipo (CECT), Burjasot, Valencia con el número de acceso
CECT 13030.
En un aspecto más en particular, la cepa de la
presente invención se encuentra en formato líquido, fresco en
pasta, seco activo y seco instantáneo.
En un segundo aspecto, la presente invención se
refiere al uso de la cepa de la especie Saccharomyces
cerevisiae identificada como GBiot-EL 011
depositada en la CECT con el número de acceso CECT 13030 en la
elaboración de bebidas alcohólicas obtenidas por fermentación
alcohólica.
En un aspecto más en particular, la bebida
alcohólica se selecciona de entre vino, cerveza, cava y sidra.
En otro aspecto más en particular, la bebida
alcohólica es vino elaborado a partir de mostos de uva. En otro
aspecto más en particular, los mostos son de uva de la Región
vitivinícola de la Rioja Alavesa, más en particular son mostos de
uva de variedad de uva tinta, más en particular son de la variedad
Garnacha, Graciano, Mencía, Monastrell, Mazuelo, Bobal, más en
particular la uva es de la variedad Tempranillo.
En un tercer aspecto, la presente invención se
refiere al uso de la cepa de la especie Saccharomyces
cerevisiae identificada como GBiot-EL 011
depositada en la CECT con el número de acceso CECT 13030 para la
elaboración de biomasa.
Figura 1: Perfiles genéticos de la cepa
GBiot-EL 011 (CECT 13030) obtenidos por separación
electroforética en geles de agarosa mediante la técnica de
amplificación de las secuencias inter delta (A), y el análisis de
fragmentos de restricción del ADN mitocondrial (B). M: Marcador de
peso molecular (fago \lambda, digerido con la enzima de
restricción PstI).
Figura 2. Cinética fermentativa de la levadura
autóctona y de la levadura comercial en la microvinificación I del
ejemplo 2. La cinética fermentativa de estas levaduras se expresó
como la evolución de los ºBrix del mosto en función del tiempo.
\newpage
\global\parskip0.950000\baselineskip
Figura 3: Cinética fermentativa de la levadura
autóctona y de la levadura comercial en la microvinificación III
del ejemplo 2.
Figura 4. Cinética fermentativa de la levadura
autóctona en formatos: fresco en pasta, seca y de la levadura
comercial en la microvinificación I del ejemplo 3.
Figura 5. Cinética fermentativa de la levadura
autóctona en formatos: fresco en pasta, seca y de la levadura
comercial en la microvinificación II del ejemplo 3.
Figura 6. Cinética fermentativa de la levadura
autóctona en formatos: fresco en pasta, seca y de la levadura
comercial en la microvinificación III del ejemplo 3.
Figura 7. Cinética fermentativa de la levadura
autóctona en formatos: fresco en pasta, seca y de la levadura
comercial en la microvinificación IV del ejemplo 3.
Figura 8. Cinética fermentativa de la levadura
autóctona y de la levadura comercial en la microvinificación I del
ejemplo 5.
Figura 9. Cinética fermentativa de la levadura
autóctona y de la levadura comercial en la microvinificación 2 del
ejemplo 5.
La cepa GBiot-EL 011 depositada
en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de
acceso CECT 13030, presenta las siguientes características:
- -
- Morfología celular: células ovaladas, redondeadas.
- -
- En medio sólido (agar extracto de malta) la colonia presentaba un color blanquecino, superficie lisa y brillante.
- -
- En agar lisina no presentaba crecimiento.
- -
- Fermentación de carbohidratos en condiciones de aerobiosis la cepa fue: Glucosa (+), maltosa (+), sacarosa (+), trehalosa(+), rafinosa(+), \alphaglucosidosa(+), Xylosa (+), galactosa (+), histidina(+), leucil-glicina(+), Prolina (-) y lactosa (-).
- -
- Fermentación de carbohidratos en condiciones de anaerobiosis, la cepa fue: Glucosa (+), maltosa (+), sacarosa (+), trehalosa(+), rafinosa(+), \betaglucosidasa(+) \alphaglucosidosa(+) y galactosa (+).
- -
- Asimilación de compuestos nitrogenados, la cepa fue: nitrato (-), lisina (-).
- -
- Requerimientos de oxígeno: es anaerobia facultativa.
- -
- Crecimiento a distintas temperaturas: La cepa creció, al menos, en un intervalo de temperatura comprendido entre 14ºC y 37ºC.
- -
- Resistencia a la cicloheximida: presentó su límite de crecimiento en presencia de 100 ppms de cicloheximida.
La cepa GBiot-EL 011 (CECT
13030) presentó una cinética de fermentación rápida y regular con
una fase de latencia corta. Fue capaz de llevar a cabo
fermentaciones alcohólicas dentro de un amplio rango temperaturas,
al menos entre 14ºC y 30ºC, sin embargo fue óptima para
fermentaciones de vinos tintos con un intervalo de temperatura de
20-30ºC. La capacidad floculante fue buena y la
formación de espuma media.
El rendimiento alcohólico fue elevado: 16,8
gramos de azúcar por grado alcohólico producido. Agotó casi en su
totalidad los azúcares reductores presentes en el mosto, dejando
los vinos prácticamente secos (entre 1-6 g/L
azúcares residuales).
La cepa GBiot-EL 011 (CECT
13030) mostró una resistencia elevada al anhídrido sulfuroso,
resistiendo concentraciones de hasta 100 mg/L de SO_{2} total. La
cepa de levadura GBiot-EL 011 (CECT 13030) se
sembró en un medio de cultivo, que contenía concentraciones de 50,
75 y 100 mg/L de SO_{2} y se observó si existía crecimiento tras
48-72 h de incubación.
\newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
La tolerancia al etanol también fue elevada,
entorno al 16% vol. La determinación de la resistencia al etanol se
llevó a cabo mediante la inoculación de la cepa autóctona tanto en
un medio líquido como en placas Petri con contenidos en etanol de
12, 14 y 16% v/v.
La cepa GBiot-EL 011 (CECT
13030) tiene un fenotipo Killer neutro, es decir, no secreta
la toxina Killer pero sí es resistente a ella. La
determinación del fenotipo Killer se basa en la siembra de
la levadura a testar en una placa con un medio tamponado e
inoculado con un césped de levadura sensible, y en otra placa, con
el mismo medio inoculado con un césped de levadura Killer
(Bevan y Somers, 1969). Tras su incubación a 27ºC durante 72 h se
observó crecimiento en ambas placas sobre los dos céspedes de las
cepas control sin aparición de halos de inhibición.
La producción de ácido sulfhídrico fue baja. El
método utilizado para determinar la formación de H_{2}S se basó
en el grado de oscurecimiento de las colonias crecidas en un medio
con agar Biggy
(Bismuth-Glucose-Glycine-Yeast),
una modificación de la fórmula desarrollada por Nickerson (1953).
Este medio contiene sulfito de bismuto y varía de color crema
(cepas poco productoras) a marrón oscuro (cepas muy productoras).
El grado de oscurecimiento lo determina el sulfuro de bismuto, que
se forma por combinación del bismuto en el medio y el H_{2}S
liberado por las levaduras.
La producción de glicerol fue media, 8 g/L de
glicerol. La determinación del glicerol producido durante la
fermentación alcohólica se realizó mediante el método enzimático
desarrollado por Kreutz (1962) modificado.
La producción de acidez volátil también fue baja
(<0.54 g/L de ácido acético). Se empleó el método de
García-Tena (García Barceló, 1976).
La caracterización genética de la cepa
GBiot-EL 011 (CECT 13030) se obtuvo mediante dos
técnicas moleculares complementarias: la amplificación por PCR
(reacción en cadena de la polimerasa) de las secuencias inter delta
que flanquean los retrotrasposones Ty1 (Ness, 1993) y el análisis
de polimorfismos de los fragmentos de restricción del ADN
mitocondrial (Querol, 1992). La Figura 1 muestra los perfiles
genéticos de la cepa GBiot-EL 011 (CECT 13030)
obtenidos con cada una de las técnicas.
La obtención de biomasa se llevó a cabo mediante
cultivo Fed-Batch, en un fermentador de 12 litros
de capacidad total (Biostat C), con control continuo del pH,
temperatura, oxígeno disuelto y agitación. La alimentación se llevó
a cabo empleando un medio de alimentación con una concentración de
azúcares totales de 250 g/L (sacarosa, glucosa, fructosa),
suplementado con una fuente de nitrógeno, magnesio, vitaminas
(biotina, inositol y pantotenato cálcico) y sales minerales (sulfato
de hierro, sulfato de zinc y sulfato de cobre).
El fermentador fue inoculado con un volumen de
inóculo asegurándose un recuento de células en el volumen inicial
de fermentación de 10^{6} UCF/mL.
En cuanto a las condiciones de fermentación,
fueron las siguientes:
- -
- pH: el pH del cultivo se mantuvo en 4,5 a lo largo de todo el proceso mediante la adición NaOH 25% (p\cdotv^{-1}) y H_{3}PO_{4} 75% (p\cdotv^{-1}).
- -
- Temperatura: 30ºC
- -
- Agitación: 700 rpm.
El proceso de obtención de biomasa duró del
orden de 40 horas. La viabilidad obtenida por mL en el caldo
fermentado alcanzó el orden de 10^{9} UFC/mL.
A partir de este caldo obtuvimos los siguientes
formatos para la levadura:
- -
- Formato líquido: caldo fermentado sin ningún tipo de tratamiento con un recuento de células viables \geq 10^{9} UFC/mL.
- -
- Formato en pasta: se obtuvo a partir de la filtración, mediante filtro prensa, del caldo fermentado. Este tratamiento nos permitió obtener una crema con un recuento de células viables \geq 10^{10} UFC/g.
- -
- Formato seco activo: este formato se obtuvo a partir de la levadura en pasta y con un tratamiento de deshidratación consistente en un secado con lecho fluido. El producto ha de tener un contenido en humedad menor del 8%. El secado a 37ºC durante 60 minutos nos proporcionó un producto de levadura seca con un recuento de levaduras viables \geq 5 x 10^{10} UFC/g. En su aplicación el producto ha de rehidratarse previamente.
\newpage
- -
- Formato seco instantáneo: se obtiene a partir de la levadura en pasta con un tratamiento de deshidratación por secado en lecho fluido. El producto ha de tener un contenido en humedad menor del 5% y un recuento de levaduras viables \geq 10^{10} UFC/g.
Ejemplo
1
El aislamiento y selección de las levaduras se
realizó durante dos vendimias consecutivas. Como resultado de este
estudio se seleccionó una cepa de levadura autóctona de la especie
S. cerevisiae, GBiot-EL 011 (CECT 13030). El
testado de la levadura autóctona seleccionada se realizó durante 3
vendimias.
Para el aislamiento de levaduras autóctonas se
procedió a recoger uva sana y madura de la variedad Tempranillo en
varios viñedos pertenecientes a la región vitivinícola de Rioja
Alavesa. Se tomaron muestras procedentes de viñedo joven (cepa de
edad menor a los 25 años), viñedo viejo (cepa de edad comprendida
entre 25-50 años) y viñedo autóctono (cepa con una
edad superior a 50 años).
Las uvas se trasladaron al laboratorio y se
almacenaron en un lugar fresco y aireado hasta su procesamiento. En
ese momento, se estrujaron y fermentaron en recipientes estériles.
Dichos recipientes se introdujeron en un incubador orbital con
temperatura controlada de 27ºC. A lo largo de la fermentación se
realizó un seguimiento de los ºBrix y una vez que éstos se
estabilizaron se procedió a la toma de muestras de estos envases
para aislar las levaduras. Las muestras obtenidas para aislar las
levaduras se sembraron, tras las correspondientes diluciones
decimales, en placas de Petri que contenían agar extracto de malta
y se dejaron incubar tres días a 27ºC. De cada placa, con
30-300 colonias, se tomaron tres colonias diferentes
con una apariencia concordante con Saccharomyces cerevisiae.
El total de cepas de levaduras aisladas de la uva, con apariencia
de S. cerevisiae fue de 175.
Una vez caracterizadas todas las levaduras, se
seleccionaron aquellas que cumplían los siguientes requisitos
tecnológicos:
- -
- Crecimiento en lisina-agar: negativo.
- -
- Test Rapid: S. cerevisiae.
- -
- Fenotipo Killer: neutro o Killer.
- -
- Formación de sulfídrico: media o baja.
- -
- Resistencia al anhídrido sulfuroso: crecimiento positivo al menos en placas con 50 mg/L SO_{2}/L.
- -
- Resistencia al etanol: crecimiento positivo al menos en placas con 12% de etanol.
De todas las cepas de levaduras aisladas, 76 de
las cepas fueron identificadas como S. cerevisiae mediante
el Rapid Yeast Plus System (casa comercial Remel).
El total de levaduras seleccionadas bajo estos
criterios fueron 41. Estas levaduras se sometieron a un primer
proceso de microvinificación con mosto de uva estéril.
Las microvinificaciones consistieron en la
inoculación con las levaduras autóctonas caracterizadas en un mosto
estéril y posterior vinificación a escala de laboratorio bajo
condiciones controladas. La inoculación con las levaduras autóctonas
preseleccionadas se realizó en mosto de uva de la variedad
Tempranillo procedente de la Rioja Alavesa.
Este proceso de microvinificación nos permitió
descartar las levaduras con cinéticas fermentativas inadecuadas y
que dieron lugar a vinos no aptos desde el punto de vista
organoléptico.
El proceso de fermentación se llevó a cabo en
frascos de fermentación de cristal de 250 mL, por duplicado,
sumergidos en baños termostatizados con agitación y temperatura
controlada a 16 ó 27ºC, dependiendo del producto que se deseaba
obtener. Las levaduras a testar se inocularon en una proporción que
nos permitió alcanzar en todos los casos una población inicial de
10^{6} células/mL. El proceso de fermentación se siguió por
medida diaria del ºBrix hasta alcanzar un valor constante. En ese
momento el vino se trasegó, se centrifugó y se almacenó en atmósfera
inerte de nitrógeno o se sulfitó (20 mg SO_{2}/L) hasta el
momento de la cata del vino. En la cata de vino se valoraron los
siguientes aspectos:
- -
- Color: se valora la formación de capa, limpidez y brillo.
- -
- Nariz: intensidad, complejidad, y con aromas sin defectos.
- -
- Boca: tanicidad y cuerpo.
\newpage
\global\parskip0.950000\baselineskip
Además de la cata se realizó un análisis de los
vinos obtenidos de los siguientes parámetros: pH, azúcares, grado,
sulfuroso libre, sulfuroso combinado y sulfuroso total, acidez
volátil, acidez total, glicerol, ácido málico, intensidad colorante,
tonalidad, índice de polifenoles totales, antocianos totales,
taninos totales y parámetros CIELAB. Estos análisis fueron
realizados por la FUNDACION LEIA.
Los resultados obtenidos en este proceso de
vinificación nos permitió descartar todas aquellas cepas que no
presentaron buena actividad fermentativa y dieron lugar a defectos
organolépticos en el vino.
Las cepas que presentaron una buena actividad y
cinética fermentativa y que se valoraron en cata positivamente, se
identificaron mediante pruebas de biología molecular (PCR y RFLP
del ADN mitocondrial). Esta caracterización molecular nos reveló
cuantas de las cepas aisladas e identificadas como S.
cerevisiae eran genéticamente diferentes, es decir, eran cepas
distintas.
Con la información obtenida en la
microvinificación, tanto de la cinética fermentativa, los
resultados de la cata y analíticos del vino y con la información de
caracterización molecular de las cepas previamente seleccionadas de
dicha microvinificación, se procedió a realizar otras dos
microvinificaciones que nos seleccionaron las cepas que testamos a
escala industrial, es decir, en bodega. En estas microvinificaciones
se ensayaron las cepas variando las condiciones del mosto y en
función de la aplicación perseguida.
Para la selección de cepas de levadura para la
fermentación alcohólica para la obtención de vino tinto las
microvinificaciones que se realizan son las siguientes:
Microvinificación de mosto rico en
azúcares: el mosto que se utilizó como sustrato, tenía un
contenido en azúcares de 25 ºBrix, lo que supuso un grado alcohólico
de 14,8.
Microvinificación de mosto con pasta: fue
una microvinificación en la que el mosto contenía gran cantidad de
materia en suspensión como lías, hollejos, etc..., que simuló las
condiciones del mosto en bodega.
En el caso de selección de cepas para procesos
de refermentación además de ensayar estas condiciones se ensayaron
otras microvinificaciones como:
- -
- Microvinificación de mosto con bajo contenido en nutrientes, tales como nitrógeno y vitaminas.
- -
- Microvinificación a baja temperatura 12ºC y alta temperatura 33ºC.
- -
- Microvinificación con mosto parado, con azúcar y alto contenido en alcohol.
En función de las cinéticas fermentativas, los
resultados analíticos obtenidos y los resultados por cata se
seleccionan las cepas que se testaron en bodega.
Ejemplo
2
La microvinificación se realizó en dos mostos de
uva Tempranillo diferentes que presentaban las características
físico-químicas descritas en la tabla 1.
\newpage
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En esta microvinificación se comparó la levadura
autóctona GBiot-EL 011 (CECT 13030) aislada a
partir de uva procedente de viñedos de Rioja Alavesa junto a una
levadura comercial Zymaflore F15 que se utilizó como referencia.
Como sustrato se utilizó un mosto de Tempranillo estéril,
referenciado como mosto 2 en la tabla 1 (mosto estéril sin
población microbiana y sin hollejos).
Tanto la levadura autóctona como la cepa
comercial presentaron una cinética fermentativa rápida y regular y
terminaron la fermentación en 19 días.
Los resultados analíticos de los vinos obtenidos
a partir del mosto inoculado se resumen en la tabla 2.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Como se puede observar la levadura autóctona
seleccionada conduce a la obtención de un vino, tras la
fermentación alcohólica de características muy similares al obtenido
con la levadura comercial. En los dos casos los vinos fueron
correctos desde el punto de vista organoléptico, no apreciándose
defectos. Los resultados obtenidos en las analíticas no mostraron
diferencias significativas entre las dos levaduras.
\vskip1.000000\baselineskip
En esta microvinificación se utilizó el mosto
referenciado como 1 en la tabla 1, que al igual que el anterior, se
trata de un mosto estéril, que no tienen población microbiana y se
le han quitado los hollejos.
La figura 2 se representa la cinética
fermentativa de estas levaduras expresada como la evolución de los
ºBrix del mosto en función del tiempo. Las dos levaduras terminaron
la fermentación en 13 días y presentaron una cinética fermentativa
similar.
La tabla 3, muestra los parámetros analíticos de
los vinos obtenidos en esta microvinificación.
\vskip1.000000\baselineskip
En esta segunda microvinificación se observaron
pequeñas diferencias entre la levadura autóctona y la comercial,
que se apreciaron en el valor del grado y rendimiento de etanol
obtenidos, siendo ligeramente superiores los obtenidos con la
levadura autóctona.
En cuanto a la valoración en cata, el vino
inoculado con la levadura autóctona destacó por su intensidad y
redon-
dez.
dez.
\vskip1.000000\baselineskip
La microvinificación realizada utilizó como base
el mosto que se testó en la primera vinificación, referenciado como
mosto 2, con los hollejos presentes en el mismo mosto. Las
cinéticas de fermentación que presentaron en este mosto las
levaduras se reflejan en la figura 3.
Las fermentaciones con este mosto fueron mucho
más rápidas que en las dos microvinificaciones anteriores, y en
solo 8 días estuvieron terminadas. El contenido en sólidos en
suspensión estimuló el crecimiento y metabolismo de las levaduras
durante la fermentación. Las dos levaduras, al igual que en las dos
microvinificaciones anteriores presentaron una cinética
similar.
Respecto a los resultados analíticos de los
vinos obtenidos en esta microvinificación, se muestran en la tabla
4.
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\vskip1.000000\baselineskip
En esta microvinificación se observaron pequeñas
diferencias entre la levadura autóctona y la comercial, que se
apreció en el rendimiento de etanol obtenido, siendo en este caso
ligeramente superior en el vino fermentado con la levadura
comercial.
Respecto a la cata, los vinos fueron valorados
positivamente, y no se apreciaron defectos en los mismos.
Además de la cata y el análisis de los vinos se
procedió a realizar un estudio de implantación de las dos
levaduras, dado que el mosto con hollejos presentaba su propia
población indígena. En los dos casos, tanto la levadura autóctona
como la comercial se implantaron en un 100%.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se testaron 3 formatos de presentación de la
levadura autóctona con el fin de evaluar las cualidades
fermentativas, organolépticas y analíticas de las distintas
formulaciones. Los formatos fueron los siguientes: en forma de
pasta fresca y en forma seca activa. La levadura autóctona se
comparó con la Zymaflore F15, utilizada frecuentemente en la
elaboración del vino Rioja y apreciada por los enólogos por sus
características fermentativas, analíticas y organolépticas. En el
caso de la levadura comercial, se realizó el ensayo en su forma
seca activa, que es el formato comercial
disponible.
disponible.
Como substratos para las fermentaciones a nivel
de laboratorio se emplearon dos mostos de uva de la variedad
Tempranillo procedentes de Rioja Alavesa. La siguiente tabla recoge
las principales características de dichos
mostos.
mostos.
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\vskip1.000000\baselineskip
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Las microvinificaciones llevadas a cabo fueron
las siguientes:
- -
- Microvinificación I: mosto 1 estéril, ajustado a 23 ºBrix, 257 mg N asimilable/L, 40 mg, SO_{2}/L y pH 3,51.
- -
- Microvinificación II: mosto 2 estéril con exceso de azúcares, a 25 ºBrix, 260 mg N asimilable/L 40 mg SO_{2}/L y pH 3,54.
- -
- Microvinificación III: mosto 2 con pasta (hollejos), a 24.6 ºBrix, 40 mg SO_{2}/L y pH 3,42.
- -
- Microvinificación IV: mosto 1 estéril, ajustado a 23ºBrix, 250 mg/L N asimilable/L, 40 mg SO_{2}/L y pH 3,50.
\vskip1.000000\baselineskip
La preparación de los inóculos se realizó de la
siguiente forma:
- -
- Levadura fresca: se disolvió en una alícuota de mosto y se adicionó directamente.
- -
- Levadura seca: se disolvió en agua destilada con glucosa (1:10 w/v), se incubó a 40ºC durante 20 minutos, se mezcló con una alícuota de mosto, se incubó durante 10 minutos y se añadió al mosto para comenzar la fermentación.
\vskip1.000000\baselineskip
En ese momento de inocular se obtuvieron en
todos los casos una población inicial de levaduras de 10^{6}
células/mL. Las fermentaciones se llevaron a cabo en frascos de
fermentación de cristal de 250 mL sumergidos en baños
termostatizados con agitación y temperatura controlada (27ºC). El
proceso se siguió mediante medida diaria del ºBrix y se dio por
finalizado cuando éste se estabilizó. Los vinos obtenidos se
trasegaron, se centrifugaron y se sulfitaron (20 mg SO_{2}/L)
hasta el momento de la cata.
Una vez finalizadas las microvinificaciones, se
realizaron las catas de los vinos obtenidos, valorando su color,
aroma y gusto. Asimismo se realizaron los análisis
correspondientes.
Sobre estos datos se llevó a cabo un análisis de
la varianza (ANOVA) de dos vías (tipo de levadura y formato) para
detectar diferencias significativas entre las microvinificaciones
elaboradas con diferentes levaduras y en sus diferentes formatos.
El nivel de significación en todos los casos es del 95%.
\vskip1.000000\baselineskip
En esta microvinificación se utilizó el mosto 1
como sustrato a fermentar.
La figura 4 muestra la cinética fermentativa de
estas levaduras expresada como la evolución de los grados Brix del
mosto en función del tiempo.
Como se aprecia en la Figura 4, la levadura
autóctona (fresca o seca) comenzó la fermentación rápidamente,
mientras que la levadura comercial comenzó un poco más tarde. Todas
las fermentaciones terminaron en un tiempo similar y con unos ºBrix
similares.
Los resultados analíticos medios de los vinos
obtenidos de las microvinificaciones de la levadura autóctona y la
levadura control en sus diferentes formatos se muestran en la tabla
6.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Desde el punto de vista organoléptico, los
catadores describieron los vinos como correctos, sin defectos
sensoriales que descartaran ninguna de los formatos en que se
presentaba la levadura autóctona.
Se repitió el diseño experimental desarrollado
en la Microvinificación I, utilizando el mosto referenciado como 2
con un ºBrix ligeramente más alto (25º Brix) con el fin de poder
comprobar la efectividad de la levadura autóctona en un medio con
mayor contenido en azúcares.
En todos los casos, las microvinificaciones se
llevaron a cabo por inoculación de la levadura autóctona en sus dos
formatos (fresco en pasta y seco) y la levadura comercial sobre el
Mosto 2.
En la figura 5 se muestra la cinética
fermentativa de estas levaduras expresada como la evolución de los
ºBrix del mosto en función del tiempo.
Al igual que en la microvinificación I, la
levadura autóctona comienza la fermentación inmediatamente tras su
adición al mosto, mientras que la levadura comercial tiene un
"periodo de adaptación" mayor. Todas las levaduras terminaron
la fermentación en 15 días y los vinos resultantes presentaron unos
niveles de azucares residuales similares.
La Tabla 7 muestra los resultados analíticos de
los vinos obtenidos de las microvinificaciones por inoculación de
la levadura autóctona en sus diferentes formatos y la levadura
comercial sobre el mosto 2.
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\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados analíticos no mostraron
diferencias relevantes entre los diferentes formatos de la levadura
autóctona ni con respecto a la levadura comercial. A nivel de cata
todos los vinos se describieron como correctos, sin encontrarse
grandes diferencias entre los vinos testados.
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El objetivo de este ensayo fue observar la
evolución de las cepas en un mosto con sólidos en suspensión y ver
su influencia en la cinética fermentativa, en los parámetros
analíticos de los vinos, así como en sus características
organolépticas. Asimismo, también para ver su interacción con las
levaduras indígenas del mosto, que en este caso crecieron durante
la fermentación junto con la levadura inoculada. Las levaduras
testadas y los formatos testados fueron los mismos que los testados
en las microvinificaciones anteriores.
La Figura 6 muestra la cinética fermentativa de
estas levaduras expresada como la evolución de los ºBrix del mosto
en función del tiempo.
Las fermentaciones con este mosto fueron mucho
más rápidas que en las dos microvinificaciones anteriores, y en
sólo 12 días estuvieron terminadas, ya que el contenido en sólidos
en suspensión estimuló el crecimiento y metabolismo de las levaduras
durante la fermentación. En la fermentación espontánea y en las
fermentaciones con la levadura comercial, el arranque de
fermentación fue más lento que en las fermentaciones inoculadas con
la levadura autóctona. No se observaron diferencias significativas
en el grado Brix final.
En la tabla 8 se muestran los resultados
analíticos de los vinos obtenidos por inoculación del Mosto 2 con
pasta, con la levadura autóctona y la levadura comercial.
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Al igual que en las microvinificaciones
anteriores no se observaron diferencias significativas en los
valores obtenidos de los parámetros analizados entre la levadura
autóctona en sus diferentes formatos con respecto a la levadura
comercial.
En el panel de cata los vinos elaborado con las
levadura autóctona han estado bien valorados por los catadores
independientemente del formato de la levadura catado.
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En este caso la microvinificación se realizó
utilizando como base el Mosto 1, con una concentración media de
azúcares en el mosto algo superior (23º Brix).
En la Figura 7 se muestra la cinética
fermentativa de estas levaduras expresada como la evolución de los
ºBrix del mosto en función del tiempo.
Las fermentaciones terminaron tras 16 días y se
retiraron los vinos para realizar los análisis químicos y la cata.
En este caso, los vinos inoculados con la levadura autóctona y
comercial seca tardaron un poco más que las demás en comenzar la
fermentación. Sin embargo, todas terminaron en un tiempo similar, y
con un grado Brix residual
similar.
similar.
En la siguiente tabla se muestran los resultados
analíticos de los vinos obtenidos por inoculación del Mosto 1 con
mayor contenido en azúcares con la levadura autóctona y la levadura
comercial.
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\newpage
Los resultados obtenidos con las
microvinificaciones llevadas a cabo con la cepa de levadura
autóctona en sus dos formatos (fresco en pasta, seca) y la levadura
comercial muestran que:
- La levadura autóctona, tanto con mostos
diferentes como en sus diferentes formatos mostró una capacidad
fermentativa elevada, terminando la fermentación en mostos de 23
ºBrix, correspondiendo a un grado alcohólico probable de 13,5%.
- Tanto en mostos con 23 ºBrix como con 25 ºBrix
la levadura autóctona comenzó la fermentación de una forma más
vigorosa. La levadura comercial tuvo un inicio de fermentación más
lenta.
- Ninguna de las levaduras testadas formó
cantidades elevadas de ácido acético y los valores de acidez
volátil estuvieron por debajo de 0,54 g/L en todas las
microvinificaciones.
- La acidez total estuvo siempre por debajo de
los 6,8 g de ác. tartárico/L.
- La formación de glicerol por las levaduras
autóctonas fue similar a la de la cepa comercial, caracterizada por
una alta producción de este compuesto. El tipo de formato en el que
se presentó la levadura no influyó en la producción de glicerol.
- En todas las fermentaciones, la levadura
autóctona dio lugar a vinos con grados alcohólicos similares a los
obtenidos con levadura comercial.
- En cuanto al rendimiento en etanol, no hubo
diferencias significativas entre la levadura comercial y la
autócto-
na.
na.
- Respecto a la contribución de las levaduras
autóctonas a los parámetros de color de los vinos, ésta estuvo
condicionada por el tipo de mosto que fermentaron. Dentro de cada
tipo de mosto, no hubo diferencias entre las levaduras inoculadas ni
entre los diferentes formatos testados.
- Respecto al análisis sensorial de los vinos
fermentados, la levadura autóctona en sus diferentes formatos tuvo
un comportamiento similar a la levadura comercial en todas las
pruebas.
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Ejemplo
4
La levadura GBiot-EL 011 (CECT
13030), testada en los ensayos de microvinificación a escala
laboratorio fue testada durante 3 vendimias consecutivas en dos
bodegas de Rioja Alavesa (Bodegas Vinos de los Herederos del
Marqués de Riscal y Bodegas Baigorri). Además de esta levadura se
utilizó como control la misma levadura comercial que se utilizó en
los ejemplos anteriores. Las dos levaduras se testaron en depósitos
que contenían mosto de uva Tempranillo.
La levadura autóctona fue suministrada a las
bodegas en el formato fresco en líquido y en pasta. La levadura
comercial se testó en forma de levadura seca activa, que es el
formato disponible comercialmente.
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La levadura autóctona se testó en las dos
bodegas de Rioja Alavesa antes mencionadas durante dos vendimias
consecutivas. La levadura se suministró en formato líquido. Las
inoculaciones se realizaron en depósitos de 20.000 kg de uva. La
variedad de uva sobre la que se realizó la inoculación fue levadura
de la variedad Tempranillo.
\vskip1.000000\baselineskip
La tabla 10 muestra los parámetros analíticos
del mosto (antes de inocular), y el vino finalizada la fermentación
alcohólica (tras la FOH), en la bodega 1 del depósito inoculado con
la levadura comercial del depósito inoculado con la levadura
autóctona en su formato líquido.
\newpage
La tabla 11 muestra los parámetros analíticos
del mosto (antes de inocular), y el vino finalizada la fermentación
alcohólica (tras la FOH), de la bodega 2 de uno de los depósitos en
fermentación inoculada con la levadura comercial con la levadura
autóctona en formato fresco líquido.
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\vskip1.000000\baselineskip
Respecto a la implantación de levadura
autóctona, en las dos bodegas se observaron buenos resultados de
implantación.
Los resultados mostraron características
físico-químicas excepcionales en el vino obtenido
por inoculación del mosto con la levadura autóctona seleccionada,
comparativamente con el vino obtenido por inoculación del mosto con
la levadura comercial habitualmente empleada en la bodega. A nivel
de cata los vinos obtenidos fueron calificados por los enólogos de
las bodegas como vinos muy correctos y de gran calidad.
Todos estos resultados ponen de manifiesto las
características excepcionales de la levadura autóctona aislada y
seleccionada de Rioja Alavesa, para la elaboración de vino de
calidad extraordinaria y que mantiene la tipicidad propia de los
vinos de esta importante comarca vitivinícola.
\vskip1.000000\baselineskip
Las inoculaciones se realizaron en depósitos de
20.000 kg de uva pertenecientes a las mismas bodegas que
participaron en las vendimias anteriores. La variedad de uva sobre
la que se realizó la inoculación fue levadura de la variedad
Tempranillo. En esta vendimia se testó la levadura autóctona en el
formato fresco en pasta. Al igual que en las vendimias anteriores
se utilizó como control la misma levadura comercial.
En la tabla 14 se muestran los datos obtenidos
en el transcurso de la fermentación de los depósitos inoculados con
la levadura fresca en pasta y se comparan con los datos para las
inoculaciones con la levadura comercial habitualmente empleada en la
bodega.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Los resultados muestran muy buenas
características físico-químicas en el vino obtenido
por inoculación del mosto con esta levadura autóctona seleccionada,
comparativamente al empleo de la levadura comercial.
Las fermentaciones alcohólicas y malolácticas de
los depósitos sobre los que se hubo inoculado las levaduras
autóctonas transcurrieron con total normalidad, elaborándose los
vinos perfectamente. Las fermentaciones con esta levadura
transcurrieron con total normalidad, elaborándose unos vinos de
calidad muy alta y con unas valoraciones organolépticas por cata
excepcionales, según los datos recogidos de las dos bodegas
participantes.
Los resultados obtenidos con las fermentaciones
industriales llevadas a cabo con la levadura autóctona en su
formato fresco en pasta fresca y la levadura comercial nos permiten
extraer de forma general las siguientes conclu-
siones:
siones:
- -
- La levadura autóctona presenta buenos resultados de implantación.
- -
- La levadura autóctona en su formato fresco en pasta ha presentado una capacidad fermentativa elevada y ha dado lugar a vinos con un grado alcohólico adecuado para los vinos de Rioja. Así mismo se alcanzó un buen rendimiento en la producción de etanol con ambos formatos de la levadura autóctona.
- -
- Los vinos elaborados con la levadura autóctona fresca en pasta una acidez volátil por debajo de 0,35 g/L tras la fermentación alcohólica y una acidez total por debajo de 6,8 g de ác.tartárico/L. Estos valores son apropiados para los vinos de Rioja.
- -
- La inoculación con levadura autóctona fresca en pasta dio lugar a vinos con altas concentraciones de glicerol, valores mayores incluso que los obtenidos con la levadura comercial.
- -
- La levadura autóctona fresca en pasta dio lugar a un vino con alta intensidad colorante y capa alta tras la fermentación alcohólica.
- -
- Se puede concluir según los resultados obtenidos en su conjunto, que la levadura autóctona fresca en pasta presenta una elevada calidad tecnológica.
\newpage
En la tabla 15 se muestran los resultados
analíticos durante el transcurso de la fermentación en la bodega 2
de los depósitos en los que se ha inoculado la levadura autóctona
fresca en pasta y se comparan con los datos para las inoculaciones
con la levadura comercial habitualmente empleada en la bodega.
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Los resultados muestran características
físico-químicas excepcionales en el vino obtenido
por inoculación del mosto con la levadura autóctona seleccionada
comparativamente con el vino obtenido por inoculación del mosto con
la levadura comercial habitualmente empleada en la bodega.
Todos estos resultados ponen de manifiesto las
características excepcionales de la levadura autóctona aislada y
seleccionada de Rioja Alavesa, para la elaboración de vino de
calidad extraordinaria y que mantiene la tipicidad propia de los
vinos de esta importante comarca vitivinícola.
Además de evaluar la aportación de las levaduras
desde el punto de vista físico-químico se estudió la
capacidad de implantarse en los depósitos inoculados frente a la
población indígena presente en el mosto. El estudio de implantación
combinó la técnica molecular de ADN mitocondrial y la determinación
del fenotipo killer. Los resultados obtenidos para cada una
de las bodegas se muestran a continuación.
\newpage
Los resultados obtenidos con las fermentaciones
industriales llevadas a cabo con la levadura autóctona en su
formato fresco en pasta y la levadura comercial muestran que:
- -
- La levadura autóctona fresca en pasta presenta buenas cualidades de implantación.
- -
- La levadura autóctona fresca en pasta ha presentado una capacidad fermentativa elevada y ha dado lugar a vinos con un grado alcohólico adecuado para los vinos de Rioja. Asimismo se alcanzó un buen rendimiento en la producción de etanol.
- -
- Los vinos elaborados con la levadura autóctona fresca en pasta presentaron una acidez volátil por debajo de 0,25 g/L tras la fermentación alcohólica y una acidez total por debajo de 6,0 g de ác.tartárico/L.
- -
- La inoculación con levadura autóctona fresca en pasta dio lugar a vinos con altas concentraciones de glicerol, valores mayores incluso que los obtenidos con la levadura comercial.
- -
- La levadura autóctona fresca en pasta dio lugar a un vino con alta intensidad colorante y capa alta tras la fermentación alcohólica.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Con objeto de comprobar si existen diferencias
en el consumo de fructosa entre la cepa de levadura autóctona
aislada a partir de uva procedente de viñedos de Rioja Alavesa y la
levadura comercial de referencia, se procedió a realizar una serie
de procesos de microvinificación en laboratorio inoculando cada una
de las levaduras en sendos frascos de fermentación que contenían
mosto estéril de la variedad Tempranillo, del que se determinó el
contenido inicial de glucosa y fructosa. El tamaño de inóculo tanto
de la levadura autóctona como de la comercial, con que se inoculó el
mosto estéril fue de 2 x 10^{8} UFC/mL.
En la tabla 16 se indican las características
del mosto estéril utilizado para las microvinificaciones.
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En la siguiente figura se representa la cinética
fermentativa de las levaduras expresada como la evolución de los
ºBrix del mosto en función del tiempo.
En la figura 8 se muestra que tanto las
levaduras autóctona como y la cepa comercial presentaron una
cinética fermentativa rápida y regular y terminaron la fermentación
en 14 días.
\newpage
Los resultados analíticos de los vinos obtenidos
a partir del mosto inoculado se muestran en la tabla 17.
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En la figura 9 se representa la cinética
fermentativa de las levaduras expresada como la evolución de los
ºBrix del mosto en función del tiempo.
Tanto la levadura autóctona como la cepa
comercial presentaron una cinética fermentativa rápida y regular y
terminaron la fermentación en 14 días.
La tabla 18 muestra los resultados analíticos de
los vinos obtenidos en la microvinificación II.
A partir de los datos obtenidos en estas dos
microvinificaciones, se observó una considerable diferencia
respecto del consumo de fructosa entre las dos levaduras. Tanto el
la microvinificación I como en la II, la levadura autóctona consumió
más fructosa que la comercial, siendo el valor obtenido de la
fructosa residual en el mosto inoculado con la levadura autóctona
de orden de la mitad que el obtenido con la levadura comercial.
También se observa, aunque con una diferencia menos significativa,
que la levadura autóctona permitió obtener un vino con menos
contenido en glucosa.
Estos datos mostraron que la levadura autóctona
presentaba una capacidad mayor de consumo, y por tanto de
asimilación de fructosa del mosto, frente a la levadura
comercial.
Claims (7)
1. Cepa de la especie Saccharomyces
cerevisiae identificada como GBiot-EL 011
depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el
número de acceso CECT 13030.
2. Cepa según la reivindicación 1,
caracterizada porque se encuentra en formato líquido, fresco
en pasta, seco activo o seco intantáneo.
3. Uso de la cepa de la especie Saccharomyces
cerevisiae identificada como GBiot-EL 011
depositada en la CECT con el número de acceso CECT 13030 en la
elaboración de bebidas alcohólicas obtenidas por fermentación
alcohólica.
4. Uso según la reivindicación 3, donde la
bebida alcohólica se selecciona de entre vino, cerveza, cava y
sidra.
5. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
3-4 donde la bebida alcohólica es vino elaborado a
partir de mostos de uva.
6. Uso según la reivindicación 5, donde la uva
es de la variedad Tempranillo.
7. Uso de la cepa de la especie Saccharomyces
cerevisiae identificada como GBiot-EL 011
depositada en la CECT con el número de acceso CECT 13030 para la
producción de biomasa.
Priority Applications (3)
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|---|---|---|---|
| ES200901625A ES2334753B1 (es) | 2009-07-22 | 2009-07-22 | Cepa de saccharomyces cerevisiae cect 13030 y su uso para la elaboracion de bebidas alcoholicas. |
| ES10170494.8T ES2524704T3 (es) | 2009-07-22 | 2010-07-22 | Cepa de Saccharomyces cerevisiae CECT 13030 y su uso para la elaboración de bebidas alcohólicas |
| EP10170494.8A EP2277990B1 (en) | 2009-07-22 | 2010-07-22 | Strain of CECT 13030 of Saccharomyces cerevisiae and its use for the production of alcoholic beverages |
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| ES200901625A ES2334753B1 (es) | 2009-07-22 | 2009-07-22 | Cepa de saccharomyces cerevisiae cect 13030 y su uso para la elaboracion de bebidas alcoholicas. |
Publications (2)
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|---|---|
| ES2334753A1 ES2334753A1 (es) | 2010-03-15 |
| ES2334753B1 true ES2334753B1 (es) | 2011-01-21 |
Family
ID=41722669
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|---|---|---|---|
| ES200901625A Expired - Fee Related ES2334753B1 (es) | 2009-07-22 | 2009-07-22 | Cepa de saccharomyces cerevisiae cect 13030 y su uso para la elaboracion de bebidas alcoholicas. |
| ES10170494.8T Active ES2524704T3 (es) | 2009-07-22 | 2010-07-22 | Cepa de Saccharomyces cerevisiae CECT 13030 y su uso para la elaboración de bebidas alcohólicas |
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| EP (1) | EP2277990B1 (es) |
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